JPS59141520A - Ｄｎａ合成抑制物質 - Google Patents
Ｄｎａ合成抑制物質Info
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- JPS59141520A JPS59141520A JP58015790A JP1579083A JPS59141520A JP S59141520 A JPS59141520 A JP S59141520A JP 58015790 A JP58015790 A JP 58015790A JP 1579083 A JP1579083 A JP 1579083A JP S59141520 A JPS59141520 A JP S59141520A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/91—Cell lines ; Processes using cell lines
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規’＆Ｔ細胞ＤＮＡ合成抑制物質に関する。
さらに詳細には、本発明は、動物の線維芽細胞またはリ
ンパ球を無血清あるいは牛胎児血清含有培地で培養して
得られるＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質に関する。
ンパ球を無血清あるいは牛胎児血清含有培地で培養して
得られるＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質に関する。
従来、Ｔ細胞などの免疫担幽細胞における免疫活性の異
常な亢進による各種の自己免疫疾患などに対する治療に
はステロイド、イムランなどが用いられている。これら
は、特定の疾病にはある程度の治療効果が認められるが
、正常細胞に対し副腎の機能低下、白血球数の減少など
の副作用があるので、よ＃）優れた治療薬の開発が望ま
れている。
常な亢進による各種の自己免疫疾患などに対する治療に
はステロイド、イムランなどが用いられている。これら
は、特定の疾病にはある程度の治療効果が認められるが
、正常細胞に対し副腎の機能低下、白血球数の減少など
の副作用があるので、よ＃）優れた治療薬の開発が望ま
れている。
本発明者らは、動物の線維芽細胞、リンパ球などが免疫
細胞（Ｔ細胞）のＤＮＡ合成を抑制する物質を生産して
おシ、この物質が免疫細胞の活性を抑制して自己免疫疾
患に対する治療に有用であることを見出し本発明を完成
するに至った。
細胞（Ｔ細胞）のＤＮＡ合成を抑制する物質を生産して
おシ、この物質が免疫細胞の活性を抑制して自己免疫疾
患に対する治療に有用であることを見出し本発明を完成
するに至った。
従来、免疫細胞に対する抑制物質は、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ。
ｏｌ。
具ユ、 １５４−１６３（１９７２）、 Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、１１６゜１４５２−１４５８（１９７６）、
Ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ １．５−２１（１９７５）な
どで知られているが、これら既知の物質はいずれも高分
子物質であるため、患者の免疫的拒絶反応などの副作用
を惹起する可能性がある。本発明の物質は哺乳動物中に
由来する低分子ペプチドであるため副作用が低いことが
予想され、免疫疾患への応用が期待される。
ｎｏｌ、１１６゜１４５２−１４５８（１９７６）、
Ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ １．５−２１（１９７５）な
どで知られているが、これら既知の物質はいずれも高分
子物質であるため、患者の免疫的拒絶反応などの副作用
を惹起する可能性がある。本発明の物質は哺乳動物中に
由来する低分子ペプチドであるため副作用が低いことが
予想され、免疫疾患への応用が期待される。
以下本発明について詳細に説明する。
本発明に係る新規Ｔ細胞ＤＮＡ合成抑制物質（以下゛電
率物質′と略記する）は、動物の線維芽細胞またはリン
パ球を培地で培養し、培養物中に生成蓄積した本物質を
採取することによって得ることができる。
率物質′と略記する）は、動物の線維芽細胞またはリン
パ球を培地で培養し、培養物中に生成蓄積した本物質を
採取することによって得ることができる。
動物としてはマウス、ラット、ヒトなどの哺乳動物が好
ましく、細胞としてはマウス（０３Ｈ／’Ｈｅ）婢細胞
、マウス３Ｔ３）ｌｌｉｉ！維＃細胞［Ｊ、 Ｃｅ１１
Ｂｉ１１．、１７．２’９９（１９６３）’：ｌ、ラッ
ト牌細胞ＳＤ （Ｓｐｌａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ）、
ヒト胎児線維芽細胞が好適にあけられる。これらの細胞
は消和実験動物＠（大分）から購入できる。
ましく、細胞としてはマウス（０３Ｈ／’Ｈｅ）婢細胞
、マウス３Ｔ３）ｌｌｉｉ！維＃細胞［Ｊ、 Ｃｅ１１
Ｂｉ１１．、１７．２’９９（１９６３）’：ｌ、ラッ
ト牌細胞ＳＤ （Ｓｐｌａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ）、
ヒト胎児線維芽細胞が好適にあけられる。これらの細胞
は消和実験動物＠（大分）から購入できる。
培地としては、動物細胞の培養に使用するものであれば
、いかなる培地をも用いることができる。好適にはＲＰ
Ｍ１１６４０培地、ＭＥＭ培地などが好適に用いられる
。ＲＰＭ１１６４０培地およびＭＥＭ培地の組成につい
ては「組織培養」中井準之助ら編集、朝食書店、９−１
１頁、１９７６年を参照。培地には牛脂光血清を１〜１
０％加えてもよい。またフォルボールエステル類を培地
に添加することにより本物質の生成が向上する。
、いかなる培地をも用いることができる。好適にはＲＰ
Ｍ１１６４０培地、ＭＥＭ培地などが好適に用いられる
。ＲＰＭ１１６４０培地およびＭＥＭ培地の組成につい
ては「組織培養」中井準之助ら編集、朝食書店、９−１
１頁、１９７６年を参照。培地には牛脂光血清を１〜１
０％加えてもよい。またフォルボールエステル類を培地
に添加することにより本物質の生成が向上する。
フォルボールエステルとしては、フォルボールミリステ
ート、７オルボールー１３−アセテ−）、１２−０−テ
トラデカノイル−フォルボール−１３−アセテート（Ｔ
ＰＡ、）などが好適に用いられる。
ート、７オルボールー１３−アセテ−）、１２−０−テ
トラデカノイル−フォルボール−１３−アセテート（Ｔ
ＰＡ、）などが好適に用いられる。
フォルボールの濃度は、通常培養液１１当シ１−１．０
００ｎｆ、好ましくは１Ｏ−１００ｎＪの範囲で用いる
。
００ｎｆ、好ましくは１Ｏ−１００ｎＪの範囲で用いる
。
培養社通常の動物細胞の培養条件に従って、液体、通気
培養を行う。゛通気は、５−１０ＸＣ０２，９Ｏ−９５
Ｎ空気を用いる。培養温度は２５−４０℃、好ましくは
３０−３７℃、ｐＨ培養物からのＴ細胞ＤＮＡ合成抑制
物質の採取は通常動゛物細胞の培養物から蛋白質を採取
する方法に従って行なわれる。
培養を行う。゛通気は、５−１０ＸＣ０２，９Ｏ−９５
Ｎ空気を用いる。培養温度は２５−４０℃、好ましくは
３０−３７℃、ｐＨ培養物からのＴ細胞ＤＮＡ合成抑制
物質の採取は通常動゛物細胞の培養物から蛋白質を採取
する方法に従って行なわれる。
細胞培養後、遠心分離によシ細胞を除き培養上清を回収
し、それに２倍容量の飽和硫安（ｐＨ７，５）を加え、
塩析処理する。塩析処理物を遠心分離して得た沈殿物を
生理食塩水にとかし、セファデックス０１００カラムに
かけ、生理食塩水で溶出する。低分子物質を含む両分に
Ｔ細胞のＤＮＡ合成を抑制する活性が認められる。
し、それに２倍容量の飽和硫安（ｐＨ７，５）を加え、
塩析処理する。塩析処理物を遠心分離して得た沈殿物を
生理食塩水にとかし、セファデックス０１００カラムに
かけ、生理食塩水で溶出する。低分子物質を含む両分に
Ｔ細胞のＤＮＡ合成を抑制する活性が認められる。
その活性画分を２倍容量の蒸留水で希釈し、ＣＭセファ
デックスにかける。５０ｍＭ食塩水でカラムを洗ったの
ち、食塩の濃度勾配で溶出する。本物質は約４００ ｍ
Ｍ食塩水で溶出されてくるので、その活性画分をロータ
リーエバポレーターで濃粗し、セファデックスＧ５０カ
ラムにかけ、生理的食塩水で溶出する。分子量約ｉ、
ｏ ｏ ｏダルトンの位置に活性が認められるので、活
性画分をロータリーエバポレーターで濃縮しシリカゲル
薄層クロマトグラフィーにスポットしメタノール−水溶
媒系で展開する。その結果２つのニンヒドリン陽性スポ
ットが認められる。Ｔ細胞ＤＮＡ合成抑制活性は、よシ
易動度の低いスポットに存在しているので、その部分の
シリカゲルを回収し、水によって本物質を抽出する。
デックスにかける。５０ｍＭ食塩水でカラムを洗ったの
ち、食塩の濃度勾配で溶出する。本物質は約４００ ｍ
Ｍ食塩水で溶出されてくるので、その活性画分をロータ
リーエバポレーターで濃粗し、セファデックスＧ５０カ
ラムにかけ、生理的食塩水で溶出する。分子量約ｉ、
ｏ ｏ ｏダルトンの位置に活性が認められるので、活
性画分をロータリーエバポレーターで濃縮しシリカゲル
薄層クロマトグラフィーにスポットしメタノール−水溶
媒系で展開する。その結果２つのニンヒドリン陽性スポ
ットが認められる。Ｔ細胞ＤＮＡ合成抑制活性は、よシ
易動度の低いスポットに存在しているので、その部分の
シリカゲルを回収し、水によって本物質を抽出する。
Ｔ細胞のＤＮＡ合成活性の測定は次のとおシに行なう。
０．１ｄのＲＰＭＩ １６４０−１０Ｘ牛脂児血清中に
懸濁した２、５Ｘ１０’個のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの胸腺
細胞を０．１ Ｋ／の線維芽細胞の培養上清またはカラ
ムクロマドグ２フイーの各両分と混合し、２．５μ２贋
のコンカナバリンＡを加えて２日間イン・ビトロで培養
する。最後の２０時間を１μＣ１の〔３Ｈ〕−チミジン
でパルスラベルし、胸腺細胞にとシこまれた〔３Ｈ〕−
チミジンを計測する。
懸濁した２、５Ｘ１０’個のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの胸腺
細胞を０．１ Ｋ／の線維芽細胞の培養上清またはカラ
ムクロマドグ２フイーの各両分と混合し、２．５μ２贋
のコンカナバリンＡを加えて２日間イン・ビトロで培養
する。最後の２０時間を１μＣ１の〔３Ｈ〕−チミジン
でパルスラベルし、胸腺細胞にとシこまれた〔３Ｈ〕−
チミジンを計測する。
かくして得られる本物質は低分子ペプチドであシ、以下
の理化学的性質を示す。
の理化学的性質を示す。
■ 元素分析： Ｃ，Ｈ，０，ＮおよびＳの元素を有す
る。
る。
■ 分子量：約ｉ、 ｏ ｏ ｏダルトン■ 熱安定性
ニー２０℃で数カ月間安定（ｐＨ６，６〜６・７）５６
−Ｃ”ｔ’３０分間安定９０℃で５分間安定 ■ 酸性・塩基性・中性の区別二弱酸性大を示す（第５
図参照） ■ 呈色反応：ニンヒドリン陽性反応。
ニー２０℃で数カ月間安定（ｐＨ６，６〜６・７）５６
−Ｃ”ｔ’３０分間安定９０℃で５分間安定 ■ 酸性・塩基性・中性の区別二弱酸性大を示す（第５
図参照） ■ 呈色反応：ニンヒドリン陽性反応。
■ 溶解性：水、エタノール、メタノールに易溶。
■ 物質の色：上記溶媒に溶かすと無色。
［相］ トリプシン処理でＴ細胞ＤＮＡ合成抑制活性が
消失する。
消失する。
本物質のＴ細胞への作用機作は次のとおシ。
本物質の添加によるＴ細胞の生存率をトリパｙ−ブルー
を用いるｄｙｅ ｅｃｃｌｕｓｉｏｎ法によって調べる
と、無添加の系のものとあまシ変らない。つｔ、ｂ、本
物質は基本的にはＴ細胞を殺さないがそのＤＮＡ合成の
みを抑制する（実験例１および第１表参照）。
を用いるｄｙｅ ｅｃｃｌｕｓｉｏｎ法によって調べる
と、無添加の系のものとあまシ変らない。つｔ、ｂ、本
物質は基本的にはＴ細胞を殺さないがそのＤＮＡ合成の
