DE2646879A1

DE2646879A1 - Matrix aus einem in wasser unloeslichen beta-1,3-glucangel und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2646879A1
Application number: DE19762646879
Authority: DE
Inventors: Seizi Igarasi; Yutaka Miyashiro; Masao Ogawa; Yoshio Yamazaki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1975-10-21
Filing date: 1976-10-16
Publication date: 1977-05-05
Also published as: US4143201A; NL7611565A; FR2328732A1; US4493894A; FR2328732B1; DK470676A; GB1577955A; SE7611646L; SE427932B

Description

VON KREISLER SCHÖNWALD MEYER EiSHOLD FUES VONKREISLER KELLER SELT&&46879

PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler + 1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. AIeIc von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, Köln

AvK/Ax

5 Köln 1 15.Oktober 1976

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27, Doshomachi 2-chome. Hiqashi-ku, Osaka (Japan).

Matrix aus einem in Wasser unlöslichen ß-1,3-Glucangel und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft eine Matrix, die aus einem in Wasser unlöslichen ß-1,3-Glucangel in Form von Perlen besteht. Der hier gebrauchte Ausdruck "Matrix" bezeichnet, falls nicht anders angegeben, beliebige Träger für immobilisierte Enzyme, für die ^ ffinitätschromatographie, Gelfiltration, für den Ionenaustausch und andere Anwendungen.

Von den bisher verwendeten Matrixmaterialien sind die Polysaccharide zu nennen. Hierzu gehören Cellulose, Dextran, Stärke und Agarose sowie ihre Derivate. Die idealen Matrixmaterialien, die als Füllung für Säulen der immobilisierten Enzyme und für die Affinitätschromatographie verwendet werden sollen, müssen beispielsweise 1) in Wasser unlöslich, 2) chemisch und mikrobiologisch beständig, 3) mechanisch fest und 4) hydrophil sein, 5) ausreichende chemische Funktionalität aufweisen, 6) sich mit Enzymen und Liganden kuppeln können, 7) kugelförmig sein, damit Flüssigkeiten ungehindert über sie fließen können, 8) nicht unspezifisch adsorptionsfähig und 9) zu niedrigen Kosten erhältlich sein.

Telefon: (0221) 234541-4 · Telex: 88823OTdOp.

4 · Telex: 88823o9dopa 3 HeiegWmm: Dompatent Köln "'«'Λ/Λί. /JVSPPr>T

Keines der bisher bekannten Materialien erfüllt alle vorstehend genannten Voraussetzungen. Allein Agarosegel ist verhältnismäßig befriedigend. Dieses Material hat jedoch den Nachteil, daß es 1) gegen Säuren unbeständig,; 2) gegen hohe Temperaturen empfindlich und 3) auf Grund seiner leichten Zusammendrückbarkeit für die Herstellung von Säulen mit großem Fassungsvermögen und großer Füllhöhe ungeeignet ist.

Es wurde nun gefunden, daß in Wasser unlösliche ß-1,3-Glucane in verhältnismäßig hohem Maße die vorstehend genannten Eigenschaften aufweisen und daß diese ß-1,3-Glucane in Form von Gelperlen bei Verwendung als Matrix für immobilisierte Enzyme und für die Affinitätschromatographie sehr geringen Strömungswiderstand aufweisen, wie durch das Bezugsbeispiel veranschaulicht, und außerdem die für Träger für die Gelfiltration, für den Ionenaustausch und andere Anwendungen sehr erwünschten Eigenschaften haben. Der Erfindung liegen diese Feststellungen zu Grunde.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß eine Matrix, die ein in Wasser unlösliches ß-1,3-Glucangel in Form von Perlen enthält, das für immobilisierte Enzyme, für die Affinitätschromatographie, die Gelfiltration, den Ionenaustausch und andere Anwendungen vorteilhaft ist.

Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung von in Wasser unlöslichen ß-1,3-Glucangelen in Form von Perlen mit Durchmessern im Bereich von etwa 5 bis 1000 u.

Zu den in Wasser unlöslichen ß-l,3-Glucanen, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind, gehören die Polysaccharide, die von Mikroorganismen der Gattung Alcaligenes und Agrobacterium gebildet werden, z.B. das Polysaccharid, das von Alcaligenes faecalis var. myxogenes 10C3K gebildet wird (Agricultural Biological

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Chemistry, Band 30 (1966) 196 ff. von Harada und Mitarbeitern), das Polysaccharid, das vom Mutantenstamm NTK-u (IFO 13140, ATCC 21680) von Alcaligenes faecalis var.myxogenes 10C3K gebildet wird (US-PSen 3 754 925 und 3 822 250) (nachstehend als PS-I bezeichnet), das von Agrobacterium radiobacter (IFO 13127, ATCC 6466) und seinem Mutantenstamm U-19 (IFO 13126, ATCC 21679) gebildete Polysaccharid (US-PSen 3 754 925 und 3 822 250) (nachstehend als PS—2 bezeichnet), Pachyman, das in der als Poria cocos bekannten rohen Droge vorkommt (Agr. Biol.Chem. Band 32, Nr.10 (1968) 1261), Laminaran, ein Bestandteil von Braunalgen, das Glucan, das ein Zellwandbestandteil von Hefen ist, usw. Bevorzugt für die ; Herstellung von Perlen aus einem solchen Glucangel werden beispielsweise die folgenden Verfahren: 1) Man führt ein Medium, das ein in Wasser unlösliches ß-l,3-Glucan enthält, durch Extrudieren, Tropfenlassen oder Sprühen in ein erhitztes Ölbad ein und bewirkt hierdurch Ge- . lierung des Glucans (japanische Offenlegungsschrift 52953/1973); 2) man löst ein in Wasser unlösliches ■! ß-l,3-Glucan in einer wässrigen Natriumhydroxyydlösung und führt die erhaltene Lösung durch eine Tropfdüse in eine wässrige Chlorwasserstofflösung ein und neutralisiert hierbei das Glucan und verursacht seine Gelierung (US-PS 3 899 480); 3) man gibt eine wäßrige alkalische Lösung des in Wasser unlöslichen ß-l,3-Glucan tropfenweise in ein organisches Lösungsmittel, das mit Wasser nicht leicht mischbar ist, worauf man die erhaltene

