DE2640387B2

DE2640387B2 - Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE2640387B2
Application number: DE2640387A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr. 3550 Marburg Bohn; Wilhelm 3551 Wenkbach Winckler
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1976-09-08
Filing date: 1976-09-08
Publication date: 1980-05-22
Also published as: DE2640387C3; SE7710085L; AU517607B2; IE45678B1; CA1092971A; ES462069A1; IE45678L; NO773093L; IT1084741B; BE858521A; AT365929B; ATA643777A; FI772641A; DK397677A; LU78084A1; GB1586240A; AU2862177A; FI61192B; FI61192C; NL7709740A

Description

erhältlich durch Anreichern des Gewebeproteins aus Organextrakten oder daraus gewonnenen Lösungen, mittels mindestens einer der folgenden Maßnahmen und Isolieren der das Gewebeprotein enthaltenden Fraktion:

a) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer Acridin- oder Chinolinbase im Bereich vom pH-Wert von 5-10 bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,8%;

b) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Gewebeproteins;

c) Adsorption des Gewebeproteins an einen schwachbasischen Ionenaustauscher und EIution davon;

d) Molekularsiebfraktionierung und Gewinnung der Fraktionen die einem Molekulargewicht von etwa 50 000 entsprechen;

e) Adsorption an Hydroxylapatit unter Vermeidung der Bindung des Gewebeproteins;

f) präparative Zonenelektrophorese und Gewinnung der χι- und /31-Zwischenzone.

2. Verfahren /um Herstellen des Gewebeproteins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Organextrakt ein Extrakt aus menschlichen Placenten verwendet wird.

3. Verwendung des Gewebeproteins nach Anspruch 1 zum Herstellen von Antiseren.

Die Erfindung betrifft ein gewebespezifisches Protein, d. h. einen Stoff, der Bestandteil von Organgeweben ist, und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Aus aufgeschlossenen Organen von Säugern lassen sich mehrere, bereits beschriebene Stoffe in relativ reiner Form isolieren. Bekannt ist z. B. das eisenhaltige Protein Ferritin, welches aus Placentengewebe hergestellt werden kann, aber auch in Magen, Milz, Leber, Niere, Uterus und Lunge nachgewiesen worden ist.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Gewebeprotein, welches gekennzeichnet ist durch die im Anspruch 1 enthaltenen Parameter und Verfahrensmaßnahmen. Es besitzt

einen Proteinanteil, im wesentlichen bestehend aus α-Aminosäuren, von 94 ± 3%;

einen Kohlenhydratanteil von 5,4 ± 2,2%, davon

Hexosen3,0 ± 1%,

Hexosamin 1,2 ± 0,5%,

Fucose 0,2 ± 0,2%,

Neuraminsäure 1,0 ± 0,5%,

einen Sedimentationskoeffizienten S\,"' von 3,5 S ± 0,5 S,

einen isoelektrischen Punkt von 4,9 ± 0,3
eine elektrophoretisch^ Beweglichkeit im Bereich zwischen den «2- und jSi-Globulinen.
einen Extinktionskoeffizienten E\";„, (278 nm) von 11,9 ± 1,0 und

eine spezifische immunologische Reaktion mit einem spezifisch gegen das Protein gerichteten Antikörper.

Als besonderes Merkmal des neuen Gewebeproteins kann festgehalten werden, daß es sich sowohl in fetalen Organen als auch in adulten Organen von Säugern nachweisen läßt. Bei Primaten, insbesondere dem Menschen, ist das Protein in folgenden fetalen Organen nachgewiesen: Herz, Leber, Niere, Lunge, Magen, Gehirn, ferner in folgenden adulten Organen: Herz, Lunge, Haut, Magen, Niere, Uterus, Leber, Milz, Nebenniere, Colon, Rektum, Blase. Mit quantitativen immunologischen Methoden lassen sich dabei in der Regel mindestens 10 mg des Proteins in 100 g Gewebe nachweisen. Auch in der Placenta ist das Produkt in der Größenordnung von 10 mg/100 g Gewebe vorhanden. Die Placenta bietet sich jedoch für die Isolierung des Proteins besonders an. In Erythrozyten kann ein Gehalt von 1 mg des Proteins/100 ml Erythrozyten nachgewiesen werden, wohingegen im Plasma oder Serum von Gesunden das Protein nicht nachzuweisen ist.

