DE2522484B2 - Verfahren zur herstellung eines in waessrigen medien unloeslichen produkts mit enzymatischer aktivitaet - Google Patents
Verfahren zur herstellung eines in waessrigen medien unloeslichen produkts mit enzymatischer aktivitaetInfo
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Description
Durch die immer häufigere Anwendung von enzymatischen Reaktionen sind die vielfachen Vorteile von
Produkten mit enzymaiischer Aktivität, die in wäßrigen
Medien unlöslich sind, mehr und mehr aufgefallen. Diese Produkte gestatten einerseits die Stabilität des Enzyms
unter den vorgesehenen Arbeitsbedingungen zu verbessern und außerdem das Enzym vom zu behandelnden
Stoff (der üblicherweise als Substrat bezeichnet wird) leicht abzutrennen, wodurch es ermöglicht wird, eine
enzymatische Reaktion durch einfache mechanische Trennung des »unlöslichen« Enzyms und des Substrats
anzuhalten, ohne daß man das Enzym durch Erhitzen inaktivieren muß und ohne daß dabei das Substrat
verunreinigt wird.
Es hat sich als besonders interessant erwiesen, ein Enzym auf einem inerten Träger zu fixieren. Es gibt
zahlreiche Verfahren zur Fixierung von Enzymen auf Trägern, wie z. B. die Adsorption eines Enzyms auf
einem unlöslichen Träger oder die Fixierung eines Enzyms auf einem Träger mit Hilfe eines bifunktionellen
Reagens.
Die durch Adsorption eines Enzyms auf einem unlöslichen Träger erhaltenen Produkte sind jedoch nur
wenig stabil, da die Haftung des Enzyms auf elektrostatischen Kräften beruht. Produkte, die durch
Fixierung eines Enzyms auf einem Träger durch ein bifunktionelles Reagens erhalten werden, sind dagegen
wesentlich stabiler, da die Haftung des Enzyms auf der Anwesenheit von kovalenten Bindungen beruht. Der
Träger besteht üblicherweise aus Materialien wie keramischen Stoffen, Glas, Kieselsäure usw. Das
bifunktionelle Reagens liegt im fertigen Produkt in polymerisierter Form vor. Anders ausgedrückt, das
Produkt besteht aus einem inerten Träger, der von einer Schale aus einem Polymer umgeben ist, auf welchem das
Enzym fixiert ist. Ein solches Produkt, bei welchem die Haftung des Enzyms durch ein bifunktionelles Reagens
bewerkstelligt wird, ist beispielsweise in der GB-PS 13 57 317 beschrieben. Bei der Herstellung dieses
Trägerenzyms wird als bifunklionelles Reagens beispielsweise Glutaraldehyd verwendet.
Die bisher verwendeten Trägermaterialien haben den Nachteil, daß sie entweder zu teuer sind, ein Produkt mit
geringer enzymatischer Aktivität ergeben oder aber für die Herstellung von Nahrungsmittelprodukten nicht
zugelassen sind.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines in wäßrigen Medien
unlöslichen Produktes mit enzymatischer Aktivität zu schaffen, das nicht die erwähnten Nachteile aufweist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines in wäßrigen Medien
unlöslichen Produkts mit enzymatischer Aktivität durch Behandlung eines inerten Trägers mit einem aus den
Dialdehyden ausgewählten bifunktionellen Reagens und Fixierung eines Enzyms, welches funktionelle Gruppen,
welche mit freien Aldehydgruppen reagieren können, besitzt, auf dem so behandelten, freie Aldehydgruppen
besitzenden Träger, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als inerter Träger Chitosan verwendet wird.
Das erfindungsgemäß hergestellte Produkt kann in enzymatischen Reaktionen anstelle des entsprechenden
löslichen Enzyms verwendet werden. Das Produkt kann entweder am Schluß der Reaktion durch mechanische
Abtrennung zurückgewonnen oder als Füllung für Kolonnen, durch welche das Substrat hindurchgeführt
wird, verwendet werden.
Chitosan ist ein natürliches Polymer, das durch Deacetylierung von Chitin in stark basischem Medium
und bei erhöhter Temperatur erhalten wird. Es ist in
Wasser unlöslich, wenn keine verdünnte Säure, mit Ausnahme von Schwefelsäure, anwesend ist.