Dispersion mit einer organischen Säure neutralisiert. j

Für das letztgenannte Verfahren sind als Beispiele von ι alkalischen wässrigen Lösungen, die in Wasser unlösliche

ι ß-1,3-Glucane aufzulösen vermögen, wässrige Lösungen von Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Bariumhydroxyd, Calciumhydroxyd, Lithiumhydroxyd und Ammoniak zu nennen. Der i pH-Wert der wässrigen alkalischen Lösungen liegt im |

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allgemeinen im Bereich von 9 bis 14, vorzugsweise im
Bereich von 11 bis 13.

Die Konzentration des in der beschriebenen Weise verwendeten, in Wasser unlöslichen ß-l,3-Glucan hat einen
Einfluß auf den mittleren Durchmesser der gebildeten , Perlen. Normalerweise liegt sie im Bereich von etwa
0,5 bis 10%. Im allgemeinen ist der Durchmesser der ge- ; bildeten Perlen um so größer, je niedriger die Konzen- ' tration von ß-l,3-Glucan ist.

Zur Dispergierung einer Lösung von in Wasser unlöslichem ß-l,3-Glucan im organischen Lösungsmittel, das mit ! Wasser nicht leicht mischbar ist, wird die Lösung vorzugsweise tropfenweise unter Rühren zugesetzt. Die Dauer, während der die tropfenweise Zugabe erfolgt, unterliegt
keiner besonderen Begrenzung, außer daß sie nicht so lang sein darf, um Hydrolyse des in Wasser unlöslichen ß-1,3-Glucan zu bewirken. Geeignet ist im allgemeinen eine ; Dauer von 10 bis 90 Minuten. Bei diesem Arbeitsgang ' kann, falls erforderlich, ein oberflächenaktives Mittel : dem organischen Lösungsmittel zugesetzt werden. Im allgemeinen wird als oberflächenaktive Verbindung vorzugsweise ein nichtionogenes Tensid verwendet, jedoch ist
dies nicht zwingend. Die Konzentration des zugesetzten
Tensids im Verhältnis zum organischen Lösungsmittel
kann im Bereich von 0,1 bis 20% liegen und beträgt vor- ■ zugsweise 0,2 bis 10% (Gew./Vol.). Geeignet sind be- \ liebige organische Lösungsmittel, die mit Wasser nicht
leicht mischbar sind. Als typische Beispiele seien ge- \ nannt: Aromatische Kohlenwasserstoffe und ihre Derivate =

(z.B. Benzol, Toluol und Xylol), aliphatische Kohlen- j Wasserstoffe und ihre Derivate (z.B. Chloroform, Tetra- j Chlorkohlenstoff, Dichloräthan, η-Hexan und Cyclohexan),; Äther (z.B. Diäthyläther und Isopropylather), Ester i (z.B. Äthylacetat und Butylacetat) und Alkohole (z.B. ! n-Butanol und Isobutanol. j

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Die Drehgeschwindigkeit des Rührers, der zum Dispergieren des in Wasser unlöslichen ß-l,3-Glucan im vorstehend genannten organischen Lösungsmittel verwendet wird, hat einen großen Einfluß auf den Durchmesser der : als Produkt gebildeten Perlen. Im allgemeinen ist der Durchmesser dieser Perlen um so kleiner, je höher die ; Rührgeschwindigkeit ist. Bei einem bevorzugten Verfah- i ren zur Gelierung der Dispersion des in Wasser unlös- ι liehen ß-1,3-Glucan wird zur Dispersion eine Säure gegeben, die im organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht leicht mischbar ist, löslich ist. Zu den bevorzugten Säuren gehören Ameisensäure, Essigsäure, Propion-

säure und Benzoesäure. Der Durchmesser der Perlen des in Wasser unlöslichen ß-1,3-Glucangels hängen zwar von den Herstellungsbedingungen ab, jedoch liegt er im allgemeinen im Bereich von 5 bis 1000 n. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Gelperlen als GeIfiltrations-' matrix ist im allgemeinen ein kleinerer Durchmesser er- ι wünscht, um höhere Trennschärfe zu erzielen, jedoch j liegt der Durchmesser der Perlen unter Berücksichtigung ; des Druckabfalls und anderer Faktoren vorzugsweise im ! Bereich von etwa 5 bis 500 u und zur Erzielung noch besserer Ergebnisse im Bereich von etwa 30 bis 150u.

