DE2618386A1

DE2618386A1 - Verfahren zum nachweis biologischer teilchen

Info

Publication number: DE2618386A1
Application number: DE19762618386
Authority: DE
Inventors: Ivar Giaever
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1975-05-01
Filing date: 1976-04-27
Publication date: 1976-11-11
Also published as: JPS6018941B2; FR2309868A1; DE2618386C2; US4041146A; FR2309868B1; JPS51133415A; GB1533787A

Description

Verfahren zum Nachweis biologischer Teilchen

Die Erfindung bezieht sich auf ein medizinisch-diagnostisches Verfahren zum Nachweisen immunologischer sowie anderer spezifischer Reaktionen an der Oberfläche eines festen,nicht-reaktiven Substrates sowie die dafür benutzte Vorrichtung. Im besonderen werden bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.erste reaktive Teilchen an dem Substrat angeheftet und nachdem eine Gelegenheit gegeben wurde für eine spezifische Reaktion der ersten Teilchen mit zweiten Teilchen, sollten die letzteren, wenn sie vorhanden waren, nun auf dem Substrat vorkommen und es wird im folgenden eine Markierung vorgenommen. Dieser Markierung folgt eine Spaltung, um die markierten zweiten Teilchen, falls solche vorhanden, von den ersten Teilchen abzuspalten. Das benutzte Spaltmittel wird dabei mit einem Instrument zur Markierungsanzeige untersucht. Das Substrat kann mit dem Instrument zur Markierungsanzeige auch vor und nach dem Abspalten untersucht werden, um

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das anfängliche Vorhandensein und dann das Verschwinden oder zumindest eine wesentliche Verringerung der Markierungen festzustellen.

Der Begriff "biologisches Teilchen", wie er im Rahmen der vorliegenden Anmeldung benutzt wird, soll kleinere Proteine umfassen, wie Plasmaproteine, Antigene, Antikörper, Lactine, sowie Körper aus proteinartigem Material, wie Viren, Bakterien, Zellen, die eine Antikörper-Produktion anregen können, wenn sie in ein Tier injiziert werden und/oder die die Eigenschaft haben, spezifisch entweder immunologisch oder nicht-immunologisch in Wechselwirkung zu treten.

Der Begriff "Markierung", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf ein identifizierendes Molekül oder eine Gruppe von Atomen mit einer Ausstrahlung, die

a) chemisch in eine Einheit eingebaut werden können, die für sich selbst schwierig oder derzeit unmöglich in großer Verdünnung nachzuweisen ist und

b) wegen der von ihr ausgehenden Ausstrahlungen mit Hilfe der geeigneten Instrumente in sehr geringen Mengen nachgewiesen werden kann.

Die Erkennung der Markierung, z.B. eines radioaktiven Isotops oder einer fluoreszierenden Gruppe, identifiziert automatisch die Anwesenheit der Einheit, in die die Markierung eingebaut worden ist.

Immunologische Reaktionen sind hoch spezifische biophysikalische Reaktionen, in denen ein erstes immunologisch reaktives biologisches Teilchen, das als Antigen bekannt ist, sich mit einem zweiten reaktiven biologischen-Teilchen, das spezifisch gegenüber dem Antigen ist, verbindet und das als Antikörper bekannt ist, wobei sich ein immunologisch komplexiertes Protein bildet. Immunologische Reaktionen, die in einem biologischen System, wie einem Tier oder einem Menschen stattfinden, sind zur Bekämpfung von Krankheiten lebenswichtig. In einem biologischen System verursacht der Eintritt eines Fremdproteins_a d.h. des Antigens, die Erzeugung von

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Antikörperproteinen in dem biologischen System, die spezifisch gegenüber dem Antigen sind, wobei der Produktionsprozeß für diese Antikörperproteine derzeit noch nicht voll verstanden ist. Einige der bedeutendsten Antikörper, die in diagnostischen Reaktionen eingesetzt werden, stehen jedoch nicht in Beziehung zu dem Eintritt eines bekannten Fremdmoleküls in ein biologisches System. Einige Antikörper, wie Anti-A und Anti-B, die bei der Blutgruppenbestimmung verwendet werden, nennt man natürliche Antikörper, da sie in menschlichen Seren anscheinend ohne vorherige Antigen-Stimulation gefunden werden. Andere Antikörper scheinen die Fähigkeit zu haben, mit einigen Bestandteilen zu reagieren, die normalerweise im Körper vorhanden sind. Dies führt zu dem pathologischen Zustand, der als Autoimmunität oder Autoallergie bekannt ist. Beispiele solcher Antikörper schließen die antinuklearen Antikörper der allgemeinen Schmetterlingsflechte (im Englischen "systemic lupus erythmatosus"), die rheumatischen Paktoren der Arthritis-Deformanz (im Englischen "rheumatiod arthritis" genannt) und die Antithyroglobulin-Antikör'per der chronischen Schilddrüsenentzündung (Hashimotos-Krankheit) ein. Die Antikörper-Proteinmoleküle weisen freie Bindestellen auf, die komplementär zu denen des Antigenmoleküls angeordnet sind, so daß sich Antigen und Antikörper unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins physisch verbinden können.'

Die meisten Antigene sind Proteine oder enthalten als wesentlichen Bestandteil Proteine, während alle Antikörper Proteine sind. Proteine sind große Moleküle hohen Molekulargewichtes, d.h. sie sind Polymere, die aus Ketten einer variablen Zahl von Aminosäuren· bestehen. Ein beliebiges Protein wird an einem Substrat nur in einer monomolekularen Schicht haften, und an dieser Proteinschicht· wird kein anderes beliebiges Protein haften. Es wird eich jedoch das hinsichtlich des ersten an jedem Substrat adeor- " bierten Proteins spezifisch reagierende Protein mit diesem immunologisch verbinden. Dies wurde zur Schaffung einer medizinisch diagnostischen Vorrichtung genutzt, in der ein besonders zubereiteter Objektträger eine daran adsorbierte monomolekulare Proteinschicht trug und dieeer dazu verwendet wurde", Lösungen auf die

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Anwesenheit des darin vermuteten spezifisch mit dem adsorbierten Protein reagierenden Proteins zu untersuchen. Ist das spezifisch reagierende Protein in der Lösung vorhanden, dann weist der Objektträger, nachdem man ihn der Lösung ausgesetzt hat, eine bimolekulare Proteinschicht auf. Ist das spezifisch reagierende Protein dagegen in der Lösung nicht vorhanden, dann weist der Objektträger auch nachdem man ihn der Lösung ausgesetzt hat, nur die ursprüngliche monomolekulare Proteinschicht auf. Verschiedene optische, elektrische, chemische und radioaktive Mittel zum Unterscheiden der monomolekularen und bimolekularen Schichten aus biologischen Teilchen weisen unterschiedliche Empfindlichkeit und Wirtschaftlichkeit auf. Die Untersuchung des proteinbeschichteten Objektträgers mit dem bloßen Auge ist die bevorzugte Art der Bestimmung der Zahl der Schichten aus biologischen Teilchen auf dem Objektträger, da dies sehr einfach ist.

Der Nachweis von Antikörpern in einem biologischen System ist von medizinisch diagnostischem Wert bei der Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt war. Ein Beispiel des diagnostischen Nachweises von Antikörpern ist der Nachweis der Antikörper der Syphilis oder der Gonorrhöe in menschlichem Serum. Umgekehrt ist auch der Nachweis gewisser Antigene in einem biologischen System von medizinisch diagnostischem Wert. Beispiele für den diagnostischen Nachweis von Antigenen sind der Nachweis von HCG-Proteinmolekülen im Urin als Test für die Schwangerschaft und der Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigen (HAA)-Moleküle im Blut in Aussicht genommener Blutspender.

