DE2656849A1

DE2656849A1 - Neue, dem somatostatin verwandte undecapeptide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2656849A1
Application number: DE19762656849
Authority: DE
Inventors: John Patrick Yardley
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1975-12-16
Filing date: 1976-12-15
Publication date: 1977-06-30
Also published as: JPS5273889A; BE849481A; NL7613927A; US4133805A; CH616652A5; FR2335236A1; FR2335236B1

Description

Neue, dem Sonatostatin verwandte ündecapeptide, Verfahren zu ren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel

Für den cyclischen die Somatotropin-Freisetzung inhibierenden Faktor (SRIF), der als Somatostatin bekannt ist, wurde von Brazeau et al., Science, ^79, 77 (1973) folgende Struktur aufgezeigt:

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

! i

S S

Zur Synthese von Somatostatin wurden in der Literatur verschiedene Kethoden beschrieben einschlieljlich der Festphasenmethode von Rivier, J. An. Chem. Soc, 96, 2986 (197A-) und den Methoden in Lösung von Sarantakis et al., Biochemical Biophysical Research

7 Ο 1 Π 7 fi / 1 Π 8 5

Π/17263 - Z-

Communications, ^A-, 2'j,¹+ (1973) und Immer et al., HeIv. Chim. Actü, 571 730 (197^)· ^s besteht auch weiter das Bestreben, die pharrcakologische Aktivität von Somatostatin durch synthetische Kodifikation seiner Struktur zu erhöhen.

Durch die vorliegende Erfindung werden neue cyclische Analoga von Somatostatin geschaffen, worin der Tryptophylrest entweder in der stereochemischen L- oder D-Konfiguration vorliegen kann

12 3 14-
und die AIa , GIy , Cys^y und Cys -Reste durch eine υ -Aminosäure der allgemeinen Formel H^N-(CH₀), q-COOH ersetzt wurden. Der Ersatz des L-Trp-Restes in Somatostatin durch D-Trp wird von J. Rivier et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 65, 7^-6 (1975) diskutiert.

Las Konzept der vorliegenden Erfindung bildet eine Verbindung aus der Klasse von

0
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-L.ys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-NH

R'¹NH(CH₂)_nGO-L-Lys(R²)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-Lys(R²)-L-Thr(R⁵)-

L-Phe-L-Thr(R⁵)-L-Ser(R⁵)-X

und ihren nicht toxischen Salzen, worin R = Wasserstoff oder

P ⁷I

t-Butyloxycarbonyl; R^ = 2-Chlorbenzyloxycarbonyl; R^ = Benzyl; η = eine ganze Zahl von 3 bis 8; T = L-Tryptophyl oder D-Tryptophyl; und X = OH, NH-NH₂, 0-(niedrig)-Alkyl, OBenzyl oder eine Verankerungsbindung, die an ein festes Polystyrolharz, dargestellt durch die Formel

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CH,

,Poly- !

.styrol-·

-fharz- .

. träger .

gebunden ist.

Die cyclischen Ausführungsformen gemäß der Erfindung weisen folgende physikalische Eigenschaften auf: sie sind weiße bis schwach lohfarbene Feststoffe, im wesentlichen unlöslich in Chloroform, Benzol und dergleichen, sind jedoch löslich in V/asser und wässrig sauren Lösungen, wie Chlorwasserstoffsäure und Essigsäure. Diese Verbindungen zeigen keine deutlich wahrnehmbaren Schmelzpunkte und können beispielsweise auf chromatographische Weise gei-einigt v/erden. Die Hydrolyse dieser Verbindungen in beispielsweise 4- n-Methansulfonsäure ermöglicht die Bestimmung ihres Aminosäuregehaltes, der mit den vorstehend aufgezeigten Strukturen übereinstimmt.

Die cyclischen.Ausführungsformen gemäß der Erfindung sind zur Inhibierung der Freisetzung des Wachstumshormons Insulin und von Glucagon verwendbar, was durch pharmakologische Standarduntersuchungen aufgezeigt wurde.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung stellen das cyclische Undecapeptid der Formel

0
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-NH

und dessen nicht toxische Salze dar.

Einen dritten Gegenstand der Erfindung stellen das cyclische

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TJndGcapeptid der Formel

0
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-T^-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-NH

sowie dessen nicht toxische Salze dar.

Die erfindungsgemäßen cyclischen Undecapeptide, die die Sekretion des Elorzions Somatotropin inhibieren, worden durch die Formel

0
C-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-Lys-L-O}hr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-KH

r Λ7 \

cer?·; ^r-sto 11t, worin T =·· L-Tryptophyl od~;r D-Tryptophyl und η = eine ganze Zahl von 3 bis 8 und deren nicht toxische Säureadditionfjc-ilze. Beispiele für die nicht roxiecnen Sauren zur· Herstellung dieser Salze sind Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure, Benzoesäure, Fumarsäure, Citronensäure und dergleichen.

Die Erfindung betrifft auch neue Undecapeptid-Zwischenprodukte der Formel

R¹NH(CH_;))_nCO-L-Lys(R²)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-Lys(R²)-L-^lI!hr(R⁵)-

L-Phe-L-Thr(R⁵)-L-Ser(R⁵)-X

worin η = eine ganze Zahl von 3 bis 8,T= D-Tryptophyl oder L-Tryptophyl; R = Wasserstoff odar eine ^c-Aminoschutzgruppe, vor-

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-V

zugsweise vom XJr ethan typ, wie t-Butyloxycarbonyl; R = Halogenbenz;/loxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl usw. -und vorzugsweise 2-Ciilorberizyloxycarbonyl; R^ = Benzyl; X = OK, NH-NH₂, O-(niedrig)-Alkyl, OBenzyl oder eine Verankerungsbindung, die an ein festes Polystyrolharz gebunden ist, dargestellt euren

FoIy-

_n η-* st;yrol-

^{U UX1}2 _ä harzträger

Der Polystyrolharzträger kann jeder geeignete Träger sein, der für die Herstellung von Polypeptiden in fester Phase üblich ist und ist vorzugsweise ein Copolymeres von Styrol mit etwa 1 bis 2 % Divinylbensol als Que!vernetzungsmittel, wodurch das Polystyrolpolyraere in bestimmten organischen Lösungsmitteln unlöslich wird, ü' Λ-urdo vorzugsweise auch chlormethyliert, um Stellen zur Esterbildung mit der zuerst eingeführten Amino-geschützten Aminosäure zu oilden. Das Polystyrolpoiymere besteht aus langen Alkylketten, die einen Phenylring an jedem zweiten Kohlenstoffatom aufweisen uri'i cot- end ständige Aminoßäurerest ist über eine kovalente Kohienstofi-au-Sauerstoff-Bindung an den Harzträger gebunden.

