DE2718325C2 - Leucinreiches 3,1-S-α↓2↓-Glykoprotein sowie dessen Verwendung - Google Patents

Leucinreiches 3,1-S-α↓2↓-Glykoprotein sowie dessen Verwendung

Info

Publication number
DE2718325C2
DE2718325C2 DE2718325A DE2718325A DE2718325C2 DE 2718325 C2 DE2718325 C2 DE 2718325C2 DE 2718325 A DE2718325 A DE 2718325A DE 2718325 A DE2718325 A DE 2718325A DE 2718325 C2 DE2718325 C2 DE 2718325C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
glycoprotein
leucine
solution
rich
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2718325A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2718325A1 (de
Inventor
Siegfried Dipl.-Chem. Dr. 3550 Marburg Baudner
Heinz Haupt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Original Assignee
Behringwerke AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Behringwerke AG filed Critical Behringwerke AG
Priority to DE2718325A priority Critical patent/DE2718325C2/de
Priority to ES78468931A priority patent/ES468931A1/es
Priority to CH427378A priority patent/CH643860A5/de
Priority to FR7811663A priority patent/FR2388824A1/fr
Priority to LU79490A priority patent/LU79490A1/de
Priority to IT22620/78A priority patent/IT1094921B/it
Priority to IE801/78A priority patent/IE46735B1/en
Priority to NL7804361A priority patent/NL7804361A/xx
Priority to AT0292478A priority patent/AT364857B/de
Priority to NZ187055A priority patent/NZ187055A/xx
Priority to DK176578A priority patent/DK176578A/da
Priority to GB16073/78A priority patent/GB1599435A/en
Priority to CA301,837A priority patent/CA1108534A/en
Priority to JP4920778A priority patent/JPS53133619A/ja
Priority to AU35405/78A priority patent/AU519645B2/en
Priority to ZA00782329A priority patent/ZA782329B/xx
Priority to SE7804714A priority patent/SE7804714L/xx
Priority to BE187103A priority patent/BE866365A/xx
Priority to ES472053A priority patent/ES472053A1/es
Publication of DE2718325A1 publication Critical patent/DE2718325A1/de
Priority to US06/103,868 priority patent/US4309339A/en
Priority to AT394180A priority patent/AT369265B/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2718325C2 publication Critical patent/DE2718325C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/473—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used alpha-Glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/822—Identified hapten
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/829—Blood
    • Y10S530/83—Plasma; serum