Zur Erläuterung der kennzeichnenden Parameter des Proteins sei folgendes ausgeführt.

Die Bestimmung des Sedimentationskoeffizienten erfolgte in einer analytischen Ultrazentrifuge bei 60 000 Umdrehungen/Minute in Doppelscktorzellen mit Hilfe der im Ultravioletten bei der Wellenlänge von 280 nm wandernden Banden der Substanz unter Verwendung von Wasser als Lösungsmittel und einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml in einer Überschichtungszelle einer analytischen Ultrazentrifuge in Anlehnung an Vinograd, Proc. Acad. Sei. USA, 49,902 (1963).

Das Molekulargewicht wurde einerseits in der Ultrazentrifuge über die Ermittlung des Sedimentationsgleichgewichtes nach Yphantis errechnet. Es ergab sich ein Wert von 37 100 ± I 400.

Andererseits w iirdc bei der Untersuchung des Proteins in einem 0,1% Natriumdodezylsulfat-haltigen Trägergel, bestehend aus Polyacrylamid, der größte Teil des Proteins in 2 Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 22 ono ± 2 000 zerlegt. Daraus läßt sich für das native Protein ein Molekulargewicht von 44 000 ± 4 000 ableiten.

Zur Bestimmung des Isoelektrischen-Punktes wurde das Verfahren der isoelektrischen Focussierung angewandt unter Einsatz der hierfür von der Firma LKB, Stockholm, vertriebenen Geräte und Reagenzien.

Die elektrophoretische Beweglichkeit wurde unter Verwendung von Zelluloseacetat als Trägerfolie ermittelt.

Kohlenhydrate wurden bestimmt nach Schultze, H. E.; Schmidiberger, R.; Haupt, H,: Untersuchungen über die gebundenen Kohlenhydrate in isolierten Plasmaproteinen. Biochem. Z, 329,490, (1958).

Eine Aminosäureanalyse wurde nach Moore, S.; Spackman, D. H.; Stein, W. H.: Chromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resis. Anal. Chem., 30,1185 (1958). durchgeführt unter Verwendung eines Fiüssigkeitschromatographen. Dabei zeigte sich, daß die am häufigsten in der Peptidkette vertretenen Aminosäuren Leucin, Glutaminsäure, Asparaginsäure und Glycerin sind.

Die immunologische Charakterisierung der Substanz erfolgt am einfachsten nach einem bekannten Diffusionsverfahren, bei welchem Antigen, d. h. das Protein, und ein gegen das Protein gerichteter Antikörper bzw. das hinsichtlich der Antikörper nicht angereicherte Antisemm, gegeneinander in einem Trägermedium, wie z. B. Agar, diffundieren. Treffen die beiden Reaktionskomponenten in einem günstigen Verhältnis aufeinander, bildet sich ein sichtbares Präzipitat aus. Nach dieser Kenntnis ist es für den Fachmann einleuchtend, daß alle immunologischen Techniken zum Nachweis und zur Bestimmung sowohl des neuen Gewebeproteins als auch der gegen das Gewebeprotein gerichteten Antikörper möglich sind.

Das Protein ist erfindungsgemäß erhältlich aus Organextrakten, in der Regel wäßrigen Extrakten von Organen, die dieses Protein enthalten und die nach folgenden Kriterien fraktioniert werden:

Das Protein ist mit Neutralsalzen fällbar. Mit dem üblicherweise für derartige Fällungen verwendeten Ammoniumsulfat wird das Protein bei einer Sättigungskonzentration des Salzes von 30 bis 60% in einem pH-Bereich in der Nähe des Neutralpunktes gefällt.

Entsprechend seinem Molekulargewicht kann das Protein durch Maßnahmen, die zur Abtrennung von Substanzen mit Molekulargewichten zwischen 35 und 50 000 geeignet sind, gewonnen werden. Vorteilhaft werden hierfür die Methoden der Gelfiltration oder der Ultrafiltration eingesetzt.