Um -solche diagnostischen Untersuchungen durchzuführen, muß man erst das geeignete Protein für das immunologisch miteinander reagierende Proteinpaar gewinnen. Derzeit muß die Quelle für ein Antikörperprotein ein lebendes biologisches System sein. Im besonderen sind Wirbeltiere dafür bekannt, daß sie die Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen beantworten. So werden z.B. viele Antikörper im Blutserum von Tieren und Menschen gefunden, die man den entsprechenden Antigenen ausgesetzt hatte. Auch Nicht-Wirbeltiere zeigen immunologische Reak-

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tionen, wenn sie auch wahrscheinlich kein spezifisches Gedächtnis haben. Sogar einige Pflanzenproteine verbinden sich mit Antigenen und die dabei gebildeten sogenannten Lectine (im Englischen "lectins" genannt) können von beträchtlichem Nutzen in diagnostischen Reaktionen sein. Einige Antigene können kontrollierbar in Laboratoriumskulturen hergestellt werden. Die meisten Antigene jedoch, wie z.B. die mit der Hepatitis verbundenen Antigene, sind derzeit, wie Antikörper, nur aus lebenden biologischen Systemen erhältlich und daher gewinnt man viele Antigene aus natürlichen Quellen, wie menschlichen oder tierischen Geweben.

Es ist in der Immunologie bekannt, daß Antxkörpermoleküle als Antigene wirken, wenn man sie in das System eines Wirbeltieres einführt, für das sie Fremdproteine sind. In einem solchen Wirbeltiersystem können demgemäß spezifisch reagierende Antikörper zu einem gegebenen Antikörper gebildet werden.

Obwohl in der vorliegenden Anmeldung die biologischen Teilchen, die miteinander immunologisch reagieren, besondere Berücksichtigung gefunden haben, ist die Erfindung auch für andere Arten biologischer Wechselwirkungen zwischen großen Molekülen geeignet, die auf nicht-immunologischen Spezifikationen beruhen, wie z.B. die Bindung von Enzymen an ihre biologischen Substrate oder von Hämoglobin an Haptoglobin.

Es ist in der Immunologie auch bekannt, ein erstes biologisches Teilchen, wie ein Antigen (oder einen Antikörper) an einer festen Oberfläche haften zu lassen, das haftende erste Teilchen dann einer Lösung auszusetzen, von der man annimmt, daß sie ein zweites -biologisches Teilchen enthält, für das das erste Teilchen spezifisch ist, und man das System dann einem radioaktiv markierten Antikörper für das zweite Teilchen aussetzt. Die obige Te'chnik wird derzeit zum Na-chweis von Hepatitis angewandt, indem man die innere Bodenoberfläche eines Testrohres mit Antikörpern für das mit Hepatitis verbundene Antigen (nachfolgend kurz MA genannt) überzieht, dann in das Röhrchen eine Blutprobe füllt, von der man annimmt, daß sie HAA enthält, und schließlich einen

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radioaktiv markierten Antikörper für HAA hinzugibt. Es wird dann ein Strahlungszähler dazu benutzt, die gesamte Bodenoberfläche · des Testrohres auf Radioaktivität zu untersuchen.

Es ist in der Immunologie auch bekannt, Antikörper für menschliche Immunoglobuline zur chemischen Kombination mit fluoreszierenden organischen Molekülen, wie Isothiocyanaten, herzustellen. Dieser markierte Antikörper wird dann dazu benutzt, eine immunologische Reaktion mit Hilfe der UV-Mikroskopie sichtbar zu machen, was insbesondere in dem serologischen Test auf Syphilis nach der Methode von Coons geschieht, die derzeit als FTA-STS-Verfahren bekannt ist. Bei diesem Verfahren wird eine Menge Syphilis-Spirochäten (Treponema pallidum) auf einem Objektträger getrocknet. Der Objektträger wird dann in eine Blutprobe eingetaucht und danach in eine Lösung des markierten Immunoglobulins. Das antimenschliche Immunoglobulin verbindet sich nicht mit dem Treponema pallidum und demgemäß fluoresziert der Objektträger, wenn er mit dem UV-Mikroskop betracht wird, nur dann, wenn die Probe Antikörper für das Treponema pallidum enthielt.

In der älteren deutschen Patentanmeldung P 24 61 230.4 werden immunologisch reaktive biologische Teilchen, wie Viren, Bakterien und andere Zellen, nachgewiesen, indem man bestimmt, ob auf einem Substrat zwischen dem nachzuweisenden Teilchen und seinem radioaktiv markierten Antikörper eine immunologische Reaktion stattfindet. Dazu wird ein erstes immunologisch reaktives biologisches Teilchen an der Oberfläche des Substrates in einem bestimmten Muster adsorbiert und das Substrat wird dann einer Lösung ausgesetzt, von der man annimmt, daß sie die nachzuweisenden Teilchen enthält, die spezifisch zu den ersten Teilchen sind. Schließlich wird das Substrat dem radioaktiv markierten Antikörper zu dem nachzuweisenden Teilchen ausgesetzt und schließlich wird die Substratoberfläche auf Radioaktivität überwacht. War das nachzuweisende Teilchen vorhanden, dann wird das bestimmte Muster ein beträchtlich höheres Strahlungsniveau haben als das umgebende Substrat.

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In der älteren deutschen Patentanmeldung P 25 36 572,4 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem eine monomolekulare Schicht erster biologischer Teilchen an der Oberfläche eines Substrates adsorbiert ist, das hergestellt ist aus irgendeinem nicht-reaktiven PestStoffmaterial. Das überzogene Substrat wird dann einer Lösung ausgesetzt, von der man annimmt, daß sie die zweiten biologischen Teilchen enthält, die spezifisch zu den ersten biologischen Teilchen sind. Als nächstes wird eine poröse opake Schicht aus nichtreaktiven dritten Teilchen auf dem überzogenen Substrat gebildet, und dann wird das überzogene Substrat einer Lösung eines Spaltmittels ausgesetzt, welches die Bindung zwischen den ersten und zweiten biologischen Teilchen spaltet. Eine visuelle Untersuchung der überzogenen Substratoberfläche oder eine Untersuchung mit geeigneten Instrumenten wird ausgeführt, um zu bestimmen, ob die Versuchslösung die zweiten biologischen Teilchen enthielt, indem man feststellt, ob die opake Schicht vollständig ist oder ob ein Teil, der den zweiten biologischen Teilchen zuzuschreiben ist, entfernt worden ist.

Es gibt jedoch noch einige Fälle, in denen die Reaktion so langsam fortschreitet oder bei denen so wenige zweite Teilchen in der Probe vorhanden sind, daß die zweite Schicht, obwohl vorhanden, spärlich und schwer mit optischen Mitteln nachzuweisen ist.

Es ist. daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem man den Kontrast durch Nachweisen einer Markierung verbessern kann, ohne daß eine verlängerte Reaktionszeit erforderlich ist.

Im Gegensatz zu den Lehren nach dem Stand der Technik, denen zufolge die Instrumente zum Anzeigen der Markierung dazu benutzt wurden, eine proteinüberzogene Oberfläche auf die Anwesenheit eines vormarkierten zweiten Proteins zu untersuchen, das an dem ersten Protein haftete, schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, bei dem man sich zweite biologische Teilchen unmarkiert mit ersten biologischen Teilchen, die an einem Substrat haften, komplexieren läßt und man das Markieren erst danach ausführt. Das

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System wird dann nach dem Markieren mit einer Lösung des Spaltmittels in Berührung gebracht, um die Bindung zwischen den beiden Schichten biologischer Teilchen zu trennen. Die benutzte Spaltmittellösung wird gesammelt und auf die Anwesenheit der Markierungen darin untersucht, was die Anwesenheit zweiter biologischer Teilchen zu bestimmen geeignet ist.