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

2. Verwendung des Glykoproteins nach Anspruch 1 zur Herstellung von Antiseren.
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Glykoprotein sowie dessen Verwendung für die Gewinnung von gegen das Glykoprotein gerichteten Antiseren, mit welchen der Gehalt des Glykoproteins in Körperflüssigkeiten nachgewiesen und bestimmt werden kann.
Das neue Glykoprotein unterscheidet sich von den bisher beschriebenen Proteinen aus menschlichem Serum in seinen physikalischen und immunochemischen Eigenschaften.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Glykoprotein, gekennzeichnet durch folgende Parameter:
a) Sedimemationskonstante in der Ultrazentrifuge 3,1 S±0,2;
b) Molekulargewicht von 49 600 ±4000;
c) elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich der *2-Globulinedes Humanserums;
d) isoelektrischer Bereich pH 3,8—4,1;
e) Extinktionskoeffizient E 1cm, 230 mm = 1% 7,0 + 2,0;
f) Gehalt von 77 ±2% «-Aminosäuren mit einem Anteil von 17±2% Leucin und 23 + 2% an Kohlenhydraten;
g) spezifische immunologische Reaktion mit gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörpern.
Für die Bestimmung der Parameter wurden folgende analytischen Verfahren angewendet:
Die Ultrazentrifugationsanalysen wurden mit einer Ultrazentrifuge der Firma Beckman, Modell E, durchgeführt. Das Protein wurde 0,2%ig (g/v) in 0,9%iger Kochsalzlösung in die Ultrazentrifugenanalyse eingesetzt. Die Sedimentation erfolgte bei 60 000 U/min und 200C in einer Überschichtungszelle. Die Registrierung erfolgte unter Einsatz der UV-Scanner-Technik bei 280 mm. Eine daraus abzuleitende Molekulargewichtsbestimmung wurde nach der Gleichgewichtsmeihode nach Yphantis vorgenommen.
Die isoclektrische Fokussierung wurde mit Hilfe einer von der Firma LKB. Stockholm. Schweden, vertriebenen Apparatur und den von dort bezogenen Reagenzien durchgeführt Verwendet wurde eine 440 ml-Säulc mit speziellen Puffersubstanzen hierfür im Bereich der pH-Werte 3-6.
Die Kohlenhydratanalyse wurde durchgeführt nach Schultze, Schmidtberger, Haupt (1958), Biochem. Z„ 3and 329, Seiten 490-507.
Die Aminosäureanalyse erfolgte nach Spackman, Stein und Moore (1958), AnaL Chem. 30, Seite 1190. Es
ίο wurde verwendet ein Aminosäureanaiysator Multichrom B der Firma Beckman.
Für die immunologische Bestimmung des neuen Glykoproteins wurde ein Antiserum verwendet, welches durch Immunisierung von Kaninchen über einen Zeitraum von sechs Wochen mit dem isolierten Protein unter Verwendung von komplettem Freundschen Adjuvans erhalten worden war. Die quantitative Bestimmung des Proteins mit Hilfe dieses Antiserums ist durchführbar nach der Methode von Laurell (1966), Analyt Biochem, Band 15, Seiten 45—52.
Wegen der auffallendsten Parameter des neuen Proteins, nämlich der relativ niedrigen Sedimentationskonstante von 3,1 S ±0,2, dem auffallend hohen Gehalt an Leucin und der leichten Charakterisierbarkeit durch die Wanderung bis pH 8,6 im ^-Bereich der Proteine wird das neue Protein als das Leucin-reiche 3,1-S-<Z2-Glykoprotein bezeichnet.
Zur Herstellung kann das Leucin-reiche 3,1-S-*2-Glykoprotein, ausgehend von menschlichem Blutserum, durch mehrere Verfahrensschritte bis zur Reindarstcllung angereichert werden. Ziel der Anreicherungen ist es jeweils, entweder das Protein möglichst frei von weiteren Serumbestandteilen oder begleitende Serumbestandteile auszufällen und das Leucin-reiche 3,1-S-Λ-2-Glykoprotein in Lösung zu behalten.
Zur Herstellung des Leucin-reichen 3,l-S-«2-Glykoproteins kann demnach ein Verfahren gebraucht werden, worin mindestens einer der folgenden Verfahrensschritte bis zur Reindarstellung des Proteins Anwen- dung findet:
