DE1238480B - Verfahren zur Trennung und Reinigung von beta-Oxyaminosaeuren - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C07C /ld I

Deutsche Kl.: 12 q-6/01

Nummer: 1 238 480

Aktenzeichen: K 48303IV b/12 q

Anmeldetag: 26. November 1962

Auslegetag: 13. April 1967

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung und Reinigung von /3-Oxyaminosäuren, die aus einem synthetischen oder einem durch Hydrolyse von Naturprodukten gewonnenen Gemisch von Aminosäuren oder aus einer sie enthaltenden Fermentationsflüssigkeit stammen.

Unter den ß-Oxyaminosäuren sind Threonin und Serin die bekanntesten. Insbesondere ist es bekannt, daß Threonin für Pharmazeutika und Nährmittel als gewerblich wertvoll geschätzt wird.

Die vorliegende Erfindung schlägt ein neues Verfahren zur Trennung und Reinigung von /?-Oxyaminosäuren in der Weise vor, daß man ein /?-Oxyaminosäuren enthaltendes Aminosäuregemisch in wäßriger Lösung durch Zusatz von basischem Kupfercarbonat in ein Kupferkomplexsalzgemisch von Aminosäuren überführt, das Kupferkomplexsalz der /3-Oxyaminosäure unter Ausnutzung des Unterschiedes in der selektischen Adsorption zwischen den verschiedenen Komplexsalzen von einem stark basischen Ionenaustauscherharz adsorbieren läßt, das adsorbierte Komplexsalz durch eine Mineralsäure, wie Salzsäure, frei macht, Kupfer aus der Komplexsalzlösung durch Behandeln mit Schwefelwasserstoff oder einem Chelatharz entfernt und die /J-Oxyaminosäure aus der entkupierten ß-Oxyaminosäurelösung in Kristallform gewinnt.

Die vorliegende Erfindung wird an dem Fall konkret beschrieben, wo als Ausgangsmaterial eine Fermentationsbrühe verwendet wird.

Es wurde bereits eine Methode zur Herstellung von L-Threonin, einer /J-Oxyaminosäure, durch ein Fermentationsverfahren (deutsche Patentanmeldung K 43835 IVa/6b; vgl. deutsche Auslegeschrift 1 232 914) vorgeschlagen. In der nach diesem Verfahren erhaltenen Fermentationsbrühe kann zuweilen auch L-Homoserin zusammen mit Nebenprodukten, wie L-Valin, L-Alanin, enthalten sein. Für die gewerbliche Herstellung von hochreinem L-Threonin aus der obengenannten Fermentationsflüssigkeit ist die Abtrennung von L-Threonin von den anderen daneben anfallenden neutralen Aminosäuren erforderlich.

Verfahren zur Trennung und Reinigung von
/?-Oxy aminosäuren

Anmelder:

Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd., Tokio

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke und Dipl.-Ing. H. Agular,

Patentanwälte, München 27, Pienzenauer Str. 2

Als Erfinder benannt:
Hirotoshi Samejima,
Yuji Nagano, Tokio

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 16. Juni 1962 (24 456)

Bisher ist eine Methode unter Verwendung eines Oxazolidonderivates (D. F. Elliot, Biochemical Journal, 45, S. 429 [1949]) zur Abtrennung von /3-Oxyaminosäuren aus Aminosäuregemischen und Reinigung bekanntgewesen. Diese Methode hat jedoch vom gewerblichen Gesichtspunkt aus wegen der besonderen Reaktionsstoffe und umständlichen Arbeitsweisen geringen Wert.

Hinsichtlich der Trennung der neutralen Aminosäuren voneinander wurden nun die adsorbierenden Fähigkeiten verschiedener Kupferkomplexsalze von Aminosäuren mit verschiedenen Ionenaustauscherharzen im einzelnen verglichen und geprüft, und es wurde schließlich gefunden, daß Kupferkomplexsalze der Oxyaminosäuren von stark basischen Ionenaustauscherharzen (OH-Typ) im pH-Bereich von 7 bis 10 selektiv adsorbiert werden. Es wurde weiter festgestellt, daß auch ein eindeutiger Unterschied zwischen der Adsorptionskraft eines Kupferkomplexsalzes von L-Threonin, einer ß-Oxyaminosäure, und der eines Kupferkomplexsalzes von L-Homoserin, einer y-Oxyaminosäure, vorhanden ist.

Der Unterschied der Adsorptionsstärken wird aus den folgenden Formelgleichungen erkenntlich.

2·Η,Ν —CH

Cu++

COOH

NH₂, NH₂

/^Cu\

X-O O—C

Kupferkomplexsalz einer von OH-Gruppen freien Aminosäure

709 549/417

HO-CH
H₂N-CH

COOH

Cu++

OH

R—CH-ch; NH

² \

NH₉

/^Cu\
C-O 0—C'

OH
CH-CH-R

Hooc— / NH₂.
H

Xu'

/NH_2x
H

O—C

CH-COOH

R R

Kupferkomplexsalz einer /3-Oxyaminosäure

Wie aus den oben beschriebenen Formelgleichungen ersichtlich ist, wird das Kupferion im allgemeinen an eine Aminosäure zwischen dem Aminorest und dem Carboxylrest unter Bildung des Kupferkomplexsalzes gebunden, welches vom stark basischen Ionenaustauscherharz wegen des Fehlens einer Elektronenladung nicht adsorbiert wird, während das Kupferion bei einer Oxyaminosäure an die Säure zwischen dem Aminorest und dem Hydroxylrest gebunden wird. Auf diese Weise besitzt das Komplexsalz Carboxylreste in freiem Zustand, wodurch es möglich wird, daß das Salz von einem stark basischen Ionenaustauscherharz als saure Substanz adsorbiert wird. Demgemäß kann das Kupferkomplexsalz einer Oxyaminosäure von den Kupferkomplexsalzen anderer Aminosäuren in der Weise getrennt werden, daß man das Aminosäuregemisch in die Kupferkomplexsalze umwandelt und die Salzlösung durch eine Kolonne mit einem stark basischen Ionenaustauscherharz führt, wobei selektiv das Salz der Oxyaminosäure adsorbiert wird. Unter den verschiedenen Oxyaminosäuren wird das Kupferkomplexsalz einer /?-Oxyaminosäure von dem stark basischen Ionenaustauscherharz stärker adsorbiert als das einer y-Oxyaminosäure, so daß auch sie voneinander getrennt werden können.

Bei der Durchführung der Trennung der Kupferkomplexsalze von Aminosäuren unter Verwendung eines stark basischen Ionenaustauscherharzes ist es erwünscht, zunächst die Entfernung von anorganischen Salzen zu bewirken, da die Gegenwart einer beträchtlichen Menge der Salze die Abtrennfähigkeit nachteilig beeinflußt.

So wird schließlich die ß-Oxyaminosäure allein abgetrennt und demzufolge aus der obenerwähnten Fermentationsflüssigkeit nur L-Threonin abgetrennt und gewonnen.

Wenn das Kupferkomplexsalz der /?-Oxyaminosäure von einem Ionenaustauscherharz adsorbiert wird, zeigt der adsorbierte Streifen in der Kolonne eine tiefblaue Färbung, deren Fortschreiten mit bloßem Auge beobachtet werden kann.

Das von dem Harz adsorbierte Kupferkomplexsalz der ß-Oxyaminosäure kann mit einer verdünnten Mineralsäure, wie verdünnter Salz- und Schwefelsäure, leicht eluiert werden. Das Stadium der Elution kann leicht durch die Fortbewegung und das Verschwinden des gefärbten Streifens beurteilt werden.

Zur Entfernung des Kupfers aus dem eluierten Kupferkomplexsalz der /?-Oxyaminosäure wird das Eluat mit Schwefelwasserstoff unter saurer Bedingung behandelt oder mit einem Chelatharz (beispielsweise Dowex A-I, Warenzeichen der Dow Chemical Co., Ltd.) unter neutraler Bedingung behandelt, wodurch die /i-Oxyaminosäure ohne Verlust an Ausbeute vollständig entkupfert wird, wobei anschließend durch Umkristallisieren hochreine ß-Oxyaminosäurekristalle erhalten werden.

Das Verfahren der Erfindung ist vom gewerblichen Standpunkt aus ungewöhnlich vorteilhaft.

Beispiel 1

400 ecm einer 1,6 g L-Threonin und 1,6 g L-Homoserin enthaltenden wäßrigen Lösung werden mit 4 g basischen Kupfercarbonat versetzt und 15 Minuten lang gekocht. Nach dem Abkühlen wird das Gemisch zur Entfernung des überschüssigen Kupfercarbonats von der tiefblauen Lösung des Kupferkomplexsalzes der Aminosäuren abfiltriert. Drei Glasröhrchen (0,8 cm Durchmesser), welche jede mit 10 ecm eines stark basischen Ionenaustauscherharzes (Diaion SA 21A, Warenzeichen der Mitsubishi Chemical Ind. Co.) gefüllt sind, das in den OH-Typ verwandelt worden ist, sind in Reihen geschaltet. Die obengenannten 400 ecm der wäßrigen Lösung werden durch die Kolonnen geführt, wobei das L-Homoserin-Kupferkomplexsalz ausfließt, während das gesamte L-Threonin-Kupferkomplexsalz von dem Kolonnenharz adsorbiert wird. Das Harz wird mit 0,In-SaIzsäure eluiert, wodurch fast das gesamte L-Threonin-Kupferkomplexsalz in dem Eluat mit dem pH 6 bis 7 erscheint. Dann wird das Eluat durch eine Glasrohre (1 cm Durchmesser), welche mit 20 ecm eines Chelatharzes (Dowex A-I, Warenzeichen der Dow Chemical Co.) gefüllt ist, das auf den Natriumtyp abgestellt ist, mit einer Raumgeschwindigkeit von 1 geführt. Das Chelatharz wird mit 600 ecm Wasser gewaschen. 180 ecm der entkupferten L-Threoninfraktion werden im Vakuum auf 10 ecm konzentriert, welche dann mit der gleichen Menge Äthylalkohol gemischt werden. Das Gemisch wird bei 5° C über Nacht stehengelassen, wodurch L-Threoninkristalle abgeschieden werden, welche nach dem Filtrieren und Trocknen 850 mg wiegen. Weitere Konzentrierung der Mutterlauge im Vakuum gibt 230 mg Kri-

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stalle. Das Produkt wurde durch Papierchromatographie als L-Threonin identifiziert.

Beispiel 2

3 1 einer L-Threonin-Fermentationsbrühe, erhalten nach der Methode der deutschen Patentanmeldung K43835 8Va/6b; deutsche Auslegeschrift 1 232 914, welche 15 g L-Threonin, 10 g L-Homoserin, 6 g L-Alanin, 6 g L-Valin und eine kleine Menge anderer Aminosäuren enthält, werden in drei gleiche Teile geteilt, von denen jeder eine Harzkolonne passiert, welche mit 500 ecm eines stark sauren Ionenaustauscherharzes vom Η-Typ (Diaion SK 1, Warenzeichen der Mitsubishi Chemical Industries Co.) zur Adsorption aller Aminosäuren gefüllt ist. Jede Harzkolonne wird mit Wasser gewaschen und dann mit lnormalem wäßrigem Ammoniak unter Auffangen einer Fraktion (pH 6 bis 9), welche den größeren Teil der Aminosäuren enthält, eluiert. Dieses Eluat ist nicht wesentlich durch Protein, Elektrolyt und anorganische Salze verunreinigt, die in der Fermentationsbrühe vorhanden sind. 80 ecm der Lösung werden mit 20 g basischem Kupfercarbonat versetzt und 15 Minuten lang gekocht zur Überführung der Aminosäuren in Kupferkomplexsalze. Nach dem Abkühlen wird überschüssiges basisches Kupfercarbonat abfiltriert. Die blaue Salzlösung wird durch vier in Reihe geschaltete Ionenaustauscherharzkolonnen geführt, von denen jede mit 100 ecm eines stark basischen Ionenaustauscherharzes (Amberlite IRA-410, Warenzeichen von Rohm & Haas Co.) vom OH-Typ gefüllt ist. Die Kupferkomplexsalze von Valin, Alanin und anderen neutralen Aminosäuren fließen als solche hindurch. Das L-Homoserin-Kupferkomplexsalz wird zunächst von dem Kolonnenharz adsorbiert, doch allmählich durch das L-Threonin-Kupferkomplexsalz verdrängt und fließt ab. Das nur das L-Threonin adsorbierende Kolonnenharz wird in der Endstufe mit Ο,ΐη-Salzsäure unter Gewinnung von 1,2 1 einer Threonin-Kupferkomplexsalzlösung eluiert, welche 13 g L-Threonin enthält. Die Lösung wird mit 80 ecm 2n-Salzsäure angesäuert und Schwefelwasserstoff zur Abscheidung des Kupfers als Kupfersulfid hindurchgeleitet, welches dann unter Zurücklassen einer wäßrigen L-Threoninlösung abfiltriert wird. Die Lösung wird durch Behandeln mit einem schwach basischen Ionenaustauscherharz (Amberlite IR-45 Warenzeichen) vom OH-Typ entsäuert, im Vakuum auf 100 ecm konzentriert, mit dem gleichen Volumen Äthylalkohol gemischt und bei 5° C über Nacht stehengelassen. Es werden 8 g (trocken) L-Threoninkristalle erhalten. Die Konzentrierung der Mutterlauge mit anschließend gleicher Arbeitsweise gibt weitere 2,5 g Kristalle. Die Analyse des Produktes durch Papierchromatographie zeigt, daß es sich ausschließlich um L-Threonin handelt.

Beispiel 3

Die Arbeitsweise wird wie im Beispiel 1 wiederholt, jedoch unter Verwendung von 400 ecm einer wäßrigen Lösung, welche 1,4 g L-Serin und 1,4 g DL-Alanin an Stelle des Materials im Beispiel 1 enthält. L-Serinkristalle werden in einer Ausbeute von 1,02 g gewonnen. Die Analyse auf Grund der Papierchromatographie zeigt, daß das Produkt nur aus L-Serin besteht.

Claims (7)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Trennung und Reinigung von /3-Oxyaminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein /5-Oxyaminosäure enthaltendes Aminosäuregemisch in die Kupferkomplexsalze überführt, eine wäßrige Lösung der Kupferkomplexsalze mit einem stark basischen Ionenaustauscherharz vom OH-Typ im pH-Bereich von 7 bis 10 in Berührung bringt, wobei selektiv das ß-Oxyaminosäure-Kupferkomplexsalz adsorbiert wird, das Harz mit einer verdünnten Mineralsäurelösung eluiert, das Kupfer aus dem Eluat durch Behandlung mit einem Entkupferungsmittel entfernt und yß-Oxyaminosäure aus dem entkupferten Eluat in kristalliner Form gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aminosäuregemisch eine Fermentationsbrühe verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminosäuregemisch natürlichen Ursprungs verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminosäuregemisch verwendet, das durch Hydrolyse einer natürlichen Substanz erhalten wurde.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Aminosäuregemisch verwendet, das durch ein synthetisches Verfahren erhalten wurde.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Entkupferungsmittel Schwefelwasserstoff verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Entkupferungsmittel ein Chelatharz verwendet.