Die derzeit bevorzugten Markierungen sind radioaktiv, z.B. Jod 125, auch als J-125 oder ^JJ-bezeichnet.

Die Markierungen können zumindest auf die folgenden Arten aufgebracht werden:

a) Die zweiten biologischen Teilchen können direkt markiert werden, nachdem eine Schicht daraus an der ersten Schicht haftet, wobei Sorge zu tragen ist, daß sich die erste Schicht nicht vorzeitig von dem Substrat trennt. Es kann ein beständiges Ergebnis auch dann erhalten werden, wenn ein Teil der ersten Schicht während des Markierens ebenfalls markiert wird, indem man die Lösung des benutzten Spaltmittels auf die Markierung untersucht, da das Spaltmittel die erste Schicht nicht abtrennt und deren Markierungen daher am Substrat haften bleiben.

Dieses bevorzugte Verfahren des Markierens kann die Betriebskosten verringern und gleichzeitig den Kontrast verbessern. Vormarkierte biologische Teilchen sind teuer und haben eine kurze Halbwertzeit. Sie können auch weniger reaktiv hinsichtlich der ersten biologischen Teilchen sein als die unmarkierten biologischen Teilchen sein würden, aus denen, sie hergestellt wurden. Ein derzeit vertriebenes Testmittel für das mit der Hepatitis verbundene Antigen·, kurz HAA genannt, welches eine mit Jod 125 vormarkierte "dritte Schicht" aus mit der Hepatitis verbundenem Antikörper verwendet, hat eine Halbwertzeit von nur 28 Tagen.

b) Die zweiten biologischen Teilchen können nach deren Anhaften an der ersten Schicht markiert werden durch Aufbringen irgendeines vormarkierten nicht-biologischen Materials, das ausreichend an dem zweiten Protein haftet, um einen gleichmäßig verteilten

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überzug darüber zu bilden, der ausreichend porös ist, damit die Spaltmittellösung leicht hindurch diffundieren kann. Während das Spaltmittel die Bindung zwischen der zweiten und der ersten Schicht aus biologischen Teilchen spalten soll, darf es die Haftung des vormarkierten haftenden Materials an der ersten Schicht nicht merklich stören. Das vormarkierte haftende Material, das von der Oberfläche in die Spaltmittellösung gelangt, liefert einen verläßlichen Indikator für die Anwesenheit oder Abwesenheit der zweiten biologischen Teilchen.

Die Markierungsverfahren a) und b) werden klar bevorzugt, da die Nachteile vermieden werden, die mit vormarkierten biologischen Teilchen verbunden sind. Diese Nachteile sind eine verkürzte Auwendungszeit, die von der Zeitdauer abhängt_s für die die Markierung wirksam ist, weiter die Verringerung der Zahl aktiver Stellen auf den biologischen Teilchen und außerdem Verlust an biologischen Teilchen vor dem Komplexieren durch Strahlung und andere nachteilige Wirkungen.

c) Schließlich können die zweiten biologischen Teilchen auch indirekt markiert werden, indem man das überzogene Substrat, nachdem man es einer Probe ausgesetzt hat, von der man annimmt, daß sie das zweite Protein enthält, mit einer Lösung vormarkierter dritter biologischer Teilchen in Berührung bringt, die zwar für die zweiten aber nicht die ersten Teilchen spezifisch sind, wenn₅ wie im Falle der Hepatitis, ein solches System existiert. Indem man dann die überzogene Oberfläche einem Spaltmittel aussetzt, wird die Bindung zwischen den ersten und zweiten und/oder den zwe-iten und dritten Schichten getrennt und die benutzte Spaltmitt-ellösung wird auf Markierungsanwesenheit untersucht.

Bei jedem der oben beschriebenen Wege zum Markieren kann die beschichtete' Oberfläche mit der Einrichtung zum Untersuchen der Markierung vor und/oder nach der Spaltstufe studiert werden, um Überprüfungen, Messungen der Hintergrundstrahlung und ähnliches auszuführen .

Die vorliegende Erfindung schafft also ein wie oben beschriebenes

Verfahren, bei dem eine Markierungen in geringerer Konzentration als leicht oder zuverlässig nachweisbar enthaltende Spaltmittel-? lösung konzentrier-t werden kann, bevor man sie auf die Markierungsstoffe untersucht. Um das erfindungsgemäße Verfahren ausführen zu können, muß die Substratoberfläche nicht flach sein, und sie kann so groß sein wie ein wirtschaftlicher Gebrauch des Verfahrens dies gestattet, um die Wahrscheinlichkeit zu vergrößern, daß innerhalb einer vernünftig kurzen Testzeit mehr zweite Teilchen an der ersten Schicht haften.

In diesem Zusammenhang sind solche Tests am meisten bevorzugt, die ausgeführt werden können, während ein Verfahren abläuft oder über Nacht.

Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Im einzelnen zeigen:

Figur 1 eine schematische Ansicht im Schnitt durch einen Teil eines Substrates, an dem eine monomolekulare Schicht erster biologischer Teilchen adsorbiert ist,

Figur 2 eine schematische Ansicht im Schnitt des überzogenen Substrates der Figur 1 nach dem Inberührungbringen mit einer Probe, die ein zweites biologisches Teilchen enthielt, das spezifisch für das erste Teilchen ist, wodurch eine zweite monomolekulare Schicht auf dem Substrat gebildet wurde,

Figuren 3a, 3b und 3c schematisch einzelne zweite biologische Teilchen, die in drei verschiedenen Arten markiert wurden, nachdem sie zuerst im unmarkierten Zustand an die erste Schicht adhäriert wurden.

Figur 4 eine Seitenansicht im Schnitt, welche die Nachweisstufe wiedergibt, bei der die Einrichtung zum Aufspüren der Markierung auf die Spaltmittellösung und Spülflüssigkeit angewandt wird, die nach dem Spalten gesammelt wurden, und

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Figur 5 eine Seitenansicht ähnlich der in Figur 4, bei der die Nachweisstufe nach der Konzentrierung, z.B. durch Verdampfen, von Spaltmittellösung und Spülflüssigkeit nach Figur 4 vorgenommen wird.

In Figur 1 ist schematisch im Schnitt die Oberfläche eines typischen Substrates IO gezeigt, das für das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweisen einer immunologischen oder anderen spezifischen Reaktion mit biologischen Teilchen benutzt werden kann. Das Substrat 10 kann aus irgendeinem festen Material hergestellt sein, das nicht mit dem biologischen Teilchen, der Spaltmittellösung und anderen Materialien reagiert, die auf das Substrat während des Verfahrens angewendet werden. Die Oberfläche 11 des Substrates 10 muß undurchdringlich sein und nicht adsorbierend für die Lösungen der biologischen Teilchen, Markierungen und das verwendete Spaltmittel und sie muß die Adsorption einer monomolekularen Schicht der ersten biologischen Teilchen darauf gestatten. Die Oberfläche 11 braucht weder lichtdurchlässig noch flach zu sein. Obwohl das Substrat ein glattes Glasplättchen sein könnte, ist dies kein bevorzugtes Material wegen der Tendenz der Spaltmittellösung, zuviele erste biologische Teilchen davon abzuspalten. Bevorzugte und brauchbare Materialien schließen eine Vielzahl kleiner Kugeln ein, die eine dünne haftende nicht-poröse Oberfläche aus z.B. Gold, Chrom, Tantal oder Molybdän haben. Es können aber auch Platten, Stäbe, Glasbehälter, innere Oberflächen und ähnliche als Substrat benutzt werden.

