DE2656849A1 - Neue, dem somatostatin verwandte undecapeptide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel - Google Patents
Neue, dem somatostatin verwandte undecapeptide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende arzneimittelInfo
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Description
Neue, dem Sonatostatin verwandte ündecapeptide, Verfahren zu
ren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel
Für den cyclischen die Somatotropin-Freisetzung inhibierenden
Faktor (SRIF), der als Somatostatin bekannt ist, wurde von
Brazeau et al., Science, ^79, 77 (1973) folgende Struktur aufgezeigt:
H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH
! i
S S
Zur Synthese von Somatostatin wurden in der Literatur verschiedene
Kethoden beschrieben einschlieljlich der Festphasenmethode
von Rivier, J. An. Chem. Soc, 96, 2986 (197A-) und den Methoden
in Lösung von Sarantakis et al., Biochemical Biophysical Research
7 Ο 1 Π 7 fi / 1 Π 8 5
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Communications, ^A-, 2'j,1+ (1973) und Immer et al., HeIv. Chim.
Actü, 571 730 (197^)· ^s besteht auch weiter das Bestreben, die
pharrcakologische Aktivität von Somatostatin durch synthetische
Kodifikation seiner Struktur zu erhöhen.
Durch die vorliegende Erfindung werden neue cyclische Analoga von Somatostatin geschaffen, worin der Tryptophylrest entweder
in der stereochemischen L- oder D-Konfiguration vorliegen kann
12 3 14-
und die AIa , GIy , Cysy und Cys -Reste durch eine υ -Aminosäure der allgemeinen Formel H^N-(CH0), q-COOH ersetzt wurden. Der Ersatz des L-Trp-Restes in Somatostatin durch D-Trp wird von J. Rivier et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 65, 7^-6 (1975) diskutiert.
und die AIa , GIy , Cysy und Cys -Reste durch eine υ -Aminosäure der allgemeinen Formel H^N-(CH0), q-COOH ersetzt wurden. Der Ersatz des L-Trp-Restes in Somatostatin durch D-Trp wird von J. Rivier et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 65, 7^-6 (1975) diskutiert.
Las Konzept der vorliegenden Erfindung bildet eine Verbindung
aus der Klasse von
0
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-L.ys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-NH
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-L.ys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-NH
R'1NH(CH2)nGO-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-Lys(R2)-L-Thr(R5)-
L-Phe-L-Thr(R5)-L-Ser(R5)-X
und ihren nicht toxischen Salzen, worin R = Wasserstoff oder
P 7I
t-Butyloxycarbonyl; R^ = 2-Chlorbenzyloxycarbonyl; R^ = Benzyl;
η = eine ganze Zahl von 3 bis 8; T = L-Tryptophyl oder D-Tryptophyl;
und X = OH, NH-NH2, 0-(niedrig)-Alkyl, OBenzyl oder eine
Verankerungsbindung, die an ein festes Polystyrolharz, dargestellt durch die Formel
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CH,
,Poly- !
.styrol-·
-fharz- .
. träger .
gebunden ist.
Die cyclischen Ausführungsformen gemäß der Erfindung weisen folgende physikalische Eigenschaften auf: sie sind weiße bis
schwach lohfarbene Feststoffe, im wesentlichen unlöslich in Chloroform,
Benzol und dergleichen, sind jedoch löslich in V/asser und wässrig sauren Lösungen, wie Chlorwasserstoffsäure und Essigsäure.
Diese Verbindungen zeigen keine deutlich wahrnehmbaren Schmelzpunkte
und können beispielsweise auf chromatographische Weise gei-einigt
v/erden. Die Hydrolyse dieser Verbindungen in beispielsweise 4- n-Methansulfonsäure ermöglicht die Bestimmung ihres Aminosäuregehaltes,
der mit den vorstehend aufgezeigten Strukturen übereinstimmt.
Die cyclischen.Ausführungsformen gemäß der Erfindung sind zur
Inhibierung der Freisetzung des Wachstumshormons Insulin und von Glucagon verwendbar, was durch pharmakologische Standarduntersuchungen
aufgezeigt wurde.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung stellen das cyclische Undecapeptid
der Formel
0
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-NH
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-NH
und dessen nicht toxische Salze dar.
Einen dritten Gegenstand der Erfindung stellen das cyclische
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TJndGcapeptid der Formel
0
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-T^-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-NH
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-T^-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-NH
sowie dessen nicht toxische Salze dar.
Die erfindungsgemäßen cyclischen Undecapeptide, die die Sekretion des Elorzions Somatotropin inhibieren, worden durch die Formel
0
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-Lys-L-O}hr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-KH
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-Lys-L-O}hr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-KH
r Λ7 \
cer?·; r-sto 11t, worin T =·· L-Tryptophyl od~;r D-Tryptophyl und η =
eine ganze Zahl von 3 bis 8 und deren nicht toxische Säureadditionfjc-ilze.
Beispiele für die nicht roxiecnen Sauren zur· Herstellung
dieser Salze sind Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Schwefelsäure,
Maleinsäure, Benzoesäure, Fumarsäure, Citronensäure und dergleichen.
Die Erfindung betrifft auch neue Undecapeptid-Zwischenprodukte
der Formel
R1NH(CH;))nCO-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-Lys(R2)-L-lI!hr(R5)-
L-Phe-L-Thr(R5)-L-Ser(R5)-X
worin η = eine ganze Zahl von 3 bis 8,T= D-Tryptophyl oder L-Tryptophyl;
R = Wasserstoff odar eine ^c-Aminoschutzgruppe, vor-
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-
-V
zugsweise vom XJr ethan typ, wie t-Butyloxycarbonyl; R = Halogenbenz;/loxycarbonyl,
Benzyloxycarbonyl usw. -und vorzugsweise 2-Ciilorberizyloxycarbonyl;
R^ = Benzyl; X = OK, NH-NH2, O-(niedrig)-Alkyl,
OBenzyl oder eine Verankerungsbindung, die an ein festes Polystyrolharz gebunden ist, dargestellt euren
FoIy-
n η-*
st;yrol-
U UX12 ä harzträger
Der Polystyrolharzträger kann jeder geeignete Träger sein, der
für die Herstellung von Polypeptiden in fester Phase üblich ist und ist vorzugsweise ein Copolymeres von Styrol mit etwa 1 bis 2 %
Divinylbensol als Que!vernetzungsmittel, wodurch das Polystyrolpolyraere
in bestimmten organischen Lösungsmitteln unlöslich wird,
ü' Λ-urdo vorzugsweise auch chlormethyliert, um Stellen zur Esterbildung
mit der zuerst eingeführten Amino-geschützten Aminosäure
zu oilden. Das Polystyrolpoiymere besteht aus langen Alkylketten,
die einen Phenylring an jedem zweiten Kohlenstoffatom aufweisen
uri'i cot- end ständige Aminoßäurerest ist über eine kovalente Kohienstofi-au-Sauerstoff-Bindung
an den Harzträger gebunden.
