DE2656654B2 - Vorrichtung zur Messung des Volumens und bestimmter optischer Eigenschaften von Partikeln - Google Patents

Vorrichtung zur Messung des Volumens und bestimmter optischer Eigenschaften von Partikeln

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DE2656654B2 DE2656654A DE2656654A DE2656654B2 DE 2656654 B2 DE2656654 B2 DE 2656654B2 DE 2656654 A DE2656654 A DE 2656654A DE 2656654 A DE2656654 A DE 2656654A DE 2656654 B2 DE2656654 B2 DE 2656654B2
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Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung des Volumens und bestimmter optischer Eigenschaften von in einer Partikelsuspension suspendierten Partikeln mit zwei über eine Meßöffnung miteinander verbundenen Kammern, in denen je eine Elektrode angeordnet ist, und bei der infolge einer Druckdifferenz der Kammern eine Strömung eines Elektrolyten durch die Meßöffnung stattfindet, und bei der die Partikelsuspension durch eine mit ihrer Austrittsöffnung vor der Meßöffnung endende Kapillare in die Strömung des Elektrolyten eingeführt und durch die Meßöffnung hindurchgeführt wird, und bei der in kurzem Abstand zur Meßölfnung senkrecht zu deren Achse eine Glasplatte vorgesehen ist, hinter der koaxial zur Meßöffnung eine optische Einrichtung vorgesehen ist.
Derartige Vorrichtungen sind bekannt (DE-OS 13 799). Jedoch ist bei dieser bekannten Anordnung die optische Einrichtung in Strömungsrichtung vor der Meßöffnung angeordnet, um, vorwiegend zu experimentellen Zwecken, die Partikel beim Durchtritt durch die Meßöffnung zu beobachten, wobei in der Meßöffnung eine Volumenmessung nach dem Coulter-Prinzip durchgeführt wurde. Alternativ dazu ist auch bei der bekannten Einrichtung die Anregung gegeben worden, die optische Einrichtung als Meßeinrichtung z. B. zur Messung der Fluoreszenz der durch die öffnung
ίο hindurchgehenden Partikel zu verwenden. Bei dem Versuch, dies durchzuführen, stellte sich jedoch heraus, daß bei zentralem Durchtritt des Partikelstromfadens durch die Meßöffnung eine gleichzeitige Beobachtung derselben durch eine in Strömungsrichtung vor der Meßöffnung angeordnete optische Einrichtung nicht möglich ist, da die dazwischen angeordnete Kapillare zur Zuführung der Partikelsuspension den Weg optisch versperrt Außerdem bedingt dieser konstruktive Aufbau einen zu großen Abstand von Meßöffnung und optischer Einrichtung, so daß nicht mehr gewährleistet ist, daß sich die Partikel an der Stelle ihres Durchtritts durch die Meßöffnung im Tiefenschärfenbereich des Objektivs der optischen Einrichtung befinden. Versuchsweise Messungen des Nukleinsäure-Gehaltes mit einer Vorrichtung gemäß der DE-OS 20 13 799, bei der die hindurchtretenden Partikel von der Seite her im UV-Bereich beleuchtet wurden, ergaben so stark verrauschte Signale, daß die Versuche aufgegeben worden sind. Die Vorrichtung der eingangs genannten
JO Art erwies sich also, sofern der Einsatz der optischen Einrichtung nicht nur zur Beobachtung der Meßöffnung, sondern zur Messung bestimmter Parameter ins Auge gefaßt war, hierfür nicht im erwünschten Maß geeignet.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, mit der gleichzeitig mindestens zwei Parameter der in der Partikelsuspension enthaltenen Partikel gemessen werden können. Dabei sollen die beiden Parameter (Volumen, Fluoreszenz), deren Messung bei der eingangs erörterten Vorrichtung alternativ für möglich angesehen wurde, gleichzeitig bestimmt werden können.