Um die Probleme zu lösen, die mit der Anwendung einer Matrix oder eines Trägers für immobilisierte Enzyme und für die Affinitätschromatographie verbunden sind,

entwickelte die Anmelderin ferner ein Verfahren zum j Einkapseln eines Kernmaterials von kleinem Durchmesser | in dem in Wasser unlöslichen ß—1,3—Glucan. Der Anmel- \ derin gelang die Herstellung von Gelperlen (nachstehend ι als Mikrokapseln bezeichnet) , die aus einem feinen Kern-^ material und aus dem in Wasser unlöslichen ß-l,3-Glucan bestehenden Umhüllungsmaterial bestehen und nach Wahl so beschaffen sein können, daß sie in Abhängigkeit vom spezifischen Gewicht des jeweils gewählten Kernmaterials entweder auf dem Wasser schwimmen oder im Wasser zu

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Boden sinken. Als Kernmaterial eignen sich beispiels- ; weise SIRASU-Perlen, Perlen aus Bimsstein, Aluminiumoxyd, Siliciumdioxyd, Glas und hohle Glasperlen. Wenn
das spezifische Gewicht des Kernmaterials höher ist als j 1, bieten die in eine Kolonne gefüllten Mikrokapseln
einen noch geringeren Strömungswiderstand als Perlen aus dem in Wasser unlöslichen ß-1,3-Glucangel. Wenn das
spezifische Gewicht der Mikrokapseln unter 1 liegt, ; kann ein Enzym oder ein anderes aktives Ingrediens an
den Kern geheftet und hierdurch ein immobilisiertes ' Enzympräparat hergestellt werden. Wenn dieses Präparat
in einem Chargenreaktionssystem verwendet wird, in dem ι das Reaktionsprodukt sich als Fällung abscheidet, ! schwimmt das immobilisierte Enzym auf dem Reaktionsge- \ misch, so daß die Abtrennung des ^Reaktionsprodukts
erheblich erleichtert wird. In dieser Weise wird ein
technisch sehr vorteilhaftes Verfahren verfügbar.

Die bekannten Gelfiltrationsmethoden können mit den ■ Gelperlen gemäß der Erfindung durchgeführt werden. Als { Beispiel sei das folgende Verfahren beschrieben: Eine [ Kolonne wird mit den Perlen des in Wasser unlöslichen ! ß-1,3-Glucangels gefüllt. Dann wird eine geeignete
Pufferlösung mit geeigneter Strömungsgeschwindigkeit ■ durch die Kolonne geleitet, um das Bett zu waschen, worauf eine bestimmte Menge einer ähnlichen Pufferlösung, , die eine Probe enthält, auf die Kolonne aufgegeben wird. Die Elution wird unter Verwendung einer ähnlichen Puf- j ferlösung in bestimmter Durchflußmenge durchgeführt, j und das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Dieses ■ Verfahren eignet sich zur Trennung von Gemischen und , zur Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen, Polysacchariden und anderen Substanzen.

Wenn die Gelperlen gemäß der Erfindung als Träger für
immobilisierte Enzyme oder für die Affinitätschromatographie verwendet werden, hat es sich gezeigt, daß die

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Menge der gekuppelten Enzyme und Liganden um so höher ist, je kleiner der Durchmesser der Perlen ist. Wenn jedoch die Perlen als Packung in einer Kolonne verwendet werden, muß wiederum der Druckabfall berücksichtigt, werden. Hierbei liegt der Durchmesser der Perlen vorzugsweise im Bereich von etwa 30 bis 500 η und zur Er- ^; zielung noch besserer Ergebnisse im Bereich von etwa ■ 30 bis 300 u. ι

Zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms oder eines Träger-Ligand-Komplexes für die Verwendung bei der Affinitätschromatographie kann beispielsweise das in ι der DT-OS 25 51 438 der Anmelderin beschriebene Verfahren angewendet werden. Hierzu wird 1 Teil der in Wasser unlöslichen ß-l,3-Glucangelperlen in 50 Raumteilen Wasser suspendiert , worauf 20 bis 60 Raumteile Wasser, das 0,1 bis 3 Teile eines Cyanhalogenids enthält, zugesetzt werden. Unter Rühren bei einer beliebigen Temperatur zwischen 0° und 50°C wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch tropfenweise Zugabe einer wässrigen 2n-Natriumhydroxydlösung auf 11 erhöht, wobei darauf geachtet wird, daß die Gelperlen sich nicht lösen (Steigerungsgeschwindigkeit etwa 0,5 pH-Einheiten/Minute) . Das Gemisch wird weitere 15 Minuten bei pH 11 gehalten, wodurch die Aktivierungsreaktion zur Vollendung gebracht wird. Nach beendeter Reaktion werden die Feststoffe abfiltriert und mit dem 10-fachen Wasservolumen gespült. Die in dieser Weise erhaltenen aktivierten Gelperlen sind in V/asser und in wässrigen Alkalilösungen unlöslich und durch Wärme nicht gelierbar. Die Abmessungen und die Festigkeit der Einzelperlen :

genügen, um nach der Einfüllung in Kolonnen eine ausreichende Durchflußmenge sicherzustellen.

Unter Verwendung dieser aktivierten Gelperlen können auch Träger—Ligand—Komplexe hergestellt werden. Bei einem Verfahren mit diesem Ziel werden die aktivierten

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Gelperlen mit einer Substanz, die eine primäre oder
sekundäre Aminogruppe enthält, z.B. einem Enzym, Protein, Peptid., einer Aminosäure, einem Coenzym, einem
Enzymsubstrat oder Inhibitor, Antigen, Antikörper,
Hormon o.dgl. vorzugsweise in einer schwach, alkalischen] wässrigen Lösung bei einer beliebigen Temperatur im ; Bereich von etwa 0° bis 50⁰C umgesetzt. J

Die Erfindung wird durch die folgenden Bezugsbeispiele
und Ausführungsbeispiele weiter erläutert.