Die linearen Sequenzen, aus denen die cyclischen Undecapeptide
9-errJiZ tor Erfindung hergestellt werden, werden selbst vorzugsweise
nach der Festphasenmethode unter Anwendung von bekannten Tecnniken
2ua: Aufbau einer Aminosäuresequenz aus einer ursprünglich auf
einem Harzträger befindlichen Aminosäure hergestellt. Eine allgemeine
Darstellung dieser Technik wird von ?ierrifield J.A.G.S.,
85, 2149 (1963) gegeben. Die linearen Sequenzen werden anschliessend
von dem Harzträger entfernt und intramolekular zur Bildung der neuen erfindungsgemäßen cyclischen Undecapeptide cyclisiert.
Wegen der cyclischen Natur der Undecapeptidprodukte ist es unwesentlich,
welche Aminosäure der Sequenz dazu ausgewählt wird, die Synthese des linearen Zwischenprodukts zu initiieren, vorausge-
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setzt, daß diese lineare Sequenz in der Reihenfolge aufgebaut
wird, die nan bei Bewegung um den Undecapeptidring gegen den Uhrzeigersinn
von der so gewählten Aminosäure vorfindet. Zur Vereinfachung wurden die erfindungsg·einäßen Undecapeptide unter Anv:."
η'lung von L-Se rin als Ausgangsaminosäure aufgebaut, so daß das
L-Sorin (beim Ablesen von rechts nach links) als erster Amino-ε
au-να rest in der Sequenz der linearen Zwischenprodukte vorliegt.
Hieraus ergibt sich, daß die ^-Aminosäure der Formel H0N(CH0)-, .~-
C. (L. J— O
CCCH ale letzter Aminosäurerest in der Folge der linearen Zwischenprodukte
(wiederum von rechts nach links gelesen) erscheint. Eine Amid ob ir. dung, die durch Umsetzung der Carboxylgruppe des L-Serinrestec
und der Aminogruppe des ;> -Aminosäurerestes hergestellt wird,
schließt die Synthese ab. Für den Fachmann ist ersichtlich, daß
bei if.'ahl einer anderen Aminosäure als L-Serin für den Beginn der
Synthese die Sequenz der linearen Zwischenprodukte variiert, jedoch
bei der Cyclisierung die gewünschte Aminosäuresequenz ivn dem
erzeugten ündecapeptidcyclus vorliegt. So benötigt man beispielsweise
folgende Aminosäuresequenz beim linearen Zwischenprodukt {··'■;: rennt ε nach links gelesen) zur Herstellung der erfindung.sgemä'ien
cyclischen Undecapeptide, wenn man D-Tryp-cophan zur Initiierun!·;
der linearen Sequenz wählt:
L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-/NH(CH0)3_Q-CO7-L-Lys-L-Asn-L-Phe-
L-Phe-D-Trp
Die intramolekulare Bildung einer Amidbindung zwischen der Carboxylgruppe
des endständigen D-Tryptophans und der ^,-Aminogruppe des
endständigen Lysins führt zu den cyclischen Undecapeptiden gemäß der Erfindung. Sin besonderer Vorteil,der sich durch die Verwendung
einer -'-Aminoalkansäure zur Initiierung der linearen Se-CjUen2.,
d.h. als erste an das Harz geknüpfte Aminosäure, ergibt, liegt darin, daß weder bei der Entfernung von dem Harz noch bei
der Aktivierung eine Racemisierung auftritt.
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In einer bevorzugten Sequenz wird die ^-Amino-ß-hydroxy-geschützte
-Aminosäure t-Boc-O-benzyl-L-serin an ihrer Carboxylgruppe an das
chlormethylierte Harz gemäß der Verfahrensweise von Gisin, HeIv.
Chim. Acta., 56, "A^G (1973) gekoppelt. Nach der Koppelung des
^-Amino-ß-hydroxy-digeschützten L-Serins an den Harzträger wird
die ^-Aminoschutzgruppe durch. Standardmethoden vorzugsweise unter
Anwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, das 5 %
Äthandithiol' enthälr, oder mittels Trifluoressigsäure allein oder
durch HCl in Dioxan entfernt. Man führt die Entfernung der Schutzgruppe
vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa O0C bis Raumtemperatur
durch. Die verbleibenden oL-Amino-geschützten Aminosäuren
werden der Reihe nach in der gewünschten Reihenfolge zu der linearen Sequenz gekoppelt, die zu dem gewünschten Produkt cyclisiert
werden kann. Alternativ können mehrere Aminosäuregruppen durch die Methode in Lösung gekoppelt werden, bevor sie mit der
auf dem Harzträger befindlichen Aminosäuresequenz unter 3ildung des gewünschten linearen Zwischenprodukts gekoppelt werden. Die
Wahl eines geeigneten Kopplungsmittels liegt im Bereich des fachmännischen Könnens. Ein besonders geeignetes Kopplungsmittel ist
das ΙΤ,ϊΤ'-Diisopropylcarbodiimid (DIC). Ein weiteres geeignetes
Kopplungsmittel ist das N^N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC).
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor in einem 2- bis 6-fachen Überschuß eingefügt
una die Kopplung wird in einem Medium von Dimethylformamid:Methylenchlorid
oder in Dimethylformamid oder Methylcnchiοrid allein
durchgeführt. In Fällen einer unvollständigen Kopplung wird das Kopplungsverfahren vor Entfernen der -<
-Aminoschutzgruppe vor dem Einbringen der nächsten Aminosäure in den I'estphasenreaktor wiederholt.
Der Erfolg der Kopplungsreaktion in jeder Synthesestufe wird durch die Ninhydrinreaktion, wie von E. Kaiser et al., Analyt,
Biochem., 24-, 595 (1970) beschrieben, überwacht.
Das vollgeschützte, auf dem Harzträger befindliche Undecapeptid weist vorzugsweise folgende Aminosäuresequenz auf:
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R'1NH(CH2)nCO-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-Lys(R2)-L-Thr-(R5)-
■2 7 ■ styrol-l
L-Hie-L-Thr(R:>)-L-Ser(E-;)-O-CH2 ■■ harz- ;
. träger j
worin die Grmrpe —
I Polystyrol -
— 0 — CH2 j harz-
I träger
den Esterrest einer der vielen funktionellen Gruppen, die in dem
Polystyrolharz vorhanden sind, darstellt und die Gruppen R' ^,
η und T wie vorstehend definiert sind.
I.i.«f vollr;eschützte lineare Aminosäurensequenz wird von dem PoIyr:'.yroLhar:'.crcigcr
abgetrennt, nie -jTupp^ R wird entfernt und das
iiaeare Peptid wird einer intramolekularen Cyclisierung unterzo-
£3!;, die verbleibenden blockierencsn Gruppen (d.h. .<
und R-'j
.•/.".".lon entfernt und das cyclische entblockierte Undecapeptid wird
bei 3DLelsweise* durch Chromatographie gereinigt. Falls gev/ünscht,
Viird daß freie cyclische Undecapeptid in ein pharmalcologisch
brauchbares 3aureadd.it ions salz u^igo wandelt;.
