DE2656317C2

DE2656317C2 - Verfahren zur Herstellung einer Suspension von beladenen Erythrocyten

Info

Publication number: DE2656317C2
Application number: DE2656317A
Authority: DE
Inventors: Günter Dr. Pilwat; Ulrich Prof. Dr. 5170 Jülich Zimmermann
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1976-12-11
Filing date: 1976-12-11
Publication date: 1986-06-19
Also published as: GB1560166A; DE2656317A1; JPS5396382A; FR2373290B1; IL53595A; SE445423B; US4269826A; FR2373290A1; SE7713945L; CH632412A5

Abstract

Ein Nachteil der nach den bekannten Verfahren hergestellten Masse von beladenen Zellen ist, dass die Wechselwirkung der in den beladenen Zellen eingeschlossenen Stoffe mit den ausserhalb der Zellmembran befindlichen Substanzen sich auf den gesamten Bereich der physiologischen Loesung erstreckt und somit die Wirkung des Stoffes nicht auf eine bevorzugte Stelle in der physiologischen Loesung konzentriert werden kann. Um diesen Nachteil zu vermeiden, wird vorgeschlagen magnetische Substanzen, deren Durchmesser im Bereich zwischen 1 und 20 nm liegt, zur Aufnahme in das Innere der beladenen Zellen in einer solchen Dosierung einzugeben, dass die beladenen Zellen durch ein auf die magnetischen Substanzen einwirkendes aeusseres Magnetfeld an einer vorbestimmten Stelle in der physiologischen Loesung festgehalten werden. Bei einer der angegebenen Varianten des Verfahrens wird beispielsweise zu dem als Mittel zur Krebsbekaempfung bekannten Stoff 6-Fluorouracil und den magnetischen Substanzen beispielsweise das Protein Albumin oder ein Zucker, beispielsweise Saccharose, in die beladenen Zellen eingeschlossen und es wird dadurch erreicht, dass die Membrane der beladenen Zellen etwa doppelt so lange stabil bleiben. Diese Art beladener Zellen wird zur Behandlung von Tumoren eingesetzt. ...U.S.W

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Suspension von in physiologischer Lösung suspendierten, mit Methotrexat beladenen Erythrocyten, bei dem die Erythrocyten in einer zellverträglichen Wirkstofflösung suspendiert und der Einwirkung von osmotischem Druck oder eines elektrischen Feldes derart ausgesetzt werden, daß das Methotrexat im Stoffaustausch mit dem Zellinhalt in das Innere der Erythrocyten gelangt, die nach Regenerierung der durch den osmotischen Druck oder das elektrische Feld bewirkten Veränderungen der Zellmembran von der zellverträglichen Lösung abgetrennt und zur Aufbewahrung in einer physiologischen Lösung mit einer Osmolarität, die derjenigen des Inhalts der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden.

Neben der Bezeichnung »beladene Zellen« oder »loaded cells« — die zum Ausdruck bringen soll, daß es sich um Zellen handelt, die mit solchen Substanzen »beladen« worden sind, die sich vom Zellinhalt unterscheiden

— sind für die nach den bekannten Verfahren hergestellten Gebilde auch die Bezeichnungen »Membranvesikel«, »Ghost-Zellen« oder »Geister-Zellen« oder auch »membrane-envelope« bekannt geworden.

Aus der DE-OS 24 05 119 ist es bekannt, Membranvesikel mit Pharmaka zu beladen, wobei bei der Herstellung dieser Membranvesikel sowohl osmotische als auch elektrische Kräfte zur Permeabilitätserhöhung der Membranen genutzt werden können.