Bezuqsbeispiel 1

Die Färbbarkeit der gemäß Beispiel 2 (Neutralisationsverfahren) und Beispiel 19 (Erhitzungsverfahren) herge- ₍ stellen PS-1-Gelperlen wurde unter Verwendung von ! wasserlöslichen Farbstoffen nach der Methode von
Nakanishi und Mitarbeitern (Carbohydrate Research 32
(1974) 47-52) ermittelt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt. :

Tabelle 1: Färbbarkeitstest

Probe

PS-1-Perlen PS-l-Per-(Neutralisalen tionsverfah- (Erhitren) zungsverfahren)

Farbstoff Kongorot

Trypanblau Anilinblau Lösliches Blau Fuchsin

Brilliantblau Methylenblau Toluidinblau 0

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•Λ. j

Bezuqsbeispiel 2 ί

1) Die Eignung der gemäß Beispiel 1 hergestellten PS-1-Gelperlen als Träger für immobilisierte Enzyme oder für die Affinitätschromatographie wurde untersucht. !

I)-(I) Die Gelperlen wurden in eine Kolonne mit 21,1 mm! Innendurchmesser unter Bildung eines Betts einer Höhe von 50 mm gefüllt. Dann wurde Wasser mit einer Dosier- ■ pumpe durchgeleitet. Die Beziehung von Durchflußmenge \ zu Druckabfall wurde untersucht. Die Ergebnisse sind ί in Tabelle 2 genannt.

Tabelle 2

Durchflußmenqe, ml/Std. Druckabfall, mm WS 48,9 25

71,6 50

112 150

Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen eindeutig, daß die Gelperlen gemäß der Erfindung der durchströmenden Flüssigkeit einen sehr geringen Widerstand bieten, so daß sie als chromatographischer Träger sehr gut geeignet sind.

(I)-(II) Gelperlen wurden wie folgt aktiviert: 100 ml destilliertes Wasser wurden zu 133 ml Gelperlen (entsprechend 5 g PS-1-Pulver) gegeben, wobei eine Suspension gebildet wurde. Getrennt hiervon wurden 5 g BrCN in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Suspension und die Lösung wurden zusammengegeben, worauf der pH-Wert durch Zusatz von 5n-Na0H allmählich erhöht wurde, bis pH 11 erreicht war. Das System wurde 15 Minuten bei pH 11 gehalten, wobei ein aktiviertes Gel von PS-I erhalten wurde. Das Gel wurde durch ein Glasfilter gege-, ben. Der Filterkuchen wurde mit 500 ml destilliertem Wasser gespült.

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Um die Fähigkeit dieses Produkts, hohe Durchflußmengen ' unter den Versuchsbedingungen der Säulenchromatographie ' zuzulassen, zu ermitteln, wurde der Druckabfall wie
folgt festgestellt: Das Produkt wurde in eine Chromatographiesäule von 19,5 mm Durchmesser und 229 mm Höhe gefüllt. Durch diese Säule wurde7Wasser mit unterschied- ■ liehen Durchflußmengen geleitet, um die Änderungen der ι Höhe des Betts und des Druckabfalls zu ermitteln. Die
Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 3 genannt.

/ mit Hilfe einer volumetrische]! Pumpe ί

Tabelle 3

Durchflußmenge ml/Std.	Druckabfall mm Hg	Höhe des Betts mm
405	14	229
455	20	228
800	54	218

Die Ergebnisse zeigen, daß die Perlen eine hohe Festigkeit hatten und kaum zusammendrückbar waren und, wie
Fig.l zeigt (Druckabfall unter der Annahme einer Betthöhe der Perlen von 1 m), von einem flüssigen Medium
leichter durchströmt werden als das z.Zt. am häufigsten
verwendete Agarosegel, so daß die Perlen gemäß der
Erfindung als chromatographischer Träger besser geeig- ^; net sind. \

(I)-(III) Ein immobilisiertes Enzympräparat wurde unter ! Verwendung der PS-1-Gelperlen wie folgt hergestellt: | 126 ml der vorstehend genannten aktivierten PS-l-Gel- ! perlen (entpsrechend 5 g PS-1-Pulver) wurden mit einer
Lösung von 50,9 mg α-Aminosäureesterhydrolase von
Xanthomonas citri (IFO 3835) (japanische Offenlegungsschrift Nr. 25 388/1972) (mit CMC behandelt, Lyophilisat) in 50 ml destilliertem Wasser zusammengegeben.
Nach Zugabe von 50 ml eines 0,2-molaren Phosphatpuffers
(pH 8,0) und 24 ml destilliertem Wasser wurde das Gemisch 20 Stunden bei 5°C und pH 8 gerührt. Das Reak-

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tionsgemisch wurde filtriert und der Filterkuchen mit
0,2-molarer Glycinlösung, 0,5-molarem wässrigem Natriumchlorid und destilliertem Wasser in dieser Reihenfolge , gewaschen, wobei ein immobilisiertes Enzympräparat

erhalten wurde.

In der vorstehend beschriebenen Weise wurden 95% des ! Proteins immobilisiert. Die Enzymaktivität dieses I Präparats wurde auf der Grundlage der Hydrolysenge- ^: schwindigkeit von D-Phenylglycinmethylester bestimmt.
Diese Bestimmung ergab, daß 90% der Aktivität immobilisiert worden waren. ]

Bezugsbeispiel· 3

Die Eignung von Perlen des PS-l-Gel·s für die Gelfiltration wurde untersucht.

Eine Glaskolonne mit einem Innendurchmesser von 26 mm ; wurde mit den Perlen des gemäß Beispiel 4 hergestellten PS-1-Gels bis zu einer Höhe von 415 mm gefüllt.
Die Perlen wurden über Nacht mit einem 0,05-molaren ' tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 0,1 Mol KCl enthielt, : mit einer Durchflußmenge von 30 ml/Std. gewaschen.