a) Zugabe eines in der Proteinchemie üblicherweise zur Fraktionierung verwendeten Neutralsalzcs bis zur Ausfällung des Leucin-reichen 3,1-S-rt2-Glykoproteins, vorzugsweise von Ammoniumsulfat in einer Menge von 2,4 bis 2,8 M/l bei neutralem pH-Wert.
b) Durch Zugabe eines in der Proteinchcmie üblicherweise zur Fraktionierung verwendeten organisehen Lösungsmittels bis zu einer Konzentration, bei welcher das Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glykoprotein gerade noch in Lösung verbleibt und begleitende Proteine ausgefällt werden, vorzugsweise Zugabe von 40% (v/v) Äthanol zu einer in schwach saurem pH-Bereich gepufferten Lösung bei einer Temperatur von — 8 bis 0°C, vorzugsweise —5"C.
Dieses Fällungsverhalten des Glykoproteins bedeutet, daß es bei den bekannten Plasma-Fraktionierungsverfahren mit Hilfe von Äthanol nach der Methode VI von Cohn (E. J. Cohn et al., J. Am.
Chem. Soc. 68 [1946], Seite 459) in Lösung verbleibt. Der verbleibende alkoholische Überstand dieses Fäliungsverfahrens enthält nur noch 1 — 2% der gesamten Plasmaproteine. Dies besagt dem l'ach-
b5 mann weiter, daß das Fraktionierungsverfahren
nach Cohn besonders geeignet ist, um das neue Glykoprotein gegenüber anderen Plasiiiaproiciiien anzureichern.
c) Zugabc von wasserlöslichen Salzen der Akridinbascn, vorzugsweise das 2-Äthoxy-6,9-Diaminoakridinlaclat bis zu einer Konzentration von 0,01 Mol/l in neutralen bis schwach alkalischen pH-Bereich. Dabei fällt das neue 3,l-S-a:2-Glykoprotein nicht aus, wohingegen die meisten Plasmaproteine mit Ausnahme der Gammaglobuline durch diese Maßnahme gefällt werden.
Demnach erweist sich eine fraktionierte Fällung einer Proteinlösung, welche neben Leucin-reichem 3.1 -S-«2-Glykoprotein noch andere Plasmaproteine enthält, mit Akridinbasen als vorteilhafter Reinigungsschritt für das neue Protein, da hierbei ein großer Teil der Begleitproteine ausgefällt wird.
d) Zugabe von in der Proteinchemie zur Fällung von Proteinen verwendeten organischen Säuren, vorzugsweise von Trichloressigsäure bis zu einer Konzentration von 0,2 Mol/l, wobei das Leucin-reiche 3,l-S-<*2-Glykoprotein in Lösung verbleibt.
Von dieser Maßnahme ist bekannt, daß sie den GIobulintcil der Plasmaproteine auszufällen vermag. Demnach erweist sie sich ebenfalls als geeignet, um das neue Glykoprotein in Lösung anzureichern.
Statt Trichloressigsäure können auch andere Säuren zur Anreicherung des neuen Glykoproteins eingesetzt werden, wie z. B. Perchlorsäure oder Sulfosalizylsäure. Bei Perchlorsäure liegt die üblicherweise für die Fraktionierung verwendete Endkonzentration zwischen 0,4 und 0,6 Mol/l. Bei diesen Konzentrationen verbleibt das neue Glykoprotein in Lösung.
e) Erhitzung der das Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glykoprotein enthaltenden Proteinlösung kurzzeitig auf eine Temperatur nahe 100°C Dei neutralem bis schwach saurem pH-Wert. Vorzugsweise wird die sogenannte Hitzekoagulation von Proteinlösungen bei einem pH-Wert von etwa 5 während 5—15 Minuten bei 95—98°C vorgenommen. Dabei zeigt sich, daß nach einer Operation üas Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glykoprotein in Lösung verbleibt. Nur wenige Proteine bleiben unter den gleichen Bedingungen in Lösung. Die meisten fallen unter Koagulation aus der Lösung aus.
Γ) Entfernung von Elektrolyten aus der das Leucinreiche 3,1-S-«2-Glykoprotein enthaltenden Lösung. Die Verringerung des Elektrolytengehaltes einer Proteinlösung führt zur Ausfällung der sogenannten Euglobuline. Dazu gehört ein Teil der Lipoproteine, die Makroglobuline, ein Teil der Immunglobuline und Ceruloplasmin, um einige als Beispiel zu nennen. Bei dieser als sogenannte Euglobulin-Fällung bezeichneten Maßnahme bleibt das Leucinreiche 3,1 -S-*2-Glykoprotein in Lösung.