Nun sind Vorrichtungen zur gleichzeitigen Messung mehrerer Parameter, so einer Messung des Volumens nach dem Coulter-Prinzip und einer Fluoreszenz-Messung mit Hilfe einer optischen Einrichtung ebenfalls bekannt (vgl. US-PS 37 10 933). Dabei wird der Partikelstromfaden vor der Meßöffnung, in der das Volumen gemessen wird, an Beobachtungsfenstern herbeigeführt, durch die auf die Partikel eine anregende Strahlung, z. B. eine Laserstrahlung, abgestrahlt wird und die dabei induzierte Fluoreszenz gemessen wird. An derselben Stelle kann auch eine Messung der Lichtstreuung erfolgen. Bei der Auswertung ist es problematisch, die Meßergebnisse für einen Parameter eines bestimmten Partikels einem Meßergebnis für den anderen Parameter desselben Partikels zuzuordnen, da die Messung beider nicht an derselben Stelle und daher auch nicht zum selben Zeitpunkt erfolgt. Bei der Auswertung muß also die Laufzeit des Partikels zwischen beiden Meßstellen berücksichtigt werden. Dies ist ein bedeutender Nachteil, denn die Laufzeit, die genau eingestellt sein muß, hängt von verschiedenen Einflußgrößen (Strömungsgeschwindigkeit des Mediums, Temperatur, Druckdifferenz usw.) ab, die alle als Quellen für mögliche Meßfehler in Betracht zu ziehen sind. Die eingangs gestellte Aufgabe ist daher weitergehend dahin zu präzisieren, daß derartige
Meßfehler ausgeschlossen werden sollen, wie sie bei diesen Anordnungen als Folge der Messung der beiden Parameter an verschiedenen Meßstellen auftreten. Ferner sind Vorrichtungen bekannt, hei denen der Partikelstromfaden nach Austritt aus einer Düse oder Bohrung im wesentlichen rechtwinklig umgelenkt wird und eine in Strömungsrichtung hinter der Meßöffnung angeordnete optische Einrichtung auf den aus der Meßöffnung austretenden Partikelstromfaden get ichtet ist (DE-OS 19 19 628). Diese Vorrichtung sieht jedoch ]0 nicht die Messung von zwei Parametern vor; sie bezeichnet die Messung des Volumens nach dem Coulter-Prinzip, von der die vorliegende Erfindung ausgeht, als zu ungenau und ersetzt sie durch eine photometrische Messung. Anregungen zur Lösung der Aufgabe sind daher daraus nicht zu entnehmen.
Die dargestellte Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Glasplatte in Strömungsrichtung hinter dem Ende der Meßöffnung vorgesehen und auf den Partikelstromfaden bei seinem Austritt aus der Meßöffnung gerichtet ist und daß der zweiten Kammer zwischen dem Ende der Meßöffnung und der Glasplatte ein Spülstrom senkrecht zur Achse der Meßöffnung zugeleitet wird, der den aus der Meßöffnung austretenden Partikelstromfaden senkrecht umlenkt.
Die Umleitung des Partikelstromfadens, die Voraussetzung für eine optische Messung an den aus der Meßöffnung austretenden Partikeln ist, erijlgt also nicht allein durch die Glasplatte. Bei dem notwendigerweise sehr kurzen Abstand zwischen dem Ende der Meßöffnung und der Glasplatte würde ohne weitere Maßnahmen nicht ausgeschlossen werden können, daß auch nur einzelne Partikel auf die Glasplatte auftreffen und sich dort festsetzen. Ferner wäre möglich, daß sich dort Luftblasen bilden. Damit wäre die Durchführung der optischen Messung unmöglich geworden.