Jeweils 1 ml der gleichen Pufferlösung, der 3 mg einer
der in Tabelle 4 genannten Proben zugesetzt worden
waren, wurde auf die Kolonne aufgegeben. Anschließend
wurde mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durch_
flußmenge von 30 ml/Std. entwickelt. Der Ablauf wurde j in Fraktionen von je 3 ml aufgefangen. Die Extinktion j bei 280 rau wurde bestimmt mit dem Unterschied, daß die I Phenol-Schwefelsäure-Methode für Dextran verwendet | wurde. Die in Tabelle 4 genannten Ergebnisse zeigen, daß| die Proben aus den Säulen in der Reihenfolge ihrer Mole-j kulargewichte austraten, ein Zeichen für die Eignung der¹ Perlen als Molekularsieb. Die Beziehung des Molekulargewichts zum Verteilungkoeffizienten ist in Fig.2 für
das oben genannte PS-l-Gel dargestellt. Die Ausschlies-

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sungsgrenze im Molekulargewichtsbereich für globulare
Proteine lag bei 1,1 χ 10 .

Tabelle 4

Probe	Molekular- qewicht	Ablauf ml	4	Verteilungs koeffizient
Dextran 2000	2.000.000	69
Cytochrom C	12.400	215	0,96
Rinderalbumin	67.000	172	0,68
γ-Globulin	160.000	152	0,55
Glutamatdehydro- genase	350.000	126	0,37
	Bezuqsbeispiel

Die Eignung der gemäß Beispiel 19 hergestellten PS-I- j Gelperlen als Träger für immobilisierte Enzyme wurde
untersucht.

Zur Aktivierung der Gelperlen wurden 100 ml destillier- ■ tes Wasser zu 115 ml Gelperlen (entsprechend 5 g PS-I- ^! Pulver) gegeben, wobei eine Suspension gebildet wurde. | Getrennt hiervon wurden 5 g BrCN in 100 ml destillier- ; tem Wasser gelöst. Die Suspension und die Lösung wurden
zusammengegeben, worauf der pH-Wert durch Zusatz von
5n-NaOH allmählich auf 11 erhöht wurde. Das System
wurde 15 Minuten bei pH 11 gehalten, wodurch ein akti- ! viertes Gel von PS-I erhalten wurde. Das Gel wurde durch ein Glasfilter filtriert. Der Filterkuchen wurde mit j 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. 126 ml der ak- s tivierten PS-1-Gelperlen (entsprechend 5 g PS-1-Pulver) j wurden mit einer Lösung von 50,9 mg 3a—Aminosäure- i esterhydrolase von Xanthomonas citri (IFO 3835) (japanische Offenlegungsschrift 25388/1972) (mit CMC behandelt, Lyophilisat) in 50 ml destilliertem Wasser zusammengegeben. Nach Zugabe von 50 ml 0,2-molarem Phos-

phatpuffer (pH 8,0) und 24 ml destilliertem Wasser wurde· das Gemisch 20 Stunden bei 5°C und pH 8 gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde filtriert und der Filterkuchen

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mit 0,2-molarer Glycinlösung, 0,5-molarer wässriger ^; Natriumchloridlösung und destilliertem Wasser in dieser, Reihenfolge gewaschen, wobei ein immobilisiertes Enzympräparat erhalten wurde. ;

In der vorstehend beschriebenen Weise wurden 92,9% des ' Proteins immobilisiert. Die Enzymaktivität des Präparats wurde auf der Grundlage der Hydrolysengeschwindigkeit von D-Phenylglycinmethylester bestimmt. Diese Bestimmung ergab, daß 90% der Aktivität immobilisiert worden waren.

Bezugsbeispiel 5

Die Eignung der gemäß Beispiel 19 hergestellten Perlen des PS-1-Gels für die Gelfiltration wurde untersucht.

Eine Glaskolonne mit einem Innendurchmesser von 15 mm wurde mit den gemäß Beispiel 19 hergestellten Perlen des PS-1-Gels bis zu einer Höhe von 215 mm gefüllt. Die Perlen wurden über Nacht mit einem 0,05-molaren Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 0,1 Mol KCl enthielt, mit einer Durchflußmenge von 21 ml/Std. gewaschen.

1 ml der gleichen Pufferlösung, der 3 mg jeweils einer der in Tabelle 5 genannten Proben zugesetzt worden waren, wurde auf die Säule aufgegeben. Anschließend wurde mit der gleichen Pufferlösung in einer Durchflußmenge von 21 ml/Std. entwickelt. Der Ablauf wurde in Fraktionen von je 3 ml aufgefangen. Die Extinktion der Fraktionen bei 280 mu wurde bestimmt, wobei jedoch die Phenol-Schwefelsäure-Methode für Dextran angewendet wurde. Die in Tabelle 5 genannten Ergebnisse zeigen, daß die Proben aus den Säulen in der Reihenfolge der Molekulargewichte austraten, ein Beweis für die Eignung der Perlen als Molekularsieb. Die Beziehung des Molekulargewichts zum Verteilungskoeffizienten war derart, daß die Ausschließungsgrenze im Molekulargewichtsbereich für globulare Proteine 7,0 χ 10 betrug.