Die Verringerung der Elektrolyte einer Proteinlösung kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, z. B. mit Hilfe der Dialyse gegen ein wäßriges Medium mit verringerter Leitfähigkeit, gegebenenfalls gegen destilliertes Wasser. Auch Elektrodialyseverfahren eder die Verringerung der Elektrolyten in Lösung durch Verwendung von Ionenaustauschern sind hierfür geeignet.
g) Molekularsiebfraktionierung der das neue Glykoprotein enthaltenden Lösung mit dem Ziel auf einer Anreicherung von Proteinen mit einem Molekulargewicht /wischen 45 000 und 55 000 bzw. ein Ausschluß von Proteinen höheren oder niedrigeren Molekulargewichtes. Hierfür wird zweckmäßig eine Säulenfraktionierung durchgeführt unter Verwendung von Molekularsiebgelen, vorzugsweise von mit Epichlorhydrin quervernetztem Dextran. Auch andere Gelfiltrationsmedien mit vergleichbaren Ausschluß- bzw. Fraktionierungsgrenzen sind im Sinne der Erfindung geeignet.
h) Behandlung der Proteinlösung, die das Leucin-reiche 3,1-S-Ä2-Glykoprotein enthält, mit einem Anionenaustauscher, vorzugsweise einem solchen, der Aminoäthyl, Diäthylaminoäthyl oder Triäthylaminoäthyl als funktionell Gruppen und Cellulose als Matrix enthält. Das Leucin-reiche 3,l-S-«2-CJlykoprotein wird aus einer Lösung mit der Ionenstärke 0,05 an derartige Ionenaustauscher gebunden. Es kann danach mit dem Ionenaustauscher zusammen von den übrigen Proteinen, die in Lösung verbleiben, abgetrennt werden. Das neue Protein läßt sich durch Erhöhung der Leitfähigkeit von Pufferlösungen mit Hilfe von beispielsweise Neutralsalzen wie Kochsalz eluieren und somit gegenüber begleitenden Proteinen anreichern.
i) Elektrophorese in geeigneten Trägermedien und Gewinnung der Zone des «2-Bereiches der Plasmaproteine,
k) Behandlung der das Leucin-reiche 3,l-S-*2-Glykoprotein enthaltenden Lösung mit wasserunlöslichem Calciumphosphat-Hydrat, vorzugsweise mit Hydroxylapatit. Selbst bei niedriger Iononstärke der Proteiniösung, z. B. solche von Viooo Mol/l Ionen, wird das neue Glykoprotein an das unlösliche Phosphat nicht adsorbiert. Bei entsprechender Vorreinigung der das neue Protein enthaltenden Eiweißlösungen stellt der Adsorptionsüberstand bzw. im Säulenchromatographifcverfahren der Säulendurchfluß die Lösung eines gereinigten 3.1-S- «2-Glykoproteins dar.
Als letzter von mehreren der vorgenannten Schritte eingesetzt, liefert der Säulendurchfluß das reine Glykoprotein.
Durch eine beliebige Kombination von vorstehend dargestellten, in der Proteinchemie üblichen Verfahrensschritten läßt sich das neue Leucin-reiche 3.1-S-i*2-Glykoprotein aus menschlichem Serum oder einer Fraktion daraus beliebig anreichern und rein darstellen.
Die schließlich anfallenden, nurmehr das Leucin-reiche 3,l-S-*2-Glykoprotein. gegebenenfalls noch Salze enthaltende Lösung kann von Elektrolyten befreit und gefriergetrocknet werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des Leucin-reichen 3,l-S-*2-Glykoproteins geht von der bekannten Serumfraktionierung mit Hilfe von 2-Äthoxy-6,9-Diaminoakridinlaciat und Ammoniumsulfat aus, allgemein bekannt unter der Bezeichnung »Rivanol-Ammoniumsulfat-Verfahren«. dargestellt in Schultze, Hermanns; Molecular Biology of Human Proteins; Elsevier Publishing Company (1966), Seite 265. Bei diesen Verfahren ist das Leucin-reiche 3,1-S-A2-Glykoprotein zusammen mit einer Reihe anderer Glykoproteine in einem Abguß angereichert, der als Nebenfraktion bei der
bO Gewinnung von Albumin und Gammaglobulin aus Humanserum anfällt. Daraus werden in einem ersten Trennungsgang mit Hilfe von 2-Äthoxy-6,9-diaminoakridinlactat in einer Konzentration von 0.03 bis 0.06 Mol/l eine Reihe begleitender Proteine ausfällt.