Die Zuführung eines Spülstroms hinter der Meßöffnung zur Umlenkung des Partikelstromfadens macht es möglich, diesen ohne das Anhaften von Partikeln oder Gasblasen an der Glasplatte so nahe vor dem Objektiv der optischen Einrichtung vorbeizuführen, daß die Meßöffnung bzw. deren unteres Ende sich im Tiefenschärfenbereich des Objektivs befindet. Vorzugsweise beträgt dieser Abstand zwischen 100 μ und 0,30 mm. Eine vorteilhafte Weiterbildung der Erfindung sieht vor, daß hinter der Meßöffnung im Gegensatz zu der bekannten Vorrichtung nach der DE-OS 20 13 799 nicht nur eine Elektrode, sondern zwei Elektroden, und zwar zu beiden Seiten der Meßöffnung vorgesehen sind, die miteinander parallel geschaltet sind. Das dient dazu, am Ende der Meßöffnung eine zu starke und einseitige Feldlinienkonzentration in dem sehr beengten Bereich zwischen dem Ende der Meßöffnung und der Glasplatte, wie sie sich etwa als Folge der umgelenkten Strömung des Partikelstromfadens ergeben könnte, zu vermeiden.
Durch die Erfindung wird es möglich, die beiden Parameter im wesentlichen zur selben Zeit zu messen. Der Impuls für die Volumenmessung nach dem Coulter-Prinzip zwischen den beiden Elektroden endet bei Austritt aus der Meßöffnung. Der Impuls für die optische Messung beim Austritt aus der Meßöffnung fällt praktisch in die Rückflanke des Impulses der Volumenmessung. Derart ist eine eindeutige Zuordnung der den beiden Parametern eines Partikels entsprechenden Meßergebnis ohne Fehler möglich. Damit wird es auch ermöglicht, sie eindeutig zueinander in Beziehung zu setzen. Ist z. B. die Fluoreszenz eines Partikels zu einem Gehalt eines bestimmten Wirkstoffes (z. B. RNS) proportional, so kann man aus der gemessenen Menge und dem Volumen die Konzentration des Wirkstoffes in den Partikeln durch einen einfachen Rechner ermitteln. Demgemäß sieht eine weitere vorteilhafte Weiterbildung der Erfindung vor, daß eine Recheneinheit vorgesehen ist, die das von der optischen Einrichtung abgegebene Signal durch das von den Elektroden abgeleitete Signal dividiert und ein Signal abgibt, daß das Ergebnis darstellt
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung und ihrer vorteilhaften Weiterbildungen sind im folgenden anhand der Zeichnungen beschrieben. Es stellt dar
F i g. 1 ein Ausführungsbeispiel;
Fig.2 einen Teil des Ausführungsbeispiels nach Fig.l;
F i g. 3 den zeitlichen Verlauf von zwei Impulsen, die sich bei Messung des Volumens und der Fluoreszenz eines Partikels ergeben;
Fig.4 eine Photographie der Bildanzeige einer Vielzahl von Impulsen nach F i g. 3 auf einem Oszillographen;
F i g. 5 eine Photographie der Bildanzeige eines 2-Parameter-Vielkanalysators, der die Meßergebnisse für Volumen und Fluoreszenz einer Probemenge kultivierter Ratten-Nervenzellen anzeigt;
F i g. 6 ein Blockschaltbild einer besonderen Verwendung der Erfindung.