Eine besonders zwackmäßige und wirksame* Folge zur "Durchführung
der vorstehender. Stufen wird nachstehend beschrieben. Diese auf- £■"zeigte ¥e.rfahrensv.feisF! umfa3t bevorzugte Methoden, jedoch sind
sn-'.erc Verfahrensweisen zur Durchführung der erforderlichen Reak—
cio.'isstufer: für den if'achraann ersichtlich und fallen in den Rahmen
der vorliegenden Erfindung.
Die vollgeschützte lineare Aminosäurensequenz kann von dem Polystyrolharzträger
durch Behandeln mit 97 %-igem Hydrazin entfernt werden. Diese Behandlung führt zu einem linearen Undecapeptid der
folgenden Struktur:
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BAD ORIGINAL^
BAD ORIGINAL^
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a1NK(CH2)nC0-L-Lys(R2)-L-Asn-L-Phe-L-P>le-(T)-L·-L7s(R2)-L-Thr(R3)-
L-Phe-L-Thr-(R5)-L-Ser(R5)-NH-KHp
2)n
Λ ? "5
worin R , R", R , η und T wie vorstehend definiert sind. Falls die Gruppe R t-3oc ist, kann sie als nächste durch Behandeln mit beispielsweise wasserfreier Trifluoressigsäure abgespalten v/erden, worauf man die intramolekulare Cyclisierung durchführt. Andererseits kann die Gruppe R', falls die t-Boc darstellt, von der auf dem Harzträger befindlichen linearen Sequenz vor der Hydrazinolyse beispielsweise durch Behandeln mit wasserfreier Trifluoressigsaure abgespalten werden. Das freie ω-Aminoundecapeptidhydrazid wird mit beispielsweise t-Butylnitrit in essigsaurem Medium während etwa 30 Minuten bei^-25°C behandelt. Zu diesem Zeitpunkt aei.fit eine negative Reaktion gegenüber Tollens-Reagenn die Abwesenheit von Hydrazin. Die Mischung wird anschließend auf etwa 30 bin zt0-mal das Volumen mit einem gegenüber der Reaktion inerten lösungsmittel, wie Dimethylformamid, bei etwa -PO0C verdünnt, der pH-V/ert wird beispielsweise mit Liisoprop7/läthylamir auf etwa 8 eingestellt und man halt etwa 3 bis etwa 5 Tage bei C C. Die große Verdünnung begünstigt die intramolekulare Cyclisierung. AnscLliiS-ser.-.I verdampft man das Lösungsmittel und der Rückstand kann beispielsweise durch Zusatz von 1 % Essigsäure und Stehen bei O0C über "Macht ausgefällt werden. Dann wird das Produkt durch Behandeln mit beispielsweise wasserfreiem Fluorwasserstoff und Anisol bei O0C während etwa 1 Stunde völlig entblockiert, d.h. die Gruppen R'" und R^ werden entfernt. Nach Entfernen des Fluorwasserstoffs kann der Rückstand in üblicher Weise, beispielsweise durch Triturieren, und anschließende Chromatographie gereinigt werden.
worin R , R", R , η und T wie vorstehend definiert sind. Falls die Gruppe R t-3oc ist, kann sie als nächste durch Behandeln mit beispielsweise wasserfreier Trifluoressigsäure abgespalten v/erden, worauf man die intramolekulare Cyclisierung durchführt. Andererseits kann die Gruppe R', falls die t-Boc darstellt, von der auf dem Harzträger befindlichen linearen Sequenz vor der Hydrazinolyse beispielsweise durch Behandeln mit wasserfreier Trifluoressigsaure abgespalten werden. Das freie ω-Aminoundecapeptidhydrazid wird mit beispielsweise t-Butylnitrit in essigsaurem Medium während etwa 30 Minuten bei^-25°C behandelt. Zu diesem Zeitpunkt aei.fit eine negative Reaktion gegenüber Tollens-Reagenn die Abwesenheit von Hydrazin. Die Mischung wird anschließend auf etwa 30 bin zt0-mal das Volumen mit einem gegenüber der Reaktion inerten lösungsmittel, wie Dimethylformamid, bei etwa -PO0C verdünnt, der pH-V/ert wird beispielsweise mit Liisoprop7/läthylamir auf etwa 8 eingestellt und man halt etwa 3 bis etwa 5 Tage bei C C. Die große Verdünnung begünstigt die intramolekulare Cyclisierung. AnscLliiS-ser.-.I verdampft man das Lösungsmittel und der Rückstand kann beispielsweise durch Zusatz von 1 % Essigsäure und Stehen bei O0C über "Macht ausgefällt werden. Dann wird das Produkt durch Behandeln mit beispielsweise wasserfreiem Fluorwasserstoff und Anisol bei O0C während etwa 1 Stunde völlig entblockiert, d.h. die Gruppen R'" und R^ werden entfernt. Nach Entfernen des Fluorwasserstoffs kann der Rückstand in üblicher Weise, beispielsweise durch Triturieren, und anschließende Chromatographie gereinigt werden.
Die pharmakologische Wirksamkeit der cyclischen Undecapeptide gemäß
der Erfindung in vivo wurde folgendermaßen bestimmt. Zur vereinfachten Wiedergabe der Untersuchungsergebnisse wird die cyclische
Verbindung (7-Aminoheptanoyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl)
als Verbindung A bezeichnet und die cyclische Verbindung 7-Aminoheptanoyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-
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-Al'
phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl
v.rird als Verbindung B bezeichnet.
Untersuchungsverfahren 1
■p
An gesättigte männliche Ratten vom Charles River Stamm CD wird eine subkutane Injektion (se) des in physiologischer Salzlösung
löslich gemachten oder suspendierten Peptids verabreicht. Eine entsprechende Kontrollsalzlösung wird se an Batten injiziert, die
als Kontrolltiere dienen, so daß auf jede untersuchte Ratte eine
Kontrollratte trifft. Die Ratten werden in getrennten Käfigen
gehalten und 20 Minuten vor Beendigung der Untersuchungsperiode
verabreicht man ihnen eine intraperitoneale Injektion (ip) von Nf.-ir.outal l in einer Dosis von 50 mg/kg. Man entnimmt Blutproben
durch cardiale Punktierung und trennt das Plasma für aie Radioiir„ru.nountersuchung
der Konzentration (ng/ml) des Wachstumshormons
(GrI) ab. Die Perioden von 1, 2 oder 4 Stunden nach der Injektion verwendest man allgemein zur Untersuchung der Wirkungsdauer des
Fotids bei der Unterdrückung zirkulierender peripherer GH-Gehalte,
Die Vergleiche zwischen Kontrollwerten und experimentellen GH-V/erten
-,/erden zu jedem Zeitpunkt durch den Studenten-Test "t"
bewertet und der statistische Wert (p) beim Gehalt von 0,05 oder darunter wird als Index für die Wirksamkeit verwendet.
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Verbindung (Dosis) 1 Std. (Anzahl der 2 Std. (Anzahl der 4 Std. (Anzahl der
4 Ratten) m Ratten) , Ratten)
A (1 mg/kg) 95 ± 47 (7) ^ ' 80 ± 12 (9)
Kontrolle 370 ± 103 (10) · 270 ± SO (10)
ρ = 0.05 P = 0.05
B (2 mg/kg) 13 ± 1.7 (10) 15 ± 2.8 (10)
Kentrolle 301 ± 73 (10) 103 ± 31 (9)
cn p^ <0.001 P = <0.01
S B (1 mg/kg) - 44 ± 12 (8) ^ 46 ± 6 (10)
Kontrolle ' r- 233 ± 42 (10) ' 90 ±15 (9)
ρ = <0.001 ρ = 0.02
B (0.25 mg/kg) - 108 ± 18 (9) 84 ± 17 (9)
Kontrolle — 159 J= 3S (9) 156 ± 43 (8)
ρ = >0.05· . P= >0-05
•CD OO
H/17263 - >g -
Untersuchungsverfahren ?
I^ännliclae Albinoratten werden in 3 Gruppen (9 Ratten pro Gruppe)
aufgeteilt und mit ip-In^jektionen von ITembutal in Dosierungen
von 50 ^g/kg versehen. 15 Minuten nach der Nembutal-Injektion*
werden subkutan an die Gruppe (a) die Testverbindung,typischerweise
500 bis 2000yug/kg; (b) SRIF 200/ug/kg oder (c) physiologische
Salzlösung injiziert. 10 Kinuten später werden 0,5 ml
Arginin (300 mg/ml, pH 7,2) in das Herz injiziert. Die Ratten werden 5 Minuten nach der Arginininjektion geköpft und das Blut
wird in Trasylol-EDTA gesammelt. Entsprechende gleiche Teile werden
anschließend auf das Wachstumshormon, auf Glucagon und Insulin
untersucht. Als aktiv wird eine Verbindung bezeichnet, die den Gehalt eines dieser Hormone in Plasma von dem in den SaIzkontrollösungen
wesentlich ändert. Die Vergleiche zwischen den Kcntrollwerten und experimentellen Werten werden statistisch durch
Analyse der Variationsmethode bewertet und die statistische Bedeutung
(p) bei 0,05 oder darunter wird als Index für die Aktivität verwendet.
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Verbindung (Dosis) ^£_(^_/^l) Insulin (/U Kinheiten/ml) Glucagon (pp;/ml)
A (3.35 mg/kg) 31 ± 6 , 157 ± 8 Kontrolle 149 ± 23 181 ± 6
ρ = <0.05
Jg A (1 mg/kg) 38 ± 11 127 ± 10
m Kontrolle 191 ± 38 141 ± 6
ρ = >0.05
^1 A (0.2 mg/kg) 57 ± 12 152 ± 15
SRIF (0.2 mg/kg) 65 ± 16 111 ± IO
Kontrolle 287 ± 53 151 ± 15
ρ = <0.05
A (0.05 mg/kg) 55 10 -- ~ ^3
CD SRIF (0.05 mg/kg) 47 8 — ~~ cn
cn Kontrolle 170 49 . — — OO
ρ = <0.05 CD
31 | ± | = | ± | = | U. | 6 |
149 | X | Ii- | ± | 23 | ||
P | ± | <0.01 | ||||
38 | 11 | |||||
191 | 38 | |||||
P | <0.01 | |||||
57 | 12 | |||||
65 | 16 | |||||
287 | 53 | |||||
P | <0.01 | |||||
55 | 10 | |||||
47 | 8 | |||||
170 | 49 |
3.0 | ± 0.7 | I 1 ν ^ |
6.4 | ± 1.3 | tn , |
P = | <0.05 | |
57 96 |
± 13 ± 15 |
|
ρ - | <0.05 | |
32 | ± 5 | |
12 | ± 3 | |
20 | i 1 | |
P = | <0.05 | |
Verbindung (!Dosis)
GH (ng/ml)
] in ( /u Einheiten/ml)
B (3.0 mg/kg.) | 92 | ± | 9 | 74 ± | 13 | |
Kontrolle | 1009 | ± | 298 . | 280 ± | 37 | |
P | <0.01 | ρ = | <O.O1 | |||
7098 | 1 B (30 με Ag.) SRIF (20 μ2Ag.) |
180 232 |
db ± |
49 87 |
||
cn | Kontrolle | 619 | 103 | |||
/1085 | B (2 με Ag.) | P 211 |
± | <0.01 18 |
||
SRIF (IO με/kg.) | 241 | 15 | ||||
Kontrolle | 543 | ± | 86 | |||
P | = | <0.01 | ||||
B (200 με Ag.) | 66 ± | 6 | ||||
SRIF. (200 με/kg.) | --— | 117 ± | 12 |
Kontrolle
± 12
ρ = <0.01
ρ = <0.01
Gliicagon ( ρ p/ml)
± 5
± 4
± 8
ρ = <0.01
± 8
ρ = <0.01
H/17265 -Ve-
'/Cf'
Die vorstehenden Testergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen cyclischen Undecapeptide nützlich zur Unterdrückung der
Sekretion von Somatotropin, Insulin und Glucagon bei Haustieren und zur Steuerung des iimsunoreaktiven Hypophysen-Wachstumshormons
in der vergleichenden und experimentellen Pharmakologie sind. Durch die bekannte Beziehung zwischen der Steuerung des Wachstumshormons
bei Standardtierexperimenten und beim Menschen charakterisiert die demonstrierte pharmakologische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen
cyclischen Undecapeptide diese Verbindungen als nützlich zur Behandlung von Akromegalie und Jugenddiabetes in
gleicher V/eise wie das Somatostatin selbst. Die Verabreichung der cyclischen Undecapeptide kann auf üblichem Wege, wie beim
Somatostatin und bei verwandten Polypeptiden unter Aufsicht eines Arztes in einer Menge erfolgen, die vom Ausmaß der vom Arzt bestimmten
Disfunktion abhängt. Die Verbindungen können allein oder zusammen mit üblichen pharmazeutisch brauchbaren Trägern oder Adjuvantien
bzw. Zusätzen in Dosiseinheitsformen verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.
t-Butyloxycarbonyl-N -(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-'fcryptophyl-N"-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-serin-Harz
I und t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-serin-Harz
II. II wird als Zwischenprodukt bei der Herstellung von I erhalten.
4-00 g chlormethyliertes. Polystyrolharz wurden mit 4-50 mliol des
Cäsiumsalzes von t-Boc-O-benzyl-serin nach der Methode von B.F.
Gisin, HeIv. Chem. Acta, 56, 14-76 (1973) unter Bildung von t-Boc-0-benzyl-serin-Harz
mit einer Substitution von 0,63 mKol/g Harz
verestert. 4-70 g des Harzes wurden anschließend in folgender Weise
behandelt:
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1. Methanolwäsche (2 χ).
2. Methylenchloridwäsche (3 x)·
3· 5 Minuten Vorwäsche mit 30 % Trifluoressigsäure-Methylenchlorid
(Vol/Vol) enthaltend 5 % Äthandithiol.