Das Fällungsmittel wild durch Zugabe von Chloridionen, vorzugsweise Natriumchlorid, präzipitiert. Zu der Proteinlösung wird ein Ionenaustauscher gegeben, welcher das Leucin-reiche 3.1 -S-rti-GIvkoprotein zu binden
vermag. Vorteilhaft wird hierfür ein Anionenaustauscher mit funktionellen Aminoäthyl-, Diäthylamino- oder Triäthylaminoäthyl-Gruppen verwendet.
Der Ionenaustauscher wird sodann mit einer Pufferlösung steigender Salzkonzentration behandelt. Durch diese Maßnahme wird das neue Protein vom Ionenaustauscher wieder abgelöst. Die Lösung wird einem Molekularsiebverfahren, bei welchem Proteine mit einem Molekulargewicht von 100 000—150 000 ausgeschlossen werden, unterworfen. In der niedrig-molekularen Fraktion befindet sich das Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glykoprotein neben anderen, niedrig-molekularen Glykoproteinen.
Es erweist sich zweckmäßig und nützlich, die Ionenaustausch-Chromatographie unter etwas variierenden Bedingungen zu wiederholen. Dies kann einerseits durch Änderung der Adsorptions- bzw. Elutionsverhältnisse oder auch durch die Auswahl von Ionenaustauschern unterschiedlicher Basizität erfolgen. Von restlichen Verunreinigungen wird das Gl> Icoprotein durch Behandlung mit einem mineralischen Adsorbens, z. B. Hydroxylapatit, abgetrennt Dabei bleiben die begleitenden Proteine an dem Adsorbens gebunden, wonach eine Lösung mit reinem Leuc.n-reichen 3,1-S-«2-Glykoprotein anfällt.
Das Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glykoprotein ist immunogen. Seine parenteral Applikation an Wirbeltiere, vorzugsweise an gebräuchliche Laboratoriumstiere wie Kaninchen, führt zur Ausbildung von Antikörpern im Blut dieser Tiere. Danach kann deren Blut gewonnen und das Serum abgetrennt und gegebenenfalls hinsichtlich vorhandener Antikörper angereichert werden. Hierzu stehen geläufige Methoden der Plasmaproteinfraktionierung dem Fachmann zur Verfügung. Durch Immunisierung der Versuchstiere mit dem isolierten 3,l-S-*2-Glykoprotein wurde ein Antiserum erhalten, das streng spezifisch mit dem Immunisierungsantigen reagiert. Kreuzreaktionen mit anderen bisher isolierten Serumproteinen wurden nicht beobachtet.
Das neue Leucin-reiche 3,1-S-«2-Glykoprotein erweist sich demnach als wertvolles immunisierendes Agens bei der Herstellung von Antiseren. Diese sind wertvolle diagnostische Reagenzien.
Gegenstand der Erfindung ist demnach auch die Verwendung des neuen Glykoproteins für die Herstellung von Antiseren.
Die quantitativen immunologischen Bestimmungen des Proteins mit Hilfe des Elektro-lmmunoassay nach Laurell in einer Serummischung von ca. 1000 Spendern ergab einen Durchschnittsgehalt an 3,l-S-«2-Glykoprotein von 2,1 mg/100 ml Serum.
Es wurde festgestellt, daß die Konzentration des Leucin-reichen 3,l-S-*2-Glykoproteins in Einzelseren von Erwachsenen zwischen 1,5 und 3.2 mg/100 ml Serum schwankt.
Die Erfindung wird am nachstehenden Beispiel näher erläutert.
Beispiel
Ausgangsmaterial für die Herstellung des Leucin-reichen 3,l-S-rt:-Glykoproteins ist eine Fraktion, ausgehend von 25 Litern Ht.nanplasma. Dieses wird mit 0,84% 2-Äthoxy-6,9-Diaminoakiidinlactat bei pH 8,0 behandelt. Aus dem Überstand wird das Fällungsmittel als Chlorid ausgefällt und entfernt; sodann wird bei DH 7,0 mit 2,0 Mol Ammoniumsulfat gefällt. Diese Fällung wird als gammaglobulinresche Fraktion abgetrennt und der Überstand folgendem Verfahren unterworfen.