Chitin ist der organische Hauptbestandteil der Schutzhülle von wirbellosen Tieren (Schilde von
Schalentieren oder Oberhäutchen von Insekten). Außer- s dem findet sich Chitin in der Skeletthaut gewisser
niedriger Pflanzenformen (wie z. B, Pilze). Es handelt sich um ein lineares Polymer von N-Acetyi-D-glucosamin
mit hohem Molekulargewicht (ungefähr 200 000) welches durch ^-Bindungen (14-Bindungen) ausgezeichnet
ist. Die N-Acetylgruppe ist schwierig abzuspalten. Die Deacetylierung verläuft niemals vollständig und
liegt bei handelsüblichen Produkten im allgemeinen in der Größenordnung von 50 bis 85%. Diese Produkte
werden mit dem Namen »Chitosan« bezeichnet.
Der als bifunktionelles Reagens verwendete Dialdehyd kann beispielsweise ein Dialdehyd mit einer Kette
von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorteilhafterweise 3 bis 6 Kohlenstoffatome, sein. Spezielle Beispiele hierfür
sind Malonaldehyd, Bernsleinaldehyd, Glutaraldehyd und Adipinaldehyd. Im allgemeinen wird die Verwendung
von Glutaraldehyd bevorzugt, da er ein wohlfeiles Handelsprodukt ist und Produkte mit bemerkenswerter
enzymatischer Aktivität ergibt.
Die Fixierung des Enzyms erfolgt in zwei Stufen. Bei der ersten Stufe, welche als »Aktivierung« bezeichnet
wird, wird das Chitosan mit dem aus den Dialdehyden ausgewählten bifunktionellen Reagens, wie z. B. Glutaraldehyd,
behandelt. Der Dialdehyd wird auf dem Chitosan durch eine der Aldehydgruppen fixiert. Es wird
dabei ein Zwischenprodukt erhalten, das als »aktiviertes« Chitosan bezeichnet wird und dessen Oberfläche
imit Aldehydgruppen bedeckt ist. In der zweiten Stufe
wird das Enzym auf dem aktivierten Chitosan fixiert. Die Maßnahmen erfolgen durch einfaches Zusammenbringen,
beispielsweise durch Eintauchen der festen Phase in der flüssigen Phase unter folgenden Bedingungen:
Behandlung des Chitosans
Dialdehydlösung mit pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise gepuffert;
Temperatur 2 bis 35° C, vorzugsweise Raumtemperatur;
Dauer der Behandlung 30 min bis 24 st; Behandlung vorzugsweise unter Luftausschluß und
Beseitigung des Überschußaldehyds durch Waschen mit Wasser.
Fixierung des Enzyms
Suspension des aktivierten Chitosans in einer Lösung mit einem pH von 2 bis 11, vorzugsweise in
einer Pufferlösung mit pH von 8,0, und mit einem Gehalt an CaCh in einer Konzentration von 0,02-m;
Zusatz des in einem wäßrigen Medium gelösten Enzyms;
Temperatur zwischen 2° C und der Temperatur, bei der das Enzym inaktiviert wird, vorzugsweise etwa
2°C;
Dauer der Behandlung 2 bis 24 st; Entfernung des nichtfixierten Enzyms durch Waschen
mit einer Kochsalzlösung, mit der Pufferlösung der Fixierung und dann mit Wasser.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf Enzyme anwendbar, die funktioneile Gruppen, welche mit den
auf dem aktivierten Chitosan vorliegenden freien Aldehydgruppen reagieren können, beispielsweise freie