Die linearen Sequenzen, aus denen die cyclischen Undecapeptide 9-errJiZ tor Erfindung hergestellt werden, werden selbst vorzugsweise nach der Festphasenmethode unter Anwendung von bekannten Tecnniken 2ua: Aufbau einer Aminosäuresequenz aus einer ursprünglich auf einem Harzträger befindlichen Aminosäure hergestellt. Eine allgemeine Darstellung dieser Technik wird von ?ierrifield J.A.G.S., 85, 2149 (1963) gegeben. Die linearen Sequenzen werden anschliessend von dem Harzträger entfernt und intramolekular zur Bildung der neuen erfindungsgemäßen cyclischen Undecapeptide cyclisiert.

Wegen der cyclischen Natur der Undecapeptidprodukte ist es unwesentlich, welche Aminosäure der Sequenz dazu ausgewählt wird, die Synthese des linearen Zwischenprodukts zu initiieren, vorausge-

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M/17263 - fr -

setzt, daß diese lineare Sequenz in der Reihenfolge aufgebaut wird, die nan bei Bewegung um den Undecapeptidring gegen den Uhrzeigersinn von der so gewählten Aminosäure vorfindet. Zur Vereinfachung wurden die erfindungsg·einäßen Undecapeptide unter Anv:." η'lung von L-Se rin als Ausgangsaminosäure aufgebaut, so daß das L-Sorin (beim Ablesen von rechts nach links) als erster Amino-ε au-να rest in der Sequenz der linearen Zwischenprodukte vorliegt. Hieraus ergibt sich, daß die ^-Aminosäure der Formel H₀N(CH₀)-, .~-

C. (L. J— O

CCCH ale letzter Aminosäurerest in der Folge der linearen Zwischenprodukte (wiederum von rechts nach links gelesen) erscheint. Eine Amid ob ir. dung, die durch Umsetzung der Carboxylgruppe des L-Serinrestec und der Aminogruppe des ;> -Aminosäurerestes hergestellt wird, schließt die Synthese ab. Für den Fachmann ist ersichtlich, daß bei if.'ahl einer anderen Aminosäure als L-Serin für den Beginn der Synthese die Sequenz der linearen Zwischenprodukte variiert, jedoch bei der Cyclisierung die gewünschte Aminosäuresequenz i_vn dem erzeugten ündecapeptidcyclus vorliegt. So benötigt man beispielsweise folgende Aminosäuresequenz beim linearen Zwischenprodukt {··'■;: rennt ε nach links gelesen) zur Herstellung der erfindung.sgemä'ien cyclischen Undecapeptide, wenn man D-Tryp-cophan zur Initiierun!·; der linearen Sequenz wählt:

L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-/NH(CH₀)₃__Q-CO7-L-Lys-L-Asn-L-Phe-

L-Phe-D-Trp

Die intramolekulare Bildung einer Amidbindung zwischen der Carboxylgruppe des endständigen D-Tryptophans und der ^,-Aminogruppe des endständigen Lysins führt zu den cyclischen Undecapeptiden gemäß der Erfindung. Sin besonderer Vorteil,der sich durch die Verwendung einer -'-Aminoalkansäure zur Initiierung der linearen Se-CjUen2., d.h. als erste an das Harz geknüpfte Aminosäure, ergibt, liegt darin, daß weder bei der Entfernung von dem Harz noch bei der Aktivierung eine Racemisierung auftritt.

709826/1085 BAD ORIGINAL

H/17263 - Sf-

In einer bevorzugten Sequenz wird die ^-Amino-ß-hydroxy-geschützte -Aminosäure t-Boc-O-benzyl-L-serin an ihrer Carboxylgruppe an das chlormethylierte Harz gemäß der Verfahrensweise von Gisin, HeIv. Chim. Acta., 56, "A^G (1973) gekoppelt. Nach der Koppelung des ^-Amino-ß-hydroxy-digeschützten L-Serins an den Harzträger wird die ^-Aminoschutzgruppe durch. Standardmethoden vorzugsweise unter Anwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, das 5 % Äthandithiol' enthälr, oder mittels Trifluoressigsäure allein oder durch HCl in Dioxan entfernt. Man führt die Entfernung der Schutzgruppe vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa O⁰C bis Raumtemperatur durch. Die verbleibenden oL-Amino-geschützten Aminosäuren werden der Reihe nach in der gewünschten Reihenfolge zu der linearen Sequenz gekoppelt, die zu dem gewünschten Produkt cyclisiert werden kann. Alternativ können mehrere Aminosäuregruppen durch die Methode in Lösung gekoppelt werden, bevor sie mit der auf dem Harzträger befindlichen Aminosäuresequenz unter 3ildung des gewünschten linearen Zwischenprodukts gekoppelt werden. Die Wahl eines geeigneten Kopplungsmittels liegt im Bereich des fachmännischen Könnens. Ein besonders geeignetes Kopplungsmittel ist das ΙΤ,ϊΤ'-Diisopropylcarbodiimid (DIC). Ein weiteres geeignetes Kopplungsmittel ist das N^N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC).

Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor in einem 2- bis 6-fachen Überschuß eingefügt una die Kopplung wird in einem Medium von Dimethylformamid:Methylenchlorid oder in Dimethylformamid oder Methylcnchiοrid allein durchgeführt. In Fällen einer unvollständigen Kopplung wird das Kopplungsverfahren vor Entfernen der -< -Aminoschutzgruppe vor dem Einbringen der nächsten Aminosäure in den I'estphasenreaktor wiederholt. Der Erfolg der Kopplungsreaktion in jeder Synthesestufe wird durch die Ninhydrinreaktion, wie von E. Kaiser et al., Analyt, Biochem., 24-, 595 (1970) beschrieben, überwacht.