みを抑制する（実験例１および第１表参照）。
また本物質はＴ細胞のＲＮＡ合成の抑制はおこさない（
実験例２および第６図番Ｍ）。ただ、Ｔ細胞の初期（０
〜５時間）のヌクレオチドのとり込み活性を有意に抑制
する（第６図ａ参照）本物質による初期の細胞の機能の
抑制−（初期のヌクレオチドの取シ込みの抑制）はＴ細
胞ＤＮＡ合成抑制によると考えられる（実験例３および
第２表参照）。゛ 実施例 本物質のＴ細胞の生存率に対する影響 マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ ）の胸腺細胞５Ｘ１０’個を１
ｗ１ｌのＲＰＭ１１６４０培地−５％牛脂児血清中に懸
濁し、本物質０．１ ｍ／または対照として生理食塩水
０．１−を懸濁液に加え、１日および２日後の細胞の生
存率を調べた。測定法は ｄｙｅｅＸＣ１ｕｌｌｌｉｏ
ｎ法によるが、１日後および２日後に０．１％トリバン
ブルー液（ｔ、９ｖ）で細胞液（Ｏ，ＩＶ）を２０倍に
希釈し、トリバンプルーに染まる細胞を顕微鏡下で数え
、その生存率を計算した。
実験例２および第６図番Ｍ）。ただ、Ｔ細胞の初期（０
〜５時間）のヌクレオチドのとり込み活性を有意に抑制
する（第６図ａ参照）本物質による初期の細胞の機能の
抑制−（初期のヌクレオチドの取シ込みの抑制）はＴ細
胞ＤＮＡ合成抑制によると考えられる（実験例３および
第２表参照）。゛ 実施例 本物質のＴ細胞の生存率に対する影響 マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ ）の胸腺細胞５Ｘ１０’個を１
ｗ１ｌのＲＰＭ１１６４０培地−５％牛脂児血清中に懸
濁し、本物質０．１ ｍ／または対照として生理食塩水
０．１−を懸濁液に加え、１日および２日後の細胞の生
存率を調べた。測定法は ｄｙｅｅＸＣ１ｕｌｌｌｉｏ
ｎ法によるが、１日後および２日後に０．１％トリバン
ブルー液（ｔ、９ｖ）で細胞液（Ｏ，ＩＶ）を２０倍に
希釈し、トリバンプルーに染まる細胞を顕微鏡下で数え
、その生存率を計算した。
結果を第１表に示す。
第１表
実施例
本物質のＴ細胞に対する作用機作
マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ ）の胸腺細胞５Ｘ１０’個をＲ
ＰＭ１１６４０培地−５％牛脂児血清に懸濁し、コンカ
ナバリンＡ（５μｒ／ｓＥ／）を加え最終容量を０．１
ｄとした。
ＰＭ１１６４０培地−５％牛脂児血清に懸濁し、コンカ
ナバリンＡ（５μｒ／ｓＥ／）を加え最終容量を０．１
ｄとした。
ＲＮＡをラベルするために１μＣ１の〔３Ｈ″］ ＵＴ
Ｐを培養細胞に加え、各時点で、冷した１０％トリクロ
ロ酢酸（ＴＣＡ）で反応を止め、ＴＣＡ不溶画分にある
ＲＮＡをＧ Ｆ ／ Ｆメンブレンフィルター（’１ｌ
ｉｌ’ｈａｔｍａｎ社製）にトラップした。メンブレン
を５％Ｔ’ＣＡでくシ返し、エタノールで１回洗った後
、乾燥させた。メンブレンをトルエン−ｐ ｏ ｐ 系
ｉｉＫ入してβ−シンチレーションカウンターでＲＮＡ
画分の放射能を測定し、そのＲＮＡ合成能を決定した。
Ｐを培養細胞に加え、各時点で、冷した１０％トリクロ
ロ酢酸（ＴＣＡ）で反応を止め、ＴＣＡ不溶画分にある
ＲＮＡをＧ Ｆ ／ Ｆメンブレンフィルター（’１ｌ
ｉｌ’ｈａｔｍａｎ社製）にトラップした。メンブレン
を５％Ｔ’ＣＡでくシ返し、エタノールで１回洗った後
、乾燥させた。メンブレンをトルエン−ｐ ｏ ｐ 系
ｉｉＫ入してβ−シンチレーションカウンターでＲＮＡ
画分の放射能を測定し、そのＲＮＡ合成能を決定した。
その結果を第６図に示す。図中（ａ）は〔３Ｈ〕ＵＴＰ
のＴ細胞への取シ込み活性、（１））はＲＮＡ合成活性
を示す。また図中白丸は本物質非存在下、黒丸は本物質
の存在下の結果を示す。
のＴ細胞への取シ込み活性、（１））はＲＮＡ合成活性
を示す。また図中白丸は本物質非存在下、黒丸は本物質
の存在下の結果を示す。
実施例
ＤＮＡ合成抑制効果への本物質の有効な添加時間
マウス（Ｃ１／Ｈｅ）の胸腺細胞２．５ Ｘ １０’個
をコンカナバリンＡ５μり／−を含むＲＰＭ１１６４０
培地−５％牛脂児血清（最終容量０．１１１Ｌｌ）に懸
濁し５％ＣＯ２，９５％空気の条件で３７℃、３日間培
養した。その培養中鎖２表に記載した時間に本物質を０
．１ ｄ添加した。培養終了１２時間前に細胞を１μＣ
１の〔３Ｈ〕チミジンでラベルし細胞に取り込まれた〔
３Ｈ〕チミジン活性を測定した。
をコンカナバリンＡ５μり／−を含むＲＰＭ１１６４０
培地−５％牛脂児血清（最終容量０．１１１Ｌｌ）に懸
濁し５％ＣＯ２，９５％空気の条件で３７℃、３日間培
養した。その培養中鎖２表に記載した時間に本物質を０
．１ ｄ添加した。培養終了１２時間前に細胞を１μＣ
１の〔３Ｈ〕チミジンでラベルし細胞に取り込まれた〔
３Ｈ〕チミジン活性を測定した。
結果を第２表に示す。
第２表
ｔ０５２４±１０２ １４．０
２．５ ５０７±１９１ １３．５５５０９±６５
１３．６ １５ ９０３±１７８ ２４１ 本物質は、Ｔ細胞のＤＮＡ合成を強く抑制する低分子ペ
プチドであるので、自己免疫挾患などへの治療剤として
用いることができる。また本物質はＤＮＡ合成のみを抑
制するが、Ｔ細胞を殺しはしカいので、特異的にＤＮＡ
合成のみを抑制することへの応用もできる。さらに、フ
ォルボールエステルによって本物質産生細胞を前癌状態
にすると本物質の産生が高まるので、癌に対する診断の
マーカーとしても本物質を用いることができる。
１３．６ １５ ９０３±１７８ ２４１ 本物質は、Ｔ細胞のＤＮＡ合成を強く抑制する低分子ペ
プチドであるので、自己免疫挾患などへの治療剤として
用いることができる。また本物質はＤＮＡ合成のみを抑
制するが、Ｔ細胞を殺しはしカいので、特異的にＤＮＡ
合成のみを抑制することへの応用もできる。さらに、フ
ォルボールエステルによって本物質産生細胞を前癌状態
にすると本物質の産生が高まるので、癌に対する診断の
マーカーとしても本物質を用いることができる。
実施例１゜
マウス３Ｔ３線維芽細胞による本物質の製造マウス３Ｔ
３線維芽細胞１０８個を、１００μｙ／ｙｔｔストレプ
トマイシン、１００単位／−ペニシリンおよび５％ＦＣ
８（仔牛血清、Ｇｉｂｃ。
３線維芽細胞１０８個を、１００μｙ／ｙｔｔストレプ
トマイシン、１００単位／−ペニシリンおよび５％ＦＣ
８（仔牛血清、Ｇｉｂｃ。
社製）を含むＲＰＭ工１６４０培地（ＧｉｂＣＯ社製）
１０ｄに接種し、５％Ｃ０２および９５％空気を通気し
つつ、３７℃で３日間培養した。この培養によシマウス
３Ｔ３線維芽細胞は飽和細胞濃度いわゆるコンフルエン
ト状態になる。
１０ｄに接種し、５％Ｃ０２および９５％空気を通気し
つつ、３７℃で３日間培養した。この培養によシマウス
３Ｔ３線維芽細胞は飽和細胞濃度いわゆるコンフルエン
ト状態になる。
培養物から上清を除いたのち、無血清条件下で新しいＲ
ＰＭ１１６４０培地１０ｄを加え、３７℃、５％ＣＯ２
，９５％空気の条件で１０時間培養した。培養上清を回
収し２倍量の飽和硫安（ｐ、ｍ７．ｓ）を加え、塩析す
る。塩析物を遠心分離して沈殿物を得、これを少量の生
理食塩水に溶かし２耐のセファデックス０１００カラム
クロマトグラフイーにかけ、生理食塩水で溶出した。溶
出液は２．５耐ずつ分画した。第１図に示すとおシ、低
分子領域にＴ細胞のＤＮＡ合成を強く阻害する活性が認
められた。
ＰＭ１１６４０培地１０ｄを加え、３７℃、５％ＣＯ２
，９５％空気の条件で１０時間培養した。培養上清を回
収し２倍量の飽和硫安（ｐ、ｍ７．ｓ）を加え、塩析す
る。塩析物を遠心分離して沈殿物を得、これを少量の生
理食塩水に溶かし２耐のセファデックス０１００カラム
クロマトグラフイーにかけ、生理食塩水で溶出した。溶
出液は２．５耐ずつ分画した。第１図に示すとおシ、低
分子領域にＴ細胞のＤＮＡ合成を強く阻害する活性が認
められた。
活性画分を２倍量の蒸留水で希釈し、０Ｍセファデック
スカラムにかけ、５０ｍＭ食塩水で洗浄後、食塩濃度勾
配（５０−６００ｍＭ ）で溶出した。溶出液は１．５
ｄずつ分画し、た。第２図に示すように主要活性は、約
０．４Ｍ食塩で溶出される。活性画分（９ｄ）をロータ
リーエバポレーターを用い５０℃で０．５−まで濃縮し
、−一セファデックス０５０カラムにかけ、生理食塩水
で溶出した。溶出液は１．２５ｄずつ分画した。
スカラムにかけ、５０ｍＭ食塩水で洗浄後、食塩濃度勾
配（５０−６００ｍＭ ）で溶出した。溶出液は１．５
ｄずつ分画し、た。第２図に示すように主要活性は、約
０．４Ｍ食塩で溶出される。活性画分（９ｄ）をロータ
リーエバポレーターを用い５０℃で０．５−まで濃縮し
、−一セファデックス０５０カラムにかけ、生理食塩水
で溶出した。溶出液は１．２５ｄずつ分画した。
第３図に示すように活性は、約ｉ、 ｏ ｏ ｏダルト
ンの位置に認められる。活性画分をシリカゲル薄層クロ
マトグラフィーで展開すると、第４図に示すように、２
つのニンヒドリン陽性のスポット（ＰＩ、ＰＩＥ）があ
り、ｐＨに強いＴ細胞ＤＮＡ合成抑制活性が認められた
。第３表にＰＩ、ｐｍの活性を示す。ｐｎのシリカゲル
を回収し、水によって本物質を抽出し、凍結乾燥し本物
質５０μ２を得た。
ンの位置に認められる。活性画分をシリカゲル薄層クロ
マトグラフィーで展開すると、第４図に示すように、２
つのニンヒドリン陽性のスポット（ＰＩ、ＰＩＥ）があ
り、ｐＨに強いＴ細胞ＤＮＡ合成抑制活性が認められた
。第３表にＰＩ、ｐｍの活性を示す。ｐｎのシリカゲル
を回収し、水によって本物質を抽出し、凍結乾燥し本物
質５０μ２を得た。
第３表
対 照 ５６２７±２３１Ｐ Ｉ ５
４５６±６２９ ｐＨ８２１±１０５ 実施例２ マウス牌細胞による本物質の製造： ＣＨ３／Ｈｅ−ｒウスの牌細胞１０８個を１０１！Ｉ／
のＲＰＭ１１６４０培地に懸濁し、３７℃、５％ｃｏ２
．９５％空気の条件で１０時間培養した。培養上清を実
施例１と同様セファデックス０１００カラムクロマトグ
ラフイーにかけ、溶出すると第７図に示すとおシ、低分
子領域にＴＭ胞のＤＮＡ合成を強く阻害する活性が認め
られた。
４５６±６２９ ｐＨ８２１±１０５ 実施例２ マウス牌細胞による本物質の製造： ＣＨ３／Ｈｅ−ｒウスの牌細胞１０８個を１０１！Ｉ／
のＲＰＭ１１６４０培地に懸濁し、３７℃、５％ｃｏ２
．９５％空気の条件で１０時間培養した。培養上清を実
施例１と同様セファデックス０１００カラムクロマトグ
ラフイーにかけ、溶出すると第７図に示すとおシ、低分
子領域にＴＭ胞のＤＮＡ合成を強く阻害する活性が認め
られた。
さらに実施例１と同様に活性画分を０Ｍセファデックス
カラムにかけ、０．４ＭＮａＣ１で溶出したのちセファ
デックス０５０カラムにかけると第８図に示したように
、実施例１の場合と同じ位置に活性が認められた。さら
に実施例１と同様に活性画分をシリカゲル薄層クロマト
グラフィーで展開し、精製して本物質的２０μＶを得た
。
カラムにかけ、０．４ＭＮａＣ１で溶出したのちセファ
デックス０５０カラムにかけると第８図に示したように
、実施例１の場合と同じ位置に活性が認められた。さら
に実施例１と同様に活性画分をシリカゲル薄層クロマト
グラフィーで展開し、精製して本物質的２０μＶを得た
。
実施例３、
ヒト胎児線維芽細胞による本物質の製造２力月のヒト胎
児胚をトリプシン処理し、ＭＥＭ培地（田水製薬社製）
に１０％ＦＣ８（Ｇｉｂｃｏ社製）、１０ ｍＭ Ｎ
−Ｎ−ビス〔２−ヒドロキシエチルクー２−アミノエタ
ン−スルホン酸（ＢＥＳ）、５ｍＭＮ−）リス〔ヒドロ
キシメチル〕−メチルー２−アミノプロパン−スルホン
酸（ＴＥＳ）および５ ｍ Ｍ Ｎ−ヒドロキシメチル
−ピペラジン−Ｎ−２−エタン−スルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ、牛丼化学社製）を加えた培地中１０ＸＣＯ２および
９０Ｘ空気を通気しつつ、３７℃で４日間培養した。こ
の培養によシヒト胎児線維芽細胞は飽和細胞濃度いわゆ
るコンフルエント状態になる。
児胚をトリプシン処理し、ＭＥＭ培地（田水製薬社製）
に１０％ＦＣ８（Ｇｉｂｃｏ社製）、１０ ｍＭ Ｎ
