DE2638250C2 - Diagnostisches Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe, sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents
Diagnostisches Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe, sowie Vorrichtung zur Durchführung des VerfahrensInfo
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- DE2638250C2 DE2638250C2 DE19762638250 DE2638250A DE2638250C2 DE 2638250 C2 DE2638250 C2 DE 2638250C2 DE 19762638250 DE19762638250 DE 19762638250 DE 2638250 A DE2638250 A DE 2638250A DE 2638250 C2 DE2638250 C2 DE 2638250C2
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Description
Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Verfahren zum Be^immen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines
spezifischen Proteins in einer biologischen Probe durch
Aufbringen eines Metalls auf ein Substratmaterial,
lnberührungbringen des Substratmaterials mit einem wäßrigen Medium, welches das mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagierende Protein enthüll, um einen Teil oder das ganze Substratmaterial mit einer monomolekularen Schicht des spezifisch reagierenden
lnberührungbringen des Substratmaterials mit einem wäßrigen Medium, welches das mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagierende Protein enthüll, um einen Teil oder das ganze Substratmaterial mit einer monomolekularen Schicht des spezifisch reagierenden
ίο Proteins ?u überziehen,
Eintauchen des überzogenen Substratmaierials in die
Probe und Überprüfen des überzogenen Substnumaierials
zur Bestimmung, ob das Substrat eine bimolekulare oder eine monomolekulare Schicht aufweist.
Die Erfindung betrifft weiter eine Vorrichtung aus einem Substrat, das mit einem Metallüberzug versehen
ist an dem ein spezifisch reagierendes Protein haftet.
zur Durchführung des Verfahrens.
Verfahren und Vorrichtung der vorgenannten Art sind in der DE-OS 23 30 702 oder der DE-OS 24 33 246
beschrieben.
Veröffentlichungen, die in erster Linie Hintergrundmaterial für die vorliegende Erfindung bilden, sind:
»Optical Measurement of the Thickness of a Film Adsorbed from a Solution« von Irving Langmuir et al in Journal of the American Chemical Society, Band 59 (JuIi bis Dezember 1937, S. 1406);
»Optical Measurement of the Thickness of a Film Adsorbed from a Solution« von Irving Langmuir et al in Journal of the American Chemical Society, Band 59 (JuIi bis Dezember 1937, S. 1406);
»Immunological and Enzymatic Reactions Carried Out at a Solid-Liquid Interface« von Alexandre Rothen in
Physiological Chemistry and Physics, 5 (1973), S. 243-258;
»Interactions Among Human Blood Proteins at Interfaces« von Leo Vroman et al.. Federation Proceedings,
Band 30, Nr. 5 (September/Oktober 1971),
S. 1494-1502, und
»The Antibody-Antigen-Reation: A Visual Observation« von Ivar Giaever in Journal of Immunology, Band
110, Nr. 4 (Mai 1973), S. 1424-1425.
Immunologische Reaktionen sind hochspezifischc Wechselwirkungen, in denen ein Antigen mit einem entsprechenden zweiten biologischen Bestandteil reagiert, der spezifisch gegenüber dem Antigen ist, und im allgemeinen als der Antikörper bekannt ist, wobei ein immunologischer Komplex gebildet wird. Immunologische
Immunologische Reaktionen sind hochspezifischc Wechselwirkungen, in denen ein Antigen mit einem entsprechenden zweiten biologischen Bestandteil reagiert, der spezifisch gegenüber dem Antigen ist, und im allgemeinen als der Antikörper bekannt ist, wobei ein immunologischer Komplex gebildet wird. Immunologische
Reaktionen, die innerhalb eines biologischen Systems stattfinden, wie einem Tier oder einem Menschen, sind
lebenswichtig bei der Bekämpfung von Krankheit In einem biologischen System verursacht der Eintritt eines
fremden biologischen Bestandteils, z. B. des Antigens,
die Erzeugung des spezifischen Antikörpers gegenüber dem Antigen in einem Verfahren, das derzeit noch nicht
voll verstanden ist. Die Antikörper-Moleküle verfügen über chemische Bindestellen, die die am Antigenmolekül
ergänzen, so daß sich Antigen und Antikörper unier Bildung des immunologischen Komplexes miteinander
verbinden.