40 Aminogruppen gewisser Aminosäuren, wie z. B. Lysin, enthalten.
Die physikalische Natur des verwendeten Chitosans besitzt keinen starken Einfluß auf das Verfahren der
Fixierung des Enjiyms. Die Auswahl des Chitosans wird
vielmehr durch die Kriterien der Anwendung bestimmt. Zwei Formen von Chitosan wurden besonders verwendet:
ein Chitosan in Form eines feinen Pulvers (welches in der folgenden Beschreibung als Form I bezeichnet
wird), welches nach der Aktivierung und Fixierung des Enzyms ein Produkt mit enzymatischer Aktivität ergibt,
welches ohne Aktivitiitsverlust lyophilisiert werden kann (dieses Produkt wird vorzugsweise in Suspension
unter starkem Rühren verwendet und durch Filtration oder Zentrifugieren zurückgewonnen), und ein Chitosan
in ziemlich groben Blättchen, welche unter mechanischen Schlägen jedoch zerbröckeln (welches in der
folgenden Beschreibung als Form 11 bezeichnet wird), welches keine Neigung zum Setzen bzw. Zusammenbakken
zeigt (dieses Produkt wird vorzugsweise zum Füllen von Kolonnen verwendet). Die Herstellung dieser
beiden Formen von Chitosan ist in den Beispielen beschrieben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Produkt mit
enzymatischer Aktivität dadurch stabilisiert, daß man
die restlichen Aldehydgruppen, die während der Fixierung nicht mit dem Enzym reagiert haben, zum
Verschwinden bringt. Beispielsweise kann man sie mit einem geeigneten chemischen Stoff zur Reaktion
bringen, beispielsweise mit einem Stoff, der eine Aminogruppe trägt. Die Verwendung von Glycin, von
Asparagin und insbesondere von Lysin hat sich als günstig erwiesen. Das so erhaltene Produkt mit
enzymatischer Aktivität zeigt eine bemerkenswerte Affinität für Substrate mit proteinischer Natur. Es ist
auch möglich, die restlichen Aldehydgruppen, beispielsweise mit Hilfe von Natriumborohydrid, zu reduzieren,
wodurch die Stabilität des Produkts mit enzymatischer Aktivität beträchtlich verbessert wird. Es ist auch
möglich, diese beiden Biehandlungen zu kombinieren.
Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Produkt besitzt eine enzymatische Aktivität, die nahe
an derjenigen des entsprechenden freien Enzyms liegt. Solche Eigenschaften sind bei Produkten von bekannten
Fixierungsverfahren kaum anzutreffen. Darüber hinaus ist das Produkt mehrere Monate stabil und besitzt eine
wesentlich höhere Inaktivierungstemperatur, als das entsprechende freie Enzym.
Wie bereits erwähni:, kann das Produkt bei enzymatischen
Reaktionen anstelle des entsprechenden freien Enzyms verwendet v/erden, und zwar entweder als
Suspension (vorzugsweise Chitosan der Form 1) oder in Kolonnen (vorzugsweise Chitosan der Form II). Die
Anwendung in der Nahrungsmittelindustrie ergibt keinerlei größere Schwierigkeiten, da Chitosan ein
natürlicher organischer Stoff ist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Herstellung von pulverförmigem Chitosan (Form 1)
30 g Chitosan werden in verdünnter Essigsäure, die aus 700 ml Wasser und 10 ml Eisessig hergestellt
worden ist, unter heftigem Rühren vollständig aufgelöst. Die erhaltene viskose Lösung wird durch zwei
Gazeschichten filtriert und dann in kleinen Portionen in 21 Wasser einlaufen gelassen, das mit Hilfe von
worden sind, werden 92,9 mg fixiertes Trypsin gefunden,
r»:_ ....;Π·/<Ιια ΛιηίιΗαίρηΙί tivitäl /RAPA) ΛιΜηΙ I«
Ätznatron auf pH 11,0 eingestellt worden ist. Unter womensina,wc.uc„«,* ..«..»»··»·»·■ ^;1" f ^1*
diesen Bedingungen fällt das Chitosan in Form feiner Die spezifische Amidaseaktiyität (ΒΑΡΑ) (μΜοΙ
und leichter Teilchen aus. Während des Verfahrens wird "-»-"' —-"" "-"-»«»n.lin/min/me F.n7«m\
der pH des alkalischen Wassers durch Zusatz von
Ätznatron auf dem Anfangswert gehalten. Nachdem alles Chitosan ausgefallen ist, wird der pH der Lösung
durch vorsichtige Zugabe von verdünnter Salzsäure auf 7,5 abgesenkt. Die durch Zentrifugieren abgetrennte
Ausfällung wird zweimal mit Wasser gewaschen und dann lyophilisiert. Auf diese Weise wird ein gebrauchsfertiges
Chitosanpulver der Formel I erhalten.
ijie speziiisfiic fiiiiiu«iwn»i»i«i ("'" 'v vh*iTiiji in
Freiheit gesetztes p-Nitroanilin/min/mg Enzym) des Präparats beträgt 49,16% und die spezifische kaseinolytische
Aktivität beträgt 38,26%.
Das Produkt wird in Gegenwart seines doppelten Gewichts Mannit lyophilisiert, und das Lyophilisat wird
1 Monat konserviert. Dann wird die enzymatische Aktivität des Lyophilisats gemessen. Sie ist die gleiche
wie bei dem frischen Produkt.
Fixierung von Trypsin
2,5 g Chitosan der Form I werden in 50 ml einer 0,05-m Acetatpufferlösung (pH 6,0) 24 st suspendiert.