4. 30 % Trifluoressigsäure-Methylenchlorid (Vol/Vol) enthaltend
5 % Äthandithiol (2 x) während jeweils 15 Minuten.
5. Methylenchloridwäsche (2 x).
6. Dimethylforniamidwäsehe.
7· 15 % Triäthylamin in Dimethylformamid (2 x) jeweils 10 Minuten.
8. Dimethylformamidwäsche.
9- Methylenchloridwäsche.
10. Methanolwäsche (2 x).
11. Methylenchloridwäsche (2 x).
Falls nicht anders angegeben, wurde bei jeder Wäsche eine Kontaktzeit
von 5 Minuten eingehalten.
Das Harz wurde sanft mit 14-6 g (0,-4-3 Mol) t-Boc-O-benzyl-L-threonin
in 1:1 Bimethylformamid-Methylenchloridlösung und 1 m-Dicyclohexylcarbodiioid
(DCG) in 4-70 ml Methylenchlorid über Nacht gerührt.
Das Harz wurde nacheinander mit Dimethylformamid (2 χ), Methanol (2 x) und Methylenchlorid (2 x) gewaschen. Zur Untersuchung
der vollständigen Reaktion wurde das Peptidharz einem Rinhydrin-Färbte
st gemäß E. Kaiser et al., Analytical Chemistry, 5*1,
595 (197O) unterzogen und als schwach positiv befunden. Die Kopplungsstufe
wurde unter Anwendung von 4-3,S g (0,14- Mol in 1:1 Dimethylfomamid-Methylenchlorid,
70 ml, 1 m-DCC) t-Boc-O-benzyl-L-threonin
wiederholt. Nach dem Rühren über Nacht und Durchführung der vorstehenden Waschfolge war die Reaktion mit Ninhydrin noch
leicht positiv, so daß eine weitere Kopplung mit 4-3,8 g (0,14- Mol
in Dimethylformamid enthaltend 21,9 g, 0,14- Mol, 1-Hydroxybenzotriasol,
14-3 ml Im-DCC) t-Soc-O-benzyl-L-threonin durchgeführt
wurde. Nach dem Rühren über Nacht und Waschen der Sequenz, war die
Ninhydrinreaktion negativ und zeigte eine vollständige Kopplung
an. Die Entfernung der t-Boc-ot-amino-Schutzgruppe wurde wie in
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den vorstellenden Stufen (3) bis (I") beschrieben durchgeführt.
Anschließend wurden folgende Aininosäurereste nacheinander eingebracht.
(Für jede Aminosäure wurde, falls nicht anders angegeben,
eine Kopplungszeit von 18 Stunden angewendet. Zwischen jede Kopplung aufeinanderfolgender Aminosäuren wurden sowohl das '.vaschsciiema
als auch die Entblockierungsfolge (3) bis (11) angewendet,
die für das t-3oc-0-benzyl-se.rin-Harz beschrieben wurden). 187 Γ-(0,7
m?!ol) t-Eoc-L-phenylalanin in Dimethylformamid, das 107,9 β
(0,705 Mol, 705 ml, 1 Hi-I)CC) 1-Eydroxybenzotriazcl enthielt. Ein
Anteil von 43,4 g Peptidharz wurde entfernt und die Synthese durch Zusatz von t-Boc-O-benzyl-L—threonin (14p,3 S, 0,47 KoI in Dimethylformamid
enthaltend 71,9 g, 0,47 Mol 1-Hydroxybenzotriazol,
47Ο ml 1 Li-DCC), t-Boc-K'-(2-chlorbenzyloxycarbon7/-l)-L-lysin
(194,8 g, 0,47 Mol in Dimethylformamid, enthaltend 35 S, 0,23 KoI 1-Hydroxybenzotriazol, 470 ml, 1 m-DCC), t-3oc-L-tryptophan
(142,9 g, C,47 Mol in Dimethylformamid, 470 ml, 1 m-DCC) fortgeführt. In dieser Stufe erfolgte eine unvollständige Kopplung, so ÖS.S nach der Waschfolge erneut mit "ü-Boc-L—tryptophan unrer Anwendung von 72 g (0,237 Mol) Aminosäure in 235 ml Dimethylformamid, das :'-o g 1-Hydroxybenzotriazol (0,237 Mol) (1 m-ECC) enthielt,
gekoppelt wurde. 40 g des Feptidharzes wurden entfernt und die
Syr, the se mit t-Boc-phenyl alanin (124,6 g, 0,46 Mol in Dimethylfor7r:amid, enthaltend 71,9 S, 0,47 Mol 1-Hydroxybenzotriazol,
470 ml, 1 m-DCC) fortgesetzt. 43,3 S Peptidharz wurden entfernt und die Synthese durch Zusatz von t-Boc-L-asparagin-p-nitrophenylestor (199*1 g- 0,56 KoI in Dimethylformamid, enthaltend 1 %
Eisessig) fortgesetzt. Diese Stufe vrurde während einer Reaktionszeit von 4 Tagen durchgeführt. 52,4- g Peptidharz wurden entfernt und die Synthese durch Zusatz von t-Boc-N -(2-chlorbenzylcxycarbonyl)-L-lysin (165,8 g, 0,4 Mol in Dimethylformamid, βητ-haltend 61,2 g, 0,4 Mol, 1-Hydroxybenzotriazol, 400 ml, 1 m-DCC) fortgesetzt. Das getrocknete und gewaschene Harz wog 568,1 g.
(194,8 g, 0,47 Mol in Dimethylformamid, enthaltend 35 S, 0,23 KoI 1-Hydroxybenzotriazol, 470 ml, 1 m-DCC), t-3oc-L-tryptophan
(142,9 g, C,47 Mol in Dimethylformamid, 470 ml, 1 m-DCC) fortgeführt. In dieser Stufe erfolgte eine unvollständige Kopplung, so ÖS.S nach der Waschfolge erneut mit "ü-Boc-L—tryptophan unrer Anwendung von 72 g (0,237 Mol) Aminosäure in 235 ml Dimethylformamid, das :'-o g 1-Hydroxybenzotriazol (0,237 Mol) (1 m-ECC) enthielt,
gekoppelt wurde. 40 g des Feptidharzes wurden entfernt und die
Syr, the se mit t-Boc-phenyl alanin (124,6 g, 0,46 Mol in Dimethylfor7r:amid, enthaltend 71,9 S, 0,47 Mol 1-Hydroxybenzotriazol,
470 ml, 1 m-DCC) fortgesetzt. 43,3 S Peptidharz wurden entfernt und die Synthese durch Zusatz von t-Boc-L-asparagin-p-nitrophenylestor (199*1 g- 0,56 KoI in Dimethylformamid, enthaltend 1 %
Eisessig) fortgesetzt. Diese Stufe vrurde während einer Reaktionszeit von 4 Tagen durchgeführt. 52,4- g Peptidharz wurden entfernt und die Synthese durch Zusatz von t-Boc-N -(2-chlorbenzylcxycarbonyl)-L-lysin (165,8 g, 0,4 Mol in Dimethylformamid, βητ-haltend 61,2 g, 0,4 Mol, 1-Hydroxybenzotriazol, 400 ml, 1 m-DCC) fortgesetzt. Das getrocknete und gewaschene Harz wog 568,1 g.