Die Vorrichtung nach F i g. 1 besteht aus einem Tank 1 für partikelfreien Elektrolyt 2 mit einer Entlüftungsöffnung 3, der über eine Leitung 4 mit einer ersten Tropfenkammer 5 in Verbindung steht. In dieser ist ein Schwimmer 6 mit einer Nadel 7 vorgesehen; bei Ansteigen des Flüssigkeitspegels verschließt die Nadel 7 die öffnung 8. Dadurch wird zwischen Elektrolyt in der Tropfenkammer 5 und im Tank 1 eine galvanische Trennung bewirkt und gleichzeitig erreicht, daß der Flüssigkeitspegel in der Tropfenkammer — bezogen auf die Halterungsplatte 5' — stets einen bestimmten Wert hat. Die Tropfenkammer 5 steht über die Leitung 9 mit einer Kammer 11 in Verbindung und führt dieser stetig Elektrolyt zu. Die Tropfenkammer 5 ist ferner an einer Schiene 12 mit Hilfe einer Schraube 13 höhenverstellbar und -einstellbar. Da der Pegel des Elektrolyten in der Tropfenkammer 5 stets gleich ist, kann durch diese Höhenverstellung der Tropfenkammer 5 der Druck in der Kammer 11 eingestellt werden. Der Tank 1 steht ferner über eine zweite Leitung 12, eine zweite Tropfenkammer 13 und eine weitere Leitung 15 mit einer Kammer 16 in Verbindung. Die Leitung 12 kann durch eine Klemmschraube 14 unterbrochen werden. Die Verbindung mündet zunächst in einer etwas verbreiterten Vorkammer 15'. Über diese Verbindung wird der Kammer 16 stetig Elektrolyt zugeführt. Die Kammer 16 weist ferner ein Abflußrohr 17 auf, an der eine (nicht gezeigte) Unterdruckquelle anliegt, die einen bestimmten Sog erzeugt. Die erste Kammer 11 und die zweite Kammer 16 stehen ferner über eine Meßöffnung 18 in Verbindung. Kurz vor der Meßöffnung 18 endet mit ihrer Austrittsöffnung eine Kapillare 19, die zur Zuführung von Partikelsuspension dient Die Partikelsuspension befindet sich in einem Behälter 20, der mit der Kapillare 19 in Verbindung steht In der Kammer 16 befindet sich ferner eine Spülkapillare 21 und ein Entlüftungsrohr22.
Sorgt man nun durch entsprechende Einstellung des Unterdrucks am Abflußrohr 17 dafür, daß der Druck in der Kammer 11 niedriger als in der zweiten Kammer 16 ist, so strömt Elektrolyt von der Kammer Ii durch dip
Meßöffnung 18 in die Kammer 16. Diese Strömung verengt sich vor der Meßöffnung 19. 1st ferner der Druck der Partikelsuspension in der Kapillare 19 etwas größer als in der Kammer 11, so tritt die Partikelsuspension aus der Kapillare 19 in die sich zur Meßöffnung 18 hin verjüngende Strömung aus und wird durch diese verengt (hydrodynamische Fokussierung) und durch die Meßöffnung hindurch transportiert. In der Kammer 11 ist eine erste Elektrode 23 und in der Kammer 16 eine zweite Elektrode 24 vorgesehen. Die Elektrode 24' in der Vorkammer 15' ist zur Elektrode 24 parallelgeschaltet dadurch, daß die zugeordneten Klemmen 24a und 24b verbunden sind. Zwischen beiden fließt ein Strom i, der von einer Stromquelle 25 eingeprägt ist. Tritt ein Partikel durch die Meßöffnung !8 hindurch, so findet in der Meßöffnung 18 eine Verdrängung des elektrischen Feldes und damit eine Widerstandsänderung auf, die bei eingeprägtem Strom / zu einem Spannungsimpuls zwischen den Elektroden 23, 24 führt. Die Höhe dieses Spannungsimpulses ur (F i g. 3) ist ein Maß für das Volumen des Partikels. Dieser Spannungsimpuls wird in einem Verstärker 25 verstärkt und einer (nicht gezeigten) Auswerteeinheit, die die Impulse nach ihrer Höhe klassifiziert und auswertet, zugeführt.