Dann werden 16,5 ml 20%iger Glutaraldehyd (hergestellt durch Verdünnung von handelsüblichem 50%igem
Glutaraldehyd mit Hilfe der oben erwähnttn Pufferlösung)
zugegeben, worauf 30 min bei Raumtemperatur gerührt wird. Nach einer Waschung mit zweifach
destilliertem Wasser wird das aktivierte Chitosan in 50 ml 0,1-m Boratpufferlösung (pH 8,0), welche 0,02
Mol/l CaCI2 enthält, dispergiert. Diese Suspension wird
auf 2°C abgekühlt, worauf dann 250 mg kristallisiertes Trypsin zugegeben werden, welches vorher in 10 ml
0,001 η HCI aufgelöst worden ist, zugegeben, worauf 2 st bei 2°C gerührt wird. Nach einer Zentrifugierung wird
das Produkt mit jeweils 50 ml einer 0,15-m NaCI-Lösung,
0,1-m Boratpufferlösung (pH 8,0) und zweifach destilliertem Wasser (3mal) gewaschen und dann in
50 ml einer eisgekühlten 0,1-m Boratpufferlösung (pH 8,0) eingebracht, worauf 100 mg festes Natriumborohydrid
zugegeben werden. Nach 20 min bei 2°C wird das unlösliche Produkt mit enzymatischer Aktivität durch
Zentrifugierung abgetrennt, von neuem mit Wasser gewaschen und in einer 0,05-m Boratpufferlösung (pH
7,5), welches Natriumazid als Konservierungsmittel enthält, aufbewahrt.
Die Menge des auf dem Chitosan durch den Glutaraldehyd fixierten Enzyms wird aus dem Unterschied
zwischen der zugefügten Menge und der in der Restlösung und den Waschwässern gefundenen Menge
ermittelt. (Die Bestimmung erfolgt durch UV-Absorption bei 280 nm).
Die Amidaseaktivität des Produkts wird an einem synthetischen Substrat getestet, nämlich an DL-BAPA
(p-Nitroanilid von N-Benzoyl-DL-Arginin), und zwar durch das Verfahren von E r 1 a η g e r et. al., Arch.
Biochem. Biophys., 95,271 (1961). Das Verfahren beruht
auf der Verfolgung des durch enzymatische Hydrolyse in Freiheit gesetzten p-Nitroanilids, wobei die spezifische
Absorption bei 410 nm gemessen wird. Die kaseinolytische Aktivität wird wie folgt bestimmt: Zu
5 ml einer 2%igen Lösung eines Substrats, das aus Kasein besteht, in einer 0,05-m Tris-Pufferlösung (pH
7,5) (oder (Tris-hydroxymethyl-aminomethan), die 15 min auf 10O0C erhitzt worden ist, werden 4 ml der
oben erwähnten Boratpufferlösung und 1 ml Enzymlösung, die 300 μg freies Trypsin oder das äquivalent
unlösliche Trypsin enthält, zugegeben. Nach 30 min Reaktion bei 35CC wird 1 ml des Mediums mit 3 ml
3%iger Trichloressigsäure gemischt. Nach der Zentrifugierung wird die optische Dichte des Überstands bei
280 nm gemessen. Die optische Dichte bei 200 nm/mg Protein/30 min wird willkürlich als kaseinolytische
Aktivität genommen.
Die erhaltenen Resultate sind wie folgt:
Für 100 mg Trypsin, die zu 1 g Chitosan zugegeben Beispiel 2
Fixierung einer Protease
Fixierung einer Protease
::,5 g Chitosan (Form I) werden wie in Beispiel 1 mit
Glutaraldehyd behandelt. Nach der Waschung wird das Produkt in 50 ml 0,05-m Tris-Pufferlösung (pH 8,0), die
0,02 Mol/l CaCI2 enthält und auf 2°C gehalten wird, dispergiert. Es werden 250 g handelsübliche Protease als
Lösung in 10 ml 0,05-m Tris-Puffer (pH 7,5), der 0,02 Mol/l CaCI2 enthält, zugegeben. Nach 2 st Kontaktzeit
unter Rühren bei 2°C wird das Produkt mit einer 0,15-m
NaCI-Lösung, mit einer 0,05-m Tris-Pufferlösung (pH 8,0) und mit Wasser gewaschen. Es wird dann in 50 ml
einer 0,1-m Lysinlösung(pH 8,0) 15 min lang aufgenommen, gewaschen und schließlich unter den Bedingungen
von Beispiel 1 mit Natriumborohydrid behandelt.