−Ｎ−ビス〔２−ヒドロキシエチルクー２−アミノエタ
ン−スルホン酸（ＢＥＳ）、５ｍＭＮ−）リス〔ヒドロ
キシメチル〕−メチルー２−アミノプロパン−スルホン
酸（ＴＥＳ）および５ ｍ Ｍ Ｎ−ヒドロキシメチル
−ピペラジン−Ｎ−２−エタン−スルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ、牛丼化学社製）を加えた培地中１０ＸＣＯ２および
９０Ｘ空気を通気しつつ、３７℃で４日間培養した。こ
の培養によシヒト胎児線維芽細胞は飽和細胞濃度いわゆ
るコンフルエント状態になる。
このコンフルエント状態の細胞５×１０８個を１０％Ｆ
ＣＳ （Ｇｉｂｃｏ社製）を含んだＭＥＭ培地で、３
７℃、１０％Ｃ’０２．９０％空気の条件で１０時間培
養した。このとき、ＴＰＡ １００ｎｆ／ｘｌを加えた
培地を用いても同様に培養した。
ＣＳ （Ｇｉｂｃｏ社製）を含んだＭＥＭ培地で、３
７℃、１０％Ｃ’０２．９０％空気の条件で１０時間培
養した。このとき、ＴＰＡ １００ｎｆ／ｘｌを加えた
培地を用いても同様に培養した。
培養上清を実施例１と同様にセファデックス０１００カ
ラムクロマトグラフイーにかけ、溶出したところ第９図
に示す結果が得られた。
ラムクロマトグラフイーにかけ、溶出したところ第９図
に示す結果が得られた。
ＴＰＡの添加によシ本物質の生産が高められることがわ
かる。
かる。
ＴＰＡ添加培地を用いたものについて、活性的
両分を実施例１と同様に処理して、本物質２〇八
μ２を得た。
第１図は実施側光における本物質精製のため第２図は実
施例１における本物質精製のための０Ｍセファデックス
カラムクロマトグラムを示す。 第３図は実施例１における本物質精製のためのセファデ
ックス０５０カラムクロマトグラムを示す。図中、矢印
はバシトラシン（１，５００ダルトン）マーカーを示す
。 第４図は実施例１における活性画分およびアミノ酸マー
カーのシリカゲル薄層クロマトグラムを示す。 第５図は本物質の紫外線吸収スペクトジムを示す。 第６図は本物質のＴ細胞に対する作用機作を示す。 第７図は実施例２における本物質精製のためのセファデ
ックス０１００カラムクロマトグラムを示す。矢印ａ、
ｂはチトクロームＣ（１３，０００ダルトン）とバシト
ラシン（１，５００ダルトン）マーカーをそれぞれ示す
。 第８図は実施例２における本物質精製のためのセフアゾ
′ツクスＧ５０カラムクロマトグラムを示す。矢印ａ、
ｂはバシトラシン（１，ｓ ００ダルトン）とマイトマ
イシンＣ’（３４０ダルトン）マーカーをそれぞれ示す
。 第９図は実施例３におけるＴＰＡによる本物質産生の増
加を示すためのセファデックス０１００カラムクロマト
グラムを示す。矢印ａ、ｂはチトクロームＣ（１３，０
００ダルトン）とバシトラシン（１，５００ダルトン）
マーカーをそれぞれ示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社第１図 令画軟 第２図 分画軟 第３図 分画畝 第４図 第５図 ２００ ．２５０ ３００
３５０兼＋（ｎｍ） 第６図 ３ ６ ９ 日今間 第７図 ２ｂ 第６図 第９図 ａｔ） 骨画軟 手続補正書（自発） 昭和３年グ月２６日 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１５７９０ 号 ２、発明の名称 ＤＮＡ合成抑制物質 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社（置 ： ０３−２
０１−７２１１ 内線２７５１）５、補正の内容 （１）明細書全文を別紙のとおり訂正する。 明 細 書 １、発明の名称 ＤＮＡ合成抑制物質 ２特許請求の範囲 （１）Ｔ細胞のＤＮＡ合成を抑制する新規Ｔ細胞合成抑
制物質。 （２）下記理化学的性質を有する特許請求の範囲第１項
記載の物質。 元素分析：Ｃ，Ｈ，○、ＮおよびＳ の元素を有する。 分 子 量 ： 約１．０００ダルトン熱 安 定
性 ： −２０ｔ：で数カ月間、５６℃で３０分間
〜１時間、 １００℃で３０分間安定。 酸性・中性・塩基性の別 ・ 弱塩基性ｐＨ安定性 ：
ｐＨ３，５〜１０．０で安定紫外線吸収スペクトル
：２１０〜２２０ｎｍに最大吸収 呈 色 反 応 ： ニンヒドリン陽性溶 解 性
： 水、エタノール、メタノールに易溶。 物 質 の 色 ： 上記溶媒に溶かすと無色（３）
動物または昆虫の線維芽細胞またはリンパ球を培地に
培養し、培養物中にＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質を精製蓄
積せしめ、該培養物よりＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質を採
取することによって得られる特許請求の範囲第１項記載
のＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質。 （４）動物が哺乳類に属する動物であることを特徴とす
る特許請求の範囲第３項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物
質。 （５）動物がマウス、ラットまたはヒトであることを特
徴とする特許請求の範囲第４項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成
抑制物質。 （６）培養液が無血清あるいは牛胎児血清を含むＲＰＭ
１１６４０培地またはＩψＥＭ培地から選ばれることを
特徴とする特許請求の範囲第３項記載のＴ細胞ＤＮＡ合
成抑制物質。 （７）培地がフォルボールミリステート、フォルボール
−１３−アセテートおよび１２−０−テトラテ゛カッイ
ルーフォルボール−１３−アセテートから選ばれるフォ
ルボールエステル類の少なくとも１種を含むことを特徴
とする特許請求の範囲第３項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成抑
制物質。 （８）哺乳動物血清および昆虫体液から採取して得られ
る特許請求の範囲第１項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物
質。 （９）哺乳動物血清が、ヒト、ウシ、ラットまたはマウ
スの血清から選ばれる特許請求の範囲第８項記載のＴｉ
ｅ胞ＤＮＡ合成抑制物質。 σＯ昆虫の体液が、カイコガ、ヤママユガ、ニクバエま
たはミツバチの体液から選ばれる特許請求の範囲第８項
記載のＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質。 ３、発明の詳細な説明 技術分野 本発明は新規なＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質に関する。さ
らに詳細には、本発明は、動物または昆虫の線維芽細胞
ならびにリンパ球を無血清あるいは牛胎児血清含有培地
で培養して得られるＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質および動
物の血清または昆虫の体液から採取して得られるＴ細胞
ＤＮＡ合成抑制物質に関する。 背景技術 従来、Ｔ細胞などの免疫担当細胞における免疫活性の異
常な先進による各種の自己免疫疾患などに対する治療に
はステロイド、イムランなどが用いられている。これら
は、特定の疾病にはある程度の治療効果がＳ忍められる
が、正常細胞に対し副腎の機能低下、白血球数の減少な
どの副作用があるので、より優れた治療薬の開発が望ま
れている。 本発明者らは、動物の線維芽細胞、リンパ球などが免疫
細胞（Ｔ細胞）のＤＮＡ合成を抑制する物質を生産して
おり、この物質が免疫細胞の活性を抑制して自己免疫疾
患に対する治療に有用であることを見出し本発明を完成
するに至った。 従来、免疫細胞に対する抑制物質は、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ。 １０９、１５４−１６３ （１９７２） 、 Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、 １１６．１４５２−１４５８ （１９７
６）、 ｌｎｆｌａｍａｔｉｏｎ １ 、５−２１
（１９７５）などで知られているが、これら既知の物
質はいずれも高分子物質であるため、患者の免疫的拒絶
反応などの副作用を惹起する可能性がある。本発明の物
質は哺乳動物中に由来する低分子ペプチドであるため副
作用が低いことが予想され、免疫疾患への応用が期待さ
れる。 発明の開示 本発明に係る新規Ｔ細胞ＤＮＡ合成抑制物質（以下゛本
物質′”と略記する）は、動物または昆虫の線維芽細胞
ならびにリンパ球を培地で培養し、培養物中に生成蓄積
した本物質を採取することによって得ることができる。 動物としてはマウス、ラット、ヒトなどの哺乳動物が好
ましく、細胞としてはマウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ）肺細胞、
マウス３Ｔ３線維芽細胞（Ｊ、 Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．、
１７．２９９ （１９６３）） 、ラット牌細胞ＳＤ
（Ｓｐｌａ３ｕｅ Ｄａｗｌｅｙ） 、ヒト胎児線維
芽細胞が好適にあげられる。これらの細胞は消和実験動
物■（大分）から購入できる。 昆虫の細胞としては、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ
ｅｎｋａｌｙｐｔｉ）より確立した線維芽細胞ＣＧｒａ
ｃｅ。 Ｎａｔｕｒｅ、 １９５．７８８ （１９６２） ）が
好適な例としてあげられる。 培地としては、動物細胞の培養に使用するものであれば
、いかなる培地をも用いることができる。 好適にはＲＰＭ１１６４０培地、ＭＥＭ培地などが用い
られる。ＲＰＭ Ｉ １６４０培地およびＭＥＭ培地の
組成については「組織培養」中井準之助ら編集、朝食書
店、９−１１頁、１９７６年を参照。 培地には牛胎児血清を１〜１０％加えてもよい。 またフォルボールエステル類を培地に添加することによ
り本物質の生成が向上する。 フォルボールエステルとしては、フォルボールミリステ
ート、フォルボール−１３−アセテート、１２−０−テ
トラデカノイル−フォルボール−１３−アセテ−） （
ＴＰＡ）などが好適に用いられる。 フォルボールの濃度は、通常培養液１ｍｌ当り１１、Ｏ
ＯＯｎｇ 、好ましくは１１０−１Ｏ０ｎの範囲で用い
る。 培養は通常の動物細胞の培養条件に従って、液体、通気
培養を行う。通気は、５−１０％Ｃ○２．９０−９５％
空気を用いる。培養温度は２５−４０℃、好ましくは３
０−３７℃、ｐ）ｌは７．５−８．５、好ましくは７．
８−８．０である。培養時間は５−２４時間が好適であ
る。培養物からのＴ細胞Ｄ Ｎ Ａ合成抑制物質の採取
は通常動物細胞の培養物から蛋白質を採取する方法に従
って行われる。 細胞培養後、遠心分離により細胞を除き培養上清を回収
し、それに２倍容量の飽和硫安（ｐＨ７，５）を加え、
塩析処理する。塩析処理物を遠心分離して得た沈澱物を
生理食塩水にとかし、セファデックスＧ１００カラムに
かけ、生理食塩水で溶出する。低分子物質を含む画分に
Ｔ細胞のＤＮＡ合成を抑制する活性が認められる。その
活性画分を２倍容量の蒸留水で希釈し、ＣＭセファデッ
クスにかける。５０ｍＭ食塩水でカラムを洗ったのち、
食塩の濃度匂配で溶出する。 本物質は約４００ｍＭ食塩水で溶出されてくるの室、そ
の活性画分をロータリーエバポレーターで濃縮し、セフ
ァデックスＧ５０カラムにかけ、生理的食塩水で溶出す
る乙分子量約１．０００ダルトンの位置に活性が認めら
れるので、活性画分をロークリ−エバポレーターで濃縮
しシリカゲル薄層クロマトグラフィーにスポットしメタ
ノール−水溶媒系で展開する。その結果２つのニンヒド
リン陽性スポットが認められる。Ｔ細胞ＤＮＡ合成抑制
活性は、より易動度の低いスポットに存在しているので
、その部分のシリカゲルを回収し、水によって本物質を