Das vollgeschützte, auf dem Harzträger befindliche Undecapeptid weist vorzugsweise folgende Aminosäuresequenz auf:

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R'¹NH(CH₂)_nCO-L-Lys(R²)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-(T)-L-Lys(R²)-L-Thr-(R⁵)-

■2 ₇ ■ styrol-l

L-Hie-L-Thr(R^:>)-L-Ser(E-^;)-O-CH₂ ■■ harz- ;

. träger j

worin die Grmrpe —

I Polystyrol -

— 0 — CH₂ j harz-

I träger

den Esterrest einer der vielen funktionellen Gruppen, die in dem Polystyrolharz vorhanden sind, darstellt und die Gruppen R' ^, η und T wie vorstehend definiert sind.

I.i.«f vollr;eschützte lineare Aminosäurensequenz wird von dem PoIyr:'.yroLhar:'.crcigcr abgetrennt, nie -jTupp^ R wird entfernt und das iiaeare Peptid wird einer intramolekularen Cyclisierung unterzo- £3!;, die verbleibenden blockierencsn Gruppen (d.h. .< und R-'j .•/.".".lon entfernt und das cyclische entblockierte Undecapeptid wird bei 3DLelsweise* durch Chromatographie gereinigt. Falls gev/ünscht, Viird daß freie cyclische Undecapeptid in ein pharmalcologisch brauchbares 3aureadd.it ions salz u^igo wandelt;.

Eine besonders zwackmäßige und wirksame* Folge zur "Durchführung der vorstehender. Stufen wird nachstehend beschrieben. Diese auf- £■"zeigte ¥e.rfahrensv.^feisF! umfa3t bevorzugte Methoden, jedoch sind sn-'.erc Verfahrensweisen zur Durchführung der erforderlichen Reak— cio.'isstufer: für den if'achraann ersichtlich und fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Die vollgeschützte lineare Aminosäurensequenz kann von dem Polystyrolharzträger durch Behandeln mit 97 %-igem Hydrazin entfernt werden. Diese Behandlung führt zu einem linearen Undecapeptid der folgenden Struktur:

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BAD ORIGINAL^

M/17263 -fr-

a¹NK(CH₂)_nC0-L-Lys(R²)-L-Asn-L-Phe-L-P>le-(T)-L·-L7s(R²)-L-Thr(R³)-

L-Phe-L-Thr-(R⁵)-L-Ser(R⁵)-NH-KHp

₂)_n

Λ ? "5
worin R , R", R , η und T wie vorstehend definiert sind. Falls die Gruppe R t-3oc ist, kann sie als nächste durch Behandeln mit beispielsweise wasserfreier Trifluoressigsäure abgespalten v/erden, worauf man die intramolekulare Cyclisierung durchführt. Andererseits kann die Gruppe R', falls die t-Boc darstellt, von der auf dem Harzträger befindlichen linearen Sequenz vor der Hydrazinolyse beispielsweise durch Behandeln mit wasserfreier Trifluoressigsaure abgespalten werden. Das freie ω-Aminoundecapeptidhydrazid wird mit beispielsweise t-Butylnitrit in essigsaurem Medium während etwa 30 Minuten bei^-25°C behandelt. Zu diesem Zeitpunkt aei.fit eine negative Reaktion gegenüber Tollens-Reagenn die Abwesenheit von Hydrazin. Die Mischung wird anschließend auf etwa 30 bin ^zt0-mal das Volumen mit einem gegenüber der Reaktion inerten lösungsmittel, wie Dimethylformamid, bei etwa -PO⁰C verdünnt, der pH-V/ert wird beispielsweise mit Liisoprop7/läthylamir auf etwa 8 eingestellt und man halt etwa 3 bis etwa 5 Tage bei C C. Die große Verdünnung begünstigt die intramolekulare Cyclisierung. AnscLliiS-ser.-.I verdampft man das Lösungsmittel und der Rückstand kann beispielsweise durch Zusatz von 1 % Essigsäure und Stehen bei O⁰C über "Macht ausgefällt werden. Dann wird das Produkt durch Behandeln mit beispielsweise wasserfreiem Fluorwasserstoff und Anisol bei O⁰C während etwa 1 Stunde völlig entblockiert, d.h. die Gruppen R'" und R^ werden entfernt. Nach Entfernen des Fluorwasserstoffs kann der Rückstand in üblicher Weise, beispielsweise durch Triturieren, und anschließende Chromatographie gereinigt werden.

Die pharmakologische Wirksamkeit der cyclischen Undecapeptide gemäß der Erfindung in vivo wurde folgendermaßen bestimmt. Zur vereinfachten Wiedergabe der Untersuchungsergebnisse wird die cyclische Verbindung (7-Aminoheptanoyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl) als Verbindung A bezeichnet und die cyclische Verbindung 7-Aminoheptanoyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-

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-Al'

phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl v.^rird als Verbindung B bezeichnet.

Untersuchungsverfahren 1

■p

An gesättigte männliche Ratten vom Charles River Stamm CD wird eine subkutane Injektion (se) des in physiologischer Salzlösung löslich gemachten oder suspendierten Peptids verabreicht. Eine entsprechende Kontrollsalzlösung wird se an Batten injiziert, die als Kontrolltiere dienen, so daß auf jede untersuchte Ratte eine Kontrollratte trifft. Die Ratten werden in getrennten Käfigen gehalten und 20 Minuten vor Beendigung der Untersuchungsperiode verabreicht man ihnen eine intraperitoneale Injektion (ip) von Nf.-ir.outal ^l in einer Dosis von 50 mg/kg. Man entnimmt Blutproben durch cardiale Punktierung und trennt das Plasma für aie Radioiir„ru.nountersuchung der Konzentration (ng/ml) des Wachstumshormons (GrI) ab. Die Perioden von 1, 2 oder 4 Stunden nach der Injektion verwendest man allgemein zur Untersuchung der Wirkungsdauer des Fotids bei der Unterdrückung zirkulierender peripherer GH-Gehalte, Die Vergleiche zwischen Kontrollwerten und experimentellen GH-V/erten -,/erden zu jedem Zeitpunkt durch den Studenten-Test "t" bewertet und der statistische Wert (p) beim Gehalt von 0,05 oder darunter wird als Index für die Wirksamkeit verwendet.