Die Größe des Substrates 10 wird hauptsächlich durch die Kosten der Materialien bestimmt, die bei dem Test verbraucht werden und dies im Vergleich zu den Kosten für die Zeit zur Durchführung des Tests. Eine Vergrößerung der Oberfläche mag die Materialkosten vergrößern, jedoch die erforderliche Berührungszeit verringern, · um Markierungen zu sammeln, die ausreichend konzentriert sind, damit sie durch die Mittel zum Nachweisen der Markierungen klar unterschieden werden können.

Die Oberfläche 11 muß frei sein von irgendwelchen Verunreinigungen, wie Resten der Spaltmittellösung, welche die Adsorption der ersten

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monomolekularen Schicht biologischer Teilchen darauf verhindern oder beeinträchtigen könnten.

Nach Auswahl eines geeigneten Substrates 10 mit einer sehr sauberen Oberfläche 11 wird eine monomolekulare Schicht 12 erster biologischer Talchen daran adsorbiert. Die Identität des Materials 12 wird in Abhängigkeit von dem jeweils ausgeführten Test variieren. So ist ein beispielhaftes Material für die ersten biologischen Teilchen Rinderserumalbumin.

Obwohl immunologisch reaktive biologische Teilchen, deren einfachster Fall das Antigen/Antikörper-Paar ist, der Einfachheit halber und beispielhaft besonders hervorgehoben werden, ist das erfindungsgemäße Verfahren doch gleichermaßen brauchbar für biologische Teilchen, die andere biologische Wechselwirkung eingehen und das einzige Kriterium ist, daß die Teilchen zueinander spezifisch sind.

Das Haften der ersten biologischen Teilchen als monomolekulare Schicht kann bewerkstelligt werden durch Aufbringen von einem oder mehreren Tropfen einer Lösung der ersten biologischen Teilchen auf die Oberfläche 11 unter Verwendung eines Tropfers oder einer anderen 'Einrichtung. Das Substrat 10 kann aber auch in eine Lösung der ersten biologischen Teilchen eingetaucht werden. Die ersten biologischen Teilchen werden auf der Grundlage ausgewählt, daß sie spezifisch reaktiv zu besonderen zweiten biologischen Teilchen sein müssen, welche die zweite Schicht auf der Substratoberfläche bilden werden, wenn sie in einer zu testenden zweiten Lösung oder einer Probe davo.n vorhanden sind.

Die ersten biologischen Teilchen können in Laboratoriumskulturen hergestellt oder aus höheren lebenden biologischen Systemen erhalten werden, und sie sind im allgemeinen in relativ hoch-reiner Form handelsüblich erhältlich, und wenn nicht derart handelsüblich erhältlich, können sie chemisch gereinigt werden. Die Lösung der ersten biologischen Teilchen kann eine Salzlösung in Wasser oder einer anderen Flüssigkeit sein, die für die.ersten biologischen Teilchen geeignet und mit diesen und dem Substratmaterial

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nicht reaktiv ist. Eine detailliertere Beschreibung der Bildung erster und zweiter monomolekularer Schichten biologischer Teilchen ist in den vorgenannten älteren deutschen Patentanmeldungen zu finden.

Die für die Bildung der ersten raonomolekularen Schicht 12 auf der Substratoberfläche 11 erforderliche Zeit (im allgemeinen bis zu

I Stunde) ist umgekehrt proportional zur Konzentration der ersten biologischen Teilchen in der ersten Lösung. Die erste monomolekulare Schicht 12 bedeckt im wesentlichen die gesamte Oberfläche

II des Substtates 10 und das Substrat 10 wird daher so klein wie eben praktisch gemacht, um die in dem Verfahren verwendeten biologischen Materialien weitgehend zu sparen, aber andererseits wiederum ausreichend groß, damit innerhalb einer kurzen Zeit ein zuverlässiger Test ausgeführt werden kann. Ein Spülen der mit der moiiomolekularen Schicht überzogenen Oberfläche des Substrates 10 mit Leitungs- oder destilliertem Wasser wird empfohlen, um überschüssige erste biologische Teilchen und möglicherweise andere in der ersten Lösung vorhandene Teilchen zu entfernen, die sich auf der monomolekularen Schicht 12 ansammeln können.

Das mit der Monoschicht überzogene Substrat 10 wird dann getrocknet, wenn es verschickt oder gelagert werden soll, vorzugsweise indem man Luft von Raumtemperatur über das Substrat bläst, um das Trocknen zu beschleunigen. Wenn das Substrat unmittelbar verwendet werden soll, besteht keine Notwendigkeit, nach dem Spülen zu trocknen. Die erste monomolekulare Schicht 12 ist im allgemeinen für das bloße Auge nicht sichtbar, da die Dicke einer solchen monomolekularen Schicht irgendwo im Bereich von 20 bis 100 S liegt, abhängig von der besonderen Art biologischer Teilchen, die diese Schicht bilden. -

In Figur 2 ist das mit einer monomolekularen Schicht überzogene Substrat gezeigt, nachdem es einer zweiten Lösung ausgesetzt wof-

man
den ist, von der/annahm, daß sie zweite immunologisch reaktive biologische Teilchen enthalten würde, die spezifisch für die ersten biologischen Teilchen sind, soweit man einen direkten Test nach solchen zweiten Teilchen ausführen wollte. Dieses Aussetzen

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wird im allgemeinen dutch Eintauchen des mit der Eonoschicht überzogenen Substrates in die zweite Lösung für eine Zeit ausgeführt, die wiederum umgekehrt proportional der normalerweise nicht bekannten Konzentration der zweiten biologischen Teilchen in der zweiten Lösung ist. Da die Konzentration der zweiten Teilchen in der zweiten Lösung im allgemeinen sehr viel geringer ist als die Konzentration der ersten Teilchen in der ersten Lösung, erfordert der Eintauchschritt in der zweiten Lösung im allgemeinen sehr viel längere Zeit als dies für die Bildung der monomolekularen Schicht aus ersten biologischen Teilchen erforderlich war und kann bis zu 24 Stunden betragen. Die Zeit hierfür kann verkürzt werden, wenn eine größerflächige Oberfläche 11 benutzt wird.

Die Anwesenheit der zweiten biologischen Teilchen in der zweiten Lösung, die man zu Test- oder Untersuchungszwecken verwendet, führt zur Bildung einer zweiten im wesentlichen vollständigen monomolekularen Schicht 13 über der monomolekularen Schicht 12 als Ergebnis der biologischen Umsetzung zwischen den zweiten und den ersten biologischen Teilchen. Nachdem das mit einer monomolekularen Schicht überzogene Substrat ausreichend der zweiten Lösung ausgesetzt wurde, wird das überzogene Substrat herausgenommen und mit Leitungswasser, destilliertem Wasser oder einer verdünnten Salzlösung in Abhängigkeit von der Natur der Lösung, in der die zweiten biologischen Teilchen enthalten waren, gewaschen. Diese Spülstufe wird angenwendet, um ein überschüssiges Ansammeln der zweiten biologischen Teilchen auf dem Substrat zu verhindern und um eine nicht spezifische Absorption möglichst gering zu halten, da die zweite Lösung typischerweise ein komplexes ungetrenntes Serum ist, das eine große Zahl andersartiger biologischer Teilchen enthält. Das überzogene Substrat kann dann in der oben beschriebenen Weise getrocknet werden, wenn dies für die nachfolgende Behandlung,- die weiter unten beschrieben wird und die ggf. ausgeführt wird, erforderlich ist. Wenn in der zweiten Lösung zweite biologische Teilchen nicht vorhanden sind, dann findet auch keine Ansammlung einer zweiten monomolekularen Schicht über der Schicht 12 statt.