抽出する。 本物質は、また哺乳動物血清、昆虫捧液から採取するこ
とによっても得ることができる。 哺乳動物血清としては、ヒト、ウシ、ラット。 マウスの血清などがあげられる。昆虫の体液としては、
鱗翅類、双翅類、膜翅類などの昆虫類だきえばカイコガ
、ヤママユガ、ニクバエ、ミツバチの体液などが用いら
れる。 哺乳動物血清および昆虫体液からの本物質の採取は、上
記細胞培養液から本物質を採取する方法と同様にして行
う。 採取行程中、Ｔ細胞のＤＮＡ合成活性の測定は次のとお
りに行う。 ０．１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０−１０％牛脂児血清中
に懸濁した２、５Ｘ１０５個のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの胸
腺細胞を０．１ｍｌの線維芽細胞の培養上清またはカラ
ムクロマトグラフィーの各両分と混合し、２．５μｇ
／ｍｌのコンカナバリンΔを加えて２日間イン・ビトロ
で培養する。最後の２０時間を１μＣ１の〔３Ｈ〕−チ
ミジンでパルスラベルし、胸腺細胞にとりこまれた〔３
Ｈ〕−チミジンを計測する。 かくして得られる本物質は低分子ペプチドであり、以下
の理化学的性質を示す。 ■ 元素分析：ＣＸＨ，ＯｌＮおよびＳの元素を有する
。 ■ 分 子 量：約１．０００ダルトン１００℃で３０
分間安定 ■ 酸性・塩基性・中性の区別二弱塩基性に吸収極大を
示す（第５図参照）。 ■ 呈色反応：ニンヒドリン陽性反応。 ■ 溶 解 性：水、エタノール、メタノールに易溶。 ■ 物質の色：上記溶媒に溶かすと無色。 ■、トリプシン（２５μｇ／ｍｌ）処理（３７℃。 １時間）でＴ細胞ＤＮＡ合成活性活性ｂ＜消失する。 ■ リボヌクレアーゼΔ（２５μｇ ／ｍｌ ）および
デオキシリボヌクレアーゼ■（２５μｇ ／ｍｌ ）処
理（３７℃、１時間）ではＴ細胞ＤＮＡ合成抑制活性に
影響を与えない。 本物質の生物学的活性の測定は次のとおり行う。 Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの牌細胞または胸腺細胞それぞれ５
Ｘ１０５個を１０％牛脂４ｙ血ａ（ギブコ社製）を含む
ＲＰＭ１１６４０培地（日永製薬社製）に懸濁し、コン
カナバリンＡ（シグマ社製、最終濃度５μｇ ／ｍｌ
）存在下で５％ｃｏ２．ｇ５％空気の条件下で、３日間
培養する。培養最後の１日間、細胞を１μｃ１の〔３Ｈ
〕チミジン（英国Ｒａｄｊｏｃｈｅｍｊｃａｌ Ｃｅｎ
ｔｅｒ社製）でラベルした後、セルハーベスタ−を使っ
て細胞をＣＦ／ＣまたはＣＦ／Ｆメンブレンフィルター
（Ｗｈａｔｍａｎ社製）にトラップする。 そのメンブレンを水とエタノールで洗い乾燥させ、細胞
中にとり込まれた〔３Ｈ〕チミジンの活性ヲヘツクマン
・シンチレーション・カウンターで測定する。 その他の哺乳類細胞のＤＮＡ合成の活性測定は、細胞ｌ
Ｘ１０４個を０．１ｍｌの１０％牛脂児血清を含むＲＰ
Ｍ１１６４０培地に懸濁し、測定する分画０．１ｍｌを
入れコンカナバリンＡ非存在下で２４時間培養する。最
後の８時間細胞を１μＣｉ（３Ｍ：ｌチミジンでラベル
する。他の条件は、上記リンパ球の場合と同じである。 リンパ球へのヌクレオチドの取り込み活性の測定ＤＮＡ
合成抑制物質の細胞膜の機能に対する作用をしらべるた
め、ヌクレオチド、ここでは、ウリジントリフ ｔ ス
フ エイト（ｌＪｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ）（ＵＴＰと略す）の取り込み活性を測定する。 マウス牌細胞を上記ＤＮＡ合成活性の測定上回じ条件で
培養し、培養開始時に細胞を１μｃＩＣ３Ｈ） ＬＩＴ
Ｐ （Ｒａｄ１ｏｃｈｅｍｉｃａ１ｃｅｒ＋ｔｅｒ社製
）でラベルする。活性の測定は上記と同様の方法で行う
。 バクテリアのＤＮＡ合成活性の測定 １０μｌのバクテリア（大腸菌、シュードモナス・マル
トフィリア、枯草菌など）懸濁液（０，５Ａ６６０ｎ−
）を９０μｍの５％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０
培地で希釈し、各分画０．１ｍｌを加える。〔３Ｈ〕チ
ミジン１μｃｉを加衣た後３７℃で一晩（１６時間）バ
クテリアを培養する。上記方法と同じ＜ＧＦ／Ｃメンブ
レンフィルターにバクテリアをトラップしたのちチミジ
ンの取り込みを測定する。 本物質のＴ細胞への作用機作は次のとおりである。 本物質の添加によるＴ細胞の生存率をトリパン・ブルー
を用いるｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ法によって調べる
と、無添加の系のものとあまり変わらない。つまり、本
物質は基本的にＴ細胞を殺さないがそのＤＮＡ合成のみ
を抑制する（実験例１および第１表参照）。 各種細胞のＤＮＡ合成に対する抑制の程度は、哺乳類リ
ンパ球が最も強（、哺乳類線維芽細胞に対しても一定の
効果がある。しかし癌化した細胞には、効果は、認めら
れない。バクテリアに対するＤＮＡ合成の抑制の効果は
、ダラム陰性菌である大腸菌で強く、ダラム陽性菌であ
る枯草菌では弱い。リンパ球ＤＮＡ合成反応に対する抑
制のメカニズムとしては、レクチン刺激後の比較的初期
に細胞膜の機能（例えばヌクレオチドの転送活性）を抑
制し、その後のＤＮＡ合成を特異的に抑制すると推定さ
れる。またこの物質群は、ＤＮＡ合成 。 を強く抑制するが細胞の生存率には、影響を与え ｌ【 ない。
Ｉさらに本物質はＴ細胞のＲＮＡ合成の抑制はおこさな
い（実験例２および第６図参照）。ただ、Ｔ細胞の初期
（０〜５時間）のヌクレオチドのと本物質による初期の
細胞の機能の抑制（初期のヌクレオチドの取り込みの抑
制）はＴ細胞ＤＮＡ合成抑制によると考えられる（実験
例３および第２表参照）。 実施例 本物質のＴ細胞の生存率に対する影響 マウ７− （Ｃ３）１／Ｈｅ）の胸腺細胞５Ｘ１０６個
を１ｍｌのＲＰＭ Ｉ １６４０培地−５％牛脂児血清
中に懸濁し、本物質０．１ｍｌまたは対照として生理食
塩水０．１ｍｌを懸濁液に加え、１日および２日後の細
胞の生存率を調べた。測定法は、ｃｌｙｅ ｅｘｃｌｕ
ｓｉｏｎ法によるが、１日後および２日後に０．１％ト
リパンブルー液（１，９ｍ１）で細胞液（０，１ｍ１）
を２０倍に希釈し、トリパンブルーに染まる細胞を顕微
鏡下で数え、その生存率を計算した。 結果を第１表に示す。 第 １ 表 起 対 照 本物質処理険
培養欝 可 の日 細胞数 生存率 細胞数 生存率攻
（ＸＩＯ５） （％） （ＸＩＯ５）
（％）１ 日 ３．６
７２ ３．８ ７６１２Ｂ
２．１ ４，２ ２．０ ４０１ 日
３．４ ６８ ３．３
６６実施例 本物質のＴ細胞に対する作用機作 マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ）の胸腺細胞５×１０５個をＲＰ
Ｍ１１６４０培地−５％牛脂児血清に懸濁し、コンカナ
バリンＡ（５μｇ ／ｍｌ ）を加え０．１ｍｌとし、
活性画分０．１ｍｌを加えた。その後細胞中のＲＮＡを
ラベルするために培養器始時に１μＣ１の［３Ｈ〕ＵＴ
Ｐを培養系に加え、各時点で、冷した１０％トリクロロ
酢酸（ＴＣＡ）で反応を止め、ＴＣＡ不溶画分にあるＲ
ＮＡをＣＦ／Ｆメンブレンフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ
社製）にトラップした。タンブレンを５％ＴＣＡでくり
返し洗浄し、エタノールで１回洗った後、乾燥させた。 メンブレンをトルエン−ＰＯＰ系溶液溶液れてβ−シン
チレーションカウンターでＲＮＡ画分の放射能を測定し
、そのＲＮΔ合成能を決定した。 その結果を第６図に示す。図中（Ａ）は〔３Ｈ〕ＵＴＰ
のＴ細胞への取り込み活性、（Ｂ）はＲＮ八へ成活性を
示す。また図中白丸は本物質非存在下、黒丸は本物質の
存在下の結果を示す。 実施例 ＤＮＡ合成抑制効果への本物質の有効な添加時間 マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ）の胸腺細胞２．５×１０５個を
コンカナバリンＡ５μｇ ／ｍｌを含むＲＰＭ １１６
４０培地−５％牛脂児血清（最終容量０．１ｍ１）に懸
濁し、５％Ｃ○２．９５％空気の条件で３７℃、３日間
培養した。その培養中実２表に記載した時間に本物質を
０．１ｍｌ添加した。培養終了１２時間前に細胞を１μ
ＣＩの〔３Ｈ〕チミジンでラベルし細胞に取り込まれた
〔３Ｈ〕チミジン活性を測定した。 結果を第２表に示す。 第 ２ 表 −３７４２±２３４１００．０ ０５２４±１０２１４．０ ２、５ ５０７±１９１ １．３．．５゜
５５０９±６５１３．６ １５ ９０３±１．７８ ２４．１ ３０ ３２１８±２０３ ８６．０ 実施例 各種哺乳類細胞に対す゛る本物質の効果上記の方法で哺
乳類細胞に対する本物質の効果を調べた。結果を第３お
よび４表に示す。 第３表 各種哺乳類細胞に対するウシ胎児血清由来本物
質（ＦＣ３Ｉ）の効果 ＧＭ２５８ （ヒト線維芽細胞） ２３４１
４８２１ＭＲ９０（同 上 ＞
５０２９ ２３１２ＳＶ４０−形質転換細胞（
同よ） ９１９３ ９００５ＰＣＩＯ（ヒト肺カ
ルシノーマ） ９１２４ ８９２３１．９２
９ （マウスフィブロサルコーマ）
４０５６ ４２１９ＭｅＬａ３
（ヒトメラノーマ） ４３９２ ４１５５マ
ウス牌細胞 ２２１８０ ．６９
８第４表 各種哺乳類細胞に対するヤママユガ由来本物
質（ＡｅＩ）の効果 ０Ｍ２５８ １４６７ ２６
０ＩＭＲ９０５５１２２６５９ ＳＶ４０−形質転換細胞 ９６８９ ９３２
１ＰＣＩＯ９０６５９２１５ Ｌ９２９ ４３６７ ４５２
８ＭｅＬａ ３ ５９７８ ４
８６２マウス牌細胞 １６８５０
１７２１実施例 バクテリアのＤＮＡ合成に対する本物質の効果上記の方
法でバクテリアのＤＮＡ合成に対する本物質の効果を調
べた。結果を第５表に示す。 Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｌ
２．４ ５．１Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ ８８．３ ８ ｇ、 ９
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ
７１．０ ９６．５本物質は、Ｔ細胞のＤＮ
Ａ合成を強く抑制する低分子ペプチドであるので、自己
免疫疾患などへの治療剤または炎症反応のような異常な
リンパ球の活性化の抑制剤として用いることができる。 本物質はＤＮＡ合成のみを抑制するが、Ｔ細胞を殺しは
しないので、特異的にＤＮＡ合成のみを抑制することへ
の応用もできる。また、フォルボールエステルによって
本物質産生細胞を前癌状態にすると本物質の産生が高ま
るので、癌に対する診断のマーカーとしても本物質を用
いることができる。 さらに本物質はダラム陰性菌に対する特異的な抗菌物質
として使用できる。 発明を実施するための最良の形態 実施例１゜ マウス３Ｔ３線維芽細胞による本物質の製造マウス３Ｔ
３線維芽細胞１０８個を、１００μｇ ／ｍ＋ストレプ
トマイシン、１００単位／ｍｌペニシリンおよび５％Ｆ
Ｃ３（牛胎児血清、Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＲＰＭ Ｉ
１６４ Ｇ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）１０ｍｌに接種し
、５％Ｃ０２および９５％空気を通気しつつ、３７℃で
３日間培養した。この培養によりマウス３Ｔ３線維芽細
胞は飽和細胞濃度いわゆるコンフルエント状態になる。 培養物から上清を除いたのち、無血清条件下で新しいＲ
ＰＭ１１６４０培地１０ｍ１を加え、３７℃、５％ＣＯ
２，９５％空気の条件で１０時間培養した。培養上清を
回収し２倍量の飽和硫安（ｐＨ７，５）を加え、塩析す
る。塩析物を遠心分離して沈殿物を得、これを少量の生
理食塩水に溶かし２ｍｌのセファデックス６１００カラ
ムクロマトグラフイーにかけ、生理食塩水で溶出した。 溶出液は２．５ｍｌずつ分画した。第１図に示すとおり