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-W-
Beispiel 2 7-t-Butyloxycarbonylaminoheptansäure
20 g (1,38 χ 10 KoI) 7-Aminoheptansäure wurden unter Anwendung
des Verfahrens von Ulf Ragnarrson et al·., Org. Syn., 53, 25 (1973)
unter "Verwendung von 17,3 g (1,49 x 10" Mol) Tetramethylguanidin
— Λ
und JO g (1,5^ x 10 ' Mol) t-Butylphenylcarbonat in 100 ml Dimethylsulfoxid während 3 Tagen in die TiteVerbindung umgewandelt.
und JO g (1,5^ x 10 ' Mol) t-Butylphenylcarbonat in 100 ml Dimethylsulfoxid während 3 Tagen in die TiteVerbindung umgewandelt.
Das Produkt (24 g) wies nach Umkristallisieren aus Äthylacetat-Hexan-Äther
einen Schmelzpunkt von 56-58° auf.
Analyse für C^EL-^NO^:
ber.: C 58,75, H 9,4-5, H 5,71
gef.: C 59,14, H 9,61, K 5,86.
7-t~Butyloxycarbonylamino3ieptanoyl-3!ii"-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-ly·Γ!yl-I'-asparaginyl-L·-phenylalanyl·-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-
:; '-(2-clilorben^7/"loxycarbönyl)-L-lysyi-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-serin-Harz
<5 g d.es Peptidharzes I von Beispiel 1 wurden nach dem Schema (3)
bis (11) des Beispiels 1 behandeit und das entb^ckierte Harz wurde
mit 7 t-Butyloxycarbonylaminoheptansauife (30 mMol in 1:1 Dimethylformamid-
Methylenchlorid) und 60 ml einer 0,5 m-Lösung von Diisopropylcarbodiimid
(DIC) in Methylenchlorid gerührt.
Das Harz wurde mit Methylenchlorid (2 x), Dimethylformamid (3 x),
und Methylenchlorid (2 x) gewaschen, wobei man das Titelharz erhielt.
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7-t-Butyloxycarbonyl-N· -(2-ch.lorbe-nzyloxycarbonyl )-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-I-T
-(2-chlorbenzyloxycarbonyO-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-Q-benzyl-L-serin-Harz
Das Peptidharz II des Beispiels 1, 10 g t-Boc-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-serin-Harz,
vnarde in die Titelverbindung umgewandelt durch stufenweise Kopplung der geeigneten
Aminosäuren in 50 ml Methylenchlorid-Dimethylforsamid (1:1) irit
4-5 ml einer 0,5 m-Lösung von 30 "ml Dicyclohexylcarbodiimid. Pur
3ede Aminosäure wurde eine Kopplungszeit von 18 Stunden eingehalten.
Jeder Kopplung gingen die folgenden Deblockierungs- und Waschschemen voraus.
Entblockierungsschema
ι. Methylenchloridwäsche (3 x).
2. Vorv/äsche mit ^O % Trifluoressigsaure in Kethylenchlorid,
enthaltend 0,5 % Gew./Vol. Dithioerythrit.
3. Wäsche mit 40 % Trifluoressigsäure in Kethylenchlorid,
enthaltend 0,5 % Gew.-/Vol. Dithioerythrit (2 x) wahrend jeweils 15 Minuten.
4. Wäsche mit Methylenchlorid (2 x).
5. Dinethylformamidwäsche (2 x).
6. 15 % Triäthylamin in Dimethylformamid (2 x) während jeweils
10 Minuten.
7. IdmethylformamidwäEiche (2 x).
8. Methylenchloridwäsche (3 x)·
9. Dimethylformamidwäsche.
10. Methylenchlorid.
Jede Waschperiode wurde während 5 Minuten durchgeführt.
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(i) Methylenchlorid (2 χ), (ii) Dimethylformamid (3 χ),
(iii) Methylenchiοrid (2 χ).
Aminosäuren in der Reihenfolge der Zugabe (20 mMol).
t-Boc-O-benzyl-L-threonin (6,18 g)
t-3oc-N~-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysin (8,34- g)
t-Boc-D-tryptophan (6,1 g) t-Boc-L-phenylalanin (5,3 g)
t-3oc-L-phenylalanin (5,3 g) t-Boc-L-asparagin-uL-p-nitrophenylester (7,1 g),
es wurde kein DIC für diese Kopplung verwendet, die in Dimethylformamid,enthaltend 1 % Essigsäure durchgeführt
wurde.
t-Boc-N"'-(2-chlorben2yloxycarbonyl)-L-lysin (8,3^- g)
7-t-Boc-aminoheptansäure (4,9 g).
7-t-Butyloxycarbonylaninoheptanoyl-li" -(2-chlorbenzyloxycarbcrj.yl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-27'
-C 2-chlorbenzyloxycarbonyl )-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylaianyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L—seryl-hydrazid
15 S des Peptidharzes von Beispiel 3, suspendiert in 100 ml trockenem
Dimethylformamid, wurden in 10 ml 97 %-igen Hydrazin während ? Tagen bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Harz wurde
filtriert und sorgfältig mit Dimethylformamid gewaschen. Die vereinten Filtrate und Vaschlösunrren wuraen unter verringertem Druck
bei Temperaturen von nicht über 30° konzentriert. Der Rückstand wurde mit 100 ml Methanol trituriert und filtriert. Die feste Ausfällung
wurde eine Stunde mit Methanol gerührt und erneut filtriert. Die Ausfällung wurde im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet
und ergab 5,8 g Hydrazid.
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7-t-Butyloxycarbonylaminohepta::o7'-l-N -(P-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopliyl-N
-^-chlorbenzyloxycarbonyl^L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-hydrazid
Das gesamte Peptiaharz des Beispiels 4 wurde mit Dimethylformamid
gewaschen und anschließend in 100 ml trockenem Dimethylformamid suspendiert und mit 10 ml 97 %-igem Hydrazin 2 Tage bei Raumtemperatur
unter Stickstoff gerührt. Das Harz wurde filtriert und sorgfältig mit Dimethylformamid -gewaschen. Die vereinten Filtrate
und V/aschlösungen wurden unter verringertem Druck bei Temperaturen
von nicht über JO0 konzentriert. Dc-r Rückstand wurde mit Methanol
trituriert und filtriert. Die feste Ausfällung wurde mit Methanol eine Stunde gerührt und erneut filtriert. Der Rückstand wurde im
Vakuu/n über Phosphorpentoxid getrocknet und ergab 4,9 g rohes Hydrazid.
