DE2620834A1 - Verfahren zur herstellung von 4-hydroxy l(-)prolin - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung von 4-hydroxy L(-)prolin

SOCIETE LA BIOCHIMIE APPLIQUEE A L«INDUSTRIE S.A. (SOLABIA)

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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 4-hydroxy L(-)prolin, welches häufiger als L-hydroxyprolin bezeichnet wird.

Es gibt zahlreiche Verfahren zur Herstellung von L-hydroxyprolin, welche sich in mehrere Gruppen unterteilen lassen.

Bei der ersten Herstellungsgruppe wird eine Synthese der Verbindung bewirkt. Aufgrund der beiden asymetrischen Kohlenstoff atome erhält man ein Gemisch aus vier Isomeren: L und D hydroxy-prolin, L und D allohydroxyprolin, deren Trennung schwierig ist.

Bei einer zweiten Verfahrensgruppe wird L-hydroxyprolin durch Ausfällung aus Gelatine-Hydrolysaten isoliert. Arginin wird zuerst ausgefällt, meist mit 2_f^-Dinitro-I-Naphtol-T-Sulfonsäure (Flavische Säure). Danach werden die störendsten Aminoessigsäuren durch Methylalkohol ausgefällt, nämlich Lysin und Histidin in Form von Phosphortungstaten und/oder Glykokoll. Das Hydroxyprolin kann dabei in Form von Reineckat oder Picrat ausgefällt werden, wobei die gewonnene Verbindung später abgebaut werden muß. Die Ausfällung in Form von N-Acetyl-O-Benzoylhydroxyprolin wurde ebenfalls beschrieben. Diese Verfahren sind schwierig durchzuführen, und man braucht für sie teure Produkte und große Mengen Lösungsmittel.

Eine dritte Verfahrensgruppe bedient sich der Behandlung eines Gelatine-Hydrolysats mit Natriumnitrit. Sämtliche Aminoessigsäuren werden duch Entzug der Amine zerstört und sind daher nicht mehr rückgewinnbar, mit Ausnahme von Prolin und Hydroxyprolin, welche in salpetrige Säure umgewandelt werden. Dieses Stadium wirft Probleme in bezug auf Umweltsicherheit auf, was auch für die nachfolgende Phase der Rückverwandlung der salpetrigen Säure gilt.

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Unseres Wissens ist noch kein Verfahren beschrieben worden, welches die industrielle Isolierung von Hydroxyprolin durch Ionenaustauscher erlaubt. Es sind jedoch Verfahren zur Abscheidung von Aminoessigsauren bekannt, welche auch für die Abscheidung von Hydroxyprolin anwendbar sein dürften. Die wichtigsten Verfahren werden nachfolgend aufgeführt.

Das erste Verfahren besteht darin, daß man das Protein-Hydrolysat über Austauschersäulen leitet; es handelt sich zumeist um Carboxyl-Austauscher, die mit Acetaten, Zitraten oder anderen Salzen auf pH-Werte in der Größenordnung von 3 bis pH gepuffert werden. Dadurch ist es möglich, jeweils nur eine oder einige Aminoessigsauren - je nach Harzgehalt, pH-Wert und Ionisierungsvermögen des Puffers - zurückzuhalten. Verhalten sich jedoch die Ionenaustauscher durch das Puffern selektiver, so verringert sich ihre Leistung dadurch erheblich, wodurch man zum Einsatz sehr großer Mengen gezwungen ist.

Ein zweites Verfahren besteht in der Fixierung sämtlicher Aminoessigsauren auf einem sauren Austauscher sowie in einer selektiven Auswaschung durch pH-Puffer mit konstantem oder ansteigendem Ionisierungsvermögen, oder zuweilen auch durch eine Säure oder eine Base. Hierbei sind die Austauschermengen noch sehr groß, und man erhält lediglich verdünnte Lösungen, die meist in bedeutenden Mengen Ionen.enthalten, welche für die Auswaschung gebraucht wurden. Dieses Prinzip wurde vor allem im analytischen Bereich angewendet.

Schließlich gibt es noch das "Verdrängungs-Verfahren", das von J.R. BENDALL, Nature (1947), Band 16O, Seite 374, sowie von S.M. PARTRIDGE, Biochem. Jour. (1952), Band 51, Seite 628, beschrieben wurde und wobei ein von aromatischen Aminoessigsauren befreites Hydrolysat auf einem stark sauren Austauscher in Wasserstofform fixiert wird, und zwar so, daß die Hälfte oder zwei Drittel der Gesamtkapazität ausgenutzt werden. Das

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Auswaschen geschieht dabei mit sehr stark verdünntem Natron, um teilweise separierte Aminoessigsäuren zu erhalten. Wird bei diesem Verfahren das Austauschervolumen beträchtlich verringert, so erfordert die Abscheidung der aromatischen Aminoessigsäuren sehr große Mengen an Aktivschwarz,und die erhaltenen Produkte sind stark verdünnt. Auch dieses Verfahren wurde - ebenso wie die beiden vorhergehenden - niemals erfolgreich für die Herstellung von Hydroxyprolin angewendet.

Es ist Ziel der vorliegenden Erfindung, die -vorgenannten Nachteile zu beseitigen, indem ein Verfahren zur Herstellung von Hydroxyprolin vorgestellt wird,bei dem nur geringe Ionenaustauschermengen- ohne Einsatz von Puffern verwendet werden, und welches den eventuellen Einsatz von schwach kollagenhaltigen Produkten als Ausgangsstoff erlaubt, welche bis jetzt nicht zur Herstellung von Hydroxyprolin herangezogen werden konnten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L (-) hydroxyprolin, gekennzeichnet durch die Hydrolyse eines Rohstoffs, der ein eventuell vorbehandeltes Kollagen enthält, des weiteren durch das Entfärben des erhaltenen Protein-Hydrolysats sowie durch den Durchgang der gewonnenen Lösung über einen schwach basischen Austauscher, wodurch Glutaminsäuren, Aspart-Säuren und mineralische Anionen zurückgehalten werden; nach dem Verlassen des ersten Austauschers wird die Lösung über einen stark sauren Austauscher geleitet, dessen Menge so vorausberechnet wurde, daß 75 - 95 % der in der Lösung vorhandenen Aminoessigsäuren zurückgehalten wird; die Lösung wird gewonnen, indem man Wasser über den Austauscher leitet; danach wird die Lösung auf 180 - 350 g/l Hydroxyprolin konzentriert - bevorzugt jedoch zwischen 230 und 280 g/l -, entfärbt und nach Ansäurung auf 3,8 - 4,6 pH kristallisiert, um reines Hydroxyprolin in Kristallform zu erhalten.

Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz

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von entgerbten Lederabfällen, von ggf. entfetteten, enthaarten und entkalkten Häuten und Schwarten sowie von Knochenabsud als Rohstoff.

Dieser Rohstoff kann auch einer nachfolgend beschriebenen Vorbehandlung unterzogen werden, und zwar vor der Hydrolyse, um die nachfolgenden Verfahrensphasen zu erleichtern.

Man kann natürlich auch Gelatine als Rohstoff verwenden, da hiermit die besten Ergebnisse erzielt werden. Allerdings ist Gelatine teuer. Nun besteht eines der neuartigen Merkmale des Verfahrens der Erfindung darin, daß schwach kollagenhaltige (und daher schwach hydroxyprolinhaltige) industrielle Proteine verwendet werden können, welche starke mineralische oder sonstige Unreinheiten aufweisen dürfen. Eine vorherige Umwandlung der Häute oder des Knochenabsuds in Gelatine ist unnötig. Industrielle Unterprodukte aus Häuten und sogar Knorpel können als Rohstoff dienen.

Es können zum Beispiel folgende Rohstoffe verwendet werden:

1. Abfälle aus der Lederverarbeitung:

a) Abfälle von eventuell enthaarten Rohhäuten, Ausfleischabfälle nach dem Wässern oder Enthaaren, Spaltrinden, verschiedene Maschinenabfälle, aus irgendwelchen Gründen für das Gerben ungeeignete Häute.

b) entgerbte Abfälle (z. B. Chromlederabschnitte, Abfälle aus der pflanzlichen Gerbung, (nach Entgerben).

2. Abfälle aus der Fleischwaren- und Pökelwaren-Herstellung:

a) eventuell entfettete und/oder gemahlene Schwarten,

b) eventuell entfettete und vorbehandelte Knochen,

c) Scliachthofabfalle, die im wesentlichen aus Häuten bestehen .

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Diese Rohstoffe können im Rohzustand direkt für die saure Hydrolyse eingesetzt werden, wobei jedoch vor allem die Abscheidung der Fette schwierig ist. Das Filtern nach der sauren Hydrolyse ist nämlich weniger einfach,und die fehlende Einheitlichkeit und Konstanz des Rohstoffs macht die Herstellung schwieriger.

Dieser Rohstoff kann allerdings sehr wohl vor allem in folgenden Fällen im Rohzustand eingesetzt werden:

- falls die Abfälle in gutem Erhaltungszustand sowie frei von Schwefel und Kalzium sind und falls man keine Fette rückgewinnen will. In diesem Fall lassen sich diese Rohstoffe ohne weiteres verwenden, und sie brauchen nur dann nach der sauren Hydrolyse gefiltert zu werden, wenn sie sehr fettig sind; in einem solchen Fall kann es wünschenswert sÄi, sie der im folgenden beschriebenen Vorbehandlung zu unterziehen.

falls diese Abfälle zwar stark kalziumhaltig, jedoch sonst in gutem Erhaltungszustand sind, und zwar deshalb, weil dieses Ion bei dem nachstehend beschriebenen Herstellungsverfahren für Hydroxyprolin nicht stört.

- falls die Umgebung, in der das Verfahren zur Herstellung von Hydroxyprolin und von weiteren Aminoessigsäuren abläuft, die Lagerung übelriechender Rohstoffe erlaubt.

Wenn die Qualität der vorgenannten Rohstoffe nicht für einen direkten Einsatz ausreicht, sieht die vorliegende Erfindung eine Vorbehandlung dieser Rohstoffe vor; die verschiedenen entsprechenden Durchführungsarten werden nachstehend definiert.

Die Knochen z. B. werden gekocht oder vorzugsweise im Druckkocher mit Dampfinjektion unter einem Druck bis zu 12 bar bevorzugt jedoch zwischen 1 und 6 bar - 30 Minuten bis zu 6 Stunden lang behandelt. Der gewonnene Knochenabsud wird kontinuierlich oder in Fraktionen in eine fettähnliche und eine

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wässrige Phase separiert, in der die Aminosäuren in Form von Proteinen enthalten sind. Die auf diese Art und Weise separierte wässrige Phase wird danach hydrolisiert.

Die Rohstoffe können einer Extraktion mit warmen Wasser unterzogen werden, die den Zweck hat, Fette und den größten Teil der löslichen Mineralsalze abzuscheiden. Das auf diese Art und Weise erhaltene Produkt hat entweder die Form von stark braungrau gefärbten und nicht durchscheinenden Stücken oder Pulverform. Dieses Produkt stellt einen guten Rohstoff für die Herstellung von Hydroxyprolin und sonstigen Aminosäuren, ζ. B. Prolin und Arginin, nach dem Verfahren der Erfindung dar. Für gewöhnlich enthält es 5 - 10 % Hydroxyprolin, und sein Einstandspreis ist um vieles niedriger als der für die billigsten Gelatine.

Der Rohstoff kann nach einem nachfolgend beschriebenen Verfahren der Auslaugung durch eiweißabbauende Enzyme behandelt werden: den ggf. gemahlenen und je nach ihrem Gehalt an Trockensubstanz mit Wasser angereicherten Rohstoffen wird ein Enzym zugesetzt, z. B. Pepsin, Trypsin, Papain, Fradiase (Protease der Streptomyces Fradiae), Pronase (Protease der Streptomyces Griseus) und Subtilisin, oder ein Gemisch von Enzymen oder stark enzymhaltigen Organen wie z. B. Bauchspeicheldrüse oder Magenschleimhäute, bevorzugt in gemahlener Form. Der pH-Wert wird eingeregelt und je nach den verwendeten Enzymen aufrechterhalten. Der Abbau kann bei Umgebungstemperatur vor sich gehen; es ist jedoch besser, das Reaktionsgemisch je nach Wärmebeständigkeit der Enzyme zu erhitzen, um das Verfahren zu beschleunigen und außerdem die Abscheidung der Fettstoffe zu erleichtern. Die Verwendung bakterienhemmender Mittel ist unnötig, wenn der pH-Wert der Reaktionsmasse sehr stark von der Neutralität abweicht (im Falle von Pepsin) oder wenn die Temperatur über ca. 50° C liegt (Fall bei Fradiase und Papain). Die Abscheidung der Fette ist einfacher, wenn die Masse in langsamer und/oder intermittierender Bewegung gehalten wird.

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Dieses Stadium ist vor allem dann interessant, wenn der Fettgehalt des Rohstoffs hoch ist, (was bei Schwarten der Fall sein kann, selbst wenn sie vorher entfettet wurden), und zwar im Hinblick auf die Rückgewinnung von Schmalz, die an sich schon das Verfahren rentabel macht. Der gewonnene proteinhaltige Absud ist fettfrei; es ist einfach, daraus die hydroxyprolinarmen, unlöslichen Bestandteile abzuscheiden, wie z. B. Haar, Nägel, Fremdkörper anderen als proteinischen Ursprungs, Haut etc. Der Proteinabsud hat dabei erst eine teilweise Hydrolyse erfahren, die in der Hydrolysxerungsphase des Herstellungsverfahrens nach dieser Erfindung ergänzt werden muß. Es gibt jedoch einige seltene Enzyme, wie die Pronase, mit denen man.die saure Hydrolyse des Verfahrens zur Herstellung von Hydroxyprolin nach der Erfindung umgehen kann.

Es ist anzumerken, daß im Sonderfall von entgerbten und schwefelenthaltenden Gerbereiabfällen, welche im sauren Medium - in der Hauptsache mit Pepsin - behandelt wurden, schwefliger Wasserstoff freigesetzt wird, den man mit geeigneten Mitteln wie Belüftung, Absorption durch Natron etc. abscheiden oder auffangen muß.

Nach einer weiteren Durchführungsart dieser Erfindung können die Rohstoffe einer sauren Vorbehandlung unterzogen werden, die vor allem dann von Interesse ist, wenn die Lagerung von Abfällen am Ort der Herstellung eine Belästigung darstellt; dies gilt vor allem für Gerbereibetriebe. Die Abfälle werden in einer möglichst geschlossenen Wanne mit sehr unterschiedlichen Wassermengen und einer starken Säure untermischt. Wasser ist nur dann erforderlich, wenn die mechanischen Hilfsmittel eine ausreichend gleichmäßige Vermengung von Abfällen und Säure nicht erlauben. Als Säure ist bevorzugt eine starke Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure zu verwenden, welche gebraucht wird, um den pH-Wert unter 5 und bevorzugt unter 3 zu senken sowie die Abfälle bakteriologisch zu stabilisieren. Man kann bis 50 Äquivalente Säure je kg Trockensubstanz - bevorzugt jedoch bis etwa 20 Äquivalente -

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verwenden. Sind die Abfälle schwefelhaltig, wird der freiwerdende Schwefelwasserstoff mit gseigneten Mitteln abgeschieden oder aufgefangen. Bei der sich daran anschließenden Hydrolyse kann die Menge der erforderlichen Säure in Abhängigkeit von der für diese Vorbehandlung verwendeten Menge gesenkt werden.

Zu der vorliegenden Erfindung gehört außerdem eine Vorbehandlung, die eine Kombination der vorher beschriebenen Phasen darstellt. Es kann z. B. von Interesse sein, die Abfälle am Ort ihrer Erzeugung anzusäuern, sie anschließend mit eiweißabbauenden Enzymen zu behandeln, z. B. mit Pepsin, und zwar entweder sofort nach der Ansäuerung der Abfälle oder als Anfangsphase beim Ablauf des Verfahrens zur Herstellung von Hydroxyprolin nach der Erfindung. Die Hydrolyse der ggf. vorbehandelten Rohstoffe kann mit einer beliebigen, starken Säure durchgeführt werden, z. B. mit Salzsäure oder Schwefelsäure. Es sind zahlreiche Verfahren bekannt. Man kann dabei die Säure ganz oder zum Teil nach einem bekannten Verfahren abscheiden, etwa durch Vakuumkonzentration (Salzsäure) und durch Ausfällen der Schwefelsäure mit Kalk. Diese Abscheidung ist nicht unbedingt erforderlich. Allerdings muß die Säurekonzentration entweder durch Abscheidung oder durch Verdünnen auf einen Wert unter 4 N - bevorzugt unter 2,5 N - gesenkt werden.

Nach der Erfindung wird zunächst eine Entfärbung mit Hilfe einer Aktivkohle oder bevorzugt durch Kontakt mit einem entfärbenden Harz bewirkt. Hierfür kann z. B. ein Duolit S 30 Harz oder Duolit ES 861 der Firma DIA-PROSIM, 107, rue Edith Cavell, 94 Vitry, verwendet werden. Das Entfärben braucht nicht unbedingt in dieser Phase geschehen, es hat jedoch den Vorteil, die übrigen, nachfolgenden Harze zu schützen und die Wirksamkeit der durch diese Harze bewirkten Reinigungsvorgänge zu verbessern. Außerdem ist es möglich, diese Entfärbungsphase während eines anderen Verfahrensstadiums, oder

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aber eine oder mehrere zusätzliche Entfärbungen durchzuführen.

Dabei leitet man das Hydrolysat über einen Anionenaustauscher mit schwacher Polarität, d. h. schwach basisch, der vorab in OH-Form gebracht wurde. Dieser Austauscher hält die für die Hydrolyse verwendete Säure bzw. das, was nach der Abscheidung davon übrig geblieben ist, vollständig zurück. Außerdem hält er mindestens zwei Drittel der Glutaminsäuren und Aspartsäuren - bevorzugt jedoch 9/10 - zurück.

Der schwach basische Austauscher kann z. B. ein Duolit A 366 Harz von DIA-PROSIM sein oder ein Amberlit IR 45 der Firma ROHM & HAAS. Es ist vorteilhaft, ihn auf zwei hintereinander geschaltete Säulen zu verteilen.

Der Hauptvorteil einer schwachen Polarität des Anionenaustauschers besteht darin, daß die Regenerierung weniger teuer ist als bei starker Polarität, wobei die Wirksamkeit der Behandlung jedoch vollkommen ausreicht.

Die Lösung wird dann über einen Kationenaustauscher geleitet, der unbedingt starke Polarität aufweisen muß. Es ist jedoch möglich, seine Regenerierung wirtschaftlicher zu gestalten, indem man ihn durch einen schwach sauren, unmittelbar davorgeschalteten Austauscher schützt. Der zuletztgenannte Austauscher fixiert die Kationen, die dann am schwersten zu verdrängen sind, wenn sie auf einem starken Austauscher fixiert sind. Man kann als Schutzmedium ein Amberlit IRC 50 Harz von ROHM & HAAS oder Duolit C 464 von DIA-PROSIM verwenden. Das Regenerierungsmedium wird während der Regenerierungsphase in entgegengesetzter Richtung über die zu behandelnde Lösung geleitet, d. h. am starken Austauscher beginnend.

Der Kationenaustauscher mit starker Polarität (stark sauer) ist bei Einsatz einer ausreichenden Menge in der Lage, sämtliche Aminoessigsäuren zurückzuhalten. Es kommt hier darauf an, die Menge an Austauscher so zu begrenzen, daß er gesättigt ist, be-

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vor er sämtliche aufgenommenen Aminoessigsäuren fixiert hat. Die richtige Menge hängt von der Leistung des Austauschers ab, die oftmals stark unterschiedlich ist, weiterhin von dem Kationengehalt des Hydrolysats und von dem Vorhandensein des vorgenannten Schutzaustausehers. Die Menge ist so zu berechnen, daß 75 - 95 % der aufgenommenen Aminoessigsäuren fixiert werden. Es sollen bevorzugt 75 - 85 % zurückgehalten werden im Falle eines sehr stark hydroxyprolinhaltigen Rohstoffs wie etwa eines Gelatinehydrolysats bzw. 85 - 95 % im Falle eines hydroxyprolinarmen Rohstoffs.

Als stark saurer Austauscher kann etwa ein Duolit C 25 D Harz der Firma DIA PROSIM oder ein Amberlit IR 120 Harz von ROHM & HAAS benutzt werden.

Die Kapazität dieser Harze liegt bei 2 Äquivalenten je Liter. Man braucht 2,5-6 Liter zur Behandlung von 1000 g Aminoessigsäuren. Eine zu große Menge stark sauren Harzes führt dazu, daß die Hydroxyprolin-Ausbeute gering oder gleich Null ist; zu wenig Harz führt dagegen zu einer zu geringen Anreicherung, so daß die Kristallisierung des gewonnenen Produkts kein ausreichend reines Produkt ergibt.

Es ist zu schwierig, zugleich eine gute Ausbeute und einen hohen Reinheitsgrad zu erreichen, wenn das Harz nur in einer einzigen Säule enthalten ist. Zwei gleichartige Säulen zeitigen gute Ergebnisse, obgleich es besser ist, wenn die erste Säule eine höhere Kapazität als die zweite Säule hat.

Der Kationenaustauscher wird in H⁺-FOiTn eingesetzt. Es wird kein Puffer oder Reaktionsmittel zum Auswaschen verwendet, die eine weitere Abscheidung erforderlich machen. Die Menge der dem Kationenaustauscher zugeleiteten Aminoessigsäuren muß sehr genau eingeregelt werden. Eine Änderung des Feuchtigkeitsgehalts im Rohstoff oder ein Lösungsverlust während einer voraufgehenden Phase können nämlich zu dem bereits erwähnten Nachteil

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eines Überschusses oder Mangels an Harz führen. Zur Beseitigung dieses Nachteils ist es möglich, etwa die zugeleitete Menge an Aminoessigsäuren zu kontrollieren. Im Falle eines Überschusses kann die überschüssige Menge abgeschieden bzw. bei einem Mangel kann Amino-Stickstoff auf einen konstanten Gehalt durch Zusatz von Ammoniak ergänzt werden.

Die Regenerierung der Austauscher bringt keine besonderen Schwierigkeiten mit sich. Im allgemeinen wird dazu Natron oder Ammoniak mit 1 bis 4 N für den basischen Austauscher verwendet, Salzsäure oder Schwefelsäure von 1,5 - 4 N mit eventuell voraufgehender Auswaschung durch Ammoniak für den oder die sauren Austauscher und schließlich Natron oder Ammoniak von 0,3 bis 3 N mit eventuell anschließenden 0,2-2 Mol/l Salzsäure für das adsorbierende Harz.

Die Lösung, die nach dem Durchleiten über stark saures Harz gewonnen wird, hat eine strohgelbe Farbe, einen pH-Wert zwischen 3»8 und 5 - bevorzugt 3,9 - 4,5 - und enthält, vor allem in Abhängigkeit von der Verdünnung des Hydrolysats, 5 40 g/l Hydroxyprolin, bevorzugt jedoch 20 - 35 g/l.

Wurden die voraufgegangenen Arbeitsgänge richtig durchgeführt und wurde vor allem die Menge Aminoessigsäure richtig berechnet, die je Liter Austauscher zu behandeln ist, so enthält das Auswaschungsprodukt auf 100 g Aminoessigsäuren 30 - 60 g Hydroxyprolin, bevorzugt jedoch 35 - 50 g.

Vor der Kristallisierungsphase ist eine Konzentration und im allgemeinen eine Entfärbung notwendig, wobei es auf die Reihenfolge dieser beiden Arbeitsgänge nicht ankommt. Es ist möglich, eine Vorkonzentration durchzuführen, der eine Entfärbung und eine endgültige Konzentration folgen. Man konzentriert bis zum Erreichen einer schwach gelb gefärbten Lösung, welche ungefähr 180 - 350 g/l Hydroxyprolin, bevorzugt jedoch 230 - 270 g/l_; enthält.

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Falls nötig, wird das Konzentrat mit einer geringen Menge Essigsäure oder Ameisensäure soweit angesäuert, daß man einen pH-Wert von 3,8 - 4,6, bevorzugt jedoch zwischen 4 und 4,3 erhält. Diese Ansäuerung ist nicht immer erforderlich.

Die Kristallisierung wird durch Zusatz eines Alkohols, etwa von Äthyl- oder Methyl-Alkohol, bewirkt. Man kann auch ein Gemisch insbesondere aus den beiden vorgenannten Alkoholen verwenden. Auf eine Volumeneinheit Konzentrat werden 1-4 Volumeneinheiten Alkohol, bevorzugt jedoch 2-3 Volumeneinheiten, gebraucht .

Die Suspension von Kristallen wird bevorzugt nach 12-48 Stunden Verweildauer in einem kalten Raum - zwischen 0 und - filtriert. Die Kristalle werden mit einem flüchtigen, sich mit Wasser mischenden Lösungsmittel - etwa mit einem der vorgenannten Alkohole oder deren Gemisch - gereinigt. Danach werden sie entweder im Vakuum oder in einem belüfteten Wärmeschrank zwischen 40 und 110° C geschleudert und getrocknet.

Die Trocknung braucht nicht sehr gründlich zu sein, da im allgemeinen eine Umkristallisierung erforderlich ist. Sie wird genau wie die erste Kristallisierung durchgeführt, und zwar nach Lösung der Kristalle in Wasser auf eine Konzentration von 180 - 400 g/l Hydroxyprolin, bevorzugt jedoch zwischen 250 - 350 g/l. Vor dem Zusetzen des Alkohols ist eine Entfärbung, etwa mit Aktivkohle, im allgemeinen nützlich.

Dieses Verfahren erlaubt außer der Gewinnung von Hydroxyprolin auch die Rückgewinnung interessanter Unterprodukte, und zwar sowohl aus der Kristallisierungsmutterlauge als auch aus dem Auswaschungsprodukt der Austauscher. Ein mineralsalzfreies und glutaminsäure-, aspartsäure- und hydroxyprolinarmes Kollagen-Hydrolysat wird durch Auswaschen des stark sauren Austauschers mit Ammoniak in 0,5 N - 3 N und durch Vakuumkonzentration des Auswaschungsprodukts gewonnen. Es kann fraktioniert oder im ursprünglichen Zustand verwendet werden. ,

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Folgende Beispiele werden zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung angeführt.

BEISPIEL 1

In ein mit Rührwerk versehenes Autoklav werden 250 Liter Wasser, 250 kg technische Schwefelsäure und 250 kg Hautleim gegeben. Man erhitzt soweit, daß ein Druck von 1 bar während acht Stunden im Innern des Autoklavs aufrechterhalten bleibt. Am folgenden Tag werden 550 Liter schwarzer Flüssigkeit abgezogen, die man auf 1800 Liter verdünnt und der 20 kg Diatomit zugesetzt werden. Danach wird gefiltert.

Das Filtrat wird anschließend über 4 in Reihe montierte Säulen geleitet, die in der richtigen Reihenfolge 500 Liter Duolit S 30, 1100 Liter Duolit A 366, noch einmal 1100 Liter Duolit A 366 und 820 liter Amberlit IR 120 enthalten. Sobald das gesamte Filtrat aufgegeben ist, wird Wasser eingetrieben bis zum Abgang der Aminosäuren. Man erhält etwa 1000 Liter Lösung, welche 85 kg Trockensubstanz enthält, auf die 23 kg Hydroxyprolin entfallen. Die Lösung wird dann über eine 270 Liter Amberlit IR 120 enthaltende Säule geleitet und mit Wasser durchgetrieben. Man erhält 570 Liter mit einem Hydroxyprolingehalt to η 12,5 kg sowie 28 kg Trockensubstanz.

Diese Lösung wird vakuumkonzentriert bis auf ein Volumen von 45 Liter, dann bei 80° C mit 500 g Acticarbone 2S entfärbt und gefiltert. Nach dem Waschen des schwarzen Kuchens erhält man 48 Liter Lösung.

Man kristallisiert durch Zusatz von 120 Litern Methanol; danach folgen einige Stunden Absetzzeit und das Verweilen in einem kühlen Raum zum übernächsten Tag.

Man filtert im Vakuum, wäscht die Kristalle mit etwa 20 Liter Methanol, schleudert gründlich und trocknet. Dies ergibt 8,8 kg

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Produkt, welches 5 - 10 % Prolin, 3 - 5 % Glycin und 0,5 1 % Alanin enthält. Das Produkt wird in 22 Liter Wasser gelöst; es werden 350 g Acticarbone und 30 ml Ameisensäure zugegeben, um auf einen pH-Wert von 4,2 zu kommen. Dann wird auf 70° erhitzt und gefiltert. Nach dem Waschen des schwarzen Produkts erhält man 30 Liter Lösung, die durch Zusatz von 75 Liter Methanol kristallisiert wird. Die Kristalle werden mit Methanol gereinigt und getrocknet. Man gewinnt 6,5 kg Hydroxyprolin.

BEISPIEL 2

Es wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 verfahren, wobei die Säule mit 270 Litern Amberlit IR 120 allerdings wegfällt. Die Lösungen werden durch 3 aufeinanderfolgende Arbeitsgänge abgeteilt und dann gemeinsam über die Säule mit 820 Litern geleitet.

BEISPIEL 3

Es wird wie in Beispiel 1 verfahren,wobei die Lösung allerdings direkt von der ersten zur zweiten Säule mit IR 120 geleitet wird ohne vorheriges Auffangen oder Dosieren.

BEISPIEL 4

Es wird wie in Beispiel 1 verfahren; nach dem Auffangen der nicht auf den Säulen mit IR 120 Harz fixierten Aminoessigsäuren werden allerdings die durch Ammoniak 2 N fixierten Aminoessigsäuren auswaschen: und zwar 1200 Liter für die erste Säule und 400 Liter für die zweite. Die Auswaschungsprodukte werden nach Fraktionen aufgefangen und dann das Verhältnis der Konzentrationen Hydroxyprolin/gesamte Aminoessigsäuren bestimmt .

Die ergiebigsten Fraktionen können kristallisiert werden unter der Voraussetzung, daß ihr Gemisch mehr als 38 - 40 % Hydroxyprolin enthält.

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Die übrigen Fraktionen werden entweder mit der nächsten Charge wieder auf die Säule mit 270 Litern Amberlit IR 120 zurückgeleitet (mehr als 20 % Hydroxyprolingehalt) oder mit einem Hydrolysesud (Gehalt 10 - 20 %) gemischt oder aber zur Herstellung von Unterprodukten (Gehalt unter 10 %) verwendet.

Mit diesem Verfahren wird eine um etwa 20 % verbesserte Ausbeute erzielt.

BEISPIEL 5

Identisch mit einem beliebigen der vorhergehenden Beispiele, wobei jedoch die Kristallisierungsmutterlaugen nach Destillation des Alkohols wiederverwendet werden. Die Mutterlaugen der ersten Kristallisierung werden dem nachfolgenden Hydrolyseabsud zugesetzt. Die Mutterlaugen der Umkristallisierung werden der zu kristallisierenden Lösung des nachfolgenden Arbeitsgangs zugesetzt.

BEISPIEL 6

2 Identisch mit einem beliebigen der Beispiele 1 bis 5, wobei die

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allerdings Kristallisierungsmutterlaugen über ein IR 120 Harz geleitet werden, und zwar im Verhältnis 150 g Aminoessigsäuren je Liter Harz. Beim Austritt aus der Säule erhält man ein von Aminoessigsäuren freies Wasser-Alkohol-Gemisch, das sich leicht destillieren läßt. Die Aminoessigsäuren werden duxb Ammoniak 2 N ausgewaschen und die gewonnenen Fraktionen dann je nach ihrem Reinheitsgrad wie in Beispiel 4 verwendet.

BEISPIEL 7

Die Hydrolyse wird wie in Beispiel 1 durchgeführt. Von den 550 Litern Hydrolyseabsud entnimmt man 290 Liter und neutralisiert sie mit Kalkmilch, um auf einen pH-Wert von 7,3 zu kommen.

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Der Kalziumsulfatkuchen wird gefiltert und mit Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser werden mit dem Rest des nicht neutralisierten Hydrolyseabsuds gemischt. Man erhält somit 750 Liter, welche 1400 Säure-Äquivalente enthalten.

Am folgenden Tag werden 20 kg Diatomit zugesetzt; man filtert und leitet die Flüssigkeit nacheinander über 300 Liter Duolit S 30 Harz, 1000 Liter Duolit A 366, welches auf zwei Säulen zu je 500 Litern verteilt ist, wie über 1350 Liter Amberlit IR 120 Harz in zwei Säulen (900 + 450 Liter).

Man erhält 400 Liter, welche 9,5 kg Hydroxyprolin enthalten, kristallisiert und kristallisiert sie um wie in den vorgenannten Beispielen und gewinnt 4,5 kg Hydroxyproline

Die Säule mit 450 Liter wird durch 60 Liter Ammoniak 2 N (geringfügige Auswaschung) ausgewaschen, um 380 Liter Auswaschungsprodukt zu erhalten, das 6 kg Hydroxyprolin und 19 kg sonstige Aminoessigsäuren enhält. Dieses Auswaschungsprodukt wird nach den Kristallisierungsmutterlaugen über eine Säule mit 200 Liter IR 120 geleitet. Durch Auswaschen mit 100 Litern Ammoniak 2 N erhält man 110 Liter Lösung, welche 6 kg Hydroxyprolin auf 9 kg sonstiger Aminoessigsäuren enthält. Zur Gewinnung von 2,3 kg Hydroxyprolin sind 3 Kristallisierungen erforderlich.

BEISPIEL 8

Identisch mit Beispiel 1; die Säule mit adsorbierendem Harz S 30 ist hierbei allerdings zwischen den Säulen mit A 366 angeordnet.

BEISPIEL 9

Identisch mit Beispiel 1; die Säule mit Amberlit IR 120 enthält hierbei jedoch nur 600 Liter Harz anstelle von 820 Litern.

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Außerdem ist dieser Säule eine Säule mit 200 Litern Duolit C 464 vorgeschaltet.

BEISPIEL 10

In eine 500 Liter fassende Wanne wird 100 kg nicht gemahlene Schwarte, 1 kg pulverisiertes Papain und 2 Liter Essigsäure in eine Lösung mit 25 Liter Wasser gegeben. Man erhitzt auf 60° C. Die Schwarten sinken allmählich ein, während der Flüssigkeitsspiegel mit fortschreitendem Einsaaten steigt. Nach ein bis zwei Stunden läßt sich die Reaktionsmasse leicht umrühren; das Umrühren wird in regelmäßigen Abständen fortgesetzt. Am nächsten Tag wird das obenaufschwimmende Schmalz (14 kg) sowie 90 Liter wässrige Lösung mit 30 % Trockenextrakt und geringfügigen,suspendierten Feststoffen abgezogen.

Dieser Lösung werden 27 kg Schwefelsäure zugesetzt; das Reaktionsgemisch wird in einem Autoklav (identisch mit dem in Beispiel 1) erhitzt. Auf diese Weise erhält man 100 Liter eines schwarzen Suds, der auf 200 Liter verdünnt wird.

Danach behandelt man diese Lösung wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei die Mengen an eingesetztem Harz und Reaktionsmitteln im Verhältnis 1 : 9 reduziert werden.

BEISPIEL 11

In eine 500 Liter fassende Wanne werden 200 kg verschiedene Gerbereiabfälle, 100 Liter warmes Wasser und 200 g Schwefelsäure gegeben; man rührt langsam um, fügt 100 g Pepsin und eine ausreichende Menge Schwefelsäure hinzu, um den pH-Wert auf 1-1,5 zu bringen. Die Temperatur wird bis zum folgenden Tag zwischen 35 und 40° C sowie der pH-Wert zwischen 1 und 1,8 gehalten. Nach etwa 24stündiger Behandlung wird das Umrühren eingestellt. Man läßt dekantieren und gewinnt separat:

- 25 kg an der Oberfläche agglomeriertes und geronnenes

Fett, das separiert wird und

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230 Liter Lösung, welche 21 % Trockenextrakt sowie verschiedene unlösliche Bestandteile enthält und aus der Hydroxyprolin nach dem vorher beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann.

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Claims (19)

1. 2B20834

   PATENTANSPRÜCHE

   \ 1.,. Verfahren zur Herstellung von 4-hydroxy L-prolin, dadurch gekennzeichnet, daß ein Rohstoff mit darin enthaltenem, eventuell vorbehandeltem Kollagen hydrolisiert wird, danach das gewonnene Protein-Hydrolysat entfärbt und die Lösung auf einen schwach basischen Austauscher geleitet wird,um die Glutaminsäuren, Aspartsäuren und mineralischen Anionen zurückzuhalten. Danach wird die aus dem ersten Austauscher austretende Lösung auf einen stark sauren Austauscher geleitet, der in vorausberechneter Menge bereitgestellt wird, so daß er 75 - 95 % der in der Lösung vorhandenen Aminoessigsäuren zurückhält. Die Lösung wird aufgefangen, indem man Wasser über den Austauscher leitete Danach wird die Lösung auf 180 - 350 g/l Hydroxyprolin, bevorzugt jedoch auf 230 - 280 g/l konzentriert, entfärbt und nach Ansäuerung auf 3,8 - 4,6 pH kristallisiert, um das reine Hydroxyprolin in Kristallform zu gewinnen.
2. 2. Verfahren zur Herstellung von Hydroxyprolin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rohstoff aus entgerbten Lederabfällen, aus eventuell entfetteten, enthaarten und entkalkten Häuten und Schwarten sowie aus Knochenabsud besteht.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ungegerbten und eventuell entkalkten Abfälle durch Extraktion mit warmem Wasser entfettet werden.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die gegerbten Abfälle kalt oder bei einer Temperatur von unter 100° C entgerbt werden.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ungegerbten Abfälle einer Vorbehandlung mit einem oder mehreren eiweißabbauenden Enzymen oder mit an eiweißab-

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   bauenden Enzymen reichen Organen unterzogen werden und das abgeschiedene Fett eventuell aufgefangen wird,
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den eiweißabbauenden Enzymen um Pepsin, Trypsin, Papain, Fradiase (Protease von Streptomyces Fradiae), Pronase (Protease von Streptomyces Griseus) und um Subtilisin handelt.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ungegerbten Abfälle einer Vorbehandlung mit starker Säure unterzogen werden.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der starken Säure um Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure handelt,
9. 9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der KnochenaDSUd durch längeres Aufkochen in Wasser oder durch Wasserdampfinjektion in ein Autoklav und durch nachfolgende Abscheidung einer daraus erhaltenen wässrigen Phase mit Hilfe von Dekantation gewonnen wird.
10. 10. Herstellungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrolysat über einem entfärbenden Harz oder über Aktivkohle entfärbt wird.
11. 11. Herstellungsverfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem entfärbenden Harz um ein Duolit S 30 oder ES 861 Harz handelt.
12. 12. Herstellungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem schwach basischen Austauscher um ein Duolit A 366 oder Amberlit IR 45 Harz handelt.
13. 13. Herstellungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem stark sauren Austauscher um ein Duolit C 25 D oder Amberlit IR 120 Harz handelt, welches in einer

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    Menge von 2,5-6 Liter je kg Aminoessigsauren eingesetzt wird.
14. 14. Herstellungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem stark sauren Austauscher ein schwach saurer Austauscher angeordnet wird.
15. 15. Herstellungsverfären nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem schwach sauren Harz um Amberlit IR C 50 oder Duolit C 464 Harz handelt.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfärbungsphase bzw. Entfärbungsphasen in jedem Stadium vor der endgültigen Kristallisierung durchgeführt werden können.
17. 17. Herstellungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch Zusatz von ein bis vier Volumeneinheiten Alkohol, bevorzugt jedoch von zwei bis drei Volumeneinheiten, je Volumeneinheit der Lösung kristallisiert wird»
18. 18. Verfahren nach Anspruch 17» dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Alkohol um Methyl- oder Äthyl-Alkohol oder um ein Gemisch daraus handelt.
19. 19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminoessigsäuren, außer Hydroxyprolin, welche auf dem sauren Austauscher fixiert sind, durch Auswaschen mit Ammoniak gewonnen werden.

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