Die Esteraktivität des Enzyms wird an einem synthetischen Substrat bestimmt, nämlich an TAME
(Methyleslcr von p-Tosyl-L-arginin). 5 ml TAME (0,025-m in H2O) 1 ml einer 1 m KCI-Lösung und 4 ml
Wasser werden in einen pH-Stat eingebracht und bei 300C thermostatisiert. Der Titrationsendpunkt wird auf
pH 8,0 festgelegt und mit 0,1 n-NaOH-Lösung eingestellt. Die Reaktion wird durch Zusatz von 0,2 bis
1 mg Protease initiiert. Der NaOH-Verbrauch wird festgehalten. EineTAME-Einheit entspricht dem Abbau
von 1 μΜοΙ Substrat (d. h. 1 μ-Äquivalent NaOH) je min,
und die spezifische Aktivität wird in TAME-Einheiten/mg Enzym ausgedrückt. Das Maß der kaseinolytischen
Aktivität wird nach dem Verfahren von H a g i h a r a et. al.. J. Biochem., 45,185 (1958) abgeleitet.
Zu jeweils 1 ml Kasein (1,2% in einer 0,05-m Tris-Pufferlösung, pH 9,0) wird jeweils 1 ml Enzymlösung
mit wachsenden Konzentrationen an freier oder fixierter Protease (0 bis 180 μg) zugegeben. Nach einer
Reaktionszeit von 10 min bei 300C wird das nichthydrolysierte
Kasein durch 3 ml eines Gemischs aus Trichloressigsäure (0,11-m), Natriumacetat (0,22-m) und
Essigsäure (0,33-m) ausgefällt. Die optische Dichte des Überstands wird bei 250 nm gemessen. Die spezifische
Aktivität ist gleich der optischen Dichte bei 275 nm/ min/mg Enzym (Bestimmung der Steigung am Ursprung
der kinetischen Kurven). Dabei wird festgestellt, daß von 100 mg Protease, die zu 1 g Chitosan zugegeben
worden sind, 33,7 mg fixiert sind. Im Verhältnis zum löslichen Enzym ist die spezifische Esteraseaktivität
75,9% (der Verlust durch Behandlung mit Borohydrid beträgt 3,3%). Die kaseinolytische Aktivität ist 46,15%.
Beispiel 3
Fixierung von Pronase
Fixierung von Pronase
Das Verfahren von Beispiel 2 wird wiederholt, wobei 250 mg Pronase verwendet werden und wobei keine
Reduktion mit Natriumborohydrid durchgeführt wird. Die kaseinolytische Aktivität des Produkts mit enzymatischer
Aktivität wird wie in jenem Beispiel gemessen,
wobei jedoch die folgenden Abwandlungen vorgenommen werden: 1 ml 2%iges Kasein in 0,05-m Tris-Pufferlösung
(pH 7,5) und 1 ml Enzymlösung (freie oder fixierte Pronase mit verschiedenen Konzentrationen
von 10 bis 160 μg) werden 10 min bei 4O0C inkubiert.
Die Reaktion wird durch Zusatz von 3 ml 5%iger Trichloressigsäure abgebrochen und die optische Dichte
des Überstands wird bei 275 nm gemessen.
Dabei wird festgestellt, daß von 100 mg Pronase, die zu 1 g Chitosan zugegeben worden sind, 29 mg fixiert
worden sind. Die kaseolytische Aktivität beträgt 57,60%.
Beispiel 4
Herstellung von Chitosan in Plättchen (Form 11)
Herstellung von Chitosan in Plättchen (Form 11)
Chitosan wird in verdünnter 1,8°/oiger Essigsäure aufgelöst, derart, daß seine Konzentration im Medium
2,5 Gew.-% beträgt. Die erhaltene Lösung wird durch zwei Gazeschichten filtriert und dann auf Metallplatten
(Oberfläche mit Polytetrafluoräthylen behandelt) geschüttet, so daß eine homogene Schicht erhalten wird
(58 ml Lösung/100 cm2). Das Produkt wird in einem Ofen mit 70°C eingetrocknet, bis eine dünner Film von
wasserfreiem Chitosan gebildet worden ist. Letzterer wird in Plättchen mit den mittleren Abmessungen 1 bis
2 cm aufgebrochen und in dieser Form für die Fixierung verwendet (Chitosan der Form II).