、低分子領域にＴ細胞のＤＮＡ合成を強く阻害する活性
がδ忍められた。 活性画分を２倍量の蒸留水で希釈し、ＣＭセファデック
スカラムにかけ、５０ｍＭ食塩水で洗浄後、食塩濃度匂
配（５０−６００ｍＭ）で溶出した。溶出液はｌ、５ｍ
ｌずつ分画した。第２図に示すように主要活性は、約０
．４ Ｍ食塩で溶出される。 活性画分（９ｍｌ＞をロータリーエバポレーク−を用い
５０℃で３．５ｍｌまで濃縮し、セファデックス０５０
カラムにかけ、生理食塩水で溶出した。溶出液は１．２
５ｍ１ずつ分画した。第３図に示すように活性は、約１
．０００ダルトンの位置に認められる。活性画分をシリ
カゲル薄層クロマトグラフィーで展開すると、第４図に
示すように、２つのニンヒドリン陽性のスポット（ＰＩ
、Ｐ１′）があり、ＰＩに強いＴ細胞ＤＮＡ合成抑制活
性が認められた。第６表にＰＩ、ＰＩ’の活性を示す。 ＰＩのシリカゲルを回収し、水によって本物質を抽出し
、凍結乾燥し本物質５μｇを得た。ＰＩが本物質に相当
する。 第 ６ 表 対 照 ５６２７ ± ２３１Ｐ
Ｉ’ ５４５６±６２９ 実施例２゜ マウス牌細胞による本物質の製造 Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの牌細胞１０８個を１０ｍ１のＲＰ
Ｍ１１６４０培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２，９５
％空気の条件で１０時間培養した。 培養上清を実施例１と同様セファデックス０１００カラ
ムクロマトグラフイーにかけ、溶出すると第７図に示す
とおり、低分子領域にＴ細胞のＤＮＡ合成を強く阻害す
る活性が認められた。 さらに実施例１と同様に活性画分をＣＭセファデックス
カラムにかけ、０．４Ｍ ＮａＣＡで溶出したのちセ
ファデックス０５０カラムにかけると第８図に示したよ
うに、実施例１の場合と同じ位置に活性が認められた。 さらに実施例１と同様に活性画分をシリカゲル薄層クロ
マトグラフィーで展開し、精製して本物質的２０μｇを
得た。 実施例３゜ ヒト胎児線維芽細胞による本物質の製造２力月のヒト胎
児胚をトリプシン処理し、ＭＥＭ培地（田水製薬社製）
に１０％ＦＣ３，１０ｍＭＮ−Ｎ−ビス〔２−ヒドロキ
シエチル〕−２−アミノエタン−スルホン酸（ＢＥＳ）
、５ｍＭ Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチルツーメチル
−２−アミノプロパン−スルホン酸（ＴＢＳ）および５
ｍＭＮ−ヒト和キシノチルーピペラジンーＮ−２−エタ
ン−スルホン酸（ＨＥＰＥＳ、牛丼化学社製〉を加えた
培地中１０％Ｃ○２および９０％空気を通気しつつ、３
７℃で４日間培養した。この培養によりヒト胎児線維芽
細胞は飽和細胞濃度いわゆるコンフルエント状態になる
。 このコンフルエント状態の細胞５Ｘ１θ８個を１０％Ｆ
Ｃ３を含んだＭＥＭ培地で、３７℃、１０％Ｃ０２，９
０％空気の条件で１０時間培養シタ。コノとき、ＴＰＡ
１００Ｔ１ｇ／ｍ＋を加えた培地を用いても同様に培養
した。 培養上清を実施例１と同様にセフアゾ・ノクスＧ１００
カラムクロマトグラフィーにかけ溶出したところ、第９
図に示す結果が得られた。ＴＰΔの添加により本物質の
生産が高められることがわかる。 ＴＰＡ添加培地を用いたものについて、活性画分を実施
例１と同様に処理して、本物質的２０μｇを得た。 実施例４、 牛胎児血清とカイコガ体液からの本物質の製造牛胎児血
清（Ｇｉｂｃｏ社製）とカイコガ体波谷２５ｍ１を５０
ｍ１の冷やした飽和硫安（ｐＨ７，５）でよく混ぜ、４
℃で１時間静置した。遠心（１６，０００ｒｐｍにて１
５分）をした後、沈殿物を１０ ｍ Ｍ ＩＪン酸バッ
ファ〜（ｐＨ７，２）５ｍｌに溶かし、セファデックス
Ｇ１００カラム（１，８Ｘ４３ｃｍ）にかけ、同じリン
酸バッファーで１分画５＋＋＋Ｉにて溶出した。第１０
図に溶出パターンを示す。 セファデックスＧ１００クロマトグラフイーの活性画分
を２倍量の蒸留水で希釈し、ＣＭセファデックス（Ｃ−
２５）カラム（１，８Ｘ１０ｃｍ）にかけ７５ｍＭ食塩
を含む水約３０ｍ１でカラムを洗った後、７．５ｍＭか
らＩＭまでの食塩の濃度勾配を含む水で１分画２．５ｍ
ｌにて溶出した。各分画の食塩濃度はシンダクティビテ
ィーメーターで測定した。第１１図に溶出パターンを示
す。その活性画分をロータリーエバポレーターで濃縮し
セファデックス０５０カラム（１，２Ｘ ５６ｃｍ）に
かけ０．１Ｍ炭酸アンモニウムで１分画１．２５ｍ１に
て溶出し、その活性画分を凍結保存した。第１２図に０
．３−０．４Ｍ ＮａＣβ濃度で溶出する両分の溶出
パターンを示す。 さらに精製を進めるため活性画分を水にとかしンリカゲ
ル薄層プレート（メルク社、シリカゲル６０．２０Ｘ２
０Ｃｍ）にスポットしメタノールと水（３：１）の混合
溶液で約２時間展開した。展開後薄層プレートにニンヒ
ドリン溶液をスプレッドした後２〜３分間バーナーで熱
し、ペプチドの位置を確かめた。結果を第１３図に示す
。図中のＬｙｓ、 Ａｒｇ、 Ａｌａ、 Ｔｒｐは、そ
れぞれのアミノ酸マーカーの位置を示す。図中のＦＣ３
ＩおよびＢｍＩが本物質に相当する。 肺細胞をレクチン（コンカナバリンＡ：５Ｍｇ／１１１
１ ）で刺激すると同時にＵＴＰＩμＣ１を細胞に加え
３７℃で培養した。培養開始と同時に第１０図のＦＣ３
Ｉ活性画分Ｎ０２３〜２７を集めた液の０．１ｍｌを加
え、初期［ＪＴＰ取り込み活性へのＦＣ３Ｉの影響を調
べた。結果を第１４図に示す。図中、白丸、黒丸はＦＣ
３Ｉの非存在および存在下での活性を示す。 実施例５゜ Ｇｒａｃｅによって確立されたヤママユガ（Ａｎｔｈｅ
ｒｅａ ｅｎｋａｌｙｐｔｉ ）由来の線維芽細胞（
Ｎａｔｕｒｅ、 １９５．７８８ （１９６２） ）
２．５ Ｘ １０’個／ｍｌを１０％牛脂児血清を含む
Ｇｒａｃｅの培地（（、ｉ ｂ ｃ ｏ社製）Ｉ Ｑｍ
ｌで３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養し、１回同じ培地
を交換してさらに３日間培養し、コンフルエントの状態
になった細胞をＱｒａｃｅの培地１［１ｍｌで３回洗っ
た。その後Ｇｒａｃｅの培地（無血清）で３７℃、５％
ＣＯ２で３日間培養した。培養液を回収し、アミコンダ
イヤフローメンブレン（ＹＭＩＯ：カットサイズ、 １
０．０００ダルトン）に通した。その濾液をロータリー
エバポレーターで濃縮し、セファデックス０５０カラム
（１，８Ｘ ４３ｃｍ）にかけ、０．１ｍＭＪン酸バッ
ファー（ｐ Ｈ７，２）で溶出した。 溶出液は２．５ｍｌずつ分画した。第１５図に示すよう
に、かなりのリンパ球ＤＮＡ合成抑制活性が分子量約５
．０００ダルトンの位置（１２〜１４画分）に、また主
要活性が約１． ＯＯＯダルトンの位置（１７〜１９両
分）に認められた。第１５図中、白丸はリンパ球へのチ
ミジンの取り込み、黒丸は各画分の２８０ｎｍにおける
吸収を示す。 トリプシン（２５μｇ ／ｍ＋ ）で３０℃でインキニ
ベートすると、５．０００ダルトンの活性は消失し、１
．０００ダルトンの位置に活性が移動する。 さらに、トリプシン消化を続けると、この活性の大部分
が消失する（第１６図）。第１６図中、上段は無処理、
中段はトリプシンを加え３０分間インキュベート、下段
はトリプシンを加え１時間インキュベートした場合を示
す。 上記の結果は、これらの因子がペプチド性であることを
示している。さらに分子量１．０００ダルトンの活性を
ＣＭセファデックスクロマトグラフィー（ｌＱｍｌ）に
かけた。すなわち、遠心管中のＣＭセファデックス（ケ
ルベット：ｌＱｍｌ）を１００ｍＭ ＮａＣ１で平衡
化し、第１５図の１７〜１９画分を加えて懸濁した。４
℃で１５分間静置後、上清を捨て、ｌＱｍｌの０．ＩＭ
ＮａＣＡでゲルを３回洗った。同じ操作を異なる塩
濃度を含んだ水１０ｍ１（０，２〜０．６Ｍ ＮａＣ
Ａ）で繰り返した。 リンパ球のＤＮＡ合成の測定には、各分画を水で４倍に
希釈して用いた。ＣＭセファデックスの結果を第１７図
に示す。図中、矢印はＮａＣβ濃度を示す。第１７図に
示すように、約０．４ＭＮａ（ｌで溶出される活性が認
められた。この活性をＡｅＩと名付けた。この活性は、
さらにセファデックス０２５クロマトグラフイーで精製
すると、第１８図のように分子量約１．０００ダルトン
を示した。次にこの因子の精製度をシリカゲル薄層クロ
マトグラフィーで確かめた。すなわち、第１８図の活性
画分ＡｅＩを凍結乾燥後、水に溶かし、シリカゲル薄層
プレート上にスポットした。メタノール−水（３：１）
溶液で展開後、ニンヒドリン溶液をプレートにかけ、バ
ーナで３分間炙り発色させた。Ｌｙｓ、Ａｒｇ、 Ａｌ
ａ、 Ｔｒｐはアミノ酸マーカーのそれぞれの位置を示
す。ＡｅＩは、アラニンより少し遅い移動度を示した（
第１９図）。第１９図中ＡｅＩが本物質に相当する。 ４図面の簡単な説明 第１図は、実施例１における本物質精製のためのセファ
デックス０１００カラムクロマトグラムを示す。矢印ａ
、 ｂ、 ｃ、 ｄはアルブミン〔６７キロダルトン（
以下Ｋ（］という）〕、西洋ワサビのノ々−オキシダー
ゼ（４０Ｋｄ）、チトクロームＣ（１３Ｋｄ）およびバ
シトラシン（１，，５Ｋｄ）マーカーをそれぞれ示す（
以下同じ）。 第２図は、実施例１における本物質精製のためのＣＭセ
ファデックスカラムクロマトグラムを示す。 第３図は、″実施例１における本物質精製のためのセフ
ァデックス０５０カラムクロマトグラムを示す。 第４図は、実施例１における活性画分およびアミノ酸マ
ーカーのシリカゲル薄層クロマトグラムを示す。 第５図は、本物質の紫外線吸収スペクトラムを示す。 第６図は、本物質のＴ細胞に対する作用機作を示す。白
丸は無処理、黒丸は本物質処理を示す。 第７図は、実施例２における本物質精製のためのセファ
デックスＧ１００カラムクロマトグラムを示す。 第８図は、実施例２における本物質精製のためのセファ
デックス０５０カラムンロマトダラムを示す。矢印ｅは
マイトマイシンＣ（３４０ダルトン）マーカーを示す（
以下同じ）。 第９図は、実施例３におけるＴＰＡによる本物質産生の
増加を示すためのセファデックスＧ１００カラムクロマ
トグラムを示す。 第１０図は、実施例４における牛脂児血清（Ａ）とカイ
コガ体液（Ｂ）のセファデックスＧ１００クロマトグラ
フイーの溶出パターンを示す。 第１１図は、実施例４における牛脂児血清（Ａ）とカイ
コガ体液（Ｂ）のＣＭセファデックス（Ｃ−２５）クロ
マトグラフィーの溶出パターンを示す。 第１２図は、実施例４におけるＦｅ２ ＩとＢｍＩのセ
ファデックスＧ５０クロマトグラフイーの溶出パターン
を示す。白丸と黒丸はＦｅ２ ＩとＢｍＩのリンパ球の
ＤＮＡ合成活性を示す。 第１３図は、実施例４におけるＦｅ２ Ｉ 、およびＢ
ｍｌ、のシリカゲル薄層クロマトグラフィーのパターン
を示す。 第１４図は、実施例４におけるＦｅ２ Ｉによるリンパ
球のレクチン刺激後の初期ＵＴＰ取り込み活性への影響
を示す。 第１５図は、実施例５におけるカイコガ線維芽細胞の培
養上清のセファデックスＧ５０クロマトグラフイーを示
す。図中１はインシュリン（５，７Ｋ（１）の分子量マ
ーカーを示す。 第１６図は、実施例５における活性因子へのトリプシン
処理の効果を示す。 第１７図は、実施例５におけるＣＭ、セフアゾ・ソクス
クロマトグラフイーを示す。 第１８図は、実施例５におけるＡｅｌのセファデックス
Ｇ２５クロマトグラフイーを示す。 第１９図は、実施例５におけるＡｅＴの７リ力ゲル薄層
クロマトグラフィーを示す。 第１０図 分画番号 第１１因 分画番号 第１と図 分画番号 第１３図 第１４図 時間 第１５図 ｃｆｄ ｅ 金歯番号 第４６図 金歯番号 第１７図 ０．１Ｍ ０．２Ｍ Ｏ，３Ｍ Ｏ，６Ｍ第１δ
図 第１９図 ＝１４６
施例１における本物質精製のための０Ｍセファデックス
カラムクロマトグラムを示す。 第３図は実施例１における本物質精製のためのセファデ
ックス０５０カラムクロマトグラムを示す。図中、矢印
はバシトラシン（１，５００ダルトン）マーカーを示す
。 第４図は実施例１における活性画分およびアミノ酸マー