Antikörper werden durch biologische Systeme als Reaktion auf das Eindringen von Fremdkörpern erzeugt.
Der Nachweis von Antikörpern in einem biologisehen System ist daher von medizinisch diagnostischem
Wert bei der Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt worden ist Es wäre z. B. brauchbar,
menschliches Blut, Plasma oder ein Gewebe auf die Anwesenheit des Antikörpers gegenüber Syphilis oder Gonorrhöe
zu untersuchen. Umgekehrt hat auch der Nachweis gewisser Antigene in einem biologischen System
medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele für den diagnostischen Nachweis von Antigenen schließen den
Nachweis der menschlichen chorionischen Gonadotrophin-Proteinmoieküle
(abgekürzt HCG genannt) im Urin als einen Test auf Schwangerschaft und den Nachweis
der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle (abgekürzt HAA) im Blut in Aussicht genommener
Blutspender ein.
Die meisten Antigene sind Proteine oder enthalten Proteine als wesentlichen Bestandteil, während alle Antikörper
Proteine sind. Proteine sind große Moleküle hohen Molekulargewichtes, d. h, sie sind Polymere, die
aus Aminsäureketten bestehen. Das Antigen- und Antikörper-Protein
kann jedes mehrere Verbindungsstellen haben. Die fünf Hauptklassen von Antikörpern (die Immunoglobuline
Ig-G, Ig M, Ig A, Ig E und Ig D) sind jedes augenscheinlich durch mindestens zwei schwere
(lange) Peptidketten von Aminosäuren und mindestens zwei leichte (kurze) Peptidketten der Säuren charakterisiert,
in denen die Bindung zwischen d%;n Aminosäurecinhcilen
als Peptidbindung bekannt ist. Diese schweren und leichten Peptidketten sind in der allgemeinen Gestall
des Buchstaben »Y« orientiert und die aktiven oder Verbindungsstellen befinden sich an den äußersten Enden
der beiden Arme des Y-förmigen Antikörpers beim Ig G-Antikörper.
Zusätzlich zu der zwischen spezifischen Protein-Antigcncn
und spezifischen Protein-Antikörpern stattfindenden immunologischen Reaktion, die zur Bildung eines
Protein-Antigen-Protein-Antikörper-Komplexes führt, werden auch andere immunologisch komplexiercnde
Reaktionen zwischen immunologisch reaktiven ;Antigenen und Antikörpern umfaßt. Weiter werden
auch spezifische Reaktionen zwischen anderen biologischen Teilchen, wie Enzymen und deren Substraten, umfaßt.
Schließlich sollen die in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Begriffe »Antigen« und »Antikörper«
solche Begriffe wie Enzyme, Substrate von Enzymen und ähnliche biologische Teilchen mit umfassen.
Auch ist das Verfahren vielseitig genug, das Austauschen eines spezifischen Antikörpers durch das entsprechende
Antigen und des Antigens durch den entsprechenden spezifischen Antikörper zu gestatten.
So schließen z. B. die folgenden Systeme biologische Teilchen ein, welche die immunologischen Reaktionen,
die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben werden, ausführen können:
Viren, Bakterien und Bakteriengifte, Pilze, Parasiten, tierische Gewebe, tierische Körperflüssigkeiten und
ähnliche.
Im Hinblick auf Viren sind die Antigene Virenkulturen
oder Teile davon, und die dazu spezifischen Antikörper können hergestellt werden, indem man sie einem
lebenden Wert verabreicht. Beispielhafte Antigen-Antikörper-Komplexe in den folgenden Virensystemen sind
für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet: Röteln-Viruskultur (Antigen)-Röteln-Virus-Antikörper,
Polio-Viruskultur (Antigen)-Polio-Virus-Antikörper, die
Kultur des die bläschenförmige Mundschleimhautentzündung verursachenden Virus (Vesicular stomatitis Virus,
abgekürzt VSV) (Antigen)-VSV-Antikörper.
Im Hinblick auf Bakterien und Bakteriengifte sind die
Antigene die jeweiligen Bakterien oder Bakteriengifte oder deren Teile, und der Antikörper wird hergestellt
durch injektion in einen lebenden Wirt. Die folgenden Beispiele von Antigen-Antikörper-Paaren können in
dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden: Tetanustoxoid-Suspension (Antigen)-Tetanus-Antikörpcr,
Diphtherietoxin-Suspension (Antigen)-Diphtherie-Antikörper,
Neisseria gonorrhöesche Suspension (Antigen)-Gonorrhöe-Amikörper Treponema palladium-Suspension
(Antigen)-Syphilis-Antikörper.