Cyclisches (7—^Aainoheptanoyl-K" -(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-N'''-(2-chloit>enzyloxycarbonyl)-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-0-benzyl-L-seryl)
Das getrocknete rohe Hydrazid des Beispiels 5 wurde in 60 ml wasserfreier
Trifluoressigsäure, 40 ml Methylenchlorid und 5 ml Anisol
suspendiert und mit 0,5 S Dithioerythrit während 15 Minuten
bei 0° and anschließend während 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Die klare Lösung wurde zu einem Öl verdampft, das beim Triturieren
mit großen Volumina an Äther 5?56 g eines flockenartigen
Feststoffs ergab, der im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet vurde.
5,5 g (2,4 mMol) des vorstehenden Feststoffs wurden in 60 ml
Dimethylformamid bei Raumtemperatur gelöst, auf -30° gekühlt und mit 12,2 ml (9,27 Mol) 0,76 η-Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran
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behandelt und anschließend mit 0,36 ml (3i1 mMol) t-Butylnitrit
versetzt. Die Lösung ergab eine negative Reaktion mit ammoniakalischem
Silbernitrat (Tollen's Reagens) nach JO Minuten im Temperaturbereich
von -20-50 , vodurch die Abwesenheit von Hydrazin angezeigt wurde. Die Reaktionsmischung wurde in einen, 2 1 wasserfreies Dimethylformamid enthaltenden Kolben bei -20° gefügt und
der pH-Wert wurde mit Diisopropyläthylamin auf 8 eingestellt. Die
Reaktionsnischung wurde drei ?age bei 0J gelagert und anschliessend
unter verringertem Druck auf ein geringes Volumen verdampft. Dor Rückstand wurde in 500 ml 1 %-ige Essigsäure gegossen, bei
0° über Nacht stehengelassen und filtriert. Der Feststoff wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man 4., 7 g
der T'itelverbindung erhielt.
Cyclisches (7-Aminoheptanoyl-N -(2-cnlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-Nr-(?-
chlorbenzyloxycarbonyl^L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl
4,9 s cos rohen Hydrazids von Beispiel 6 wurden in einer Mischung
von ^00 ml wasserfreier Trifluoressigsäure und 5 ml Anisol, dao
0,5 g Dithioerythrit enthielt, während 10 Minuten bei 0° und anschließend während 50 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die iclare
Lösung wurde zu einem öl verdampft, das" beim Triturieren mit grossen
Volumina an Äther 4,8 g eines Feststoffs nach Trocknung im Vakuum über Phosphorpentoxid ergab.
4-,8 g (2,1 mMol) des vorstehenden Feststoffs, gelöst in 50 ml
Dimethylformamid bei Raumtemperatur, wurden auf -30° gekühlt und mit 2 nl (8 mMol) 4 η-Chlorwasserstoff in Dioxan und anschließend
mit 0,31 ml (2,68 mMol) t-3utylnitrit versetzt. Die Lösung ergab mit ammoniakalischem Silbernitrat (Tollen's Reagens) eine negative
Reaktion nach 30 Minuten im Temperaturbereich von -20 bis -30°,
was die Abwesenheit von Hydrazin anzeigte. Die Reaktionsmischung wurde in einen, 2 1 wasserfreies' Dimethylformamid enthaltenden
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Kolben bei -20° überführt und der pH-Wert mit Diisopropyläthylaiain
auf 8 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde 4 1/2 Tage
bei 0° gelagert und anschließend bei Temperaturen <f 35° im Vakuum
verdampft. Der Rückstand wurde in 500 ml 1 %-ige Essigsäure gegossen
und der Feststoff durch Filtration gewonnen. Nach dem Waschen mit Wasser und Trocknen im Vakuum über Phosphorpentoxid erhielt
man 4,2 g Produkt.
Cyclisches (7-Aininoheptanoyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-Ij-seryl)
4,6 g cyclisches (7-Aminopentanoyl-N"-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-N>-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-l3'"syl-ö-benzyl-L-threonyl-L-phenyl
alanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl wurden im Vakuum mit
IGO al wasserfreiem Fluorwasserstoff und 30 ml Anisol eine Stunde
bei 0° behandelt. Der Fluorwasserstoff wurde unter verringertem
brück entfernt und der Rückstand sorgfältig mit Äther
und anschließend mit 100 ml entgaster ?C %-iger Essigsäure exti'ariioi't.
Die klare Fraktion wurde mi c Wasser verdünnt und lyophylisiert, wobei man 3<15 g der rohen Titelverbindung erhielt.
'Reinigung
3,1 g des rohen, von Schutzgruppen befreiten Peptide in 20 %
Essigsäure wurden auf eine Sephadex G 25 (fein)-Kolonne von
200 χ 2,5 cm in 20 % Essigsäure aufgetragen. Es wurden 180 Fraktionen
von jeweils 5»& ml gewonnen. Der Abstrom der Kolonne wurde
bei 254 m/u mit einem analytischen UV-DeLektor (Modell Altex 153)
unter Anwendung einer präparativen Altexfließzelle und einem
Allesschreiber-AufZeichnungsgerät überwacht. Es wurden vier Hauptfraktionen
entnommen A (82-94) 26? mg; B (99-107) 883 mg;.C (111-V9)
97Ο mg; D (120-136) 700 mg. Die Fraktion D (120-136) wurde
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zur weiteren Reinigung durch DünnschichtChromatographie, zur
Aminosäureanalyse und posiriven Tryptophanreaktion mit Ehrlich-Reagens
gewählt. Der erneute Auftrag auf die gleiche Säule ergab
einen einzigen Peak der Fraktionen "'"6-127 (jeweils 5,6 rnl),
'1-9"I mg (70 % Gewinnung). Die vreiterc· Reinigung erfolgte an einer
15Ο χ ?,5 era Trennsäule von Scphudex G 25 (fein), hergestellt im
Gleichgewicht mit der unteren Phase und anschließend der oberen Phase des Lösungsmittel 373 tens n-3-atanol: Essigsäure:Wasser 4:1:5.
Ler Abstrom der Kontrolle, der wie vorstehend überwacht wurde, führte in den Fraktionen 1VB-G* zu einem homogenen Material. Die
Fraktionen wurden gewonnen, verdampft und aus 10 %-iger Essigsäure
lyophylisiert. Der Feststoff wurde in 1 yti-iger Essigsaure
R
gelöst, durch ein 0,3/um Nillipore Filter filtriert und lyophylisiert, wobei man 250 mg Produkt vom M/^ -27,5 c, 1,^8 1 % Essigsäure erhielt.
gelöst, durch ein 0,3/um Nillipore Filter filtriert und lyophylisiert, wobei man 250 mg Produkt vom M/^ -27,5 c, 1,^8 1 % Essigsäure erhielt.
Die Ami no säure analyse einer 18 Stunden bei 110 in einem evakuierten
verschlossenen Rohr, das A n-ilethansulfonsäure und 0,2 %
3-(2-iuninoäthyl)-indol enrhielt, hydrolysieren Probe ergab:
Asp (1,0), Ihr* (1,88), Ser (0.9*0, ?-e (2,97), 7-NH2(CH2)6-C0^H
("-,O), Lys (2,03), HH3 (0,79), 'Trp (0,95).