カーのシリカゲル薄層クロマトグラムを示す。 第５図は本物質の紫外線吸収スペクトジムを示す。 第６図は本物質のＴ細胞に対する作用機作を示す。 第７図は実施例２における本物質精製のためのセファデ
ックス０１００カラムクロマトグラムを示す。矢印ａ、
ｂはチトクロームＣ（１３，０００ダルトン）とバシト
ラシン（１，５００ダルトン）マーカーをそれぞれ示す
。 第８図は実施例２における本物質精製のためのセフアゾ
′ツクスＧ５０カラムクロマトグラムを示す。矢印ａ、
ｂはバシトラシン（１，ｓ ００ダルトン）とマイトマ
イシンＣ’（３４０ダルトン）マーカーをそれぞれ示す
。 第９図は実施例３におけるＴＰＡによる本物質産生の増
加を示すためのセファデックス０１００カラムクロマト
グラムを示す。矢印ａ、ｂはチトクロームＣ（１３，０
００ダルトン）とバシトラシン（１，５００ダルトン）
マーカーをそれぞれ示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社第１図 令画軟 第２図 分画軟 第３図 分画畝 第４図 第５図 ２００ ．２５０ ３００
３５０兼＋（ｎｍ） 第６図 ３ ６ ９ 日今間 第７図 ２ｂ 第６図 第９図 ａｔ） 骨画軟 手続補正書（自発） 昭和３年グ月２６日 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１５７９０ 号 ２、発明の名称 ＤＮＡ合成抑制物質 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社（置 ： ０３−２
０１−７２１１ 内線２７５１）５、補正の内容 （１）明細書全文を別紙のとおり訂正する。 明 細 書 １、発明の名称 ＤＮＡ合成抑制物質 ２特許請求の範囲 （１）Ｔ細胞のＤＮＡ合成を抑制する新規Ｔ細胞合成抑
制物質。 （２）下記理化学的性質を有する特許請求の範囲第１項
記載の物質。 元素分析：Ｃ，Ｈ，○、ＮおよびＳ の元素を有する。 分 子 量 ： 約１．０００ダルトン熱 安 定
性 ： −２０ｔ：で数カ月間、５６℃で３０分間
〜１時間、 １００℃で３０分間安定。 酸性・中性・塩基性の別 ・ 弱塩基性ｐＨ安定性 ：
ｐＨ３，５〜１０．０で安定紫外線吸収スペクトル
：２１０〜２２０ｎｍに最大吸収 呈 色 反 応 ： ニンヒドリン陽性溶 解 性
： 水、エタノール、メタノールに易溶。 物 質 の 色 ： 上記溶媒に溶かすと無色（３）
動物または昆虫の線維芽細胞またはリンパ球を培地に
培養し、培養物中にＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質を精製蓄
積せしめ、該培養物よりＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質を採
取することによって得られる特許請求の範囲第１項記載
のＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質。 （４）動物が哺乳類に属する動物であることを特徴とす
る特許請求の範囲第３項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物
質。 （５）動物がマウス、ラットまたはヒトであることを特
徴とする特許請求の範囲第４項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成
抑制物質。 （６）培養液が無血清あるいは牛胎児血清を含むＲＰＭ
１１６４０培地またはＩψＥＭ培地から選ばれることを
特徴とする特許請求の範囲第３項記載のＴ細胞ＤＮＡ合
成抑制物質。 （７）培地がフォルボールミリステート、フォルボール
−１３−アセテートおよび１２−０−テトラテ゛カッイ
ルーフォルボール−１３−アセテートから選ばれるフォ
ルボールエステル類の少なくとも１種を含むことを特徴
とする特許請求の範囲第３項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成抑
制物質。 （８）哺乳動物血清および昆虫体液から採取して得られ
る特許請求の範囲第１項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物
質。 （９）哺乳動物血清が、ヒト、ウシ、ラットまたはマウ
スの血清から選ばれる特許請求の範囲第８項記載のＴｉ
ｅ胞ＤＮＡ合成抑制物質。 σＯ昆虫の体液が、カイコガ、ヤママユガ、ニクバエま
たはミツバチの体液から選ばれる特許請求の範囲第８項
記載のＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質。 ３、発明の詳細な説明 技術分野 本発明は新規なＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質に関する。さ
らに詳細には、本発明は、動物または昆虫の線維芽細胞
ならびにリンパ球を無血清あるいは牛胎児血清含有培地
で培養して得られるＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質および動
物の血清または昆虫の体液から採取して得られるＴ細胞
ＤＮＡ合成抑制物質に関する。 背景技術 従来、Ｔ細胞などの免疫担当細胞における免疫活性の異
常な先進による各種の自己免疫疾患などに対する治療に
はステロイド、イムランなどが用いられている。これら
は、特定の疾病にはある程度の治療効果がＳ忍められる
が、正常細胞に対し副腎の機能低下、白血球数の減少な
どの副作用があるので、より優れた治療薬の開発が望ま
れている。 本発明者らは、動物の線維芽細胞、リンパ球などが免疫
細胞（Ｔ細胞）のＤＮＡ合成を抑制する物質を生産して
おり、この物質が免疫細胞の活性を抑制して自己免疫疾
患に対する治療に有用であることを見出し本発明を完成
するに至った。 従来、免疫細胞に対する抑制物質は、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ。 １０９、１５４−１６３ （１９７２） 、 Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、 １１６．１４５２−１４５８ （１９７
６）、 ｌｎｆｌａｍａｔｉｏｎ １ 、５−２１
（１９７５）などで知られているが、これら既知の物
質はいずれも高分子物質であるため、患者の免疫的拒絶
反応などの副作用を惹起する可能性がある。本発明の物
質は哺乳動物中に由来する低分子ペプチドであるため副
作用が低いことが予想され、免疫疾患への応用が期待さ
れる。 発明の開示 本発明に係る新規Ｔ細胞ＤＮＡ合成抑制物質（以下゛本
物質′”と略記する）は、動物または昆虫の線維芽細胞
ならびにリンパ球を培地で培養し、培養物中に生成蓄積
した本物質を採取することによって得ることができる。 動物としてはマウス、ラット、ヒトなどの哺乳動物が好
ましく、細胞としてはマウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ）肺細胞、
マウス３Ｔ３線維芽細胞（Ｊ、 Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．、
１７．２９９ （１９６３）） 、ラット牌細胞ＳＤ
（Ｓｐｌａ３ｕｅ Ｄａｗｌｅｙ） 、ヒト胎児線維
芽細胞が好適にあげられる。これらの細胞は消和実験動
物■（大分）から購入できる。 昆虫の細胞としては、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ
ｅｎｋａｌｙｐｔｉ）より確立した線維芽細胞ＣＧｒａ
ｃｅ。 Ｎａｔｕｒｅ、 １９５．７８８ （１９６２） ）が
好適な例としてあげられる。 培地としては、動物細胞の培養に使用するものであれば
、いかなる培地をも用いることができる。 好適にはＲＰＭ１１６４０培地、ＭＥＭ培地などが用い
られる。ＲＰＭ Ｉ １６４０培地およびＭＥＭ培地の
組成については「組織培養」中井準之助ら編集、朝食書
店、９−１１頁、１９７６年を参照。 培地には牛胎児血清を１〜１０％加えてもよい。 またフォルボールエステル類を培地に添加することによ
り本物質の生成が向上する。 フォルボールエステルとしては、フォルボールミリステ
ート、フォルボール−１３−アセテート、１２−０−テ
トラデカノイル−フォルボール−１３−アセテ−） （
ＴＰＡ）などが好適に用いられる。 フォルボールの濃度は、通常培養液１ｍｌ当り１１、Ｏ
ＯＯｎｇ 、好ましくは１１０−１Ｏ０ｎの範囲で用い
る。 培養は通常の動物細胞の培養条件に従って、液体、通気
培養を行う。通気は、５−１０％Ｃ○２．９０−９５％
空気を用いる。培養温度は２５−４０℃、好ましくは３
０−３７℃、ｐ）ｌは７．５−８．５、好ましくは７．
８−８．０である。培養時間は５−２４時間が好適であ
る。培養物からのＴ細胞Ｄ Ｎ Ａ合成抑制物質の採取
は通常動物細胞の培養物から蛋白質を採取する方法に従
って行われる。 細胞培養後、遠心分離により細胞を除き培養上清を回収
し、それに２倍容量の飽和硫安（ｐＨ７，５）を加え、
塩析処理する。塩析処理物を遠心分離して得た沈澱物を
生理食塩水にとかし、セファデックスＧ１００カラムに
かけ、生理食塩水で溶出する。低分子物質を含む画分に
Ｔ細胞のＤＮＡ合成を抑制する活性が認められる。その
活性画分を２倍容量の蒸留水で希釈し、ＣＭセファデッ
クスにかける。５０ｍＭ食塩水でカラムを洗ったのち、
食塩の濃度匂配で溶出する。 本物質は約４００ｍＭ食塩水で溶出されてくるの室、そ
の活性画分をロータリーエバポレーターで濃縮し、セフ
ァデックスＧ５０カラムにかけ、生理的食塩水で溶出す
る乙分子量約１．０００ダルトンの位置に活性が認めら
れるので、活性画分をロークリ−エバポレーターで濃縮
しシリカゲル薄層クロマトグラフィーにスポットしメタ
ノール−水溶媒系で展開する。その結果２つのニンヒド
リン陽性スポットが認められる。Ｔ細胞ＤＮＡ合成抑制
活性は、より易動度の低いスポットに存在しているので
、その部分のシリカゲルを回収し、水によって本物質を
抽出する。 本物質は、また哺乳動物血清、昆虫捧液から採取するこ
とによっても得ることができる。 哺乳動物血清としては、ヒト、ウシ、ラット。 マウスの血清などがあげられる。昆虫の体液としては、
鱗翅類、双翅類、膜翅類などの昆虫類だきえばカイコガ
、ヤママユガ、ニクバエ、ミツバチの体液などが用いら
れる。 哺乳動物血清および昆虫体液からの本物質の採取は、上
記細胞培養液から本物質を採取する方法と同様にして行
う。 採取行程中、Ｔ細胞のＤＮＡ合成活性の測定は次のとお
りに行う。 ０．１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０−１０％牛脂児血清中
に懸濁した２、５Ｘ１０５個のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの胸
腺細胞を０．１ｍｌの線維芽細胞の培養上清またはカラ
ムクロマトグラフィーの各両分と混合し、２．５μｇ
／ｍｌのコンカナバリンΔを加えて２日間イン・ビトロ
で培養する。最後の２０時間を１μＣ１の〔３Ｈ〕−チ
ミジンでパルスラベルし、胸腺細胞にとりこまれた〔３
Ｈ〕−チミジンを計測する。 かくして得られる本物質は低分子ペプチドであり、以下
の理化学的性質を示す。 ■ 元素分析：ＣＸＨ，ＯｌＮおよびＳの元素を有する
。 ■ 分 子 量：約１．０００ダルトン１００℃で３０
分間安定 ■ 酸性・塩基性・中性の区別二弱塩基性に吸収極大を
示す（第５図参照）。 ■ 呈色反応：ニンヒドリン陽性反応。 ■ 溶 解 性：水、エタノール、メタノールに易溶。 ■ 物質の色：上記溶媒に溶かすと無色。 ■、トリプシン（２５μｇ／ｍｌ）処理（３７℃。 １時間）でＴ細胞ＤＮＡ合成活性活性ｂ＜消失する。 ■ リボヌクレアーゼΔ（２５μｇ ／ｍｌ ）および
デオキシリボヌクレアーゼ■（２５μｇ ／ｍｌ ）処
理（３７℃、１時間）ではＴ細胞ＤＮＡ合成抑制活性に
影響を与えない。 本物質の生物学的活性の測定は次のとおり行う。 Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの牌細胞または胸腺細胞それぞれ５
Ｘ１０５個を１０％牛脂４ｙ血ａ（ギブコ社製）を含む
ＲＰＭ１１６４０培地（日永製薬社製）に懸濁し、コン
カナバリンＡ（シグマ社製、最終濃度５μｇ ／ｍｌ
）存在下で５％ｃｏ２．ｇ５％空気の条件下で、３日間
培養する。培養最後の１日間、細胞を１μｃ１の〔３Ｈ
〕チミジン（英国Ｒａｄｊｏｃｈｅｍｊｃａｌ Ｃｅｎ
ｔｅｒ社製）でラベルした後、セルハーベスタ−を使っ
て細胞をＣＦ／ＣまたはＣＦ／Ｆメンブレンフィルター
（Ｗｈａｔｍａｎ社製）にトラップする。 そのメンブレンを水とエタノールで洗い乾燥させ、細胞
中にとり込まれた〔３Ｈ〕チミジンの活性ヲヘツクマン
・シンチレーション・カウンターで測定する。 その他の哺乳類細胞のＤＮＡ合成の活性測定は、細胞ｌ
Ｘ１０４個を０．１ｍｌの１０％牛脂児血清を含むＲＰ
Ｍ１１６４０培地に懸濁し、測定する分画０．１ｍｌを
入れコンカナバリンＡ非存在下で２４時間培養する。最
後の８時間細胞を１μＣｉ（３Ｍ：ｌチミジンでラベル
する。他の条件は、上記リンパ球の場合と同じである。 リンパ球へのヌクレオチドの取り込み活性の測定ＤＮＡ
合成抑制物質の細胞膜の機能に対する作用をしらべるた
め、ヌクレオチド、ここでは、ウリジントリフ ｔ ス
フ エイト（ｌＪｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ）（ＵＴＰと略す）の取り込み活性を測定する。 マウス牌細胞を上記ＤＮＡ合成活性の測定上回じ条件で
培養し、培養開始時に細胞を１μｃＩＣ３Ｈ） ＬＩＴ
Ｐ （Ｒａｄ１ｏｃｈｅｍｉｃａ１ｃｅｒ＋ｔｅｒ社製
）でラベルする。活性の測定は上記と同様の方法で行う
。 バクテリアのＤＮＡ合成活性の測定 １０μｌのバクテリア（大腸菌、シュードモナス・マル
トフィリア、枯草菌など）懸濁液（０，５Ａ６６０ｎ−
）を９０μｍの５％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０
培地で希釈し、各分画０．１ｍｌを加える。〔３Ｈ〕チ
ミジン１μｃｉを加衣た後３７℃で一晩（１６時間）バ
クテリアを培養する。上記方法と同じ＜ＧＦ／Ｃメンブ
レンフィルターにバクテリアをトラップしたのちチミジ
ンの取り込みを測定する。 本物質のＴ細胞への作用機作は次のとおりである。 本物質の添加によるＴ細胞の生存率をトリパン・ブルー
を用いるｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ法によって調べる
と、無添加の系のものとあまり変わらない。つまり、本
物質は基本的にＴ細胞を殺さないがそのＤＮＡ合成のみ
を抑制する（実験例１および第１表参照）。 各種細胞のＤＮＡ合成に対する抑制の程度は、哺乳類リ
ンパ球が最も強（、哺乳類線維芽細胞に対しても一定の
効果がある。しかし癌化した細胞には、効果は、認めら
れない。バクテリアに対するＤＮＡ合成の抑制の効果は
、ダラム陰性菌である大腸菌で強く、ダラム陽性菌であ
る枯草菌では弱い。リンパ球ＤＮＡ合成反応に対する抑
制のメカニズムとしては、レクチン刺激後の比較的初期
に細胞膜の機能（例えばヌクレオチドの転送活性）を抑
制し、その後のＤＮＡ合成を特異的に抑制すると推定さ
れる。またこの物質群は、ＤＮＡ合成 。 を強く抑制するが細胞の生存率には、影響を与え ｌ【 ない。
Ｉさらに本物質はＴ細胞のＲＮＡ合成の抑制はおこさな
い（実験例２および第６図参照）。ただ、Ｔ細胞の初期
（０〜５時間）のヌクレオチドのと本物質による初期の
細胞の機能の抑制（初期のヌクレオチドの取り込みの抑
制）はＴ細胞ＤＮＡ合成抑制によると考えられる（実験
例３および第２表参照）。 実施例 本物質のＴ細胞の生存率に対する影響 マウ７− （Ｃ３）１／Ｈｅ）の胸腺細胞５Ｘ１０６個
を１ｍｌのＲＰＭ Ｉ １６４０培地−５％牛脂児血清
中に懸濁し、本物質０．１ｍｌまたは対照として生理食
塩水０．１ｍｌを懸濁液に加え、１日および２日後の細
胞の生存率を調べた。測定法は、ｃｌｙｅ ｅｘｃｌｕ
ｓｉｏｎ法によるが、１日後および２日後に０．１％ト
リパンブルー液（１，９ｍ１）で細胞液（０，１ｍ１）
を２０倍に希釈し、トリパンブルーに染まる細胞を顕微
鏡下で数え、その生存率を計算した。 結果を第１表に示す。 第 １ 表 起 対 照 本物質処理険
培養欝 可 の日 細胞数 生存率 細胞数 生存率攻
（ＸＩＯ５） （％） （ＸＩＯ５）
（％）１ 日 ３．６
７２ ３．８ ７６１２Ｂ
２．１ ４，２ ２．０ ４０１ 日
３．４ ６８ ３．３
６６実施例 本物質のＴ細胞に対する作用機作 マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ）の胸腺細胞５×１０５個をＲＰ
Ｍ１１６４０培地−５％牛脂児血清に懸濁し、コンカナ
バリンＡ（５μｇ ／ｍｌ ）を加え０．１ｍｌとし、
活性画分０．１ｍｌを加えた。その後細胞中のＲＮＡを
ラベルするために培養器始時に１μＣ１の［３Ｈ〕ＵＴ
Ｐを培養系に加え、各時点で、冷した１０％トリクロロ
酢酸（ＴＣＡ）で反応を止め、ＴＣＡ不溶画分にあるＲ
ＮＡをＣＦ／Ｆメンブレンフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ
社製）にトラップした。タンブレンを５％ＴＣＡでくり
返し洗浄し、エタノールで１回洗った後、乾燥させた。 メンブレンをトルエン−ＰＯＰ系溶液溶液れてβ−シン
チレーションカウンターでＲＮＡ画分の放射能を測定し
、そのＲＮΔ合成能を決定した。 その結果を第６図に示す。図中（Ａ）は〔３Ｈ〕ＵＴＰ
のＴ細胞への取り込み活性、（Ｂ）はＲＮ八へ成活性を
示す。また図中白丸は本物質非存在下、黒丸は本物質の
存在下の結果を示す。 実施例 ＤＮＡ合成抑制効果への本物質の有効な添加時間 マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ）の胸腺細胞２．５×１０５個を
コンカナバリンＡ５μｇ ／ｍｌを含むＲＰＭ １１６
４０培地−５％牛脂児血清（最終容量０．１ｍ１）に懸
濁し、５％Ｃ○２．９５％空気の条件で３７℃、３日間
培養した。その培養中実２表に記載した時間に本物質を
０．１ｍｌ添加した。培養終了１２時間前に細胞を１μ
ＣＩの〔３Ｈ〕チミジンでラベルし細胞に取り込まれた
〔３Ｈ〕チミジン活性を測定した。 結果を第２表に示す。 第 ２ 表 −３７４２±２３４１００．０ ０５２４±１０２１４．０ ２、５ ５０７±１９１ １．３．．５゜
５５０９±６５１３．６ １５ ９０３±１．７８ ２４．１ ３０ ３２１８±２０３ ８６．０ 実施例 各種哺乳類細胞に対す゛る本物質の効果上記の方法で哺
乳類細胞に対する本物質の効果を調べた。結果を第３お
よび４表に示す。 第３表 各種哺乳類細胞に対するウシ胎児血清由来本物
質（ＦＣ３Ｉ）の効果 ＧＭ２５８ （ヒト線維芽細胞） ２３４１
４８２１ＭＲ９０（同 上 ＞
５０２９ ２３１２ＳＶ４０−形質転換細胞（
同よ） ９１９３ ９００５ＰＣＩＯ（ヒト肺カ
ルシノーマ） ９１２４ ８９２３１．９２
９ （マウスフィブロサルコーマ）
４０５６ ４２１９ＭｅＬａ３
（ヒトメラノーマ） ４３９２ ４１５５マ
ウス牌細胞 ２２１８０ ．６９
８第４表 各種哺乳類細胞に対するヤママユガ由来本物
質（ＡｅＩ）の効果 ０Ｍ２５８ １４６７ ２６
０ＩＭＲ９０５５１２２６５９ ＳＶ４０−形質転換細胞 ９６８９ ９３２
１ＰＣＩＯ９０６５９２１５ Ｌ９２９ ４３６７ ４５２
８ＭｅＬａ ３ ５９７８ ４
８６２マウス牌細胞 １６８５０
１７２１実施例 バクテリアのＤＮＡ合成に対する本物質の効果上記の方
法でバクテリアのＤＮＡ合成に対する本物質の効果を調
べた。結果を第５表に示す。 Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｌ
２．４ ５．１Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ ８８．３ ８ ｇ、 ９
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ
７１．０ ９６．５本物質は、Ｔ細胞のＤＮ
Ａ合成を強く抑制する低分子ペプチドであるので、自己
免疫疾患などへの治療剤または炎症反応のような異常な
リンパ球の活性化の抑制剤として用いることができる。 本物質はＤＮＡ合成のみを抑制するが、Ｔ細胞を殺しは
しないので、特異的にＤＮＡ合成のみを抑制することへ
の応用もできる。また、フォルボールエステルによって
本物質産生細胞を前癌状態にすると本物質の産生が高ま
るので、癌に対する診断のマーカーとしても本物質を用
いることができる。 さらに本物質はダラム陰性菌に対する特異的な抗菌物質
として使用できる。 発明を実施するための最良の形態 実施例１゜ マウス３Ｔ３線維芽細胞による本物質の製造マウス３Ｔ
３線維芽細胞１０８個を、１００μｇ ／ｍ＋ストレプ
トマイシン、１００単位／ｍｌペニシリンおよび５％Ｆ
Ｃ３（牛胎児血清、Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＲＰＭ Ｉ
１６４ Ｇ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）１０ｍｌに接種し
、５％Ｃ０２および９５％空気を通気しつつ、３７℃で
３日間培養した。この培養によりマウス３Ｔ３線維芽細
胞は飽和細胞濃度いわゆるコンフルエント状態になる。 培養物から上清を除いたのち、無血清条件下で新しいＲ
ＰＭ１１６４０培地１０ｍ１を加え、３７℃、５％ＣＯ
２，９５％空気の条件で１０時間培養した。培養上清を
回収し２倍量の飽和硫安（ｐＨ７，５）を加え、塩析す
る。塩析物を遠心分離して沈殿物を得、これを少量の生
理食塩水に溶かし２ｍｌのセファデックス６１００カラ
ムクロマトグラフイーにかけ、生理食塩水で溶出した。 溶出液は２．５ｍｌずつ分画した。第１図に示すとおり
、低分子領域にＴ細胞のＤＮＡ合成を強く阻害する活性
がδ忍められた。 活性画分を２倍量の蒸留水で希釈し、ＣＭセファデック
スカラムにかけ、５０ｍＭ食塩水で洗浄後、食塩濃度匂
配（５０−６００ｍＭ）で溶出した。溶出液はｌ、５ｍ
ｌずつ分画した。第２図に示すように主要活性は、約０
．４ Ｍ食塩で溶出される。 活性画分（９ｍｌ＞をロータリーエバポレーク−を用い
５０℃で３．５ｍｌまで濃縮し、セファデックス０５０
カラムにかけ、生理食塩水で溶出した。溶出液は１．２
５ｍ１ずつ分画した。第３図に示すように活性は、約１
．０００ダルトンの位置に認められる。活性画分をシリ
カゲル薄層クロマトグラフィーで展開すると、第４図に
示すように、２つのニンヒドリン陽性のスポット（ＰＩ
、Ｐ１′）があり、ＰＩに強いＴ細胞ＤＮＡ合成抑制活
性が認められた。第６表にＰＩ、ＰＩ’の活性を示す。 ＰＩのシリカゲルを回収し、水によって本物質を抽出し
、凍結乾燥し本物質５μｇを得た。ＰＩが本物質に相当
する。 第 ６ 表 対 照 ５６２７ ± ２３１Ｐ
Ｉ’ ５４５６±６２９ 実施例２゜ マウス牌細胞による本物質の製造 Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスの牌細胞１０８個を１０ｍ１のＲＰ
Ｍ１１６４０培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２，９５
％空気の条件で１０時間培養した。 培養上清を実施例１と同様セファデックス０１００カラ
ムクロマトグラフイーにかけ、溶出すると第７図に示す
とおり、低分子領域にＴ細胞のＤＮＡ合成を強く阻害す
る活性が認められた。 さらに実施例１と同様に活性画分をＣＭセファデックス
カラムにかけ、０．４Ｍ ＮａＣＡで溶出したのちセ
ファデックス０５０カラムにかけると第８図に示したよ
うに、実施例１の場合と同じ位置に活性が認められた。 さらに実施例１と同様に活性画分をシリカゲル薄層クロ
マトグラフィーで展開し、精製して本物質的２０μｇを
得た。 実施例３゜ ヒト胎児線維芽細胞による本物質の製造２力月のヒト胎
児胚をトリプシン処理し、ＭＥＭ培地（田水製薬社製）
に１０％ＦＣ３，１０ｍＭＮ−Ｎ−ビス〔２−ヒドロキ
シエチル〕−２−アミノエタン−スルホン酸（ＢＥＳ）
、５ｍＭ Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチルツーメチル
−２−アミノプロパン−スルホン酸（ＴＢＳ）および５
ｍＭＮ−ヒト和キシノチルーピペラジンーＮ−２−エタ
ン−スルホン酸（ＨＥＰＥＳ、牛丼化学社製〉を加えた
培地中１０％Ｃ○２および９０％空気を通気しつつ、３
７℃で４日間培養した。この培養によりヒト胎児線維芽
細胞は飽和細胞濃度いわゆるコンフルエント状態になる
。 このコンフルエント状態の細胞５Ｘ１θ８個を１０％Ｆ
Ｃ３を含んだＭＥＭ培地で、３７℃、１０％Ｃ０２，９
０％空気の条件で１０時間培養シタ。コノとき、ＴＰＡ
１００Ｔ１ｇ／ｍ＋を加えた培地を用いても同様に培養
した。 培養上清を実施例１と同様にセフアゾ・ノクスＧ１００
カラムクロマトグラフィーにかけ溶出したところ、第９
図に示す結果が得られた。ＴＰΔの添加により本物質の
生産が高められることがわかる。 ＴＰＡ添加培地を用いたものについて、活性画分を実施
例１と同様に処理して、本物質的２０μｇを得た。 実施例４、 牛胎児血清とカイコガ体液からの本物質の製造牛胎児血
清（Ｇｉｂｃｏ社製）とカイコガ体波谷２５ｍ１を５０
ｍ１の冷やした飽和硫安（ｐＨ７，５）でよく混ぜ、４
℃で１時間静置した。遠心（１６，０００ｒｐｍにて１
５分）をした後、沈殿物を１０ ｍ Ｍ ＩＪン酸バッ
ファ〜（ｐＨ７，２）５ｍｌに溶かし、セファデックス
Ｇ１００カラム（１，８Ｘ４３ｃｍ）にかけ、同じリン
酸バッファーで１分画５＋＋＋Ｉにて溶出した。第１０
図に溶出パターンを示す。 セファデックスＧ１００クロマトグラフイーの活性画分
を２倍量の蒸留水で希釈し、ＣＭセファデックス（Ｃ−
２５）カラム（１，８Ｘ１０ｃｍ）にかけ７５ｍＭ食塩
を含む水約３０ｍ１でカラムを洗った後、７．５ｍＭか
らＩＭまでの食塩の濃度勾配を含む水で１分画２．５ｍ
ｌにて溶出した。各分画の食塩濃度はシンダクティビテ
ィーメーターで測定した。第１１図に溶出パターンを示
す。その活性画分をロータリーエバポレーターで濃縮し
セファデックス０５０カラム（１，２Ｘ ５６ｃｍ）に
かけ０．１Ｍ炭酸アンモニウムで１分画１．２５ｍ１に
て溶出し、その活性画分を凍結保存した。第１２図に０
．３−０．４Ｍ ＮａＣβ濃度で溶出する両分の溶出
パターンを示す。 さらに精製を進めるため活性画分を水にとかしンリカゲ
ル薄層プレート（メルク社、シリカゲル６０．２０Ｘ２
０Ｃｍ）にスポットしメタノールと水（３：１）の混合
溶液で約２時間展開した。展開後薄層プレートにニンヒ
ドリン溶液をスプレッドした後２〜３分間バーナーで熱
し、ペプチドの位置を確かめた。結果を第１３図に示す
。図中のＬｙｓ、 Ａｒｇ、 Ａｌａ、 Ｔｒｐは、そ
れぞれのアミノ酸マーカーの位置を示す。図中のＦＣ３
ＩおよびＢｍＩが本物質に相当する。 肺細胞をレクチン（コンカナバリンＡ：５Ｍｇ／１１１
１ ）で刺激すると同時にＵＴＰＩμＣ１を細胞に加え
３７℃で培養した。培養開始と同時に第１０図のＦＣ３
Ｉ活性画分Ｎ０２３〜２７を集めた液の０．１ｍｌを加
え、初期［ＪＴＰ取り込み活性へのＦＣ３Ｉの影響を調
べた。結果を第１４図に示す。図中、白丸、黒丸はＦＣ
３Ｉの非存在および存在下での活性を示す。 実施例５゜ Ｇｒａｃｅによって確立されたヤママユガ（Ａｎｔｈｅ
ｒｅａ ｅｎｋａｌｙｐｔｉ ）由来の線維芽細胞（
Ｎａｔｕｒｅ、 １９５．７８８ （１９６２） ）
２．５ Ｘ １０’個／ｍｌを１０％牛脂児血清を含む
Ｇｒａｃｅの培地（（、ｉ ｂ ｃ ｏ社製）Ｉ Ｑｍ
ｌで３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養し、１回同じ培地
を交換してさらに３日間培養し、コンフルエントの状態
になった細胞をＱｒａｃｅの培地１［１ｍｌで３回洗っ
た。その後Ｇｒａｃｅの培地（無血清）で３７℃、５％
ＣＯ２で３日間培養した。培養液を回収し、アミコンダ
イヤフローメンブレン（ＹＭＩＯ：カットサイズ、 １
０．０００ダルトン）に通した。その濾液をロータリー
エバポレーターで濃縮し、セファデックス０５０カラム
（１，８Ｘ ４３ｃｍ）にかけ、０．１ｍＭＪン酸バッ
ファー（ｐ Ｈ７，２）で溶出した。 溶出液は２．５ｍｌずつ分画した。第１５図に示すよう
に、かなりのリンパ球ＤＮＡ合成抑制活性が分子量約５
．０００ダルトンの位置（１２〜１４画分）に、また主
要活性が約１． ＯＯＯダルトンの位置（１７〜１９両
分）に認められた。第１５図中、白丸はリンパ球へのチ
ミジンの取り込み、黒丸は各画分の２８０ｎｍにおける
吸収を示す。 トリプシン（２５μｇ ／ｍ＋ ）で３０℃でインキニ
ベートすると、５．０００ダルトンの活性は消失し、１
．０００ダルトンの位置に活性が移動する。 さらに、トリプシン消化を続けると、この活性の大部分
が消失する（第１６図）。第１６図中、上段は無処理、
中段はトリプシンを加え３０分間インキュベート、下段
はトリプシンを加え１時間インキュベートした場合を示
す。 上記の結果は、これらの因子がペプチド性であることを
示している。さらに分子量１．０００ダルトンの活性を
ＣＭセファデックスクロマトグラフィー（ｌＱｍｌ）に
かけた。すなわち、遠心管中のＣＭセファデックス（ケ
ルベット：ｌＱｍｌ）を１００ｍＭ ＮａＣ１で平衡
化し、第１５図の１７〜１９画分を加えて懸濁した。４
℃で１５分間静置後、上清を捨て、ｌＱｍｌの０．ＩＭ
ＮａＣＡでゲルを３回洗った。同じ操作を異なる塩
濃度を含んだ水１０ｍ１（０，２〜０．６Ｍ ＮａＣ
Ａ）で繰り返した。 リンパ球のＤＮＡ合成の測定には、各分画を水で４倍に
希釈して用いた。ＣＭセファデックスの結果を第１７図
に示す。図中、矢印はＮａＣβ濃度を示す。第１７図に
示すように、約０．４ＭＮａ（ｌで溶出される活性が認
められた。この活性をＡｅＩと名付けた。この活性は、
さらにセファデックス０２５クロマトグラフイーで精製
すると、第１８図のように分子量約１．０００ダルトン
を示した。次にこの因子の精製度をシリカゲル薄層クロ
マトグラフィーで確かめた。すなわち、第１８図の活性
画分ＡｅＩを凍結乾燥後、水に溶かし、シリカゲル薄層
プレート上にスポットした。メタノール−水（３：１）
溶液で展開後、ニンヒドリン溶液をプレートにかけ、バ
ーナで３分間炙り発色させた。Ｌｙｓ、Ａｒｇ、 Ａｌ
ａ、 Ｔｒｐはアミノ酸マーカーのそれぞれの位置を示
す。ＡｅＩは、アラニンより少し遅い移動度を示した（
第１９図）。第１９図中ＡｅＩが本物質に相当する。 ４図面の簡単な説明 第１図は、実施例１における本物質精製のためのセファ
デックス０１００カラムクロマトグラムを示す。矢印ａ
、 ｂ、 ｃ、 ｄはアルブミン〔６７キロダルトン（
以下Ｋ（］という）〕、西洋ワサビのノ々−オキシダー
ゼ（４０Ｋｄ）、チトクロームＣ（１３Ｋｄ）およびバ
シトラシン（１，，５Ｋｄ）マーカーをそれぞれ示す（
以下同じ）。 第２図は、実施例１における本物質精製のためのＣＭセ
ファデックスカラムクロマトグラムを示す。 第３図は、″実施例１における本物質精製のためのセフ
ァデックス０５０カラムクロマトグラムを示す。 第４図は、実施例１における活性画分およびアミノ酸マ
ーカーのシリカゲル薄層クロマトグラムを示す。 第５図は、本物質の紫外線吸収スペクトラムを示す。 第６図は、本物質のＴ細胞に対する作用機作を示す。白
丸は無処理、黒丸は本物質処理を示す。 第７図は、実施例２における本物質精製のためのセファ
デックスＧ１００カラムクロマトグラムを示す。 第８図は、実施例２における本物質精製のためのセファ
デックス０５０カラムンロマトダラムを示す。矢印ｅは
マイトマイシンＣ（３４０ダルトン）マーカーを示す（
以下同じ）。 第９図は、実施例３におけるＴＰＡによる本物質産生の
増加を示すためのセファデックスＧ１００カラムクロマ
トグラムを示す。 第１０図は、実施例４における牛脂児血清（Ａ）とカイ
コガ体液（Ｂ）のセファデックスＧ１００クロマトグラ
フイーの溶出パターンを示す。 第１１図は、実施例４における牛脂児血清（Ａ）とカイ
コガ体液（Ｂ）のＣＭセファデックス（Ｃ−２５）クロ
マトグラフィーの溶出パターンを示す。 第１２図は、実施例４におけるＦｅ２ ＩとＢｍＩのセ
ファデックスＧ５０クロマトグラフイーの溶出パターン
を示す。白丸と黒丸はＦｅ２ ＩとＢｍＩのリンパ球の
ＤＮＡ合成活性を示す。 第１３図は、実施例４におけるＦｅ２ Ｉ 、およびＢ
ｍｌ、のシリカゲル薄層クロマトグラフィーのパターン
を示す。 第１４図は、実施例４におけるＦｅ２ Ｉによるリンパ
球のレクチン刺激後の初期ＵＴＰ取り込み活性への影響
を示す。 第１５図は、実施例５におけるカイコガ線維芽細胞の培
養上清のセファデックスＧ５０クロマトグラフイーを示
す。図中１はインシュリン（５，７Ｋ（１）の分子量マ
ーカーを示す。 第１６図は、実施例５における活性因子へのトリプシン
処理の効果を示す。 第１７図は、実施例５におけるＣＭ、セフアゾ・ソクス
クロマトグラフイーを示す。 第１８図は、実施例５におけるＡｅｌのセファデックス
Ｇ２５クロマトグラフイーを示す。 第１９図は、実施例５におけるＡｅＴの７リ力ゲル薄層
クロマトグラフィーを示す。 第１０図 分画番号 第１１因 分画番号 第１と図 分画番号 第１３図 第１４図 時間 第１５図 ｃｆｄ ｅ 金歯番号 第４６図 金歯番号 第１７図 ０．１Ｍ ０．２Ｍ Ｏ，３Ｍ Ｏ，６Ｍ第１δ
図 第１９図 ＝１４６
Claims (7)
- （１）Ｔ細胞のＤＮＡ合成を抑制する新規Ｔ細胞合成抑
制物質。 - （２）下記理化学的性質を有する特許請求の範囲第１項
記載の物質。 元素分析：Ｃ，Ｈ，Ｏ，ＮおよびＳの元素を有する。 分子量二二約ｉ、ｏｏｏダルトン 熱安定性ニー２０℃で数カ月間、５６℃で３０分間、９
０℃で５分間安定。 酸性・中性・塩基性の別：弱酸性 ｐＨ安定性： ｐ Ｈ３，５−９，５で安定紫外線吸収
スペクトル：２２０ｎｍに最大吸収呈色反応：ニンヒド
リン陽性 溶解性：水、エタノール、メタノールに易溶。 物質の色二上記溶媒に溶かすと無色 - （３）動物の線維芽細胞またはリンパ球を培地に培養し
、培養物中にＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質を生成蓄積せし
め、該培養物よｆｉＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物質を採取す
ることによって得られる特許請求の範囲第１項記載のＴ
細胞ＤＮＡ合成抑制物質。 - （４）動物が哺乳類に属する動物であることを特徴とす
る特許請求の範囲第３項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成抑制物
質。 - （５）動物がマウス、ラットまたはヒトであることを特
徴とする特許請求の範囲第４項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成
抑制物質。 - （６）培養液が無血清あるいは牛胎児血清を含むＲＰＭ
１１６４０培地またはＭＥＭ培地から選ばれることを特
徴とする特許請求の範囲第３項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成
抑制物質。 - （７） 培地が７オルボールミリステート、フォルボ
ール−１３−アセテートおよび１２−０−テトラデカノ
イル−フォルボール−１３−アセテートカラ選ばれるフ
ォルボールエステル類の少なくとも１種を含むことを特
徴とする特許時求の範囲第３項記載のＴ細胞ＤＮＡ合成
抑制物質。
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