Fixierung einer Baktcricnprotease
5 g Chitosan der Form 11 werden in 150 ml einer 0,1-m
Pufferlösung (pH 8,0) dispergicrt. Nach einer Verweilzeit von 5 min werden 15 ml 25%iger Glutaraldehyd
zugegeben, worauf das Gemisch 1 st bei Raumtemperatur stehengelassen wird. Das erhaltene Produkt wird
filtriert und nach einer Waschung in 30 ml 0,1 -m Veronalpufferlösung (pH 8,0), welche 0,02 Mol/l CaCl2
enthält und auf 2°C abgekühlt ist, suspendiert. Hierauf wird eine konzentrierte (5 ml, 1100 TAME-Einheiten,
d. h., 1,7 g handelsübliches Produkt) Bakterienproteaselösung eingeführt. Nach einer Nacht bei 2°C unter
mäßigem Rühren wird das Produkt durch Filtration
ίο abgetrennt, mit einer 0,15-m NaCI-Lösung, mit einer
Veronalpufferlösung und abschließend mit Wasser gewaschen. Die Reduktion mit Borohydrid, 1 mg/ml
0,1 -m Veronal-Pufferlösung (pH 8,0) wird wie in Beispiel 1 ausgeführt.
Die Bestimmung der Esteraktivität (TAME) wird wie im Beispiel 2 durchgeführt. Die kaseinolytische Aktivität
wird wie folgt bestimmt: 1 ml 1%ige Kaseinlösung in 0,2-m Tris-Pufferlösung (pH 9,0) und 1 m einer Lösung
mit verschiedenen Alcalase-Konzentrationen (10-1000 μg) oder eine bekannte Menge des unlöslichen
Produkts werden 10 min bei 370C inkubiert. Dann werden 3 ml 5%ige Trichloressigsäure eingeführt,
worauf die optische Dichte des Überstands bei 280 nm gemessen wird. Die für das freie Enzym erhaltene Kurve
(optische Dichte als Funktion der Konzentration) dient als Eichkurve.
Es wird festgestellt, daß die unlöslich gemachte Alcalase 41,2 TAM E/Einheiten/g trockenes Produkt
enthält, was 66,4 mg der Ausgangsalcalase äquivalent ist (spezifische TAME-Aktivität: 0,62 Einheiten/mg). Die
kaseinolytische Aktivität entspricht 11 mg freier Alcalase/g
trockenes Produkt. Die Ausbeute, bezogen aul TAME-Einheiten, beträgt 18,7%.
7OBBStA
Claims (13)
1. Verfahren zur Herstellung eines in wäßrigen Medien unlöslichen Produkts mit enzymatischer S
Aktivität durch Behandlung eines inerten Trägers mit einem aus den Dialdehyden ausgewählten
bifunktionellen Reagens und Fixierung eines Enzyms, welches funktionelle Gruppen, welche mit
freien Aldehydgruppen reagieren können, besitzt, ό auf dem so behandelten, freie Aldehydgruppen
besitzenden Träger, dadurch gekennzeichnet,
daß als inerter Träger Chitosan verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Chitosan pulverförmiges Chitosan
verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Chitosan plättchenförmiges Chitosan
verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das plättchenförmige Chitosan durch
Zerbrechen eines Films von wasserfreiem Chitosan erhalten worden ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die restlichen Aldehydgruppen,
die während der Fixierung nicht mit dem Enzym reagiert haben, durch Behandlung des erhaltenen
unlöslichen Produktes mit enzymatischer Aktivität mit einer Verbindung, welche eine freie Aminogruppe
trägt, und/oder mit einem Reduktionsmittel zum Verschwinden bringt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung, die eine Aminogruppe
trägt, Lysin verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Reduktionsmittel Natriumborohydrid
verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch t, dadurch gekennzeichnet, daß das in wäßrigen Medien unlösliche
Produkt mit enzymatischer Aktivität lyophilisiert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das in wäßrigen Medien unlösliche
Produkt mit enzymatischer Aktivität in Gegenwart der doppelten Gewichtsmenge Mannit lyophilisiert
wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Chitosan und der Dialdehyd bei
einem pH zwischen 6 und 8 zur Reaktion gebracht werden.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Chitosan und der Dialdehyd bei einer Temperatur zwischen 2 und 35° C zur Reaktion
gebracht werden.
12. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym bei einem pH zwischen 2
und 11 fixiert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym bei einer Temperatur
zwischen 20C und der Temperatur, bei welcher das Enzym inaktiv wird, fixiert wird.
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