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Tabelle 5 '

Probe	Molekular	Ablauf	Verteilungs
	gewicht	ml	koeffizient
Dextran 2000	2.000.000	15,8
Cytochrome C	12.400	39,5	1,08
Rinderalbumin	67.000	29,0	0,60
Fibrinogen (Rind)	340.000	20,2	0,20
Bezugsbeispiel 6

Zu 125 ml von gemäß Beispiel 9 hergestelltem PS-I in
Form von Perlen (Teilchendurchmesser 50-200 u) (entsprechend etwa 5 g PS-I auf Trockenbasis) wurden 100 ml
Wasser und 100 ml 5%iges (Gew./Vol.) Cyanbromid gegeben . i

Bei 25°C wurde unter Rühren 2n-Natriumhydroxydlösung
mit einer automatischen Titriervorrichtung in solchen
Mengen zugetropft, daß der pH-Wert mit einer Geschwin- j digkeit von etwa 0,5 pH/Minute allmählich stieg, bis ! ein End-pH-Wert von 11 erreicht war. Das System wurde ι etwa 15 Minuten bei pH 11 gehalten, wodurch die Reaktion bis zur Vollendung stattfand. Nach dieser Reaktion
wurde der Feststoff abfiltriert und mit 500 ml destilliertem Wasser gespült. In dieser Weise wurde ein aktiviertes perlförmiges PS-I erhalten (Trockengewicht
5,1 g).

1 g dieser aktivierten PS-1-Gelperlen (auf Trockenbasis); wurde in 50 ml 0,05-molarem Phosphatpuffer (pH 8,0) 1 suspendiert, wobei eine Suspension erhalten wurde. Die- j ser Suspension wurden 20 ml der genannten Phosphatpuf- , ferlösung zugesetzt, in der 200 mg £ —Aminocapryl-D- J tryptophanmethylester als Ligand gelöst worden waren. j Das Gemisch wurde 20 Stunden bei 5°C unter sachtem ! Rühren umgesetzt. Anschließend wurde der Feststoff mit I einem Glasfilter abfiltriert und mit 500 ml 0,05-molarem Phosphatpuffer (pH 8,0), der 1 Mol NaCl enthielt,

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it-

gewaschen,

Auf der Grundlage der Extinktion der erhaltenen Wasch- j flüssigkeit bei 280 mu wurde eine Immobilisierung des ; Liganden von 22% berechnet. \

ι Eine Glaskolonne mit einem Durchmesser von 20 mm wurde .

mit der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen ^:

i Affinitätsmatrix bis zu einer Höhe von 100 mm gefüllt :

und mit einem 0,05-molaren Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) ^: ins Gleichgewicht gebracht. 2 ml der oben genannten j Pufferlösung, in der IO mg a-Chymotrypsin (Hersteller ! Worthington Biochemical Co., USA) gelöst worden waren, \ wurde auf die Säule aufgegeben. Anschließend wurde mit ' 100 ml der gleichen Pufferlösung gewaschen. Hierbei \ traten 8% des ursprünglichen Proteins (bestimmt auf
Grund der Extinktion bei 280 mu) aus. Die Aktivität
von α-Chymotrypsin, bestimmt als Esteraseaktivität
unter Verwendung von Benzoyl—L—tyrosinäthylester als
Substrat, wurde nicht beobachtet. Ferner wurde mit
100 ml 0,1-molarer Essigsäure eluiert. Hierbei wurden \ 90% des ursprünglichen Proteins und 96% der Aktivität
zurückgewonnen.

Beispiel 1 ;

Zu 9 g pulverförmiger!! PS-I (siehe oben) wurden 270 ml

gereinigtes Wasser gegeben, worauf durch Rühren eine '

Aufschlämmung gebildet wurde. Zu dieser Aufschlämmung ,

wurden 30 ml In—NaOH gegeben, wobei das PS-I gelöst und '

eine wässrige Lösung von PS-I und Natriumhydroxyd ge- '

bildet wurde. In ein 2 1-Becherglas wurden 1200 ml
Toluol und 6 g des oberflächenaktiven Derivats von
Polyoxyäthylen und hydriertem Rizinusöl "Emalex HC-30"
(Hersteller Nihon Emulsion Co. Ltd._t Japan) gegeben.
Unter Rühren mit einem Schneckenrührer bei 800 UpM
wurde die oben genannte wässrige Lösung von PS-I und
Natriumhydroxyd bei Raumtemperatur tropfenweise züge-

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setzt. Die erhaltene PS-1-Dispersion wurde zu einem ■ Gemisch von 2000 ml Toluol und 100 ml Essigsäure unter | Rühren bei 800 UpM gegeben, worauf noch ungefähr eine
weitere Stunde gerührt wurde. Das Gemisch wurde dann ; etwa 3 Stunden stehen gelassen. Nach dieser Zeit hatte ^! sich das als Produkt gebildete Gel abgesetzt. Das ; Lösungsmittel wurde durch Dekantieren entfernt und das i zurückbleibende Sediment fünfmal mit je 2 1 gereinigtem ^; Wasser neutral gewaschen, wodurch das organische Lö- I sungsmittel vollständig entfernt wurde. In dieser Weise'

wurden 240 ml PS-l-Gel erhalten. Dieses Gel hatte die j folgenden Teilchendurchmesser: |

30 - 50 JU 4,0%

50 - 100 u 42,8% i

100 - 200 u 36,8%

200 - 300 u 16,4%

Jedes Teilchen war perlförmig. Eine Mikroskopaufnahme ι dieser Gelperlen zeigt Fig.3 (8 Teilstriche auf der j Skala entsprechen 100 u). i

i Beispiel 2 _;

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurde eine
wässrige Lösung, die Natriumhydroxyd und PS-I enthielt, , das aus 10 g pulverförmigem PS-I, 140 ml gereinigtem ^: Wasser und 60 ml. 5n-NaOH hergestellt worden war, in ; 1200 ml Toluol in Gegenwart von 6,7 g des Tensids ! "Emalex HC-30" durch Rühren mit 800 UpM dispergiert. \ Die Dispersion wurde zu einem Gemisch von 2000 ml Toluol und 100 ml Essigsäure gegeben. In dieser Weise wurden
206 ml Gelperlen mit Durchmessern von 50 bis 150 u
erhalten. Dieses Produkt eignete sich als Matrix.