Die Kammer 16 ist in einem Block 26 vorgesehen. Die Kammer 16 weist eine öffnung 27 auf, die mit einer Glasplatte 28 abgedeckt ist. Die Glasplatte wird durch Klemmen 29 gehalten. Hinter der Glasplatte 28 ist ein optisches System 30 angeordnet. Die Anordnung bzw. Einstellung dieses optischen Systems 30 ist derart, daß die aus der Meßöffnung 18 heraustretenden Partikel im Tiefenschärfebereich des optischen Systems liegen. Von den Eigenschaften des optischen Systems hängt auch der Abstand des in Strömungsrichtung hinteren Endes 18' zur Glasplatte 28 ab; er beträgt z. B. 100 μ—30 mm. Die Partikel werden durch dieses optische System 30 mit anregender Strahlung, z. B. einer Laserstrahlung, ausgestrahlt; durch dasselbe optische System wird die damit induzierte Fluoreszenz gemessen. Derartige optische Systeme sind bekannt, so daß auf ihre nähere Beschreibung im vorliegenden Falle verzichtet werden kann. Damit wird, wie erwähnt, z. B. die Fluoreszenz gemessen; ferner kann damit auch das Streulicht (light scattering) gemessen werden. Die mit diesem optischen System 30 gemessenen Impulse ur (vgl. F i g. 3) werden ebenfalls in der (nicht gezeigten) Auswerteeinrichtung klassifiziert und ausgewertet
Wie aus F i g. 2 ersichtlich, erfolgt eine im wesentlichen rechtwinklige Umlenkung des Partikelstromfadens 31 bei seinem Austritt aus dem in Strömungsrichtung hinteren Ende 18' der Meßöffnung 18. Nach der Umlenkung folgt der Partikelstromfaden 31 schließlich dem Pfeil 32; danach kommt es auf seinen genauen Lauf nicht mehr an. Die Partikelsuspension gelangt in den Bereich 16' der Kammer 16 zum oberen Teil der Kammer, in dem das Abflußrohr 17 vorgesehen ist Auf das hintere Ende 18' der Meßöffnung ist das optische System 30 fokussiert, wie durch die Strahlengänge 32', 32" angedeutet
Damit erfolgt einmal die Messung des Volumens beim Durchtritt eines Partikels durch die Meßöffnung 18 praktisch gleichzeitig mit der Messung der Fluoreszenz durch das optische System 30. Ergänzend ist daraul hinzuweisen, daß man mit dem optischen System natürlich auch mehrere Messungen gleichzeitig (Fluoreszenz, Streulicht) durchführen kann.
-, Wie aus F i g. 3 zu ersehen, fällt der Impuls u/, der ein Maß für die Fluoreszenz eines Partikels ist, praktisch in die Rückflanke des etwas längeren Impulses ur, der an den Elektroden 23, 24 entsteht und ein Maß für das Volumen des Partikels ist. Damit wird eine eindeutige
ίο zeitliche Zuordnung der Impulse zueinander möglich. F i g. 4 zeigt eine Aufnahme der Darstellung derartiger Impulse auf einem Oszillographen, die dies bestätigt.
Es ist gewährleistet, daß der Partikelstrom selbst, trotz Umlenkung der Strömung, nicht in Kontakt mit
!5 der Glasplatte 28 kommt und diese vcrdrecki. Das bewirkt der über die Leitung 15 her zugeführte Strom des Elektrolyten, der insoweit die Funktion eines Spülstromes hat, der den aus der Meßöffnung 18 austretenden Partikelstromfaden in den Bereich 16' der Kammer 16 mitnimmt. Die Elektrode 24' in der Vorkammer 15' dient dazu, am Ende der Meßöffnung 18 eine zu starke und einseitige Feldlinienkonzentration in dem sehr beengten Bereich zwischen Ende 18' der Meßöffnung und Glasplatte 28 zu vermeiden.