Das Gewebeprotein wird bei neutralem oder schwach alkalischem pH-Wert an schwach-basische Ionenaustauscher adsorbiert, vorteilhaft wird dabei eine vergleichsweise wenig konzentrierte Pufferlösung verwendet, denn durch Erhöhung der Salzkonzentration oder auch durch Erniedrigung des pH-Wertes kann die Adsorption verhindert werden. Andererseits bietet sich bei Kenntnis dieses Verhaltens die Möglichkeit an, das Gewebeprotein zu adsorbieren und unter Verwendung von höher konzentrierten Salzlösungen bzw. von Pufferlösungen mit erniedrigten pH-Werten, wieder zu cluieren.

Eis hat sich gezeigt, daß das Gewebeprotein mit den wasserlöslichen organischen Basen der Acridin- und Chinolinreihe, die für Proteinfällungsverfahren üblicherweise Verwendung finden, nicht präzipitiert wird. Es bleibt in der bei diesen Verfahren üblichen Konzentration im wäßrigen Überstand. Danach kann beispielsweise eine Acridinbase, wie das 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridin-lactat oder eine Chinolinbase wie Bis-(2methyl-4-amimochinolyl-öj-carbamid-hydrochlorid, zur Fällung von begleitenden Proteinen verwendet werden, wobei das erfindiingsgemäße Gewebeprotein im Überstand verbleibt.

Ähnliche Überlegungen können gelten bei Verwendung von Hydroxylapatit als Adsorbens für Proteine. Das Gewebeprotein zeigt keine besonderen Affinität zum Hydroxylapatit, wohingegen eine Reihe von Begleitproteinen von hydroxylapatit festgehalten wird.

Aufgrund der Kenntnis der elektrophonischen Beweglichkeit kann für die Anreicherung, bzw. Isolierung, des Gewebeproteins die präparative Zonen-Elektrophorese eingesetzt werden.

Die Affinität des Gewebeproteins aufgrund ssines immunologischen Verhaltens kann dafür eingesetzt werden, das Protein mit Hilfe von sog. Immun-Adsorp-K) tionsverfahren anzureichern. Hierfür kann in an sich bekannter Weise ein Immunadsorbens. d. h. ein trägergebundener Antikörper, gegen das Gewebeprotein hergestellt werden, welcher das Gewebeprotein spezifisch zu binden vermag. Das Protein kann danach durch ij Änderung der Milieubedingungen wieder eluiert werden.

Durch eine ausgewählte Kombination der genannten Methoden, die einerseits zur Anreicherung des Gewebeproteins andererseits zu seiner Abtrennung von den übrigen begleitenden Proteinen führen, kann die Isolierung der erfindungsgemäßen Substanz erfolgen. Demzufolge ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung in den einzelnen Anreicherungsschritten für das Gewebeprotein und in den durch Kombination der _>-> Maßnahme zur Anreicherung sich ergebenden Verfahren zu dessen Reinigung zu sehen.

Es ergibt sich somit erfindungsgemäß die Anwendung mindestens einer der folgenden Maßnahmen auf Organextrakte oder daraus gewonnenen Lösungen, die so das Gewebeprotein enthalten und die anschließende Gewinnung der bezüglich des Gewebeproteins angereicherten Fraktion:

a) Zugabe von wasserlöslichen Derivaten einer r, Acridin- oder Chinolinbase, vorzugsweise des

2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridinlactat, im Bereich vom pH-Wert von 5—10, vorzugsweise bei etwa pH 8, bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,8% (Gewicht zu Volumen), wobei das Gewebeprotein

im wesentlichen im Überstand verbleibt.

b) Zugabe von Neutralsalzen bis zur Ausfällung des Gewebeproteins, vorzugsweise vom Ammoniumsulfat bei etwa neutralem pH-Wert bis zu 30—60% der Sättigungskonzentration des Ammoniumsulfats.

c) Adsorption des Gewebeproteins an einen schwachbasischen Ionenaustauscher, wie Diäthylaminoäthylcellulose, bei einer Leitfähigkeit der Lösung von 0-2 mS und neutralem oder schwach alkali-

-,i) schem pH-Wert, beispielsweise unter Verwendung eines etwa 0,01 M Puffers vom pH-Wert von etwa 8. Ein bevorzugt zu verwendender Puffer ist Tris-Hydroxymethylaminomethan-HCI. Die EIution des Gewebeproteins kann durch Verschiebung

v> des pH-Wertes auf < pH 7,0 oder durch Erhöhung der Leitfähigkeit auf > 5 mS erreicht werden.