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Nachdem die zweite monomolekulare Schicht 13 sich auf dem überzogenen Substrat gebildet hat_s können die zweiten biologischen Teilchen, wie bei 14 in Figur 3a dargestellt, direkt markiert werden. Ein radioaktives Markieren wird bevorzugt. Ein Verfahren für die Radiojodierung von Teilchen ist von W.M. Hunter und F.C, Greenwood in Nature, 194, Seite 495 (1962) beschrieben.

Das Markieren sollte in neutraler Lösung ausgeführt werden, um eine vorzeitige Abtrennung der zweiten Schicht, falls eine solche vorhanden ist, von der ersten Schicht zu vermeiden. Geeignete Verfahren zum radioaktiven Markieren einer adsorbierten Schicht biologischer Teilchen sind in dem Handbook of Experimental Immunology, herausgegeben von D.M. Weir, Blackwell Scientific Publications, 1973 im Kapital 17 "Radioimmunoassay" von W.M. Hunter, Seiten 17.1 - 17.36 und in den darin genannten Druckschriften beschrieben. Weitere Ausführungen sind in dem Buch "Principles of Competitive Protein-Binding Assays'^ Herausgeber W.D. Odell und W.H. Daughaday, Philadelphia, Lippincott 1971, in Kapitel X "Radioiodination of Peptide Hormones: Procedure and Problems" von F.C. Greenwood auf den Seiten 288 - 296 enthalten. Ein anderes Werk, das geeignete radioaktive Markierungsverfahren beschasLbt, ist "Radioimmunoassay Methods", Herausgeber K.E. Kirkham und W.M. Hunter, Churchill, Livingstone 1971, und zwar die Kapitel "The Preparation and Assessment of Iodinated Antigens" von W.M. Hunter auf den Seiten 3-23 und "The Immuradiometric Assay" von G*Μ. Addison und CN. Haies auf den Seiten 447 -

Alternativ zu dem radioaktiven Markieren kann auch ein Markieren mit- fluoreszierenden und anderen Stoffen erfolgen. Das Verfahren zum Fluoreszenzmarkieren ebenso wie das zum radioaktiven Markieren ist dem'Fachmann im allgemeinen bekannt. Geeignete Verfahren zum Fluoreszenzmarkieren einer haftenden Schicht biologischer Teilchen sind in dem oben beschriebenen Handbook of Experimental Immunology im Kapitel l8 "Immunofluorescence" von G.D, Johnson und E.J. Holborow beschrieben.

Anstatt die biologischen Teilchen, wie in Figur 3a veranschaulicht, direkt zu markieren, können sie auch indirekt markiert

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iyerden, inäem man dritte Teilchen IJr- r;.It- Markierungen lh vormarkiert, wobei die Teilehen 15r spezifisch zu den zweiten biologischen Teilchen nicht aber spezifisch zu den ersten biologischen Teilchen sine - Diese markierten Teilchen werden zur Bildung dner dritten Schient auf der monomclekularen Schicht der zweiten biologischen Teilchen eingesetzt=, Diese Ausführungsform ist in Figur 3b abgebildet. Die dritten Teilchen werden zuerst, wie für die Ausführungsform nach Figur 3a beschrieben, markiert. Auch das Markieren der dritten Teilchen ist vorzugsweise radioaktiv, wobei sie beispielsweise mit Jod 125 jodiert werden können.

Nachdem das überzogene Substrat der Figur 3b ausreichend den zweiten biologischen Teilchen in der Lösung ausgesetzt worden ist, nimmt man das Substrat aus der zweiten Lösung, von der man annimmt, daß sie solche Teilchen enthält, heraus und vSsht es mit einer geeigneten Lösung, z.B. Wasser oder verdünnter wäßriger Salzlösung, um den größten Teil der nicht spezifischen Teilchen, der an dem Substrat haftet, zu entfernen. Das überzogene Substrat wird danach einer Lösung dritter biologischer Teilchen 15r ausgesetzt, die radioaktiv markiert sind und biophysikalisch aktiv gegenüber den zweiten biologischen Teilchen sind, z.B. einem Antikörper zu den zweiten biologischen Teilchen, In jedem Falle ist das radioaktiv markierte dritte biologische Teilchen spezifisch zu dem zweiten biologischen Teilchen, so daß die Anwesenheit des letzteren auf dem Substrat 10 das Komplexieren der dritten Teilchen damit und somit das Bilden einer dritten monomolekularen Schicht auf dem Substrat 10 über den vorher gebildeten monomolekularen Schichten verursacht, wie in Figur 3b gezeigt. Das Aussetzen des überzogenen Substrates 10 gegenüber den dritten biologischen Teilchen kann durch Eintauchen in eine dritte Lösung solcher Teilchen erfolgen oder durch Überziehen mit der dritten Lösung für den Fall, daß eine ausreichend hohe Konzentration darin vorhanden ist. Die Zeitdauer, während der man das Substrat der dritten Lösung aussetzt, um eine im wesentlichen vollständige Schicht aus dritten Teilchen 15r auf der Schicht der zweiten biologischen Teilchen zu erhalten, ist wiederum hauptsächlich eine Funktion der Konzentration solcher Teilchen in der dritten Lösung. Die Konzentration der dritten Teilchen kann wie im Falle der

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ersten Teilchen kontrolliert werden_s da. diese Teilchen in Laboratoriumskulturen oder in höheren biologischen Systemen hergestellt werden. Die Konzentration dieser biologischen Teilchen ist im allgemeinen viel höher als die Konzentration der zweiten Teilchen in der zweiten Lösung, so daß die Zeit des Aussetzens gegenüber den dritten Teilehen im allgemeinen sehr viel geringer als die Eintauchzeit in die zweite Lösung_o

Eine dritte Ausführungsform ist in Figur 3c abgebildet, in der die zweiten biologischen Teilchen in der zweiten Schicht markiert werden, nachdem die Schicht der zweiten biologischen Teilchen durch Aufbringen einer Schicht aus dritten Teilchen 15η festgelegt wurde, die sich auch über die bis dahin noch freien Teile der ersten Schicht erstreckt. Die Schicht aus dritten Teilchen 15n ist nicht reaktiv mit dem Substrat 10 und den die monomolekularen Schicht 11 und 12 bildenden biologischen Teilchen, doch sind die Teilchen 15n z.B. mit J-125 radioaktiv vormarkiert worden und sie bedecken die gesamte überzogene Oberfläche des Sub= strates unter Bildung der dritten und äußersten Schicht. Hatte die zweite Lösung keine zweiten biologischen Teilchen enthalten, dann bildet die Schicht aus den Teilchen 15n nur die zweite Schicht auf dem Substrat 10. Die nicht-reaktive Schicht aus den Teilchen lfm muß ausreichend porös sein_s damit bei der nachfolgenden Behandlung des überzogenen Substrates mit einer Spaltmittellösung das Spaltmittel durch die Schicht 13 hindurchdringen kann. Wegen der nachfolgenden Behandlung mit der Spaltmittellösung müssen die Teilchen 15n der dritten Schicht auch nicht-reaktiv mit dem Spaltmittel sein.

Die-Schicht aus Teilchen 15n kann aus jedem Material gebildet werden,· das in Form diskreter kleiner Teilchen existiert und das in einer porösen zusammenhängenden Schicht dispergiert werden kann und das unter Verwendung bekannter Techniken vormarkiert werden kann, das an den bereits vorhandenen Schichten aus biologischen Teilchen haftet und das nicht-reaktiv ist mit den ersten und zweiten biologischen Teilchen, dem Substrat und der Spaltmittellösung.