Bei Pilzen sind die Antigene die antigenischen Extrakte
von Pilz-Suspensionen und der Antikörper ist der Pilz-Antikörper, der durch Injektion in einen lebenden
Wirt erzeugt wird. Antigen-Antikörper-Komplexe von Püzsystemen sind durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:
Aspergillusextrakt-Suspension (Antigen)-Aspergilluspilz-Antikörper,
Candidaextrakt-Suspension (Antigen)-Candidapilz-Antikörper.
Antigene und Antikörper in parasitischen Systemen werden in ähnlicher Weise erhalten wie bei Pilzen. Das
System Toxoplasma gondii-Extrakt (Antigen)-Toxoplasma gondii-Antikörper ist ein typisches Beispiel.
Mit der Bezeichnung »Polysaccharide« ist ein System gemeint, in dem das Antigen ein Kohlenhydrat-Antigen
isx. Ein Beispiel für ein solches Antigen-Antikörper enthaltendes
System ist Pneumococcus-Polysaccharides (AntigenJ-Pneumococcus-Antikörper.
Zusätzlich zu der typischen Enzym-Enzymsubstrat-Reaktion können Enzyme selbst oder Teile davon als
Antigene eingesetzt werden, und der Antikörper ist der jeweilige Enzym-Antikörper, der von einem lebenden
Wirt nach I/ijektion gebildet wird. Beispielhaft für Antigen-Antikörper-Komplexe
von Enzym-Systemen sind:
Trypsinextrakt-
Trypsin-Antikörper
Chymotrypsinextrakt-
Chymotrypsinextrakt-
Chymotrypsin-Antikörper
Pepsinextrakt-Pepsin-Antikörper
Ribonuclease Extrakt-Ribonuclease-Antikörper
Pepsinextrakt-Pepsin-Antikörper
Ribonuclease Extrakt-Ribonuclease-Antikörper
Thrombinextrakt-
Thrombin-Antikörper
Amylase-Extrakt-
Amylase-Extrakt-
Amylase- Antikörper
Penicillinase Extrakt-
Penicillinase Extrakt-
Penicillinase- Antikörper
Bei Hormonen wird der Antigenbestandteil üblicherweise in einem Hormonextrakt gefunden, und der Antikörper
ist der jeweilige Hormon-Antikörper, der von einem lebenden Organismus nach der Injektion gebildet
wird. Ein beispielhafter Antigen-Antikörper-Komplex
Insulin-Insulin-Antikörper.
Obwohl die nachfolgende Beschreibung hauptsächlich auf immunologische Wechselwirkungen zwischen
spezifischen Proteinantigenen und spezifischen Proteinantikörpern gerichtet ist, kann sie ebenso auf die vorbeschriebenen
Systeme und immunologisch reaktiven Antigene und Antikörper angewendet werden.
In der derzeit ausgeführten Weise beruht die diagnostische Verwendung der immunologisch aktiven Antikörper
und Antigene auf deren ausfällenden oder agglutinierenden Eigenschaften, die sich aus der immunologischen
Komplexierungs-Reaktion ergeben. Das klassische Beispiel dieser diagnostischen Verwendungen ist
' das Verfahren zur Bestimmung der Blutgruppe, bei dem Blutproben mit Alpha- und Beta-Serumantikörpern vermischt
werden und die Blutgruppe durch Beobachten einer auftretenden Agglutinierung in der Blutprobe bestimmt
wird.