d) Trennung aufgrund der Molekulargröße (Molekularsiebfraktionierung). Besonders geeignet ist die Gelfiltration in einer Säule, gefüllt mit einem

bo Polymeren entsprechender Porengröße, beispielsweise mit Epichlorhydrin-vernetztem Dextran, das als SEPHADEX® von der Firma Pharmacia, Uppsala, hergestellt wird, mit dem Ziel der Anreicherung von Proteinen mit einem Molekularen gewicht von etwa 50 000. Aber auch Produkte wie ULTRO-GEL® von LKB, Bromma oder BIOGEL P® von Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif., können eingesetzt werden.

e) Durchführung einer Adsorption mit Hydroxylapatit. Da das Gewebeprotein bei Bedingungen, die üblicherweise in der präpativen Biochemie eingehalten werden, von Hydroxylapatit nicht gebunden wird, ist Hydroxylapatit ein gteignetes Agens, um Begleitproteine des Gewebeproteins aus der Lösung zu entfernen. Die Gewebeproteinlösung wird hierfür zweckmäßig auf einen pH-Wert um den Neutralpunkt eingestellt und die Leitfähigkeit der Lösung auf etwa 1 mS gehalten.

Preparative Zonenelektrophorese.

Die das Protein enthaltende Lösung, die für die Durchführung einer Elektrophorese von Proteiner, geeignet ist, vorzugsweise eine alkalische Pufferlösung, beispielsweise ein Natriumdiäthylbarbituratpuffer vom pH 8,6, lonenstärke = 0,1, wird hierzu in einer Apparatur zur präparativen Elektrophorese, wie sie beispielsweise von N. Heimburger und R. Schmidtberger in Behringwerke-Mitteilungen, Heft 43, Seite 83 ff, insbesondere auf Seite 119—120, beschrieben wird, eingetragen. Bei dem Gerät handelt es sich um die horizontale Anordnung einer Trägerlektrophorese in einem offenen Trog, in welchem das Trägermaterial zur Abführung der bei der Elektrophorese auftretenden Joule'schen Wärme auf unter 10⁰C gekühlt wird. Als Trägermaterial dienen gegenüber Proteinen indifferente Substanzen, vorteilhaft Polyvinylchlorid, oder dessen Copolymerisate i;i Form eines feinen Granulats.

Es ist empfehlenswert, die Elektrophorese im alkalischen pH-Bereich, vorteilhaft bei etwa pH 8,6, bei einer Ionenstärke von 0,08—0,12 und bei einer Feldstärke von 4—6 Volt/cm vorzunehmen. Bei Verwendung von 0,1 M Natriumdiäthylbarbituratpuffer vom pH-Wert 8,6 wandert das Gewebeprotein im elektrischen Feld in dem als «2- und ^i-Zone klassifizierbaren Bereich der Plasmaproteine.
Für die Gewinnung des hochmolekularen «-Globulins wird diese Zone herausgeschnitten und vom inerten Trägermaterial mit Hilfe von Wasser oder wäßrigen Salzlösungen, beispielsweise einer 0,5 bis l°/oigen Kochsalzlösung, eluiert. In einem letzten Reinigungsschritt kann das Eluat vorteilhaft nach einer vorherigen Konzentrierung, beispielsweise auf einem Ultrafilter, einer Gelfiltration unterworfen werden.

Zur Herstellung des neuen Gewebeproteins werden mehrere der angeführten Maßnahmen miteinander kombiniert und dabei jeweils diejenige Fraktion weiter verarbeitet, die das Gewebeprotein enthält, während die übrigen Fraktionen verworfen werden.

Vorteilhaft setzt man dabei als Organextrakt Human-Placente-Extrakt ein. Ohne das daraus eine Einschränkung herzuleiten wäre, soll im folgenden eine Möglichkeit beispielhaft aufgezeigt werden, wie das Gewebeprotein aus einem Organgewebe gewonnen werden kann.

Dazu werden beispielsweise menschliche Placente zerkleinert und mit Wasser oder einer verdünnten, zweckmäßig einer weniger als 10%igen Salzlösung, vorteilhaft mit einer 0,5%igen Neutralsalzlösung, wie beispielsweise Natriumchlorid, extrahiert. Zweckmäßig verwendet man auf 1 kg Placemen etwa 1 —5 Liter der Extraktionslösungen. Die nicht gelösten Anteile werden durch Zentrifugation oder Filtration von dem Extrakt abgetrennt.

Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die Arbeiten bei der Herstellung des Gewebeproteins unterhalb der Zimmertemperatur, beispielsweise bei 10⁰C, durchzuführen. Der neutrale bis schwach alkalische, vorzugswei- -, se auf etwa pH 8 eingestellte Placentenextraki wird sodann mit einem wasserlöslichen Derivat einer Acridinbase, beispielsweise dem 2-Äthoxy-6,9-Diaminoacridin-lactat, bis zu einer Konzentration von 0,8 ± 0,4% versetzt oder mit ei.nem wasserlöslichen

κι Derivat einer Chinolinbase, vorteilhaft mit Bis-(2methyM-aminochinolyl-ej-carbamid-hydrochlorid bis zu einer Konzentration von 0,3 ± 0,15%. Die dabei entstehende Fällung wird verworfen. Der Überstand enthält den Hauptanteil des anzureichernden Gewebe-

is proteins. Danach ist es zweckmäßig, überschüssiges Fällungsmittel durch Zusatz von Verbindungen abzuscheiden, welche mit dem Fällungsmittel einen Niederschlag zu bilden vermögen. Die Acridinbasen bilden beispielsweise mit Halogeniden schwer lösliche Verbin-

2(i düngen, so daß es sich anbietet, zur Abscheidung der Acridinbase Natriumchlorid zu verwenden. Eine befriedigende Abscheidung wird erreicht bei einer Konzentration von etwa 3 — 7% (G : V) Natriumchlorid. Der überstehenden Proteinlösung wird im folgenden so viel eines für die Fällung von Eiweißkörpern verwendbaren Salzes zugesetzt, daß das Gewebeprotein aus der Lösung verdrängt wird. Vorteilhaft wird als Salz Ammoniumsulfat verwendet: Zweckmäßig wird hierfür eine Sättigungskonzentration des Ammoniumsulfats

jo von 30 —60%, vorzugsweise 40 — 50%, eingehalten. Der sich nach Zugabe des Ammoniumsulfals bildende Niederschlag wird durch Zentrifugation oder Filtration gewonnen und in Wasser wieder aufgelöst. Da derartige durch Salzfällung erhaltene Niederschläge in der Regel

j5 noch Fällungsmittel selbst einschließen, empfiehlt es sich, danach eine Dialyse anzuschließen. Die Lösung gegen die die Proteinlösung dialysiert wird ist zweckmäßig eine wenig konzentrierte Pufferlösung. Sinnvoll ist hier der Einsatz von Pufferlösungen, die bei der Ionenaustauschchromatographie üblich sind und die eine Adsorption des Gewebeproteins an einen schwachbasischen Ionenaustauscher ermöglichen.

Die dialysierte Lösung des Gewebeproteins wird danach in einem wenig konzentrierten Puffermilieu mit dem schwachbasischen Ionenaustauscher, z. B. Diäthylaminoäthylzellulose gemischt und nach erfolgter Adsorption des Gewebeproteins an den Ionenaustauscher dieser von der restlichen Lösung abgetrennt, z. B. abfiltriert. Wurde die Adsorption beispielsweise in einem schwach alkalischen Milieu {etwa pH 8,0) und einem Puffer der Konzentration von etwa 0,01 Mol/Liter durchgeführt, läßt sich ein Waschen des Ionenaustauschers mit einem 0,02 molaren Puffer bei etwas erniedrigtem pH-Wert (etwa 6-7) vornehmen.

Die Salzkonzentration des Elutionspuffers kann bei insgesamt etwa 0,2 Mol/Liter liegen.

Es ist vorteilhaft, das Eluat ähnlich wie oben beschrieben mit so viel Neutralsalz zu versetzen, daß das Protein aus der verdünnten Lösung als Niederschlag

bo und danach wieder aufgelöst in konzentrierter Form erhalten werden kann. Zur weiteren Reinigung kann das wieder aufgelöste Protein einer Gelfiltration unterworfen werden. Besonders gut angereicherte Fraktionen hinsichtlich des gesuchten Gewebeproteins werden

bu erhalten, wenn hierfür das quervernetzte Dextran der Firme Pharmacia, SEPHA DEX® vom Typ G 150, verwendet wird, zweckmäßig in Form von Maßnahmen einer Säulenchromatographie. Zur Elution können in