Fig.5 ist eine photographische Wiedergabe der Bildanzeige eines 2-Parameter-VielkanalanaIysators. Er zeigt das aus einem Bildschirm eines solchen Gerätes aufgezeichnete Profil der Volumen- und Fluoreszenzmessung einer bestimmten Partikelmenge. Gemessen wurde die Parameter-Fluoreszenz und Volumen bei kultivierten Ratten-Nervenzellen, die sich teilweise im Zustand der Zellteilung befinden, wobei an die bei der Teilung synthetisierte DNS Mithramycin angelagert ist, das fluoresziert. Eine sehr hohe Anzahl von Zellen hat ein geringes Volumen und geringe Fluoreszenz. Das ist der erste hohe Berg der gebirgsartigen Darstellung links vorne im Bild. Diese Zellen befinden sich in ihrer sogenannten G 1-Phase, in der der DNS-Gehalt der Zellen konstant bleibt. Im Bereich zunehmender Fluoreszenz sinkt die Anzahl der Zellen ab. Der folgende Höhenrücken kennzeichnet die sogenannte Synthesephase S, in der als Vorbereitung der späteren Zellteilung DNS synthetisiert wird. Das Volumen nimmt dabei ebenfalls leicht zu. Kurz vor und während der Teilungsphase (G 2-Phase) fallen die Zellen dann in den zweiten kleinen Gipfel schräg hinten in der Darstellung 4, d. h. die Zahl dieser Zellen ist wieder etwas höher. Dieses Beispiel zeigt, daß sich mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung einwandfreie 2-Parameter-Messungen vornehmen lassen.
F i g. 6 zeigt in prinzipieller Darstellung eine Vorrichtung nach F i g. 1 bis 3. Ein von der optischen Meßeinrichtung 30 abgeleiteter Meßimpuls wird im Verstärker 35 verstärkt Der verstärkte Meßimpuls ur gelangt an einen Dividierer 36. An den Dividierer 36 gelangt ebenfalls der im Verstärker 25 verstärkte Meßimpuls u„ Im Dividierer 36 wird der Quotient u//uv gebildet Das ist die Volumen-Konzentration eines bestimmten Wirkstoffes in einem Partikel unter der Voraussetzung, daß ur, also die Fluoreszenz, der Menge des Wirkstoffes im Partikel proportional ist Das ist z. B. bei der RNS der Fall.
Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Vorrichtung zur Messung des Volumens und bestimmter optischer Eigenschaften von in einer Partikelsuspension suspendierten Partikeln mit zwei über eine Meßöffnung miteinander in Verbindung stehenden Kammern, in denen je eine Elektrode angeordnet ist, bei der infolge einer Druckdifferenz in den Kammern eine Strömung eines Elektrolyten durch die Meßöffnung stattfindet, und bei der die Partikelsuspension durch eine mit ihrer Austrittsöffnung vor der Meßöffnung endende Kapillare in die Strömung des Elektrolyten eingeführt und durch die Meßöffnung hindurchgeführt wird, und bei der in kurzem Abstand zur Meßöffnung senkrecht zu deren Achse eine Glasplatte vorgesehen ist, hinter der koaxial zur Meßöffnung eine optische Einrichtung vorgesehen ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Glasplatte (28) in Strömungsrichtung hinter dem Ende (18') der Meßöffnung (18) vorgesehen und die dahinter angeordnete optische Einrichtung auf den Partikelstromfaden (31) bei seinem Austritt aus der Meßöffnung (18) gerichtet ist, und daß der zweiten Kammer (16) zwischen dem Ende (18') der Meßöffnung (18) und der Glasplatte (28) ein Spülstrom senkrecht zur Achse der Meßöffnung (18) zugeleitet wird, der den aus der Meßöffnung (18) austretenden Partikelstromfaden (31) senkrecht umlenkt.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen dem in Strömungsrichtung hinteren Ende (18') der Meßöffnung (18) und der Glasplatte (28) 100 μ bis 0,30 mm beträgt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Strömungsrichtung hinter der Meßöffnung (18) in der zweiten Kammer (16) zu beiden Seiten der Meßöffnung je eine zweite Elektrode (24, 24') angeordnet ist, die beide miteinander parallel geschaltet sind.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß eine Recheneinheit (36) vorgesehen ist, die das von der optischen Einrichtung (30) abgegebene Signal (uf) durch das von den Elektroden abgeleitete Signal (uv) dividiert und ein Signal abgibt, das das Ergebnis darstellt.
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