Bei der erschöpfenden Sansylierung der freien Aminogruppen und der anschließenden Aminosäurehydrolyse -unter Beding^angen, die zu
einem völligen Verlust des Lysins führten, wurde kein Verlust an ■7-Aminoheptansäure, bezogen auf Phenylalanin, festgestellt.
Dünnschi chtchromatographie | T | 0,6 | II | III |
Rf-Verte | Siliciumdioxidgel 0,3 | 0,77 | 0,54 | |
Cellulose | 0,88 | 0,60 | ||
Die Rf-Werte wurden auf 5 χ 20 cm-Brinkmann-SiO2-Gel 60 F-254-
und auf 5 x 20 cm Avicel Analtech-Platten bestimmt. Die Flecken
wurden durch Jod und Ehrlich-Reagens sichtbar gemacht.
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BADiORlGlNAt, ,
'XV '
Lösungsmittelsysteme
I Bu tanol: Essigsäure: V/asser (4: 1:5)
II Äthylacetat:Butancl:Essigsäure:Wasser (1:1:1:1)
III Isoamylalkohol:Pyridin: V/asser (7:7 = 6)
Cyclisches (7-Aminoheptanoyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-tiireonyl-L—seryl)
"+i3 g cyclisches (7-Aminoheptanoyl-I\T"-(2-chlorbenz7/ rloxj'-carbonyl)-L-lysyl-L-aGparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopayliT"'--(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-plienylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl)
wurden im Vakuum mit 100 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff und 30 ml Anisol eine Stunde
bei 0 behandelt. Fluorwasserstoff wurde unter verringertem Druck
entfernt und der Rückstand sorgfältig mit Äther trituriert, worauf
mit 100 ml entgaster 20 %-iger Essigsäure extrahiert wurde. Die ε?«ure Fraktion wurde mit Wasser verdünnt und lyophilisiert, wobei
m^n 2,55 g der.Titelverbindung erhielt.
Reinigung
2,50 g des rohen, von Schutζgruppen befreiten Peptids in 20 %-iger
iGsigsäuro wurden auf eine 200 χ 2,5 cm^ Säule von Sephadex G-25
(fein) in 20 %-iger Essigsäure aufgetragen. 18C Fraktionen von ,je-.veils
5·.6 ml wurden gesammelt. Der Abstrom der Säule wurde wie in
:?>- ir.piel 9 beschrieben überwacht. Positive Tryptophanfraktionen
wTjrden gesammelt und lyophilisiert, wobei man 1,0 g Peptid erhielt,
das erneut auf die Säule aufgetragen wurde. Die Fraktionen 129 bis 148 (295 mg) wurden durch Dünnschichtchromatographie und Aminosäurenanalyse
für die weitere Reinigung selektiert. Die Fraktionen 129-1^8 wurden erneut auf eine 150 x 2,5 cm Trennsäule von Sephadex
G-25 (fein) aufgetragen, die durch Equilibrieren mit der unteren Phase und anschließend der oberen Phase des Lösungsmittelsystems
n-Butanol:Essigsäure:Wasser - 4:1:5 hergestellt wurde. Der
709826/ 1 085
K/17263
Säulenabstrom wurde wie vorstehend überwacht und ergab ein homogenes
Material in den Fraktionen 7^ bis °A· Die Fraktionen wurden
gewonnen, verdampft und der Rückstand aus 10 %-iger Essigsäure lyophilisiert. Der Rückstand wurde in 1 %-iger Essigsäure durch
ein 0,3 /um Millipore -Filter filtriert und lyophilisiert, wobei
man 120 mg Produkt vom MZ^ - 31,5°, c = 1,11 % Essigsäure,
erhielt.
Die Aminosäureanalyse einer 18 Stunden bei 1100C in einem evakuierten
verschlossenen Rohr mit 4 n-Kethansulfonsäure und 0,2 % 3-(2-Aminöäthyl)-indol
hydrolysierten Probe ergab:
Asp (1,0), Thr (1,83), Ser (1,05), Hie (2,88),
Lys (1,99), NH3 (1,03), Trp (0,87).
Nach der erschöpfenden Dansylierung der freien Aminogruppen und
der anschließenden Aminosäurehydrolyse unter Bedingungen, die zu. einen völligen Verlust an Lysin führten, wurde kein Verlust an
7-Aiüinoheptansäure, bezogen auf Phenylalanin, festgestellt.
Rf-Werte
Siliciuadioxidgel Cellulose
I | II | III |
0,32 | 0,77 | 0,54 |
0„60 | 0,88 | 0,64 |
Die verwendeten Platten und Lösungsmittelsysteme I5 II und III
entsprachen denen von Beispiel 9·
709826/1085
BAD ORIGINAL
Claims (1)
- M/17263PatentansOruclie1. Undecapeptide der FormelCCH2)aR1ί7:I(CH9)T1C0-L-LysCR2)-L-Asn-L·-Phe-L-Phe-(T)-L-Lys(R2)-L-Thr(R3)-and ihre nicht toxischen Salze -corin H = Wasserstoff oder .-; ucyloxycarbonyl; E' -= ^-ChIo. .<ε .zyl oxy carbonyl; rK = Bf n-7.7/I; η = eine ganze Zahl von j5 Vas σ; T = L-Tryptophyl oder D-rryptophyl; und X = OH, 1'K-NK0, U- .niedrig)-Alkyl, 0-Senzyl oder eine Verankerungsbindung ai. e^nen festen Polystyrolharzcräfrer, dargestellt durch:Poly- ;.harzjträger |P. Undöcapeptid gemäß Anspruch 1 der FormelC-L-Lys-L-Asn-L-Fhe-L-Phe-L-TrF-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-NH709826/1085BAD ORIGINALK/17263Λ-sowie seine nickt toxischen Säureadditionssalze. J. üncecapeptid gemäß Anspruch. 1 der Formel0
G-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-KHsowie seine nicht toxischen Säureadditionssalze.4-, Verfahren zur Herstellung der Undecapeptide gemäß einen der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man an ein gegebenenfalls Chlormethylierres Earz in fesrer Phase sine Aminosäure der gewünschten Sequenz, mit geschützter Aninogruppe koppelt und nach Abspaltung der Amir.oschutzgruppe die lineax-e Aminosäuresequenz in der gewünschten Reihenfolge bildet, worauf man die lineare Sequenz p;ef;;e oar. onfall ε von ieir. Harztrager oni~ fernt und gegebenenfalls intramolekular cyciisiert.5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Aufbau der linearen Sequenz durch Bindung einer -.' -Air.ir.oalkansäure an das feste Harz beginnt.6. Verfahren gemäß Anspruch A-, dadurch gekennzeichnet, daß man den Aufbau der linearen Sequenz durch Bindung von L-Serin oder B-Tryptophan an das Kara beginnt.7· Arzneimittel, enthaltend mindestens eines der undecapeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis J und/oder seiner nicht toxischen Säureadditionssalze bzw. seiner pharmazeutisch brauchbaren Salze, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfe- und/ oder- Trägerstoffen.709826/1085 BAD ORIGINAL
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