absoluten Dicke erfordert außerordentliche Sorgfalt. lsi
andererseits die Konzentration der Antikörper in der Lösung gering, dann erfordert die Messung der absoluten
Dicke eine lange Zeit Aus praktischen Gründen ist daher der Nachweis immunologischer Reaktionen an
einer Oberfläche mit einem Eilipsometer nicht für diagnostische Zwecke eingesetzt worden.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung,
daß irgendein willkürlich ausgewähltes, immunolo-
Die Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein, wie sie derzeit ausgeführt wird, ist ein Inhibitionstest
Dieser Test wird ausgeführt, indem man eine
Menge des HCG-Antiserums in eine Urinprobe einmischt Dann gibt man Polystyrol-Kügelchen, die mit
HCG-Protein überzogen worden sind, in die so vorbereitete Urinprobe. Die Polystyrol-Kügelchen werden
agglutinieren, wenn, aber auch nur wenn HCG-Protein
in der Urinprobe nicht vorhanden ist Ist in einer Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden, dann komplexiert 10 gisch reaktives Antigen an einem Substrat nur in einer das HCG-Protein auf den Polystyrol-Kügelchen mit monomolekularen Schicht adsorbiert wird und daß nur dem vorher in die Urinprobe eingeführten HCG-Anti- ein spezifischer Antikörper für ein solches willkürlich serum, und die Kügelchen agglutinieren. Ist andererseits ausgewähltes Antigen sich mit diesem unter Bildung in der Urinprobe HCG-Protein in ausreichenden Men- einer bimolekularen Schicht mit dem Substrat verbingenvorhanden, dann komplexiert dieses mit dem vorher is den wird. Bei der Ausführung der vorliegenden Erfineingeführten HCG-Antiserum unter Bildung eines dung sind solche Schichten leicht und rasch nachweis-Komplexes, der aus der Probe ausfällt so daß das vor- bar. Diese Feststellung gestattet daher die Schaffung her eingeführte Antiserum für ein Komplexieren mit von Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung dem HCG-Protein auf den Kügelchen unter Agglutinie- des Verfahrens, die eine große Brauchbarkeit in medi/.irung nicht mehr verfügbar ist Gemäß der vorliegenden 20 nisch diagnostischen und pharmakologischen AnwcnilErfindung konnte der gegenwärtige HCG-Protein- düngen haben.
Menge des HCG-Antiserums in eine Urinprobe einmischt Dann gibt man Polystyrol-Kügelchen, die mit
HCG-Protein überzogen worden sind, in die so vorbereitete Urinprobe. Die Polystyrol-Kügelchen werden
agglutinieren, wenn, aber auch nur wenn HCG-Protein
in der Urinprobe nicht vorhanden ist Ist in einer Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden, dann komplexiert 10 gisch reaktives Antigen an einem Substrat nur in einer das HCG-Protein auf den Polystyrol-Kügelchen mit monomolekularen Schicht adsorbiert wird und daß nur dem vorher in die Urinprobe eingeführten HCG-Anti- ein spezifischer Antikörper für ein solches willkürlich serum, und die Kügelchen agglutinieren. Ist andererseits ausgewähltes Antigen sich mit diesem unter Bildung in der Urinprobe HCG-Protein in ausreichenden Men- einer bimolekularen Schicht mit dem Substrat verbingenvorhanden, dann komplexiert dieses mit dem vorher is den wird. Bei der Ausführung der vorliegenden Erfineingeführten HCG-Antiserum unter Bildung eines dung sind solche Schichten leicht und rasch nachweis-Komplexes, der aus der Probe ausfällt so daß das vor- bar. Diese Feststellung gestattet daher die Schaffung her eingeführte Antiserum für ein Komplexieren mit von Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung dem HCG-Protein auf den Kügelchen unter Agglutinie- des Verfahrens, die eine große Brauchbarkeit in medi/.irung nicht mehr verfügbar ist Gemäß der vorliegenden 20 nisch diagnostischen und pharmakologischen AnwcnilErfindung konnte der gegenwärtige HCG-Protein- düngen haben.