Für die bekannten Verfahren sind sowohl Zellen, die als Einzelzellen in einer physiologischen Lösung vorkommen, wie beispielsweise Erythrocyten, Lymphocyten, Trombozyten oder Leukozyten, als auch solche Zellen verwendbar, die — wie beispielsweise Leberzellen

— in Geweben als Verbände von miteinander zusammenhängenden Zellen angeordnet sind. Denn der Zellverband eines Gewebes ist durch biochemische oder biophysikalische Maßnahmen auflösbar, so daß auf diese Weise in einer Lösung suspendierbare Zellen erhalten werden. Dabei wird bei der Durchführung der bekannten Verfahren, insbesondere beim Einschluß der Stoffe in die Membranvesikel, eine spezifische Eigenschaft der Membran lebender Zellen ausgenutzt, nämlich die, daß eine in Grenzen vorgenommene Permeabilitätserhöhung durch Regeneration der Zellen wieder

ίο ausheilbar ist Die ausgeheilte Membran der Membranvesikel erlangt daher wieder die semipermeabler! Eigenschaften der Membran der ursprünglichen Zeilen. Dadurch ist es — abgesehen von der Verwendung von Stoffen, die nach ihrem Einschluß in die Membranvesikel die Membran zerstören und dadurch freigesetzt werden — möglich, die in den Membranvesikeln eingeschlossenen Stoffe mit in einer physiologischen Lösung außerhalb der Membranvesikel befindlichen Substanzen in Wechselwirkung zu bringen, ohne daß die in den Membranvesikeln eingeschlossenen Stoffe in die physiologische Lösung gelangen. Das geschieht dadurch, daß die Membranvesikel in die physiologische Lösung eingegeben werden und die Substanz durch Permeation durch die semipermeable Membran der Membranvesikel gelangen. Dadurch ist es beispielsweise möglich, durch das in Membranvesikeln eingeschlossene Enzym Invertase den in einer physiologischen Lösung befindlichen Rohrzucker zu Glucose und Fructose umzusetzen, da sowohl der Rohrzucker als auch Glucose und Fructose durch die Membran gelangen, während das Enzym Invertase in den Membranvesikeln eingeschlossen bleibt. Auch ist es beispielsweise möglich, Zellen mit Urease zu beladen, die gebildeten Membranvesikel in die Blutbahn eines menschlichen Körpers zu injizieren und, ohne daß die Urease aus den Membranvesikeln in das Blut freigesetzt wird, den im Blut befindlichen und in die Membranvesikel eindringenden Harnstoff abzubauen.
Das der Fachwelt am Anmeldetag zur Verfügung stehende know how erlaubte es somit, mit Pharmaka beladene Membranvesikeln für die klinische Anwendung herzustellen. Die Fachwelt war jedoch nach diesem Stand der Technik nicht in der Lage, eine gezielte Anwendung der durch die Membranvesikel in den Blutkreislauf gegebenen Pharmaka vorzunehmen. Vielmehr erstreckte sich die Wechselwirkung der in den beladenen Membranvesikeln eingeschlossenen Pharmaka mit den außerhalb der Membranvesikel befindlichen Substanzen je nach ihrer (unkontrollierten) Freisetzung auf die gesamte physiologische Lösung (auf den gesamten Blutkreislauf). Ein gezielter Einsatz der mit Pharmaka beladenen Membranvesikel war somit nach dem bekannten Stand der Technik nicht möglich.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ausgehend von den bekannten Verfahren, ein Verfahren der eingangs bezeichneten Art zu schaffen, mit Membranvesikeln, die es ermöglichen, die Wirkstoffe in einer physiologischen Lösung — die beispielsweise das in den Adern oder Venen des tierischen oder menschlichen Körpers fließende Blut sein kann — an einer bevorzugten Stelle, im vorgenannten Fall beispielsweise an oder in einem bestimmten Organ des tierischen oder menschlichen Körpers, zur Wirkung zu bringen.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird

b5 gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß in die zellverträgliche Wirkstofflösung zusätzlich magnetische Substanzen mit einem Durchmesser im Bereich zwischen 1 und 20 nm eingegeben werden.

Werden nach dem Verfahren gemäß der Erfindung ferri-, ferro- oder auch paramagnetische Verbindungen, wie beispielsweise Kobalt- oder Nickelferrit oder Magnetit oder Ferritin in die Membranvesikel eingeschlossen, dann ist es auf einfache Weise möglich, die in der Blutbahn eines Körpers befindlichen Membranvesikel durch ein an bevorzugter Stelle des menschlichen Körpers angelegtes magnetisches Feld an dieser Steüe festzuhalten. Das Methotrexat — aber auch andere pharmakologische Stoffe und weitere Stoffe, wie Radionu-Wide — werden so an der betreffenden Stelle bevorzugt zur Wirkung gebracht, wobei zur Erzeugung eines hinreichenden Feldgradienten des magnetischen Feldes gegebenenfalls ein mit physiologischem Kunststoff überzogenes Metallstück an die betreffende Stelle gebracht wird.

Zwar ist es aus T. Nakamura et al, J. of Appl. Physics, Vol. 42, Nr. 4, March 1971, S. 1320-24, R. Newbower bekannt, magnetische Partikel in den Blutkreislauf von Tieren einzubringen. Auch ist es aus IEEE Transactions on Magnetics Vol. MAG-9, Nr. 3, Sept 1973, S. 447-450 bekannt, mit einer Umhüllung versehene magnetische Partikel in den Blutkreislauf eines tierischen Körpers einzuführen und die Partikel durch außerhalb des Körpers vorgesehene Einrichtungen über magnetische Kräfte entweder zu führen oder nachzuweisen. Auch ist vorgeschlagen worden, diese bekannten Verfahren im Rahmen verschiedener medizinischer Anwendungen einzusetzen. Bei diesen bekannten medizinischen Anwendungen ging die Fachwelt jedoch ausschließlich davon aus, die magnetischen Partikel, ob diese nun mit einer Hüllschicht versehen sind oder nicht, direkt in den Blutkreislauf einzugeben.

Eine vorteilhafte Weiterausgestaltung des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht darin, daß der zellverträgliehen Wirkstofflösung zusätzlich 0,1 Vol.% Albumin beigegeben wird. Albumin gehört zu den Stoffen, die mit den Wirkstoffen Wasserstoffbrücken bilden oder kovalente Bindungen eingehen, ohne daß die Wirkstoffe in ihrer vorgesehenen Wirkung beeinträchtigt werden. Bei einem Wirkstoff wie Methotrexat, der nach alleinigem Einschluß in die Membranvesikel durch Wechselwirkung mit der Zellmembran zu deren vorzeitigen Zerstörung führen würde — was eine vorzeitige unkontrollierte Freisetzung des Wirkstoffes aus den Membranvesikeln und möglicherweise eine Verteilung des Wirkstoffes in der physiologischen Lösung zur Folge hätte — wird so die vorzeitige Zerstörung der Zellmembran verhindert.

Wird beispielsweise zu dem als Mittel zur Krebsbekämpfung bekannten Wirkstoff 6-Flourouracil und den magnetischen Substanzen das Protein Albumin oder ein Zucker, beispielsweise Saccharose, in die Membranvesikel eingeschlossen, so wird dadurch erreicht, daß die Membran der Membranvesikel etwa doppelt so lange stabil bleibt. Selbstverständlich ist es durch entsprechende Dosierung des die Zerstörung verzögernden Wirkstoffes auch möglich zu erreichen, daß die Membranvesikel nur über kurze Zeit intakt bleiben.

Eine besonders vorteilhafte Verwendung der Suspension gemäß vorgenannter Verfahrensvariante besteht beispielsweise in ihrer Verwendung beim Einsatz zur Behandlung von Tumoren. Hierzu wird das Methotrexat, das zu den Folsäureantagonisten gehört, die heute neben alkylierenden Wirkstoffen zu den wirksamsten Substanzen für die Behandlung von Neoplasien (Geschwulste) zählen, zusammen mit dem magnetischen Stoff und dem die Zerstörung der Zellmembran verzögernden Albumin in den Membranvesikeln eingeschlossen. Die Suspension wird sodann in die Blutbahn des Körpers injiziert und die Membranvesikel durch ein äußeres magnetisches Feld an der Stelle des Tumors festgehalten. Das nach vorbestimmter Zeit freiwerdende Methotrexat entfaltet sodann an der Stelle des Tumors seine Wirkung. Dadurch wird in vorteilhafter Weise verhindert, daß das Methotrexat im gesamten Blutkreislauf verteilt wird, überall im Körper seine Wirkung entfaltet und somit^; auch gesundes Gewebe angreift Dieser Nachteil war bei der bisher üblichen Anwendung des Methotrexats, wobei Methotrexat direkt in die Blutbahn injiziert wird, nicht zu verhindern. Bei Verwendung der nach der vorgenannten Verfahrensvariante hergestellten Membranvesikel wird zudem erreicht, daß eine geringere Dosis als bisher erforderlich für die Behandlung von Tumoren in den Körper eingebracht zu werden braucht oder daß eine geringere Zahl von Injektionen als bisher nötig ist, was dazu beiträgt, negative Neben- · Wirkungen beim Einsatz dieses Mittels zu vermeiden.

Werden in die Wirkstofflösungen weitere, die Zerstörung der Zellmembran bewirkende Stoffe eingegeben, so wird dadurch erreicht, daß die Zellmembran der Membranvesikel nach einer vorbestimmten Zeit zerstört wird. Bei Verwendung von solchen, die Zerstörung der Zellmembran bewirkenden Stoffen, wie zum Beispiel proteolytische Enzyme und Lipid abbauende Substanzen, wie Pronase, Phospholiphase und Trypsin, ist es beispielsweise nach Injizieren von Membranvesikeln in die Blutbahn eines tierischen oder menschlichen Körpers möglich, bestimmte, in den Membranvesikeln eingeschlossene Stoffe, wie beispielsweise Tetrazyklin, dem Ferritin beigefügt ist, durch Festhalten der Membranvesikel an einer bevorzugten Stelle in der Blutbahn zu sammeln und den Wirkstoff nach einer vorbestimmten Zeit in die Blutbahn freizusetzen. Hierdurch wird eine besonders hohe Effektivität des verwendeten Stoffes erzielt. Dabei ist es selbstverständlich möglich, eine Mischung von Membranvesikeln mit unterschiedlicher Dosis des die Zellmembran zerstörenden Wirkstoffes in die Blutbahn zu injizieren, um so den Verlauf der Freisetzung des Stoffes im Körper in vorbestimmter Weise zu steuern.

Eine sehr vorteilhafte Weiterausgestaltung des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht ferner darin, daß Methotrexat in Liposomen inkorporiert ist, welche einen Durchmesser von 5 bis 20 nm besitzen.

Da die Liposomen nach ihrer Freisetzung aus den Membranvesikeln sofort in das an die Blutbahn angrenzende Gewebe gelangen, ist es somit möglich, bestimmte Stoffe direkt in das Innere von Organen eines Körpers, das durch Blutkapillare nicht erreicht wird, zur Wirkung zu bringen. Dazu ist es lediglich erforderlich, die Membranvesikel zunächst in der Blutbahn des Organs durch Einwirkung eines von außen an den Körper angelegten magnetischen Feldes festzuhalten und danach den oder die mit Liposomen umhüllten Stoffe durch Zerstörung der Zellmembran freizusetzen.

Ausführungsbeispiel 1

Nach der von W. J. Schnehle und V. D. Deetschreak in J. appl. Phys. 32,2355 (1961) angegebenen Methode wurden zunächst Ferritpartikeln hergestellt, indem 1 Mol Kobaltchlorid und 2 Mol Eisen(IlI)-chlorid in 2 1 heißem, destilliertem Wasser gelöst und zu 1 I einer siedenden 8-molaren Natronlaugenlösung unter Rühren hinzugegeben wurden. Das gebildete Kobalt-Ferrit wurde so-

dann mit Wasser bis zum Erreichen der Neutralität gewaschen und danach große Partikeln abfiltriert Um nach dem Einschluß der Ferritteilchen in die Membranvesikel eine nachträgliche Hämolyse oder die Zerstörung der Membranvesikel zu vermeiden, wurden die Ferritpartikeln im Anschluß daran mit einem SüikonFilm überzogen, indem die die Ferritpartikeln enthaltende Suspension mit Silikonöl der Handelsbezeichnung AR5 geschüttelt wurden. Nach dem Abtrennen des Siiikonöls durch Abzentrifugieren wurden die Ferritpartikeln in eine Lösung folgender Zusammensetzung im Gewichtsverhältnis von 1 : lOsuspensiert:

105 mM KCl; 2OmM NaCl; 4 mM MgCl₂;

7.6 mM Na₂HPO₄;2,4 mM NaH₂PO₄ und
1OmM Glucose.

Zur Bildung der Membranvesikel wurden Erythrocyten, unabhängig von der Herstellung der Ferritpartikel, in einer Lösung der vorgenannten Zusammensetzung im Verhältnis von etwa 1 Volumenteil Erythrocyten zu 10 Volumenteilen der Lösung suspendiert Der pH-Wert der Lösung betrug 7,2.

Von der so gebildeten, die Erythrocyten enthaltenden Suspension wurden 10 ml in einer hierfür geeigneten Apparatur für 40 μsek bei O⁰C einer elektrischen Feldstärke von 12 kV/cm ausgesetzt Etwa 1 Minute nach Anwendung des elektrischen Feldes, auf die die Hämolyse erfolgte, wurden Methrotrexat im Verhältnis von 5 mM pro Liter Lösung sowie 1 ml der die Fei ritpartikeln enthaltenden Suspension zugegeben. Nach der Hämolyse, die etwa 5 Minuten dauerte, wurde die Lösung für weitere 5 Minuten auf 0⁰C gehalten, um einen Ausgleich zwischen dem in dem Zellinnern befindlichen Medium mit der Außenlösung, die das Methotrexat enthielt, zu erreichen. Im Anschluß daran wurde die Temperatur der Lösung auf 37 ⁰C erhöht, um das Ausheilen der in den Membranen durch das elektrische Feld bewirkten Veränderungen zu beschleunigen. Der Ausheilungsvorgang war dabei nach etwa 20 Minuten abgeschlossen. Um die mit den Ferritpartikeln beladenen Membranvesikel aus der Suspension zu gewinnen, wurde danach die Suspension mehrmals 2 Minuten lang bei einer Beschleunigung, die dem tausendfachen Wert der Erdbeschleunigung entspricht, zentrifugiert, wobei jeweils die auf den nicht eingeschlossenen Partikeln liegende Zellschicht entnommen wurde.

Die erhaltenen Membranvesikel wurden im Anschluß daran im Volumenverhältnis von 1 :10 in einer physiologischen Lösung suspendiert, die wie folgt zusammengesetzt war:

138,6 mM NaCl; 12,3 mM Na₂HPO₄;

2.7 mM NaH₂PO₄.

Der pH-Wert der Lösung betrug 7,4. Die so erhaltene Suspension wurde in ein Reagenzglas mit einem Durchmesser von 10 mm gefüllt und dieses zwischen die Polschuhe eines U-förmigen Permanentmagneten gebracht. Wie durch Untersuchungen mittels eines Mikroskops nachgewiesen werden konnte, sammelten sich die Membranvesikel an den an den Polschuhen anliegenden Reagenzglaswänden.

Bei einer Lagerung der Membranvesikel bei etwa 4⁰C wurden nach etwa einem Tag noch 90%, nach 2 Tagen 87%, nach 4 Tagen noch 65% und nach 7 Tagen noch 53% der Membranvesikel im Zellsediment nacheewiesen.

Ausführungsbeispiel 2

Die Membranvesikel wurden, wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, hergestellt dabei jedoch anstelle der die Ferritpartikeln enthaltenden Lösung 1 ml einer 10%igen isotonen Ferritintösung der die Erythrocyten enthaltenden Lösung zugegeben. Nach Präparation der gebildeten Membranvesikel wurde das eingeschlossene Ferritin mittels eines Elektronenmikroskops nachgewiesen.

Ausführungsbeispiel 3

Die Membranvesikel wurden, wie im Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, gebildet, jedoch, zusätzlich zu dem Methotrexat und den Ferritpartikeln noch 0,1 Volumen% Albumin in die Lösung gegeben, in der die Erythrocyten dem elektrischen Feld zur Permeabilitätserhöhung und zum Einschließen der Stoffe ausgesetzt wurden.

Die Membranvesikel konnten bei einer Temperatur von etwa 4°C über eine längere Zeit gelagert werden als die nach dem Ausführungsbeispiel 1 gebildeten Membranvesikel. Nach 7 Tagen wurden noch 85% der Membranvesikel im Zellsediment nachgewiesen.

Ausführungsbeispiel 4

Die Membranvesikel wurden, wie im Ausführungsbeispiel 1 angegeben, hergestellt. Anstelle jedoch der die Erythrocyten enthaltenden Lösung nach der Applizierung des elektrischen Feldes die das Methotrexat und die Ferritpartikeln enthaltende Lösung zuzugeben, wurden schon vor der Applizierung des elektrischen Feldes in die Lösung, in die die Erythrocyten eingegeben wurden, Saccharose und Pronase P in einer Dosierung eingegeben, so daß diese Lösung 10 mM Saccharose und 0,01 mg pro 100 ml Lösung Pronase P enthielt Die Saccharose war mit Radionuklid C 14 markiert.

Um die Wirkung des in dem Membranvesikeln eingeschlossenen Pronase P zu verfolgen, wurden die Membranvesikel in einer physiologischen Lösung der in Ausführungsbeispiel 1 angegebenen Zusammensetzung aufbewahrt, nach 20 Stunden abzentrifugiert uitd durch Messung der in der Lösung und der in den noch intakten beladenen Zellen enthaltenen Radioaktivität die Menge der intakten Membranvesikel festgestellt. Bezogen auf Membranvesikel, die ohne den Einschluß von Pronase P hergestellt worden waren, betrug die Zahl der noch intakten Membranvesikel nach 20 Stunden nur noch 11 %.

Ausführungsbeispiel 5

Die Zellen wurden, wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben, hergestellt. Statt jedoch nach der Applizierung des elektrischen Feldes die das Methotrexat und die Ferritpartikeln enthaltende Lösungen zuzugeben, wurden schon vor der Applizierung des elektrischen Feldes Methotrexat, das mit Tritium markiert worden war, Albumin und Phospholiphase C zugegeben. Der Anteil an Methotrexat in der Lösung betrug 5 mM, der an Albumin 0,1 Volumen% und der an Phospholiphase C 0,01 mg pro 100 ml Lösung.

Nach Bildung der Membranvesikel wurde die Wirkung der in den Zellen eingeschlossenen Phospholiphase C durch Messung der Radioaktivität — wie in Ausführungsbeispiel 4 angegebenen — festgestellt. Nach 20 Stunden waren noch — bezogen auf Membranvesikel,

7

die ohne Einschluß von Phospholiphase C hergestellt und zwar sogar in einem solchen Maße, daß die Niere — worden waren — nur noch 17% an intakten Membran- selbstverständlich je nach der injizierten Menge an Susvcsikeln vorhanden. pensionslösung — durch die festgehaltenen Erythrocy-

ten praktisch blockiert werden konnte. Ausführungsbeispiel 6

Zur Herstellung von Membranvesikeln durch Einwirkung osmotischen Druckes wurden Erythrocyten im Volumenverhältnis von 1 :1 in isotoner, phosphat-ge-

(M pufferter NaCl-Lösuhg der folgenden Zusammenset-J zung suspendiert:

138,6 mM NaCl; 12,3 mM Na₂HPO₄;

2,7 mM NaH₂PO₄.

!5

Der pH-Wert der Lösung betrug 7,4.
Von der so gebildeten Suspension wurde 1 ml zur Erhöhung der Permeabilität der Membran der Zellen zu 10 ml einer Lösung unter Rühren zugegeben, die 5 mM Metholrexat, das mit Tritium markiert worden war, 4 mM MgSO₄ und 5OmM Saccharose enthielt. Im Anschluß daran wurden weitere 1 ml einer Lösung zugegeben, die 4 mM MgSO₄, 50 mM Saccharose und Ferrit-Ipartikeln im Gewichtsverhältnis 1:10 enthielt. Die so gebildete Lösung wurde 5 Minuten bei 0° C belassen. Im Anschluß daran wurde die Osmolarität der ursprünglichen Lösung wieder hergestellt, indem eine entsprechende Menge einer 2 molaren KCl-Lösung zugegeben wurden. Die Lösung wurde darauf weitere 5 Minuten bei 0°C belassen und sodann die Temperatur für 20 Minuten auf 37°C erhöht, um das Ausheilen der Membranen zu beschleunigen. Nach Abzentrifugieren der so gebildeten Membranvesikel aus der Lösung wurden die Zellen in eine isotone, phosphat-gepufferte NaCl-Lösung der vorgenannten Zusammensetzung inkubiert.

Die so gebildeten Membranvesikel enthielten — bezogen auf die Volumeneinheit — praktisch die gleiche Menge an Methotrexat wie das Außenmedium, nämlich '

98% der in dem Außenmedium vorhandenen Konzentration an Methotrexat.

Der Nachweis der Wirkung der in den Membranvesikeln eingeschlossenen Ferritpartikeln geschah wie in ■ Ausführungsbeispiei i beschrieben.

45 Ausführungsbeispiel 7

Entsprechend Ausführungsbeispiel 1 wurden Erythrocyten mit Magnetpartikeln beladen und zusätzlich mit 51 -Cr radioaktiv markiert Sie wurden anschließend in isotone Kochsalzlösung im Verhältnis 1 :3 resuspendiert. IO bis 20 μΐ Suspension wurden jeweils in die Schwanzvene einer Maus injiziert, bei der unter Narkose eine Niere freigelegt und zwischen die Polschuhe eines Permanentmagneten geschoben worden war.

Nach etwa 10 bis 20 Minuten wurde die Maus getötet, |

die beiden Nieren entfernt und in der üblichen Weise die -j

Radioaktivität an den Nieren bestimmt Es zeigte sich, |

daß die Nieren, die sich im Magnetfeld befanden, durchschnittlich 20 bis 50% mehr Radioaktivität aufwiesen als die Kontrollieren der gleichen Tiere.

Es zeigte sich ferner, daß bei Injektionen von zu großen Suspensionsvolumina (etwa 200 μΐ) künstliche Trombosen in der im Magnetfeld befindlichen Niere erzeugt wurden.

Diese Versuchsergebnisse zeigen, daß mit Magnetteilchen beladene Erythrocyten in einem bestimmten Orean, hier der Niere, festgehalten werden konnten.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer Suspension von in physiologischer Lösung suspendierten, mit Methotrexat beladenen Erythrocyten, bei dem die Erythrocyten in einer zellverträglichen Wirkstofflösung suspendiert und der Einwirkung von osmotischem Druck oder eines elektrischen Feldes derart ausgesetzt werden, daß das Methotrexat im Stoffaustausch mit dem Zellinhalt in das Innere der Erythrocyten gelangt, die nach Regenerierung der durch den osmotischen Druck oder das elektrische Feld bewirkten Veränderungen der Zellmembran von der zellverträglichen Lösung abgetrennt und zur Aufbewahrung in einer physiologischen Lösung mit einer Osmolarität, die derjenigen des Inhalts der beladenen Zellen entspricht, suspendiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß in die zellverträgliche Wirkstofflösung zusätzlich magnetische Substanzen mit einem Durchmesser im Bereich zwischen 1 und 20 nm eingegeben werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zellverträglichen Wirkstofflösung zusätzlich 0,1 Vol.-% Albumin beigegeben wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Methotrexat in Liposomen inkorporiert ist, welche einen Durchmesser von 5 bis 20 nm besitzen.