der Biochemie gebräuchliche Pufferlösungen, denen zur Erhöhung des Fraktionierungseffektes Neutralsalze zugesetzt werden können, beispielsweise 0,01 -0,1 m Tris-hydroxymethyl-aminomethan Salzsäurepuffer mit Zusatz von 0 — 5 m NaCI von annähernd neutralem bis basischem pH-Wert dienen. Bei diesem Elutionsverfahren wird das Gewebeprotein in den eluierten Fraktionen, zweckmäßig mit immunologischen Verfahren, gesucht, wonach diejenigen Fraktionen ausgesondert und gesammelt werden, die das erfindungsgemäße Protein enthalten.

Da auch die Gelfilirationseluate das Gewebeprotein in verdünnter Form enthalten, ist auch hier eine Anreicherung durch Fällung mit Neutralsalzen, wie beschrieben, angezeigt.

Die durch Wiederauflösung des Salzniederschlages gewonnene Lösung des Gewebeproteins wird durch Dialyse gegen eine sehr stark verdünnte Pufferlösung auf die Bedingungen eingestellt, die geeignet sind, möglichst viele der noch vorhandenen Verunreinigungen an Hydroxydapatit zu adsorbieren. Geeignet sind hier insbesondere schwach-konzentrierte Phosphatpuffer, beispielsweise ein etwa 0,005molarer Natriumphosphatpuffer, dessen pH-Wert etwa zwischen 6,5 und 7,0 liegt. Beim Kontakt des Hydroxylapatits mit der vorliegenden Proteinlösung wird das erfindungsgemäße Gewebeprotein weitgehend in Lösung belassen, so daß das Hxdroxylapatit, das zweckmäßig in eine Säule eingefüllt ist, für das folgende Verfahren nicht mehr berücksichtigt werden muß. Der Durchlauf durch die Hydroxylapatitsäule enthält das gesuchte Gewebeprotein in abermals angereicherter und gereinigter Form.

Eine Wiederholung der Ionenaustauschchromatographie, wobei — abweichend zum vorher beschriebenen Schritt — der Ionenaustauscher in eine Säule gefüllt, die das Gewebeprotein enthaltende Lösung auf die Säule aufgetragen und mit einer Salzlösung steigender Konzentration (gradient) eluiert wird führt zu weiteren Anreicherungen des Gewebeproteins. Das nach diesen beispielhaft aufgezeigten Schritten durchgeführte Reinigungsverfahren führt zu dem Gewebeprotein in einer Reinheit von > 99%.

Das Gewebeprotein läßt sich selbstverständlich nach dem vorher Gesagten in der gleichen Reinheit auch durch Kombination anderer Schritte, beispielsweise auch unter Einfügung eines Schrittes der präparativen Elektrophorese oder der Immunadsorption, erhalten.

Das erfindungsgemäß hergestellte Gewebeprotein hat antigene Eigenschaften. Eine damit durchgeführte Immunisierung von Tieren nach bekannten Methoden führte zur Bildung von spezifischen Antikörpern im Blut der immunisierten Tiere. Deren Seren können nach üblichen Verfahren gewonnen und die darin enthaltenen Antikörper angereichert werden.

Die nachgewiesene Gewebespezifität des erfindungsgemäßen Stoffes legt eine diagnostische Bedeutung nahe. Gewebeerkrankungen lassen sich durch den Austritt des Proteins aus dem Gewebe in die Blutbahn im Blut nachweisen. Hierfür kommen im wesentlichen die bekannten immunologischen Nachweisverfahren unter Verwendung der spezifischen gegen das Gewebeprotein gerichteten Antikörper in Frage.

Die Erfindung wird in dem nachstehenden Beispiel näher erläutert:

Beispiel

150 kg tiefgefrorene Placemen werden zerkleinert und mit 1501 einer 0,5%igen wäßrigen Natriumchloridlösung extrahiert. Der Extrakt wird mit 2n-Natriumhy droxyd auf pH 8 eingestellt und mit 50 I einer 3%iger wäßrigen Lösung von Diaminoäthoxyacridin-Iactai versetzt. Nach einer Wartezeit von 1 Stunde wird dei ι Überstand, der das Gewebsprotein enthält, abgehebert mit 5% festem Natriumchlorid (11 kg) zur Abscheidung des noch in Lösung verbliebenen Diaminoäthoxyacridin-lactats versetzt, filtriert und mit 30% — bezogen aul das Gewicht der Flüssigkeit — festem Ammonsulfai

ίο versetzt und gut durchgerührt. Nach 1 Stunde wird der Niederschlag abfiltriert.