.Schwangerschaftstest vereinfacht werden, indem man Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Vcr-
HCG-Antiserum an die Polystyrolkügelchen haften läßt fahren zum ökonomischen Nachweisen immunologi-
und direkt eine Urinprobe untersucht In diesem Fall scher Reaktionen an einer Oberfläche der eingangs gewürden
die Polystyrol-Kügelchen agglutinieren, wenn, 25 nannten Art zu schaffen sowie eine Vorrichtung zur
aber auch nur wenn HCG-Protein in der Probe vornan- Durchführung des Verfahrens. Insbesondere sollen das
den ist
Der Grund für die Nichtanwendung dieses einfacheren Verfahrens scheint der zu sein, daß die verfügbaren
HCG-Antiseren komplexe Mischungen sind, die einen großen Anteil von anderen Bestandteilen als HCG-Antikörpern
enthalten. Der nach dem Stand der Technik erforderliche zusätzliche Aufwand zur Extrahierung der
Antikörper aus den HCG-Antiseren machten bei direkter Verwendung der Seren den Inhibitionstest nach dem
Stand der Technik vorteilhafter. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird jedoch ein
Verfahren geschaffen, durch das der einfache direkte Test ausführbar wird. Ein ernster Nachteil der Agglutinierungstests
ist der, daß die dabei verwendeten Teilchen aus einer Vielzahl von Gründen, die nichts mit der
immunologischen Agglutinierung zu tun haben, agglomerieren können, wodurch die Verläßlichkeit des Testes
verringert wird. Obwohl daher die Agglutinierungstests
mit großer Sorgfalt durch ausgebildete Techniker aus- 45 wäßrigen Medium, z. B. einer Lösung, erhältlich ist und
geführt werden, treten gelegentlich diagnostische Feh- das zum Nachweisen oder Reinigen seines entsprechcnler
auf. den spezifisch reagierenden Antikörpers benutzt wer-
Obwohl es bekannt ist, daß die Antigen-Antikörper- den soll. Das in Berührungbringen kann nach irgendci-Komplexierungs-Reaktion
stattfinden wird, wenn ein ner Technik erfolgen, z. B. indem man ein oder mehrere
Antigen (oder Antikörper) an einer Oberfläche adsor- 50 Tropfen des Mediums auf die Scheibe aufbringt oder
biert ist, ist diese Technik nicht sehr auf medizinische man diese teilweise oder ganz eintaucht. Je nach der
Diagnosen unter Verwendung von Objektträgern als angewendeten Technik und der Konzentration des AnSubstraten
angewendet worden. Die Komplexierungs- tigens im wäßrigen Medium wird das erste Antigen auf
reaktion an einer Oberfläche ist mit einem Eilipsometer der gesamten Oberfläche des Substrats oder einem Teil
beobachtet worden. Ein Ellipsometer ist ein komplexes 55 davon in einer monomolekularen Schicht haften. Ein
optisches Instrument mit dem es möglich ist, die Dicke Antigen wird nur in monomolekularer Schicht haften, es
Verfahren und die Vorrichtung in der Wirksamkeit vergleichbar
einem mit Gold überzogenen Substrat sein, aber billiger als dieses.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Substratmaterial verwendet wird, das objektträgerähnlich
ist und eine Metalloxidschicht zwischen dem Metall des Objektträgers und der monomolekularcn
Schicht aufweist.
Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung finden sich in den Unteransprüchen.
Das Substratmaterial kann Glas, Glimmer, Kunststoff, glasartiges Siliziumdioxid, Quarz oder ein ähnliches
Material sein, wobei ein Metall auf das Substratmaterial aufgebracht wird. Bevorzugt wird ein metallisierter
Glasobjektträger. Nach dem Versehen mit einer Metalloxidschicht wird der Objektträger mit einer Lösung
in Berührung gebracht, die ein erstes interessierendes Antigen enthält, das in einem relativ konzentrierten
von Filmen in der Größenordnung von 10 pm zu messen. Ellipsometer sind teuer und erfordern erfahrenes
Bedienungspersonal. Beim Studium von immunologischen Reaktionen mit Eilipsometern sind bisher zwei
Verfahren angewendet worden. Bei dem einen Verfahren läßt man die zu studierende Reaktion stattfinden
und danach legt man den Objektträger, auf dem die Reaktion stattgefunden hat, in ein Ellipsometer und
wird keine weitere Adsorption stattfinden. Das heißt, das Antigen wird an dem Substrat haften, nicht aber an
sich selbst Die zum Adsorbieren der monomolekularcn Schicht auf dem Substrat erforderliche Zeit ist eine
Funktion der Konzentration des Antigens in der Lösung und des Grades, mit dem die Lösung gerührt wird. Beispielsweise
überzieht eine l°/oige Rinderserumalbuminlesung
einen Objektträger in etwa 30 Minuten vollstän-
mißt die Filmdicke. Bei dem anderen Verfahren wird der 65 dig mit einer monomolekularen Proteinschicht.