Beispiel 3

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt,) wobei jedoch 6 g der oberflächenaktiven Verbindung
"Emalex HC-40" (Nihon Emulsion Co.Ltd., Japan) als
Tensid verwendet wurden. Als Produkt wurden 265 ml Gel-

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perlen mit Durchmessern von 50 bis 250 η erhalten. Die Perlen eigneten sich als Matrix.

Beispiel 4

Unter Verwendung von 6 g der oberflächenaktiven Verbindung "Emalex HC-20" (Nihon Emulsion Co.Ltd.) wurde der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wiederholt, wobei 280 ml Gelperlen mit Durchmessern von 30 bis 150 u erhalten wurden.

Beispiel 5

Unter Verwendung von 6 g eines Derivats von Polyoxyäthylen und Rizinusöl "Emalex C-40" (Nihon Emulsion Co.Ltd.) als Tensid wurde der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wiederholt, wobei 312 ml Gelperlen mit Durchmessern von 15 bis 100 u erhalten wurden. Auch diese Perlen eigneten sich als Matrix.

Beispiel 6

Unter Verwendung von 6 g des Tensids "Tween 60" wurde der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wiederholt, wobei Gelperlen mit Durchmessern von 15 bis 200 u . erhalten wurden. Die Perlen eigneten sich als Matrix. !

Beispiel 7 i

Unter Verwendung von Benzol an Stelle von Toluol als geschlossene Phase der Dispersion wurde der in Bei- j spiel 1 beschriebene Versuch wiederholt, wobei 240 ml J Gelperlen mit Durchmessern von 100 bis 300 u erhalten wurden. Diese Perlen eigneten sich als Matrix.

Beispiel 8
Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt,

wobei jedoch mit 1200 UpM gerührt wurde. Hierbei wurden) 223 ml Gelperlen mit Durchmessern von 20 bis 100 u erhalten. Diese Perlen eigneten sich als Matrix.

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26AB879

Beispiel 9 '

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch Ameisensäure an Stelle von Essigsäure als Neutralisationsmittel verwendet wurde. Hierbei wurden 250 ml Gelperlen erhalten, die Durch- '■ messer von 40 bis 200 u hatten und sich als Matrix ι eigneten.

Beispiel 10

Zu 3 g Pachyman-Pulver wurden 90 ml gereinigtes Wasser gegeben, worauf gerührt wurde, bis sich eine Auf- ! schlämmung gebildet hatte. Durch Zusatz von 10 ml j 5n-NaOH wurde das Pachyman gelöst. In ein 1 1-Becher- j glas wurden 500 ml Toluol und 2 g des Derivats von | Polyoxyäthylen und hydriertem Rizinusöl "Emalex HC-30" ^! gegeben. Unter Rühren mit 800 UpM wurde die oben genannte wässrige Lösung von Pachyman und Natriumhydroxyd bei Raumtemperatur zugetropft. j

Die erhaltene PachymandiSpersion wurde zu einem Gemisch von 2000 ml Toluol und 100 ml Essigsäure gegeben, wo- j rauf etwa 1 Stunde gerührt wurde. Das Lösungsmittel wurde durch Dekantieren entfernt und das abgesetzte Gel mit Wasser gespült. Hierbei wurden 80 ml Pachyman- j gel mit Durchmessern von 50 bis 30Ou erhalten. Dieses _; Produkt eignete sich als Matrix. j

Beispiel 11

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch mit 2100 UpM gerührt wurde. Hierbei wurden 280 ml Gelperlen erhalten, die Durchmesser von 5 bis 50 u hatten und sich als Matrix eigneten.

Beispiel 12

Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wurde wiederholt^ wobei jedoch mit 400 UpM gerührt wurde. Hierbei wurden 200 ml Gelperlen erhalten, die Durchmesser von 200 bis j

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-a. ι

1000 u hatten und sich als Matrix eigneten.

Beispiel 13

3 g PS—1—Pulver wurden durch Zusatz von 144 ml ge- ; reinigtem Wasser und 16 ml In-NaOH gelöst. Zur Lösung j wurden 9 g SIRASU-Perlen (0,25 bis 0,42 mm (40-80 ' mesh), Sanki Engineering Co.Ltd., Japan) gegeben, wo- ! rauf gerührt wurde. Unter Rühren mit 360 UpM wurde ' dieses Gemisch tropfenweise zu einer Lösung von 600 ml Toluol und 2 g der oberflächenaktiven Verbindung
"Emalex HC-30" gegeben. Dieser Dispersion wurden 15 ml Essigsäure zugesetzt, wobei Gelbildung stattfand. Das ] Reaktionsgemisch wurde durch ein Nylontuch gefiltert. ' Der Filterkuchen wurde mit Wasser gespült. Wie Fig.4 ' zeigt (8 Teilstriche auf der Skala entsprechen 100 η), ergab eine Untersuchung des Filterkuchens unter dem
Mikroskop, daß kugelförmige Mikrokapseln, die eine
Größe von 0,42 χ 0,84 mm (20-40 mesh) hatten und je- ^: weils aus einer SIRASU-Perle als Kern und PS-I als j Hülle bestanden, gebildet worden waren. '

Beispiel 14

^Der in Beispiel 13 beschriebene Versuch wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß Dichloräthan an Stelle
von Toluol verwendet wurde, wobei ebenfalls Mikrokap- ; sein erhalten wurden. ■

Beispiel 15 j

Der in Beispiel 13 beschriebene Versuch wurde wieder- ! holt, wobei jedoch kugelförmiges Aluminiumoxyd (^lrNeo
Bead C", 0,25 bis 1,41 mm (14-60 mesh), Mizusawa
Industrial Chemicals Ltd., Japan) an Stelle der SIRASU-Perlen verwendet wurden. Auch hier wurden Mikrokapseln erhalten.