Der Überstand wird durch Ultrafiltration auf 5 I eingeengt Der Eiweißgehalt der Lösung beträgt dann 3%. Die Lösung wird mit einer 0,85%igen Kochsalzlösung am Ultrafilter gewaschen und danach mit 7,5 g 2 Äthoxy-ö.g-diaminoacridon-lactat versetzt. Das dabei entstandene Präzipitat wird durch Zentrifugation abgetrennt. Zu der überstehenden Lösung wird Kochsalz bis ίο zu einer Endkonzentration von 5% (g/v) zugegeben. Dabei fällt die Akridinbase als Chiorid aus. Es wird durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand wird durch Waschen auf dem Ultrafilter vom Kochsalz befreit und mit 0,02 M Phosphat-Puffer, pH 7,0, äquilibriert Er stellt 3 Liter einer 2,5%igen Proteinlösung dar. Dazu werden 300 g Diäthylaminoäthyl-Cellulose-Ionenaustauscher zugegeben, 1 Stunde gerührt, am Filter abgenutscht und der Filterrückstand mit 0,02 M/l Phosphat-Puffer, pH 0,7, gewaschen. Darauf wird der Ionenaustauscher mit einer IM NaCl-Lösung gewaschen. Der Durchfluß wird zum Teil entfernt Eine Fraktion, weiche das Leucin-reiche Giykoprotein enthält, wird weiter verarbeitet. Man führt mit dieser eine Gelfiltration an SEPHADEX G 150 durch; die Gelfiltration wird in einer Säule vom Durchmesser 20 cm und einer Höhe von 1 m, welche mit SEPHADEX9G 150 gefüllt ist, durchgeführt. Als Elutionsmittel dient Trishydroxymethylaminoethan-HCl-Puffer, O.lmolar, vom pH 8,0, enthaltend 1 Mol NaCl. Dabei wird eine hochmolckulare Fraktion abgetrennt und eine niedermolekulare Fraktion, welche das Leucin-reiche 3,l-S-rt:2-Glykoprotein enthält, gewonnen.
Anschließend wird eine Säule (ca. 500 ml, 5 χ 45 cm) mit Diäthylaminoäthyl-SEPHADEX-Ionenaustauschcr gefüllt, die das Leucin-reiche 3,l-S-«2-Glvkoprotein enthaltende Fraktion auf die Säule aufgetragen und die Elution der Substanzen mit einem linearen Salzgradicnten von 0,006 M Trishydroxymethylaminomethan-HCI-Puffer vom pH-Wert 8,6 ohne Salzzusat/. bis 0,006 M Trishydroxymethylaminomethan· Puffer HCI vom pH-Wert 8,6, enthaltend 0,2 M NaCl/l, angelegt. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt. Es werden diejenigen Fraktionen weiterverarbeitet, welche durch eine Kontroil-Elektrophorese eine elektrische Bcweglichkeit im «2-Bereich der Proteine aufweisen. Zur Anreicherung des Proteins werden die Fraktionen mil Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 70% versetzt. Der dabei entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen, in Wasser aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert, der für die folgende QAE-Chromatographie verwendet wird.
Anschließend wird eine weitere Chromatographie an QAE-SEPHADEX in einer vergleichbaren Vcrsuchsanordnung durchgeführt. Zur Elution wird ein linearer Salzgradient von 0,08 Mol Natriumacetat-Puffer, pH 5,5, bis 0,35 Mol Natriumacetat-Puffer, pH 5,5, angelegt. Die durch Elektrophorese charakterisierten Fraktionen werden gewonnen und weiterverürbeitet.
Zunächst erfolgt eine Dialyse gegen 0,001 Mol Nntriumphosphat-Puffer vom pH 7,0. Das gegen diesen Puffer äquilibrierte Produkt wird schließlich auf eine mit Hydroxylpatit gefüllte Säule aufgetragen (Säulengröße 4x12 cm). Der Säuleninhalt wird eluiert mit 0,0Oi Mol Phosphatpuffer, pH 7,0. Der Durchfluß stellt reines Leucin-reiches 3,1 -S-Ä2-Glykoprotein dar.
Ausgehend von 25 Litern Humanplasma werden 100 mg des erfindungsgemäßen Proteins erhalten.
Es zeigt folgende Aminosäure-Zusammensetzungen:
7 N-Aeetylneuraminsäure 27 18 325
Mol% des Summe (Kohlenhydratanteil)
Aminosäuren Aminosäure- Variations
iinlcils koeffizient
3,87 %
Lysin 2,23 5,90 — ry
Histidin 4,65 11,28
Arginin 11,45 7,68
Asparaginsäure 3,87 1,49 1 ΓΪ
Threonin 6,43 6,26 IU
Serin 10,72 2,36
Glutaminsäure 7,04 2,51
Prolin 7,32 4,43
Glycin 6,65 2,31 I <Λ
Alanin 1,21 1,97 I D
1/2 Cystin 4,48 9,83
Valin 0,75 3,78
Methionin 1,29 5,81
Isoleucin 22,05 3,16 ■yn
Leucin 0,81 5,79
Tyrosin 3,23 19,53
Phenylalanin 1,60 1,39
Tryptophan 11,69
25
Kohlcnhydrat Gew.-o/o
Galaktose 4,1 ±0.3
Mannose 3,8 + 0,3
Glucose 0 30
Fucose 0,3 + 0,1
Xylose 0
N-Acetylhexosamin 8,1+0,5
6,6 + 0,4
22,9+1,6 35
Die Streubreiten sind methodisch bedingte Fehlergrenzen.
40
50