Objektträger für die stattfindende immunologische Re- Die nächste Stufe besteht darin, das mit dem Antigen
aktion in dem Ellipsometej angeordnet, und man beob- überzogene Substrat in eine Lösung einzutauchen, von
achtet die Veränderung der Filmdicke. Die Messung der der man vermutet, daß sie den spezifisch reagierenden
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Antikörper für das erste Antigen enthält. Diese Lösung kann und tut es üblicherweise auch, viele Bestandteile
zusätzlich zu dem spezifisch reagierenden Antikörper enthalten, dessen Anwesenheit man nachweisen möchte.
Es wird jedoch kein anderer Antikörper als ein spezifisch reagierender Antikörper an der ersten Schicht auf
dem Substrat haften. Es ist selbstverständlich bekannt, daß gewisse biologische Substanzen gemäß der als
nicht-spezifisches Haften bekannten Erscheinung sich anlagern können. Solche Substanzen finden sich in Seren
usw. Es gibt jedoch eine Reihe von Möglichkeiten, das nicht-spezifische Haften zurückzudrängen, von denen
die bequemste das Verdünnen des solche Substanzen enthaltenden Mediums zu sein scheint. Ist der spezifisch
reagierende Antikörper nicht vorhanden, dann wird das Substrat nach dem Eintauchen in die Lösung, in
der man den spezifisch reagierenden Antikörper vermutet hat, doch immer nur eine monomolekulare Antigenschicht
aufweisen. Ist dagegen der spezifisch reagierende Antikörper in der Lösung vorhanden, dann findet ein
immunologisches Komplexieren zwischen dem ersten Antigen und seinem entsprechenden spezifisch reagierenden
Antikörper statt, und das Substrat wird nach einer gewissen Zeit eine bimolekulare Schicht tragen.
Die für die Adhäsion einer vollständigen zweiten monomolekularen Schicht auf dem überzogenen Substrat erforderliche
Zeit ist wieder eine Funktion der Konzentration des entsprechenden spezifisch reagierenden Antikörpers
in der Lösung. Für Antikörper im Blutserum kann dies in Abhängigkeit von der Konzentration von
Minuten bis zu einem Tag dauern.
Die relativen Filmdicken kann man elektrisch bestimmen. Die an dem Substrat haftenden Proteinschichten
sind elektrisch isolierend. Man bringt daher einen Quecksilbertropfen oder eine andere Elektrode auf der
oberen Proteinschicht an. Die obere Proteinschicht ist entweder das erste Antigen, wenn die Lösung, in der
man den spezifisch reagierenden Antikörper vermutete, einen solchen nicht enthielt oder es ist der spezifisch
reagierende Antikörper, wenn ein solcher in der Lösung enthalten war. Der Metallfilm auf dem Substrat oder das
Metallsubstrat und der Quecksilbertropfen stellen daher die beiden leitenden Platten eines elektrischen Kondensators
dar, der durch eine isolierende Schicht, die entweder eine monomolekulare oder eine bimolekulare
Schicht von Antigen oder Antikörpern ist, getrennt sind. Die elektrische Kapazität dieses Kondensators wird
mittels eines geeigneten Instrumentes gemessen, z.B. einer Heathkit Impedanz Brücke Modell IB-28. Die
elektrische Kapazität von Kondensatoren mit einer bimolekularen dielektrischen Schicht variiert etwa um einen
Faktor 2 bis 5 gegenüber einem Kondensator fnii
einer monomolekularen Schicht
Weitere Methoden zum Bestimmen, ob das Substrat eine mono- oder bimolekulare Proteinschicht aufweist,
sind in den obigen DE-OS angegeben, auf die hiermit Bezug genommen wird.
Gemäß bisher ausgeführter Tests sind die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die ein Substrat
mit Metallkügelchen verwenden und wobei ein Metall, z. B. Titan, bedeckt mit einem Oxidüberzug, z. B.
einem Titanoxid, eingesetzt wird, in der Brauchbarkeit einem Goldsubstrat vergleichbar. Weiter wurde bestimmt,
daß diese Ausführungsform in Abhängigkeit von der Dicke der interessierenden Filme unterschiedliche
Empfindlichkeiten hat Im besonderen Fall weisen die größte Empfindlichkeit Substrate mit Metallkügelchen
auf. deren Filme Dicken unterhalb von etwa 20 nm haben. Die Gold- und anderen Substratformen haben
die größte Empfindlichkeit für Filme, die 3 nm in der Dicke übersteigen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert.