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Die dritte Schicht l:ann gebildet werden durch Eintauchen des überzogenen Substrates :.n er.ne gerührte dritte Lösung, die eine relativ :;oli6 Konzentration welcher vor markiert er nicht-reaktiver Teilchen enthält, um ;ine Sohisivi aus den Teilchen 15n zu bilden, die miteinander in Berührung stehen oder- einen geringen Abstand voneinander haben. Es können auch Metall-, Glas- oder Kunststoffteilchen, die vormarkiert worden sind, in einer geeigneten gerührten Lösung dazu verwendet werden, die Schicht 15n herzustellen. Das Lösungsmittel dafür kann einfach Wasser- sein. Für den Fall, daß das überzogene Substrat in eine Lösung der kleinen Teilchen getauchtwird, gibt es keine Notwendigkeit, das überzogene Substrat zu trocknen, nachdem man das mit der- monomolekularen Schicht überzogene Substrat der- Lösung ausgesetzt hat, in der man die zweite" biologischen Teilchen vermutete und nachdem man es gespült hat_, v/eil ciie die Teilchen 15n enthaltende Lösung das überzogene Substrat ohnehin anfeuchtet. Die Größe der im allgemeinen kugelförmigen dritten Teilchen 15n₉ seien sie aus Glas oder Kunststoff, kann eine weiten Bereich haben (Durchmesser von O₅I bis 100 .um), da es lediglich Punktion der Schicht 15-n ist, eine markierte poröse Schicht für das nachfolgend zu benutzende Spaltmittel zu haben.

Bei einer anderen Ausführungsform des Verfahrens zum Aufbringen der dritten Schicht aus Teilchen 15n auf das Substrat wird ein übliches Aerosolspray verwendet, das mit jedem Material gefüllt sein kann, das nicht-reaktiv ist mit dem Substrat, den biologischen Teilchen und dem Spaltmittel sowie richtig markiert ist und eine poröse Schicht, vorzugsweise eine opake Schicht, bilden kann. Das" überzogene Substrat sollte vor dem Besprühen trocken sein, damit die Teilchen 15n an der Schicht 13 (oder 12) besser haften. Die in "einem Gas suspendierten Teilchen, die das Aerosol bilden, können entweder fein zerteilte Feststoffe oder Flüssigkeiten sein. So kann z.B. die getrocknete und überzogene Oberfläche des Substrates leicht mit modifiziertem MS-122 Fluorkohlenstoff, einem Entformungsmittel und Trockenschmiermittel der Miller-Stephenson Chemical Company, besprüht werden. Dieses Produkt besteht normalerweise aus einer Aerosol-Zubereitung eines synthetischen Polymerwachses geringen Molekulargewichtes. Zur Verwendung in der

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vorliegenden Erfindung werden die Polymerteilchen vor der Verpackung gleichförmig mit einer Lösung eines radioaktiv jodier-ts." anorganischen Jodsalzes in einer auf ölgrundlage beruhenden Kohlenwasserstoff- und damit wasserunlöslichen Lösung überzogen. Die Markierungen können von den teilchenförmigen Trägern dafür physisch eingefangen, darin dispergiert, darauf adsorbiert oder chemisch daran gebunden werden.

Wird die Schicht 15n aus einem Material mit hohem Kontrast hergestellt, z.B. dem markierten Fluorkohlenstoffwachs-Aerosol, dann kann das Ausmaß der Homogenität der Verteilung der Markierungen auch optisch überprüft werden. Ist ein optisches Überprüfen nicht ausführbar oder nicht beabsichtigt, dann braucht die Schicht aus den Teilchen 15n kein stark sichtbares .Trägermaterial, wie markiertes Pluorkohlenstoffwachs,zu umfassen, sondern sie kann aus einer Lösung eines radioaktiv jodierten anorganischen Jodsalzes in einem Kohlenwasserstoff, d.h. einer wasserunlöslichen ölgrundlage, bestehen.

Die Dicke der aufgesprühten Schicht 15n kann beträchtlich dicker sein als die Dicke der monomolekularen Schichten 12 und 13, und die Dicke ist üblicherweise im Bereich von 1 bis 10 Mikrometer, kann jedoch aber auch im Bereich von einer monomolekularen Schicht bis zu 100 Mikrometern reichen. Die Dickenbereiche für die einzelnen Teilchen oder in den aufgesprühten Sehichtdicken kann für verschiedene Materialien wegen der verschiedenen Porosität und Lichtundurchlässigkeit verschieden sein.

Nach dem Markieren, das z.B. gemäß den in den Figuren 3a bis 3c veranschaulichten Verfahren erfolgt sein kann, wird die überzogene Oberfläche des Substrates 10 einer Spaltmittellösung ausgesetzt, z.B. Tropfen einer schwachen Säurelösung, einer alkalischen Lösung oder einer salzhaltigen Lösung. Da die Schicht 13, ' wenn eine solche vorhanden ist, und jede danach aufgebrachte Schicht porös sind, dringt das Spaltmittel bis zu der monomolekularen Schicht aus ersten biologischen Teilchen durch, und wenn die zweiten biologischen Teilchen vorhanden sind, spaltet es die Bindung zwischen und den zweiten biologischen Teilchen, nicht

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aber die Bindung zwischen den ersten biologischen Teilchen und dem Substrat. Die monomolekulare Schicht 13 wird von der Region entfernt, in der die Spaltung stattfindet, und sie gelangt in die Spaltmittellösung 16 und die verwendete Spülflüssigkeit. Die abgespaltene^ zweiten biologischen Teilchen und die Flüssigkeit werden in einem Behälter (im Falle der Ausführungsformen der Figuren 3b und 3c) zusammen mit den Teilchen 15r oder 15n, die daran haften, gesammelt.

Für den Fall, daß die auf die An- oder Abwesenheit zweiter biologischer Teilchen untersuchte Probe frei von zweiten biologischen Teilehen ist, hat die Anwendung der Spaltmittellösung auf den überzug auf der Oberfläche 11 keine Wirkung auf die überzogene Oberfläche des Substrates und in der Spaltmittellösung treten daher keine Markierungen über eine geringe Hintergrundmenge hinaus auf. Wird in dem vorgenannten Falle die Ausführungsform des Verfahrens angewandt, die in Figur 3c veranschaulicht ist, dann bleibt die aus den Teilchen 15n bestehende Schicht während der . Durchführung des Abspaltens, Spülens und Sammelns vollständig.

Ist das Spaltmittel eine Säurelösung, dann üblicherweise eine Lösung einer schwachen Säure, die stark genug ist, um die Bindung zwischen den Schichten der ersten und zweiten biologischen Teil-' chen zu spalten, nicht aber stark genug, um die Bindung zwischen der ersten Schicht 12 aus biologischen Teilchen und der festen Oberfläche des Substrates, an der sie adsorbiert ist, zu spalten oder anders zu beeinflussen. Für die hierin beschriebenen Zwecke ist eine 0,1 normale Zitronensäurelösung geeignet. Der Konzentrationsbereich der Zitronensäure zur Erzielung der erwünschten Ergebnisse liegt zwischen 0,01 und 1,0 normaler Zitronensäure. Andere geeignete schwache Säuren, die verwendet werden können, sind 0,1 normale Malonsäure und 0,1 normale Ameisensäure. Stärkere Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure und Schwefelsäure können auch verwendet werden, jedoch in sehr viel geringeren Konzentrationen, d.h. etwa 0,01 normal. Die schwache Säurelösung, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, kann allgemein als eine Säurelösung beschrieben werden, welche das Substrat oder irgendein Material einer aufzubringenden- dritten Schicht nicht

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angreift und die vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 2 bis 5 aufweist, obwohl auch ein pH-Wert von 1,0 sich als zufriedenstellend erwiesen hat, wie im Falle von 0,1 normaler Chlorwasserstoff säure .

Es können auch alkalische und hochkonzentrierte Salzlösungen als Spaltmittel verwendet werden. Die brauchbaren alkalischen Lösungen haben einen pH-Wert im Bereich von 9 bis 13 und typischerweise ist eine 0,2 normale Natriumhydroxydlösung zur Spaltung der Bindung zwischen Eialbumin und seinem Antigen eingesetzt worden. Verschiedene Salzlösungen höherer Salskonzentrationen sind auch als Spaltmittel bekannt, wie die von HaCl und NaJ. So spaltet eine 1,79 molare NaCl-Lösung das Pneumokokkenpolysaccharid von. seinem Antikörper.

Wird z.B. ein Strahlungsmarkieren angewendet, dann kann die Aufcoradiographietechnik zum Nachweis der Strahlungsemmision unter- Verwendung eines speziellen photographischen Filmes, der- gegenüber Gammastrahlung empfindlich ist, benutzt werden, wobei dieser FiI)L benachbart zur benutzten Spaltmittellösung angeordnet wird. Die Anwesenheit Gammastrahlen abgebender Markierungen in der Lösung wird auf solchem Film leicht sichtbar wegen des sehr viel höheren Belichtens, verglichen mit dem normalen Hintergrundbelichtene Sind radioaktiv markierte dritte biologische Teilchen verwendet worden (vgl. Figur 3b), die hauptsächlich Gammastrahlen aussenden, dann kann der Strahlungszähler 17 ein üblicher Gammastrahlenzähler sein, der ein Rohr umfaßt mit einem Zähler bzw. Szintillatorkristall an dem öffnungsende des Rohres und einer Photokathoae am-Ausgangsende. Das Rohr, der Kristall und die Verbindungen für die-Vorspannung in dem Zähler sind die üblichen und deshalb nicht dargestellt. Der Zählerkristall, der z.B. aus Natriumjodid hergestellt sein kann, spricht auf auftreffende Gammastrahlen an und emittiert Lichtphotonen, die durch die nicht-dargestellte Photokathode angezeigt Werden und die in Spannungsimpulse umgewandelt werden entsprechend der Zahl der nachgewiesenen Zählungen. Die Ausgangsspannung der Photokathode wird zu einem geeigneten elektronischen und nicht-dargestellten Verstärker zur Verstärkung der Spannungszählimpulse geleitet. Der Ausgang des Verstärkers

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ist an den Eingang eines geeigneten nicht-dargestellten in Realzeit arbeitenden Anzeigegerätes gelegt_s um eine visuelle (Oszilloskop) oder hörbare- 'Lau.-sprseher) Anzeige zu geben oder sie kann auch an ein Speichergerät gelegt werden, wie ein Magnetband, um eine verspätete Ablesung zu gestatten.

Wird ein solches radioaktives Markieren angewandt, bei dem Betastrahlen von den markierten Einheiten ausgesandt werden, dann kann die Einrichtung zum Anzeigen der Markierung, z.B. ein Strahlungszähler, ein üblicher Betastrahlensahler sein, der ein abgeschlossenes Rohr umfaßt, das gasgefüllt ist und eine nicht-dargestellte Elektrode aufweist, die mit einer nicht-dargestellten Quelle relativ hoher Spannung verbunden ist, so daß die das Gas ionisierenden Betastrahlen und jede solche Gasionisation von einer, elektronischen nicht-dargestellten Verstärker und einem ebenfalls nicht-dargestellten Anzeigeinstrument nachgewiesen werden.

Ein Verteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, daß beim Vorliegen der Markierungen 14, ungeachtet ihrer Art oder Angliederung, in derart geringer Konzentration in der Masse der benutzten Spaltmittellösung 16, daß das Gerät 17 zum Anzeigen der Markierung keine zuverlässige Anzeige gibt, die Lösung 16 zu einer kleineren Menge 18 konzentriert werden kann, wodurch die Markierungen 14 ebenfalls konsentriert werden und einen zuverlässigeren Nachweis durch das Gerät 17 zum Nachweisen der Markierungen gestatten.

Wenn es erwünscht ist, kann das überzogene Substrat nach der Messung, wie sie in den Figuren 4 oder 5 dargestellt ist, einer Untersuchung durch die Einrichtung 17 zum Anzeigen der Markierungen unterworfen werden, wobei man im wesentlichen die gleiche Instrumentation und Techniken anwendet, wie sie oben beschrieben sind, und zwar kann dieses Untersuchen des überzogenen Substrates sowohl vor als auch nach der Spalt- und Spüloperation erfolgen, um eine differentielle Anzeige zu bestimmen.

In der obigen Beschreibung ist auf erste und zweite immunologisch reaktive biologische Teilchen Bezug genommen worden, wobei das

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zweite biologische Teilchen spezifisch zum ersten war. Diese Bezeichnungen sind mit Überlegung gewählt worden, und die immunologisch reaktiven biologischen Antigenteilchen, die verwendet und nachgewiesen werden können mit der vorliegenden Erfindung, sollen Hormone, Viren, Bakterien, Enzyme und andere Teilchen einschließen, die leicht gezüchtet oder in anderer Weise isoliert oder· gesammelt werden können oder die in menschlichem Serum oder anderen Testlösungen vorhanden sind. Die vorliegende Erfindung ist jedoch anwendbar auf jede Art Paar biologischer Teilchen, die miteinander reagieren. D.h. zusätzlich zur Anwendung auf immunologisch reaktive Antigen/Antikörper-Systeme schließt das erfindungsgemäße Verfahren auch andere Formen biologischer Wechselwirkungen zwischen großen Molekülen ein, die nicht auf immunologischen Grundlagen beruhen, wie z.B. das Verbinden von Enzymen mit ihren biologischen Substraten oder das Binden von Hämoglobin an Haptoglobin.

Die Lösung, in der man die.zweiten Teilehen vermutet, ist im allgemeinen eine menschliche Serumprobe, obwohl es auch eine andere Art von Lösung sein kann, die geeignet .ist für die jeweils untersuchten biologischen Teilchen. Beim direkten Testen, bei dem man einen Antikörper nachweisen will, wie im Falle der Syphilis oder Gonorrhöe, wird der Antikörper im menschlichen Serum eines Patienten nächgewiesen. Beim Inhibitionstest wiederum zum Nachweisen eines Antigens, z.B. des HAA, kann der Antikörper in einer Ziege, einem Kaninchen oder einem anderen geeigneten Tier gezüchtet werden und die geeignete Menge dieses tierischen Serums wird mit dem menschlichen Serum des zu testenden Patienten vermischt.

Alle Stufen der verschiedenen Beispiele können bei Zimmertemperatur- ausgeführt werden, d.h. bei einer Temperatur im Bereich von etwa 18 bis 25 °C. Doch ist die Temperatur in der vorliegenden Erfindung nicht kritisch.

Die Bezeichnung des Substrates 10 als "nicht-reaktiv" mit den biologischen Teilchen und der Markierungsschicht bezieht sich auf seine chemische und biologische Inertheit zu dem Ausmaß, daß es die biologischen Teilchen, die Markierungen oder das verwendete

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Spaltmittel nicht angreift oder zerstört. Das Substrat muß jedoch die Fähigkeit haben, die ersten biologischen Teilchen darauf als monomolekulare Schicht zu adsorbieren. In gleicher Weise ist das Material der Teilchen 15n nicht-reaktiv mit den biologischen Teilchen der Schichten 12 und 13 (und mit dem Substrat 10), doch hat es die Fähigkeit, die Schicht der zweiten biologischen Teilchen 13 (oder die Schicht 12 der ersten Teilchen bei Abwesenheit der zweiten Schicht) zu binden oder daran zu haften.