500 g des auf dem Filter gesammelten Niederschlages werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und gegen eine 0,01 molare Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Salz-

r, säure-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 0,05% Natriumazid enthält, dialysiert. Die dialysierle Lösung wird zentrifugiert und der Überstand wird mit der gleichen Pufferlösung auf 2000 ml aufgefüllt, mit 0,1 η Natriumhydroxydlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit 500 g feuchter Diäthylaminoäthylcellulose (Firma Serva, Heidelberg) 1 Stunde verrührt.

Dann wird die Diäthylaminoäthylcellulose durch Filtrieren von der Lösung abgetrennt, zweimal mit je 1 I 0,01 molarem Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Salzsäurepuffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen und danach dreimal mit je 500 ml 0,02molarem Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Salzsäurepuffer, pH 6,5, der 0,85% Natriumchlorid und 0,05% Natriumazid enthält, eluiert.

Den vereinigten Eluaten werden 30% Ammonsulfat, bezogen auf das Flüssigkeitsgewicht, zugesetzt und das Ganze wird verrührt. Der Niederschlag, der das Gewebeprotein enthält, wird in 300 ml destilliertem Wasser gelöst und der Gelfiltration mittels SEPHADEX®G-150 unter Verwendung von O.lmolarem Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Salzsäurepuffer vom pH 8,0, der 1,0 Mol Natriumchlorid/Liter enthält, unterzogen (100:20 cm-Säule). Hierbei dient der Tris-Puffer zunächst als Suspensionsmedium, in dem der Träger für die Gelfiltration — nämlich das SEPHADEX® G-150 vorliegt. Das in destilliertem Wasser gelöste Gewebeprotein wird auf die mit SEPHADEX® gefüllte Säule aufgetragen und mit dem besagten Tris-Puffer eluiert.

Anschließend werden die Eluate mit spezifischem Gewebeprotein-Antiserum getestet, die Gewebeprotein-haltigen Fraktionen gesammelt und daraus die Proteine nochmals, wie oben beschrieben, mit 30% festem Ammonsulfat ausgefällt.
Die Weiterreinigung erfolgt an Hydroxylapatit (Säule

so 3 χ 23 cm) unter Verwendung eines 0,005m Phosphatpuffers, pH 6,8, und anschließend durch Chromatographie an Diäthylaminoäthylen-SEPHADEX® (Pharmacia) (Säule 3 χ 23 cm) unter Verwendung eines Tris-HCl-Puffers, pH 7,0. Zur Elution wird ein Salzgradient mit 0-2% NaCl angelegt Es werden 40 mg des neuen Gewebeproteins in einer Reinheit von 99,5% erhalten.

Die Aminosäureanalyse ergab folgende Werte (Mol-Prozent):

Lysin

Histidin

Arginin

Asparaginsäure

Threonin

Serin

Glutaminsäure

Prolin

5,64
1,05
3,83
9,84
433
4,78
11,29
6,41

9 10

Glycin 8,65 Isoleucin 3,32

Alanin 7,51 Leucin 14,43

Cystin/2 2,11 Tyrosin 5,10

Valin 6,68 Phenylalanin 3,08

Methionin 0,98 ; Tryptophan 1,14

Claims

Patentansprüche:

1. Gewebeprotein mit

a) einem Proteinameii von 94 ± 3%
einem Gehalt an Kohlenhydraten
5,4 ± 2,2% und davon

Hexosen3,0 ± 1%,
Hexosamin 1,2 ± 0,5%,
Fucose 0,2 ± 0,2%,
Neuraminsäure 1,0 ± 0,5%;

b) einem Sedimentationskoeffizienten S
von 3,5 S ± 0,5 S;

c) einem isoelektrischen Punkt von 4,9 ± 0,3;

d) einer elektrophoretischen Beweglichkeit im Bereich zwischen den xi- und 0i-GIobulinen;

e) einen Extinktionskoeffizienten E|'l (278 nm) von 11,9 ± 1,0,