Ein diagnostischer Test auf Gonorrhöe wurde folgendermaßen ausgeführt:
Ein Glasobjektträger wurde mit einer Titanschicht metallisiert und die Oberflächenschicht dann oxidiert
unter Bildung einer Deckschicht aus Titanoxid. Dann löste man Neisseria-Gonorrhöe-Extrakt in Salzwasser,
um eine Konzentration von 1 mg/ml zu erzeugen. Ein Tropfen der Lösung des Antigens wurde im Zentrum
des Objektträgers aufgebracht. Der Objektträger wurde in einer Feuchtigskeitskammer (Kunststoffbehälter
gefüllt mit feuchten Schwämmen) bei Zimmertemperatur (23°C) inkubiert, bis das Antigen an der Oxidoberfläche
haftete (10—30 Minuten). Der Objektträger wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und mit einem
Luftstrahl trockengeblasen. Zu diesem Zeitpunkt kann der Objektträger zur späteren Verwendung gelagert
werden. Für diese Verwendung wird der Objektträger in Blutserum eingetaucht, welches den Antikörper zum
Neisseria-Antigen enthält, wobei das Gesamtvolumen 2 ml beträgt. Objektträger und Antikörperlösung werden
in einem Plastikbehälter, der auf einer Schüttelvorrichtung befestigt ist, 12 Stunden bei 23° C inkubiert
Nach der Inkubation wird der Objektträger wieder mit destilliertem Wasser gewaschen. Wenn nach dem
Trocknen ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck im Zentrum des Objektträgers beobachtet wird, zeigt
dies eine positive Reaktion. In Fällen, in denen das Blutserum keine Gonorrhöe-Antikörper enthält, bildet sich
keine bimolekulare Schicht, und man sieht keinen Fleck.
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Claims (11)
1. Diagnostisches Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen
Proteins in einer biologischen Probe durch Aufbringen eines Metalls auf ein Substratmaterial,
Inberiihrungbringen des Substratmaterials mit einem wäßrigen Medium, welches das mit dem genannten
spezifischen Protein spezifisch reagierende Protein enthält, um einen Teil oder das ganze Substratmaterial
mit einer monomolekularen Schicht des spezifisch reagierenden Proteins zu überziehen,
Eintauchen des überzogenen Substratmaterials in die Probe und Überprüfen des überzogenen Substratmaterials
zur Bestimmung, ob das Substrat eine bimolekulare oder eine monomolekulare Schicht
aufweist,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Substratmateria! verwendet wird, das objektträgerähnlich
ist und eine Metatioxidschicht zwischen dem Metall des Objektträgers und der monomolekularen
Schicht aufweist
2. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet,
daß das spezifische Protein entweder ein Antigen oder ein Antikörper ist und dementsprechend
das spezifisch reagierende Protein ein Antikörper oder Antigen ist
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen abgeleitet ist von einem
Bakterium, einem Virus, einem Pilz, Säugetiergewebe oder Säugetierkörperflüssigkeiten.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Anti-Immunoglobulin
ist
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper aus der Klasse Immunoglobulin
Ig G ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Metall durch Überziehen des Substratmaterials mit einem Metallfilm aufgebracht
wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet daß das Metall Titan und das Metalloxid
ein Titanoxid ist.
8. Vorrichtung aus einem Substrat das mit einem Metallüberzug versehen ist, an dem ein spezifisch
reagierendes Protein haftet, zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß das Substrat ein Objektträger ist und daß eine Metalloxidschicht zwischen
dem Metallüberzug und der Schicht des spezifisch reagierenden Proteins vorhanden ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallüberzug aus Titan und die
Metalloxidschicht aus Titanoxid besteht.
10. Verwendung des Verfahrens oder der Vorrichtung
nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Nachweisen des Antigens oder Antikörpers.
11. Verwendung des Verfahrens oder der Vorrichtung
nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Nachweis von Gonorrhöe mittels Neisseria Gonorrhöe-Antigen.
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19762638250 Expired DE2638250C2 (de) | 1975-08-27 | 1976-08-25 | Diagnostisches Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe, sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
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BR (1) | BR7605744A (de) |
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IT (1) | IT1076948B (de) |
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