Die Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens einschließlich der Konzentrierung und Markierungsnachweisstufen, die nach dem Sammeln der Spaltmittellösung nach ihrer Anwendung ausgeführt werden, sind geeignet, in automatisierte^im großen Rahmen angewandten Testsystemen benutzt zu werden.

Außer den besonderen Ausführungsformen und Beispielen sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung selbstverständlich noch andere Modifikationen und "Variationen möglich. So kann eine Blutserumprobe quantitativ auf ein besonderes biologisches Teilchen mittels einer einfachen Variation untersucht werden. Eine Vielzahl von Behältern gleicher Größe wird verwendet, wobei die Größe ausreichend ist, um die anzuwendende Spaltmittellösung und Spülflüssigkeit aufzuneh-men. Vier Behä'lter und vier Substrate sind eine geeignete Zahl. Jedes Substrat wird in gleicher Weise mit der gleichen Menge eines besonderen ersten biologischen Teilchens in gereinigter Form, zunächst z.B. einem Hormon, für das der quantitative Test auszuführen ist, bedeckt. Dies ergibt die Ausbildung im wesentlichen gleichflächiger monomolekularer Schichten des Hormons auf jedem Substrat.

Die Blutserumprobe, die auf dieses Hormon geprüft werden soll, wirddn vier gleiche Teile geteilt und verschiedene bekannte Konzentrationen, z.B. a, 2a, 4a, 8a, des Antikörpers zu diesem gegebenen Hormon werden zu den vier Blutproben gegeben, um entsprechend der zugegebenen Antikorperkonzentration einen Teil oder das gesamte Hormon im Blutserum in den vier getrennten Teilen der Blutprobe zu konzentrieren. Angenommen, die Konzentrationen des

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Antikörper zum Hormon wären richtig ausgewählt, dann enthält ein oder mehrere der getrennten Teile der Blutprobe jetzt überschüssige Antikörper. Jeder der getrennten Teile der Blutprobe wird nun in Berührung gebracht,ζ.B. durch Eintauchen, mit der Hormonschicht auf einem getrennten Substrat für die gleiche Zeitdauer. Dann werden die Substrate herausgenommen und gespült.

Als nächstes werden die überzogenen Substratflächen dem Markierungsmedium ausgesetzt gemäß einem der oben beschriebenen drei Verfahren. Schließlich wird jedes Substrat mit der gleihen Menge Spaltlösung und wenn erforderlich Spülwasser in Berührung gebracht. Spaltlösung und Spülwasser für jedes Substrat werden in einem getrennten Behälter gesammelt. Die vier Behälter werden dann auf Radioaktivität untersucht. Die Hormonkonzentration wird quantitativ dadurch bestimmt, daß sie einen Wert zwischen den Konzentrationen a, 2a, 4a, 8a hat, bei dem eine beträchtliche Strahlung zuerst nachgewiesen wird, und der nächst tieferen Konzentration.

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Claims

Ansprüche

1.!Diagnostisches Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Ab- ^-^Wesenheit ausgewählter biologischer Teilchen in einer flüssigen Probe, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

Inberührungbringen einer Oberfläche eines Substrates mit ersten biologischen Teilchen, die spezifisch sind zu den ausgewählten biologischen Teilchen und als erste Schicht die Oberfläche überziehen,

Inberührungbringen der überzogenen Oberfläche des Substrates mit der Probenflüssigkeit für eine ausgewählte Zeitdauer, Aufbringen eines Markierungsmediums auf die überzogene Oberfläche, die in der vorigen Stufe entstanden ist, wobei das Markierungsmedium der überzogenen Oberfläche Markierungen verfügbar macht,

Inberührungbringen der überzogenen Oberfläche der vorherigen Stufe mit einer Spaltmittellösung, die selektiv die Bindung zerstören kann, die zwischen den ersten biologischen Teilchen und den ausgewählten biologischen Teilchen existieren mag, Abtrennen der Spaltmittellösung, die in der vorherigen Stufe benutzt worden ist, zusammen mit irgendwelchem darin enthaltenem Material, das von der überzogenen Oberfläche freigesetzt worden ist von dem Substrat und

Untersuchen des abgetrennten Spaltmittels und des darin enthaltenen Inhaltes auf die Anwesenheit von Ausstrahlungen der Markierungen, um die Anwesenheit der ausgewählten biologischen Teilchen in der Flüssigkeitsprobe anzuzeigen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß "das Substrat im wesentlichen planar ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Substrat nicht-planar ist.

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4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die mit den ersten biologischen Teilchen in Berührung gebrachte Oberfläche des Substrates metallisch ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die mit den ersten biologischen Teilchen in Berührung gebrachte Oberfläche des Substrates nicht-metallisch' ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß die ersten biologischen Teilchen Protein, Antigen oder Antikörper zu den ausgewählten biologischen Teilchen sind.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch g e -

k e n'n ζ e i c h- η e t , daß die zweiten biologischen Teilchen zellulare Teilchen, Viren oder Bakterien sind.

8. Verfahren nach Anspruch· 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Markierungsmedium eine Zusammensetzung enthält, die zum direkten Markieren chemisch reaktiv' mit'den biologischen Teilchen ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Markierungsmedium dritte biologische Teilchen enthält, die spezifisch reaktiv mit den ausgewählten biologischen Teilchen sind, wobei die dritten biologischen Teilchen vor dem Aufbringen auf die überzogene Oberfläche direkt markiert worden sind.

10. Verfahren nach Anspruch 1. bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Markierungsmedium haftende nicht-reaktive, nicht-biologische vormarkierte Teilchen enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß die nicht-reaktiven vormarkierten Teil-

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chen durch leichtes Besprühen als Aerosol als eine Schicht auf die überzogene Oberfläche aufgebracht werden.

12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß die Markierung Strahlen aussendet .

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß die Markierungen radioaktiv öder fluoreszierend sind.

14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß die Spaltmxttellösung eine Lösung einer schwachen Säure einer Base oder eines hochkonzentrierten Salzes ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß im Falle der Säurelösung der pH-Wert im Bereich von 1 bis 5 liegt.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß im Falle der alkalischen Lösung der pH-Wert im Bereich von 9 bis I3.liegt.

17. Verfahren nach Anspruch 1 bis l6, dadurch gekennzeichnet , daß die überzogene Oberfläche nach dem Inberührungbringen mit der Spaltmittellösung gespült wird und sowohl die Spaltmittellösung als auch das Spülmittel für •die nachfolgende Untersuchung benutzt werden.

18. Verfahren nach Anspruch"! bis l6, dadurch gekennzeichnet , daß weiter die Spaltmittellösung

zusammen mit dem nach der Abtrennung von dem Substrat darin enthaltenen Material vor der Untersuchungsstufe konzentriert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet , daß die überzogene Oberfläche des

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Substrates vor dem Behandeln mit der Spaltmittellösung auf Markierungsausstrahlungen untersucht wird.

20. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß die nicht-reaktiven vormarkierten Teilchen auf die überzogene Oberfläche aufgebracht werden und dort" eine poröse opake Schicht bilden.

21. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß die Schicht opak ist.

22. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Zusammensetzung radioaktiv oder fluoreszierend ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet , daß die Zusammensetzung Jod-125 enthält.

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