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Glykoprotein aus menschlichem Serum, gekennzeichnet durch folgende Parameter:
a) Sedimentationskonstante in der Ultrazentrifuge 3.1 S ±0,2;
b) Molekulargewicht von 49 600 ±4000;
c) elektrophoretische Beweglichkeit im Bereich der Ä2-Globuline des Humanserums;
d) isoelektrischer Bereich pH 3,8—4,1;
e) Extinktionskoeffizient £L„2eomm = 7,O±2,O;
f) Gehalt von 77 ±2% α-Aminosäuren mit einem Anteil von 17%±2% Leucin und 23±2% an Kohlenhydraten;
g) spezifische immunologische Reaktion mit gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörpern.
DE2718325A 1977-04-25 1977-04-25 Leucinreiches 3,1-S-&alpha;&darr;2&darr;-Glykoprotein sowie dessen Verwendung Expired DE2718325C2 (de)

Priority Applications (21)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2718325A DE2718325C2 (de) 1977-04-25 1977-04-25 Leucinreiches 3,1-S-&alpha;&darr;2&darr;-Glykoprotein sowie dessen Verwendung
ES78468931A ES468931A1 (es) 1977-04-25 1978-04-19 Procedimiento para la preparacion de una glucoproteina de suero humano.
CH427378A CH643860A5 (de) 1977-04-25 1978-04-20 Leucinreiches 3,1-s-alpha-2-glykoprotein, verfahren zu dessen herstellung sowie dessen verwendung.
FR7811663A FR2388824A1 (fr) 1977-04-25 1978-04-20 3,1-s-a2-glycoproteine riche en leucine, son procede de preparation et son utilisation
IT22620/78A IT1094921B (it) 1977-04-25 1978-04-21 3,1-s-alfa2-glicoproteina,ricca di leucina,processo per la sua preparazione e suo impiego
LU79490A LU79490A1 (de) 1977-04-25 1978-04-21 Leucinreiches 3,1-s-a2-glykoprotein,verfahren zu dessen herstellung sowie dessen verwendung
DK176578A DK176578A (da) 1977-04-25 1978-04-24 Glycoprotein dets fremstilling og anvendelser
NL7804361A NL7804361A (nl) 1977-04-25 1978-04-24 Leucinerijk 3,1-s-alpha2-glycoproteine, zijn berei- ding en toepassing.
AT0292478A AT364857B (de) 1977-04-25 1978-04-24 Verfahren zur gewinnung eines neuen leucinreichen 3,1-s-alpha2-glykoproteins
NZ187055A NZ187055A (en) 1977-04-25 1978-04-24 Leucine-rich 3.1-s-glycoprotein and antiserum
IE801/78A IE46735B1 (en) 1977-04-25 1978-04-24 Glycoprotein,and process for its production
GB16073/78A GB1599435A (en) 1977-04-25 1978-04-24 Glycoprotein and process for its production
CA301,837A CA1108534A (en) 1977-04-25 1978-04-24 LEUCINE-RICH 3,1-S-.alpha..SUB.2-GLYCOPROTEIN, PROCESS FOR ISOLATING IT AND ITS USE
JP4920778A JPS53133619A (en) 1977-04-25 1978-04-24 High leucine containing 3*11ssalpha22glycoprotein * production and use thereof
AU35405/78A AU519645B2 (en) 1977-04-25 1978-04-24 Leucine rich 3, 1-s-2 glycoprotein, its isolation and use
ZA00782329A ZA782329B (en) 1977-04-25 1978-04-24 Leucine-rich 3,1-s-a2-glycoprotein,process for isolating it and its use
BE187103A BE866365A (fr) 1977-04-25 1978-04-25 3,1-s-alpha2-glycoproteine riche en leucine, son procede de preparation et son utilisation
SE7804714A SE7804714L (sv) 1977-04-25 1978-04-25 Leucinrikt 3,1-s-alfa2-glykoprotein, forfarande for dess isolering samt dess anvendning
ES472053A ES472053A1 (es) 1977-04-25 1978-07-26 Procedimiento para la preparacion de un agente diagnostico para la determinacion inmunologica de la glucoproteina 3,1s-a2 rica en leucina
US06/103,868 US4309339A (en) 1977-04-25 1979-12-14 Leucine-rich 3,1-S-α2 -glycoprotein, process for isolating it and its use
AT394180A AT369265B (de) 1977-04-25 1980-07-29 Verfahren zur herstellung eines antiserums gegen ein leucinreiches 3,1s-alpha2-glykoprotein