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Beispiel 16 ;

Mikrokapseln wurden auf die in Beispiel 13 beschriebene Weise hergestellt, wobei jedoch Glasperlen ("BH-W", 74-105 η (150-200 mesh), Nippon Electric ^; Glass Co., Ltd., Japan) an Stelle von SIRASU-Perlen verwendet wurden. ι

Beispiel 17 j

Mikrokapseln wurden auf die in Beispiel 13 beschriebene Weise hergestellt, wobei jedoch an Stelle von SIRASU-Perlen kugelförmiges Siliciumdioxyd ("Silbead W", 3,36-4,76 mm (4-6 mesh), Mizusawa Industrial Chemicals j Ltd., Japan) verwendet wurden. !

Beispiel 18 ^!

Mikrokapseln wurden auf die in Beispiel 13 beschriebene Weise hergestellt, wobei jedoch an Stelle von SIRASU-Perlen Bimsstein (0,42-0,59 mm, 28-40 mesh, Ishikawaraito Co. Ltd., Japan) verwendet wurde. j

Beispiel 19 j

Zu 20 g PS-1-Pulver wurden 660 ml destilliertes Wasser ι gegeben. Durch Rühren wurde eine Suspension gebildet. Diese Suspension wurde tropfenweise unter Rühren mit

einem Mischer (Homomixer) bei 2500 UpM zu 2 1 Maisöl ^! gegeben, das auf 80 bis 85°C erhitzt war, worauf weitere 30 Minuten gerührt wurde. Die erhaltene PS-1-Dispersion-wurde auf Raumtemperatur gekühlt und das Maisöl ' durch Dekantieren entfernt. Das abgesetzte Gel wurde !

mit 400 ml Toluol gespült. Das Spülen wurde wiederholt, bis das Maisöl vollständig entfernt war.

Das Toluol wurde mit destilliertem Wasser durch Dekantieren entfernt. Hierbei wurden 460 ml PS-l-Gel er- ι halten, das die folgende Teilchengrößenverteilung hatte:

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264Έ879

50 - 100 Ji 22,5%

100 - 150 u 46%

150 - 200 u 21%

200 - 250 u 5%

250 - 300 u 4%

300 - 350 Ji 1,5%

709818/105S

Leerseite

Claims

-JM-

Patentansprüche ■

ι 1) yVerfahren zur Herstellung einer Matrix in form von : Perlen mit Durchmessern im Bereich von etwa 5 bis 1000 AJ, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige alkalische Lösung eines in Wasser unlöslichen ß-1,3- ; Glucan in einem organischen Lösungsmittel, das mit j Wasser nicht leicht mischbar ist, dispergiert und zur j erhaltenen Dispersion eine organische Säure gibt.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

ι die Konzentration des in Wasser unlöslichen ß-1,3- | Glucan in der alkalischen wässrigen Lösung im Bereich von etwa 0,5 bis 10% liegt. ;
3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige alkalische Lösung des in Wasser unlöslichen ß-l,3-Glucan verwendet, die ein Kernmaterial enthält. '
4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeich- J net, daß man als Kernmaterial SIRASU-Perlen verwendet, j
5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kernmaterial kugelförmiges Aluminiumoxyd ; verwendet. ι
6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeich- ι

net, daß man als Kernmaterial Glasperlen verwendet. j
7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeich- ι net, daß man als Kernmaterial Bimsstein verwendet. j
8) Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige alkalische Lösung des in Wasser unlöslichen ß-l,3-Glucan einen pH-Wert im Bereich von 9 bis 14 hat.

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9) Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkali Natriumhydroxyd verwendet.
10) Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeich- ; net, daß man als organisches Lösungsmittel einen J aromatischen Kohlenwasserstoff verwendet.
11) Verfahren nach Anspruch 1 bis 9>, dadurch gekennzeich- · net, daß man als organisches Lösungsmittel Benzol oder Toluol verwendet· :
12) Verfahren nach Anspruch 1 bis 9 , dadurch gekennzeich- ' net, daß man als organisches Lösungsmittel Dichlor- ι äthan verwendet.
13) Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeich- ,

net, daß man ein organisches Lösungsmittel verwendet, ; das eine oberflächenaktive Verbindung enthält.
14) Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeich- i net, daß man die oberflächenaktive Verbindung in einer Menge von 0,1 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Volumen des organischen Lösungsmittels, verwendet.
15) Verfahren nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als oberflächenaktive Verbindung ein nichtionogenes Tensid verwendet.
16) Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Säure Essigsäure verwendet.
17) Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Säure Ameisensäure verwendet.

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18) Gemäß Anspruch 1 bis 17 hergestellte Matrix in Form von perlförmigem, in Wasser unlöslichem ß-1,3-Glucangel mit Durchmessern im Bereich von 5 bis 1000 Ai.
19) Verwendung der Matrix nach Anspruch 18 mit einem Teilchendurchmesser im Bereich von 30 bis 300 u als Träger für immobilisierte Enzyme und für die Affinitätschromatographie .
20) Verwendung der Matrix nach Anspruch 18 mit einem Teilchendurchmesser von etwa 30 bis 150 u als Träger für die Gelfiltration.

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