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Verbindung (Dosis) 1 Std. (Anzahl der 2 Std. (Anzahl der 4 Std. (Anzahl der

₄ Ratten) _m Ratten) , Ratten)

A (1 mg/kg) 95 ± 47 (7) ^ ' 80 ± 12 (9)

Kontrolle 370 ± 103 (10) · 270 ± SO (10)

ρ = 0.05 P = 0.05

B (2 mg/kg) 13 ± 1.7 (10) 15 ± 2.8 (10)

Kentrolle 301 ± 73 (10) 103 ± 31 (9)

cn p^ <0.001 P = <0.01

S B (1 mg/kg) - 44 ± 12 (8) ^ 46 ± 6 (10)

Kontrolle ' _r- 233 ± 42 (10) ' 90 ±15 (9)

ρ = <0.001 ρ = 0.02

B (0.25 mg/kg) - 108 ± 18 (9) 84 ± 17 (9)

Kontrolle — 159 J= 3S (9) 156 ± 43 (8)

ρ = >0.05· . P= >0-05

•CD OO

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Untersuchungsverfahren ?

I^ännliclae Albinoratten werden in 3 Gruppen (9 Ratten pro Gruppe) aufgeteilt und mit ip-In^jektionen von ITembutal in Dosierungen von 50 ^g/kg versehen. 15 Minuten nach der Nembutal-Injektion* werden subkutan an die Gruppe (a) die Testverbindung,typischerweise 500 bis 2000yug/kg; (b) SRIF 200/ug/kg oder (c) physiologische Salzlösung injiziert. 10 Kinuten später werden 0,5 ml Arginin (300 mg/ml, pH 7,2) in das Herz injiziert. Die Ratten werden 5 Minuten nach der Arginininjektion geköpft und das Blut wird in Trasylol-EDTA gesammelt. Entsprechende gleiche Teile werden anschließend auf das Wachstumshormon, auf Glucagon und Insulin untersucht. Als aktiv wird eine Verbindung bezeichnet, die den Gehalt eines dieser Hormone in Plasma von dem in den SaIzkontrollösungen wesentlich ändert. Die Vergleiche zwischen den Kcntrollwerten und experimentellen Werten werden statistisch durch Analyse der Variationsmethode bewertet und die statistische Bedeutung (p) bei 0,05 oder darunter wird als Index für die Aktivität verwendet.

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Verbindung (Dosis) ^£_(^_/^l) Insulin (_/U Kinheiten/ml) Glucagon (pp;/ml)

A (3.35 mg/kg) 31 ± 6 , 157 ± 8 Kontrolle 149 ± 23 181 ± 6

ρ = <0.05

Jg A (1 mg/kg) 38 ± 11 127 ± 10

_m Kontrolle 191 ± 38 141 ± 6

ρ = >0.05

^¹ A (0.2 mg/kg) 57 ± 12 152 ± 15

SRIF (0.2 mg/kg) 65 ± 16 111 ± IO

Kontrolle 287 ± 53 151 ± 15

ρ = <0.05

A (0.05 mg/kg) 55 10 -- ~ ^₃

CD SRIF (0.05 mg/kg) 47 8 — ~~ cn

cn Kontrolle 170 49 . — — OO

ρ = <0.05 CD

31	±	=	±	=	U.	6
149	X	Ii-	±	23
P	±	<0.01
38		11
191		38
P		<0.01
57		12
65	16
287	53
P	<0.01
55	10
47	8
170	49

3.0	± 0.7	I 1 ν ^
6.4	± 1.3	tn ,
P =	<0.05
57 96	± 13 ± 15
ρ -	<0.05
32	± 5
12	± 3
20	i 1
P =	<0.05

Verbindung (!Dosis)

GH (ng/ml)

] in ( /u Einheiten/ml)

	B (3.0 mg/kg.)	92	±	9	74 ±	13
	Kontrolle	1009	±	298 .	280 ±	37
		P		<0.01	ρ =	<O.O1
7098	1 B (30 με Ag.) SRIF (20 μ₂Ag.)	180 232	db ±	49 87
cn	Kontrolle	619		103
/1085	B (2 με Ag.)	P 211	±	<0.01 18
	SRIF (IO με/kg.)	241		15
	Kontrolle	543	±	86
		P	=	<0.01
	B (200 με Ag.)				66 ±	6
	SRIF. (200 με/kg.)		--—		117 ±	12

Kontrolle

± 12
ρ = <0.01

Gliicagon ( ρ p/ml)

± 5

± 4
± 8
ρ = <0.01

H/17265 -Ve-

'/Cf'

Die vorstehenden Testergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen cyclischen Undecapeptide nützlich zur Unterdrückung der Sekretion von Somatotropin, Insulin und Glucagon bei Haustieren und zur Steuerung des iimsunoreaktiven Hypophysen-Wachstumshormons in der vergleichenden und experimentellen Pharmakologie sind. Durch die bekannte Beziehung zwischen der Steuerung des Wachstumshormons bei Standardtierexperimenten und beim Menschen charakterisiert die demonstrierte pharmakologische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen cyclischen Undecapeptide diese Verbindungen als nützlich zur Behandlung von Akromegalie und Jugenddiabetes in gleicher V/eise wie das Somatostatin selbst. Die Verabreichung der cyclischen Undecapeptide kann auf üblichem Wege, wie beim Somatostatin und bei verwandten Polypeptiden unter Aufsicht eines Arztes in einer Menge erfolgen, die vom Ausmaß der vom Arzt bestimmten Disfunktion abhängt. Die Verbindungen können allein oder zusammen mit üblichen pharmazeutisch brauchbaren Trägern oder Adjuvantien bzw. Zusätzen in Dosiseinheitsformen verabreicht werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

t-Butyloxycarbonyl-N -(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-'fcryptophyl-N"-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-serin-Harz I und t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-serin-Harz II. II wird als Zwischenprodukt bei der Herstellung von I erhalten.

4-00 g chlormethyliertes. Polystyrolharz wurden mit 4-50 mliol des Cäsiumsalzes von t-Boc-O-benzyl-serin nach der Methode von B.F. Gisin, HeIv. Chem. Acta, 56, 14-76 (1973) unter Bildung von t-Boc-0-benzyl-serin-Harz mit einer Substitution von 0,63 mKol/g Harz verestert. 4-70 g des Harzes wurden anschließend in folgender Weise behandelt:

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1. Methanolwäsche (2 χ).

2. Methylenchloridwäsche (3 x)·

3· 5 Minuten Vorwäsche mit 30 % Trifluoressigsäure-Methylenchlorid (Vol/Vol) enthaltend 5 % Äthandithiol.

4. 30 % Trifluoressigsäure-Methylenchlorid (Vol/Vol) enthaltend 5 % Äthandithiol (2 x) während jeweils 15 Minuten.

5. Methylenchloridwäsche (2 x).

6. Dimethylforniamidwäsehe.

7· 15 % Triäthylamin in Dimethylformamid (2 x) jeweils 10 Minuten.

8. Dimethylformamidwäsche.

9- Methylenchloridwäsche.

10. Methanolwäsche (2 x).

11. Methylenchloridwäsche (2 x).

Falls nicht anders angegeben, wurde bei jeder Wäsche eine Kontaktzeit von 5 Minuten eingehalten.

Das Harz wurde sanft mit 14-6 g (0,-4-3 Mol) t-Boc-O-benzyl-L-threonin in 1:1 Bimethylformamid-Methylenchloridlösung und 1 m-Dicyclohexylcarbodiioid (DCG) in 4-70 ml Methylenchlorid über Nacht gerührt. Das Harz wurde nacheinander mit Dimethylformamid (2 χ), Methanol (2 x) und Methylenchlorid (2 x) gewaschen. Zur Untersuchung der vollständigen Reaktion wurde das Peptidharz einem Rinhydrin-Färbte st gemäß E. Kaiser et al., Analytical Chemistry, 5*1, 595 (197O) unterzogen und als schwach positiv befunden. Die Kopplungsstufe wurde unter Anwendung von 4-3,S g (0,14- Mol in 1:1 Dimethylfomamid-Methylenchlorid, 70 ml, 1 m-DCC) t-Boc-O-benzyl-L-threonin wiederholt. Nach dem Rühren über Nacht und Durchführung der vorstehenden Waschfolge war die Reaktion mit Ninhydrin noch leicht positiv, so daß eine weitere Kopplung mit 4-3,8 g (0,14- Mol in Dimethylformamid enthaltend 21,9 g, 0,14- Mol, 1-Hydroxybenzotriasol, 14-3 ml Im-DCC) t-Soc-O-benzyl-L-threonin durchgeführt wurde. Nach dem Rühren über Nacht und Waschen der Sequenz, war die Ninhydrinreaktion negativ und zeigte eine vollständige Kopplung an. Die Entfernung der t-Boc-ot-amino-Schutzgruppe wurde wie in

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den vorstellenden Stufen (3) bis (I") beschrieben durchgeführt.

Anschließend wurden folgende Aininosäurereste nacheinander eingebracht. (Für jede Aminosäure wurde, falls nicht anders angegeben, eine Kopplungszeit von 18 Stunden angewendet. Zwischen jede Kopplung aufeinanderfolgender Aminosäuren wurden sowohl das '.vaschsciiema als auch die Entblockierungsfolge (3) bis (11) angewendet, die für das t-3oc-0-benzyl-se.rin-Harz beschrieben wurden). 187 Γ-(0,7 m?!ol) t-Eoc-L-phenylalanin in Dimethylformamid, das 107,9 β (0,705 Mol, 705 ml, 1 Hi-I)CC) 1-Eydroxybenzotriazcl enthielt. Ein Anteil von 43,4 g Peptidharz wurde entfernt und die Synthese durch Zusatz von t-Boc-O-benzyl-L—threonin (14p,3 S, 0,47 KoI in Dimethylformamid enthaltend 71,9 g, 0,47 Mol 1-Hydroxybenzotriazol,

47Ο ml 1 Li-DCC), t-Boc-K'-(2-chlorbenzyloxycarbon7/-l)-L-lysin
(194,8 g, 0,47 Mol in Dimethylformamid, enthaltend 35 S, 0,23 KoI 1-Hydroxybenzotriazol, 470 ml, 1 m-DCC), t-3oc-L-tryptophan
(142,9 g, C,47 Mol in Dimethylformamid, 470 ml, 1 m-DCC) fortgeführt. In dieser Stufe erfolgte eine unvollständige Kopplung, so ÖS.S nach der Waschfolge erneut mit "ü-Boc-L—tryptophan unrer Anwendung von 72 g (0,237 Mol) Aminosäure in 235 ml Dimethylformamid, das :'-o g 1-Hydroxybenzotriazol (0,237 Mol) (1 m-ECC) enthielt,
gekoppelt wurde. 40 g des Feptidharzes wurden entfernt und die
Syr, the se mit t-Boc-phenyl alanin (124,6 g, 0,46 Mol in Dimethylfor7r:amid, enthaltend 71,9 S, 0,47 Mol 1-Hydroxybenzotriazol,
470 ml, 1 m-DCC) fortgesetzt. 43,3 S Peptidharz wurden entfernt und die Synthese durch Zusatz von t-Boc-L-asparagin-p-nitrophenylestor (199*1 g- 0,56 KoI in Dimethylformamid, enthaltend 1 %
Eisessig) fortgesetzt. Diese Stufe vrurde während einer Reaktionszeit von 4 Tagen durchgeführt. 52,4- g Peptidharz wurden entfernt und die Synthese durch Zusatz von t-Boc-N -(2-chlorbenzylcxycarbonyl)-L-lysin (165,8 g, 0,4 Mol in Dimethylformamid, βητ-haltend 61,2 g, 0,4 Mol, 1-Hydroxybenzotriazol, 400 ml, 1 m-DCC) fortgesetzt. Das getrocknete und gewaschene Harz wog 568,1 g.

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-W-

Beispiel 2 7-t-Butyloxycarbonylaminoheptansäure

20 g (1,38 χ 10 KoI) 7-Aminoheptansäure wurden unter Anwendung des Verfahrens von Ulf Ragnarrson et al·., Org. Syn., 53, 25 (1973) unter "Verwendung von 17,3 g (1,49 x 10" Mol) Tetramethylguanidin

— ^Λ
und JO g (1,5^ x 10 ' Mol) t-Butylphenylcarbonat in 100 ml Dimethylsulfoxid während 3 Tagen in die TiteVerbindung umgewandelt.

Das Produkt (24 g) wies nach Umkristallisieren aus Äthylacetat-Hexan-Äther einen Schmelzpunkt von 56-58° auf.

Analyse für C^EL-^NO^: ber.: C 58,75, H 9,4-5, H 5,71 gef.: C 59,14, H 9,61, K 5,86.

Beispiel 3

7-t~Butyloxycarbonylamino3ieptanoyl-3!ⁱi"-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-ly·^Γ!yl-I'-asparaginyl-L·-phenylalanyl·-L-phenylalanyl-L-tryptophyl- :; '-(2-clilorben^7/"loxycarbönyl)-L-lysyi-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-serin-Harz

<5 g d.es Peptidharzes I von Beispiel 1 wurden nach dem Schema (3) bis (11) des Beispiels 1 behandeit und das entb^ckierte Harz wurde mit 7 t-Butyloxycarbonylaminoheptansauife (30 mMol in 1:1 Dimethylformamid- Methylenchlorid) und 60 ml einer 0,5 m-Lösung von Diisopropylcarbodiimid (DIC) in Methylenchlorid gerührt.

Das Harz wurde mit Methylenchlorid (2 x), Dimethylformamid (3 x), und Methylenchlorid (2 x) gewaschen, wobei man das Titelharz erhielt.

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Beispiel

7-t-Butyloxycarbonyl-N· -(2-ch.lorbe-nzyloxycarbonyl )-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-I-T -(2-chlorbenzyloxycarbonyO-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-Q-benzyl-L-serin-Harz

Das Peptidharz II des Beispiels 1, 10 g t-Boc-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-serin-Harz, vnarde in die Titelverbindung umgewandelt durch stufenweise Kopplung der geeigneten Aminosäuren in 50 ml Methylenchlorid-Dimethylforsamid (1:1) irit 4-5 ml einer 0,5 m-Lösung von 30 "ml Dicyclohexylcarbodiimid. Pur 3ede Aminosäure wurde eine Kopplungszeit von 18 Stunden eingehalten. Jeder Kopplung gingen die folgenden Deblockierungs- und Waschschemen voraus.

Entblockierungsschema

ι. Methylenchloridwäsche (3 x).

2. Vorv/äsche mit ^O % Trifluoressigsaure in Kethylenchlorid, enthaltend 0,5 % Gew./Vol. Dithioerythrit.

3. Wäsche mit 40 % Trifluoressigsäure in Kethylenchlorid, enthaltend 0,5 % Gew.-/Vol. Dithioerythrit (2 x) wahrend jeweils 15 Minuten.

4. Wäsche mit Methylenchlorid (2 x).

5. Dinethylformamidwäsche (2 x).

6. 15 % Triäthylamin in Dimethylformamid (2 x) während jeweils 10 Minuten.

7. IdmethylformamidwäEiche (2 x).

8. Methylenchloridwäsche (3 x)·

9. Dimethylformamidwäsche. 10. Methylenchlorid.

Jede Waschperiode wurde während 5 Minuten durchgeführt.

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Waschsenema

(i) Methylenchlorid (2 χ), (ii) Dimethylformamid (3 χ), (iii) Methylenchiοrid (2 χ).

Aminosäuren in der Reihenfolge der Zugabe (20 mMol).

t-Boc-O-benzyl-L-threonin (6,18 g) t-3oc-N~-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysin (8,34- g) t-Boc-D-tryptophan (6,1 g) t-Boc-L-phenylalanin (5,3 g) t-3oc-L-phenylalanin (5,3 g) t-Boc-L-asparagin-uL-p-nitrophenylester (7,1 g),

es wurde kein DIC für diese Kopplung verwendet, die in Dimethylformamid,enthaltend 1 % Essigsäure durchgeführt

wurde.

t-Boc-N"'-(2-chlorben2yloxycarbonyl)-L-lysin (8,3^- g) 7-t-Boc-aminoheptansäure (4,9 g).

Beispiel 5

7-t-Butyloxycarbonylaninoheptanoyl-li" -(2-chlorbenzyloxycarbcrj.yl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-27' -C 2-chlorbenzyloxycarbonyl )-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylaianyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L—seryl-hydrazid

15 S des Peptidharzes von Beispiel 3, suspendiert in 100 ml trockenem Dimethylformamid, wurden in 10 ml 97 %-igen Hydrazin während ? Tagen bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Harz wurde filtriert und sorgfältig mit Dimethylformamid gewaschen. Die vereinten Filtrate und Vaschlösunrren wuraen unter verringertem Druck bei Temperaturen von nicht über 30° konzentriert. Der Rückstand wurde mit 100 ml Methanol trituriert und filtriert. Die feste Ausfällung wurde eine Stunde mit Methanol gerührt und erneut filtriert. Die Ausfällung wurde im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet und ergab 5,8 g Hydrazid.

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Beispiel 6

7-t-Butyloxycarbonylaminohepta::o7'-l-N -(P-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopliyl-N -^-chlorbenzyloxycarbonyl^L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-hydrazid

Das gesamte Peptiaharz des Beispiels 4 wurde mit Dimethylformamid gewaschen und anschließend in 100 ml trockenem Dimethylformamid suspendiert und mit 10 ml 97 %-igem Hydrazin 2 Tage bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Harz wurde filtriert und sorgfältig mit Dimethylformamid -gewaschen. Die vereinten Filtrate und V/aschlösungen wurden unter verringertem Druck bei Temperaturen von nicht über JO⁰ konzentriert. Dc-r Rückstand wurde mit Methanol trituriert und filtriert. Die feste Ausfällung wurde mit Methanol eine Stunde gerührt und erneut filtriert. Der Rückstand wurde im Vakuu/n über Phosphorpentoxid getrocknet und ergab 4,9 g rohes Hydrazid.

Beispiel 7

Cyclisches (7—^Aainoheptanoyl-K" -(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-N'''-(2-chloit>enzyloxycarbonyl)-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-0-benzyl-L-seryl)

Das getrocknete rohe Hydrazid des Beispiels 5 wurde in 60 ml wasserfreier Trifluoressigsäure, 40 ml Methylenchlorid und 5 ml Anisol suspendiert und mit 0,5 S Dithioerythrit während 15 Minuten bei 0° and anschließend während 45 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die klare Lösung wurde zu einem Öl verdampft, das beim Triturieren mit großen Volumina an Äther 5_?56 g eines flockenartigen Feststoffs ergab, der im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet vurde.

5,5 g (2,4 mMol) des vorstehenden Feststoffs wurden in 60 ml Dimethylformamid bei Raumtemperatur gelöst, auf -30° gekühlt und mit 12,2 ml (9,27 Mol) 0,76 η-Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran

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behandelt und anschließend mit 0,36 ml (3i1 mMol) t-Butylnitrit versetzt. Die Lösung ergab eine negative Reaktion mit ammoniakalischem Silbernitrat (Tollen's Reagens) nach JO Minuten im Temperaturbereich von -20-50 , vodurch die Abwesenheit von Hydrazin angezeigt wurde. Die Reaktionsmischung wurde in einen, 2 1 wasserfreies Dimethylformamid enthaltenden Kolben bei -20° gefügt und der pH-Wert wurde mit Diisopropyläthylamin auf 8 eingestellt. Die Reaktionsnischung wurde drei ?age bei 0^J gelagert und anschliessend unter verringertem Druck auf ein geringes Volumen verdampft. Dor Rückstand wurde in 500 ml 1 %-ige Essigsäure gegossen, bei 0° über Nacht stehengelassen und filtriert. Der Feststoff wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man 4., 7 g der T'itelverbindung erhielt.

Beispiel 8

Cyclisches (7-Aminoheptanoyl-N -(2-cnlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N^r-(?- chlorbenzyloxycarbonyl^L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl

4,9 s cos rohen Hydrazids von Beispiel 6 wurden in einer Mischung von ^00 ml wasserfreier Trifluoressigsäure und 5 ml Anisol, dao 0,5 g Dithioerythrit enthielt, während 10 Minuten bei 0° und anschließend während 50 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die iclare Lösung wurde zu einem öl verdampft, das" beim Triturieren mit grossen Volumina an Äther 4,8 g eines Feststoffs nach Trocknung im Vakuum über Phosphorpentoxid ergab.

4-,8 g (2,1 mMol) des vorstehenden Feststoffs, gelöst in 50 ml Dimethylformamid bei Raumtemperatur, wurden auf -30° gekühlt und mit 2 nl (8 mMol) 4 η-Chlorwasserstoff in Dioxan und anschließend mit 0,31 ml (2,68 mMol) t-3utylnitrit versetzt. Die Lösung ergab mit ammoniakalischem Silbernitrat (Tollen's Reagens) eine negative Reaktion nach 30 Minuten im Temperaturbereich von -20 bis -30°, was die Abwesenheit von Hydrazin anzeigte. Die Reaktionsmischung wurde in einen, 2 1 wasserfreies' Dimethylformamid enthaltenden

709826/1085 BAD ORtQlNAL

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Kolben bei -20° überführt und der pH-Wert mit Diisopropyläthylaiain auf 8 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde 4 1/2 Tage bei 0° gelagert und anschließend bei Temperaturen <f 35° im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in 500 ml 1 %-ige Essigsäure gegossen und der Feststoff durch Filtration gewonnen. Nach dem Waschen mit Wasser und Trocknen im Vakuum über Phosphorpentoxid erhielt man 4,2 g Produkt.

Beispiel 9

Cyclisches (7-Aininoheptanoyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-Ij-seryl)

4,6 g cyclisches (7-Aminopentanoyl-N"-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-tryptophyl-N^>-(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-l3'"syl-ö-benzyl-L-threonyl-L-phenyl alanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl wurden im Vakuum mit IGO al wasserfreiem Fluorwasserstoff und 30 ml Anisol eine Stunde bei 0° behandelt. Der Fluorwasserstoff wurde unter verringertem brück entfernt und der Rückstand sorgfältig mit Äther und anschließend mit 100 ml entgaster ?C %-iger Essigsäure exti'ariioi't. Die klare Fraktion wurde mi c Wasser verdünnt und lyophylisiert, wobei man 3<15 g der rohen Titelverbindung erhielt.

'Reinigung

3,1 g des rohen, von Schutzgruppen befreiten Peptide in 20 % Essigsäure wurden auf eine Sephadex G 25 (fein)-Kolonne von 200 χ 2,5 cm in 20 % Essigsäure aufgetragen. Es wurden 180 Fraktionen von jeweils 5»& ml gewonnen. Der Abstrom der Kolonne wurde bei 254 m/u mit einem analytischen UV-DeLektor (Modell Altex 153) unter Anwendung einer präparativen Altexfließzelle und einem Allesschreiber-AufZeichnungsgerät überwacht. Es wurden vier Hauptfraktionen entnommen A (82-94) 26? mg; B (99-107) 883 mg;.C (111-V9) 97Ο mg; D (120-136) 700 mg. Die Fraktion D (120-136) wurde

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zur weiteren Reinigung durch DünnschichtChromatographie, zur Aminosäureanalyse und posiriven Tryptophanreaktion mit Ehrlich-Reagens gewählt. Der erneute Auftrag auf die gleiche Säule ergab einen einzigen Peak der Fraktionen "'"6-127 (jeweils 5,6 rnl), '1-9"I mg (70 % Gewinnung). Die vreiterc· Reinigung erfolgte an einer 15Ο χ ?,5 era Trennsäule von Scphudex G 25 (fein), hergestellt im Gleichgewicht mit der unteren Phase und anschließend der oberen Phase des Lösungsmittel 373 tens n-3-atanol: Essigsäure:Wasser 4:1:5. Ler Abstrom der Kontrolle, der wie vorstehend überwacht wurde, führte in den Fraktionen ¹VB-G* zu einem homogenen Material. Die Fraktionen wurden gewonnen, verdampft und aus 10 %-iger Essigsäure lyophylisiert. Der Feststoff wurde in 1 yti-iger Essigsaure

R
gelöst, durch ein 0,3/um Nillipore Filter filtriert und lyophylisiert, wobei man 250 mg Produkt vom M/^ -27,5 c, 1,^8 1 % Essigsäure erhielt.

Die Ami no säure analyse einer 18 Stunden bei 110 in einem evakuierten verschlossenen Rohr, das A n-ilethansulfonsäure und 0,2 % 3-(2-iuninoäthyl)-indol enrhielt, hydrolysieren Probe ergab:

Asp (1,0), Ihr* (1,88), Ser (0.9*0, ?-e (2,97), 7-NH₂(CH₂)₆-C0^H ("-,O), Lys (2,03), HH₃ (0,79), 'Trp (0,95).

Bei der erschöpfenden Sansylierung der freien Aminogruppen und der anschließenden Aminosäurehydrolyse -unter Beding^angen, die zu einem völligen Verlust des Lysins führten, wurde kein Verlust an ■7-Aminoheptansäure, bezogen auf Phenylalanin, festgestellt.

Dünnschi chtchromatographie	T	0,6	II	III
R_f-Verte	Siliciumdioxidgel 0,3		0,77	0,54
Cellulose	0,88	0,60

Die R_f-Werte wurden auf 5 χ 20 cm-Brinkmann-SiO₂-Gel 60 F-254- und auf 5 x 20 cm Avicel Analtech-Platten bestimmt. Die Flecken wurden durch Jod und Ehrlich-Reagens sichtbar gemacht.

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BADiORlGlNAt, ,

'XV '

Lösungsmittelsysteme

I Bu tanol: Essigsäure: V/asser (4: 1:5) II Äthylacetat:Butancl:Essigsäure:Wasser (1:1:1:1) III Isoamylalkohol:Pyridin: V/asser (7:7 = 6)

Beispiel 10

Cyclisches (7-Aminoheptanoyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-tiireonyl-L—seryl)

"⁺i3 g cyclisches (7-Aminoheptanoyl-I\^T"-(2-chlorbenz7_/ ^rloxj'-carbonyl)-L-lysyl-L-aGparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptopayliT"'--(2-chlorbenzyloxycarbonyl)-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-plienylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl) wurden im Vakuum mit 100 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff und 30 ml Anisol eine Stunde bei 0 behandelt. Fluorwasserstoff wurde unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand sorgfältig mit Äther trituriert, worauf mit 100 ml entgaster 20 %-iger Essigsäure extrahiert wurde. Die ε?«ure Fraktion wurde mit Wasser verdünnt und lyophilisiert, wobei m^n 2,55 g der.Titelverbindung erhielt.

Reinigung

2,50 g des rohen, von Schutζgruppen befreiten Peptids in 20 %-iger iGsigsäuro wurden auf eine 200 χ 2,5 cm^ Säule von Sephadex G-25 (fein) in 20 %-iger Essigsäure aufgetragen. 18C Fraktionen von ,je-.veils 5·.6 ml wurden gesammelt. Der Abstrom der Säule wurde wie in :?>- ir.piel 9 beschrieben überwacht. Positive Tryptophanfraktionen wTjrden gesammelt und lyophilisiert, wobei man 1,0 g Peptid erhielt, das erneut auf die Säule aufgetragen wurde. Die Fraktionen 129 bis 148 (295 mg) wurden durch Dünnschichtchromatographie und Aminosäurenanalyse für die weitere Reinigung selektiert. Die Fraktionen 129-1^8 wurden erneut auf eine 150 x 2,5 cm Trennsäule von Sephadex G-25 (fein) aufgetragen, die durch Equilibrieren mit der unteren Phase und anschließend der oberen Phase des Lösungsmittelsystems n-Butanol:Essigsäure:Wasser - 4:1:5 hergestellt wurde. Der

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Säulenabstrom wurde wie vorstehend überwacht und ergab ein homogenes Material in den Fraktionen 7^ bis °A· Die Fraktionen wurden gewonnen, verdampft und der Rückstand aus 10 %-iger Essigsäure lyophilisiert. Der Rückstand wurde in 1 %-iger Essigsäure durch ein 0,3 /um Millipore -Filter filtriert und lyophilisiert, wobei man 120 mg Produkt vom MZ^ - 31,5°, c = 1,11 % Essigsäure, erhielt.

Die Aminosäureanalyse einer 18 Stunden bei 110⁰C in einem evakuierten verschlossenen Rohr mit 4 n-Kethansulfonsäure und 0,2 % 3-(2-Aminöäthyl)-indol hydrolysierten Probe ergab:

Asp (1,0), Thr (1,83), Ser (1,05), Hie (2,88), Lys (1,99), NH₃ (1,03), Trp (0,87).

Nach der erschöpfenden Dansylierung der freien Aminogruppen und der anschließenden Aminosäurehydrolyse unter Bedingungen, die zu. einen völligen Verlust an Lysin führten, wurde kein Verlust an 7-Aiüinoheptansäure, bezogen auf Phenylalanin, festgestellt.

Jünnschichtchromatographie

R_f-Werte

Siliciuadioxidgel Cellulose

I	II	III
0,32	0,77	0,54
0„60	0,88	0,64

Die verwendeten Platten und Lösungsmittelsysteme I₅ II und III entsprachen denen von Beispiel 9·

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Claims

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PatentansOruclie

1. Undecapeptide der Formel

CCH₂)_a

R¹ί7:I(CH₉)_T1C0-L-LysCR²)-L-Asn-L·-Phe-L-Phe-(T)-L-Lys(R²)-L-Thr(R³)-

and ihre nicht toxischen Salze -corin H = Wasserstoff oder .-; ucyloxycarbonyl; E' -= ^-ChIo. .<ε .zyl oxy carbonyl; rK = Bf n-7.7/I; η = eine ganze Zahl von j5 Vas σ; T = L-Tryptophyl oder D-rryptophyl; und X = OH, 1'K-NK₀, U- .niedrig)-Alkyl, 0-Senzyl oder eine Verankerungsbindung ai. e^nen festen Polystyrolharzcräfrer, dargestellt durch

:Poly- ;

.harzjträger |

P. Undöcapeptid gemäß Anspruch 1 der Formel

C-L-Lys-L-Asn-L-Fhe-L-Phe-L-TrF-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-NH

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Λ-

sowie seine nickt toxischen Säureadditionssalze. J. üncecapeptid gemäß Anspruch. 1 der Formel

0
G-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-KH

sowie seine nicht toxischen Säureadditionssalze.

4-, Verfahren zur Herstellung der Undecapeptide gemäß einen der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man an ein gegebenenfalls Chlormethylierres Earz in fesrer Phase sine Aminosäure der gewünschten Sequenz, mit geschützter Aninogruppe koppelt und nach Abspaltung der Amir.oschutzgruppe die lineax-e Aminosäuresequenz in der gewünschten Reihenfolge bildet, worauf man die lineare Sequenz p;e_f;;e oar. onfall ε von ieir. Harztrager oni~ fernt und gegebenenfalls intramolekular cyciisiert.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Aufbau der linearen Sequenz durch Bindung einer -.' -Air.ir.oalkansäure an das feste Harz beginnt.

6. Verfahren gemäß Anspruch A-, dadurch gekennzeichnet, daß man den Aufbau der linearen Sequenz durch Bindung von L-Serin oder B-Tryptophan an das Kara beginnt.

7· Arzneimittel, enthaltend mindestens eines der undecapeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis J und/oder seiner nicht toxischen Säureadditionssalze bzw. seiner pharmazeutisch brauchbaren Salze, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfe- und/ oder- Trägerstoffen.

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