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2718325A DE2718325C2 (de) 1977-04-25 1977-04-25 Leucinreiches 3,1-S-&alpha;&darr;2&darr;-Glykoprotein sowie dessen Verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2718325A1 DE2718325A1 (de) 1978-10-26
DE2718325C2 true DE2718325C2 (de) 1986-09-25

Family

ID=6007197

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2718325A Expired DE2718325C2 (de) 1977-04-25 1977-04-25 Leucinreiches 3,1-S-&alpha;&darr;2&darr;-Glykoprotein sowie dessen Verwendung

Country Status (19)

Country Link
US (1) US4309339A (de)
JP (1) JPS53133619A (de)
AT (1) AT364857B (de)
AU (1) AU519645B2 (de)
BE (1) BE866365A (de)
CA (1) CA1108534A (de)
CH (1) CH643860A5 (de)
DE (1) DE2718325C2 (de)
DK (1) DK176578A (de)
ES (2) ES468931A1 (de)
FR (1) FR2388824A1 (de)
GB (1) GB1599435A (de)
IE (1) IE46735B1 (de)
IT (1) IT1094921B (de)
LU (1) LU79490A1 (de)
NL (1) NL7804361A (de)
NZ (1) NZ187055A (de)
SE (1) SE7804714L (de)
ZA (1) ZA782329B (de)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3334405A1 (de) * 1983-09-23 1985-04-04 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Membranassoziierte proteine (mp(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)), verfahren zu ihrer gewinnung sowie ihre verwendung
DE3410694A1 (de) * 1984-03-23 1985-10-03 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung
JPS61294366A (ja) * 1985-06-24 1986-12-25 Toubishi Yakuhin Kogyo Kk 糖鎖に特異的な抗体の検出用試薬及びその使用
CH671879A5 (de) * 1987-02-26 1989-10-13 Nestle Sa
US5101018A (en) * 1989-06-12 1992-03-31 International Minerals & Chemical Corp. Method for recovering recombinant proteins
US5047511A (en) * 1989-08-28 1991-09-10 Pitman-Moore, Inc. Method for recovering recombinant proteins
KR20210073547A (ko) * 2018-10-09 2021-06-18 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 류신 리치 α2 글리코 단백질 조성물

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4191533A (en) * 1971-09-29 1980-03-04 Behringwerke Aktiengesellschaft Pregnancy-specific β1 -glycoprotein and process for isolating it
DE2221261A1 (de) * 1972-04-29 1973-11-15 Behringwerke Ag Ap-glykoproteine und verfahren zu ihrer isolierung
FR2222083B1 (de) * 1973-03-22 1976-05-14 Fontaine Michel
DE2640387C3 (de) * 1976-09-08 1981-01-22 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung
DE2720704C2 (de) * 1977-05-07 1986-09-25 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Neues Glycoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS-ERMITTELT

Also Published As

Publication number Publication date
ES472053A1 (es) 1979-02-01
DE2718325A1 (de) 1978-10-26
NL7804361A (nl) 1978-10-27
IT1094921B (it) 1985-08-10
AU3540578A (en) 1979-11-01
GB1599435A (en) 1981-10-07
US4309339A (en) 1982-01-05
JPS53133619A (en) 1978-11-21
NZ187055A (en) 1981-05-29
ES468931A1 (es) 1978-12-16
FR2388824B1 (de) 1984-05-18
CH643860A5 (de) 1984-06-29
IT7822620A0 (it) 1978-04-21
IE780801L (en) 1978-10-25
AU519645B2 (en) 1981-12-17
BE866365A (fr) 1978-10-25
ATA292478A (de) 1981-04-15
DK176578A (da) 1978-10-26
AT364857B (de) 1981-11-25
LU79490A1 (de) 1978-11-28
ZA782329B (en) 1979-04-25
IE46735B1 (en) 1983-09-07
FR2388824A1 (fr) 1978-11-24
CA1108534A (en) 1981-09-08
SE7804714L (sv) 1978-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2720704C2 (de) Neues Glycoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
EP0143413B1 (de) Digitalis-Antikörper, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Therapie von Digitalis-Intoxikationen
EP0000134B1 (de) Glykoprotein, Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung zur Gewinnung von Antiserum sowie das Antiserum
DE2640387C3 (de) Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung
EP0127603B1 (de) Verfahren zur Herstellung einer Faktor VIII(AHF)-hältigen Präparation
US4302385A (en) Placenta-specific tissue protein PP10
DE2842467A1 (de) Neues ubiquitaeres gewebsprotein pp tief 8
DE2718325C2 (de) Leucinreiches 3,1-S-&amp;alpha;&amp;darr;2&amp;darr;-Glykoprotein sowie dessen Verwendung
EP0037963B1 (de) Neues Protein PP9, Verfahren zu seiner Gewinnung sowie seine Verwendung
DE3228503A1 (de) Neues protein (pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)7(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowie seine verwendung
DE3230996A1 (de) Neues protein (pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)3(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowie seine verwendung
DE3418888A1 (de) Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)8(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung
EP0141326B1 (de) Neues Protein PP20, Verfahren zu seiner Gewinnung sowie seine Verwendung
EP0029191B1 (de) Neues Protein PP11, ein Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung
DE2718326A1 (de) Neues protein und verfahren zu dessen herstellung
DE3410694A1 (de) Gewebeprotein pp(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung
AT369265B (de) Verfahren zur herstellung eines antiserums gegen ein leucinreiches 3,1s-alpha2-glykoprotein
EP0137345B1 (de) Membranassoziierte Proteine (MP2), Verfahren zu ihrer Gewinnung sowie ihre Verwendung
DE2256910C3 (de) Metallionenbindendes 93 S-A1 -Glykoprotein und seine Verwendung
JPS58135816A (ja) 食欲調整物質の製造方法
DE3314293A1 (de) Membran-assoziiertes plazentaprotein (mp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee