Die Erfindung betrifft das neue wasserunlösliche Antibiotikum Papulacandin, das in Form seiner Hauptkomponenten A und B sowie mehrerer Nebenkomponenten, oder von Mischungen von 2 oder mehreren dieser Komponenten vorliegt (solche Mischungen werden der Einfachheit halber im folgenden als Papulacandin [Antibiotikum A 32283] bezeichnet), und Derivate des Antibiotikums sowie Präparate, welche diese Verbindungen enthalten, und Verfahren zur Herstellung dieser Stoffe.
Das Antibiotikum Papulacandin entsteht bei der Züchtung eines neuen Mikroorganismus, der in unseren Laboratorien unter der Bezeichnung A32283 aufbewahrt wird. Der Stamm A 32283 ist der Art Papularia sphaerosperma (Pers.) Höhnel, früher als Arthrinium phaesospermum (Corda) Ellis bezeichnet, Ordnung Moniliales, zuzuordnen. Die Art ist von Ellis in Ellis M.B. Dematiaceous Hyphomycetes 1971, p. 569 unter Arthrinium phaeospermum eingehend beschrieben. Der Stamm A 32283 wurde beim Northern Regional Research Lab. US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois unter der NR. NRRL 8086 deponiert. Er wurde 1969 am Sustenpass (Schweiz) als Saprophyt auf abgefallenen Blättern einer nicht bestimmten Pflanzenart gefunden. Die Isolierung erfolgte auf einem Hefe - Nähragar folgender Zusammensetzung: Hefeextrakt 4 g/l.
Malzextrakt 10 g/l, Glucose 4 g/l, Agar Agar 20 g/l, pH nach Sterilisation: 7.0
Das Antibiotikum Papulacandin wird bei der Züchtung der Art Papularia sphaerosperma, insbesondere des Stammes NRRL 8086 gebildet. Zur Herstellung von Papulacandin wird Papularia sphaerosperma oder eine Papulacandin bildende Mutante in einer wässerigen, eine Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährlösung aerob gezüchte, bis die Nährlösung eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt, und das Antibiotikum Papulacandin hierauf isoliert. Das Antibiotikum Papulacandin bildende Mutanten können z. B. unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.
Als Kohlenstoffquelle sind beispielsweise zu nennen: assimilierbare Kohlenhydrate, z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Mannit, Stärke, Glycerin, ferner Inosit. Als stickstoffhaltige Nährstoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Phosphate von Alkali- oder Erdalkalimetallen, von Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelkolben oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 400C, vorzugsweise ca. 230C. Eine wesentliche antifungische Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 1'/2 bis 5 Tagen. Vorzugsweise kultiviert man in mehreren Stufen, d.h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in flüssigem Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, z. B. im Verhältnis
1:20, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man beispiels weise, indem man ein durch ca. 14tägiges Wachstum auf einem festen Nährboden erhaltenes versportes Mycel in ein flüssiges Medium überimpft und 48 Stunden wachsen lässt.
Die Isolierung des Antibiotikums aus dem Kulturmedium erfolgt nach an sich bekannten Methoden unter Berücksichti gung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigen schaften des Antibiotikums.
So kann das Antibiotikum beispielsweise aus der unfiltrierten Kulturbrühe mit einem mit Wasser wenig mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Essigester, extrahiert werden.
Dieses sogenannte whole-broth -Verfahren wird vorzugsweise angewendet, weil sich das Antibiotikum sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat befindet. Das Antibiotikum sammelt sich in der wasserhaltigen organischen Phase, z. B. im Essigester an und diese Phase wird von der extrahierten Kulturflüssigkeit und dem Schlamm (extrahiertes Mycel und Nährlösungsfestbestandteile) abgetrennt. Der bei der Extraktion erhaltene Rückstand kann einer oder mehreren erneuten Extraktionen mit dem gleichen oder einem anderen Lösungsmittel unterworfen werden.
Man kann auch das z. B. mit Filterhilfsmitteln abfiltrierte Mycel oder das Kulturfiltrat allein extrahieren. Das mit Wasser gewaschene Mycel (mitsamt dem Filterhilfsmittel) wird vor zugsweise mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. einem Niederalkanol mit 1-4 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, ferner Dimethylsulfoxid, Formamid, Dimethylformamid, Methylacetamid, Dioxan, Tetrahydrofuran, Aceton, oder mit Mischungen dieser Lösungsmittel mit Wasser, insbesondere mit wasserhaltigem Methanol, extrahiert. Das Kulturfiltrat wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel z. B. mit Essigester, mit Wasser nicht mischbaren Alkohol wie n-Butanol, höheren aliphatischen Ketonen z. B. Methylisopropylketon, extrahiert.
Zur Reinigung des nach Abdampfen des Lösungsmittels erhaltenen Rohproduktes kann man sich z. B. der Extraktion, der Fällung, der Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmittelphasen oder der Absorption, vor allem Chromatographie bedienen. So können aus dem Rohprodukt, z. B.
Essigesterextrakt der Kulturbrühe, erhebliche Anteile an Begleitstoffen durch aufeinanderfolgende einfache Reinigungsprozesse wie Extraktion des getrockneten oder gelösten Rohproduktes mit Lösungsmitteln, in denen das Antibiotikum unlöslich ist, z. B. Kohlenwasserstoffen wie Petroläther, Cyclohexan, oder wasserfreien halogenierten Kohlenwasserstoffen wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, entfernt werden. Man kann auch das Rohprodukt lösen, z. B.
in Methanol, und durch Adsorptionsmittel wie Aktivkohle, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aluminiumoxid oder Mischungen davon oder Adsorptionsharze, z. B. vernetzte Dextrane wie Sephadex (der Fa. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) von Begleitstoffen abtrennen. Beispielsweise kann das Rohprodukt durch wiederholte Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel, zweckmässig mit geringen Zusätzen von Aktivkohle, gereinigt werden. Das Antibiotikum wird vorzugsweise nach dem Gradientenverfahren mit Mischungen von Chloroform oder Tetrakohlenstoff und Methanol eluiert, wobei der prozentuale Gehalt des stärker polaren Lösungsmittels stufenweise gesteigert wird. Wenn man den durch Extraktion der Kulturbrühe gewonnenen Extrakt an einer Mischung von Kieselgel mit z. B. 5 Gew. Prozent Aktivkohle und z. B.
Chloroform/Methanol als Elutionsflüssigkeit chromatographiert, findet man nahezu die gesamte Menge des aus der Kulturbrühe extrahierten Antibiotikums auf die Eluate der Methanolkonzentrationen 5-20 % verteilt.
Die oben erwähnte Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmittelphasen kann auch als Gegenstromverteilung mit einer Craig-Apparatur vorgenommen werden. Als Lösungsmittelsystem dient beispielsweise eine Mischung von Essigester, Cyclohexan, Methanol und Wasser.
Zur Gewinnung der einzelnen einheitlichen Komponenten des Antibiotikums kann ihre Trennung und Isolierung z. B.
nach der Methode derpräparativen Dünnschichtchromatographie unter den für den analytischen Nachweis beschriebenen Bedingungen erfolgen. Vorteilhafter ist die Trennung mittels Säulenchromatographie, wobei als Adsorptionsmittel z. B. Kiesel gel mit einem Gehalt von 1-5 Prozent Aktivkohle benutzt und die Elution vorzugsweise nach dem Gradientenverfahren mit einer Mischung von Chloroform und Methanol bewirkt wird.
Die Steigerung der Konzentration des polareren Lösungsmittels erfolgt zweckmässig in kleineren Prozentualen Abstufungen, z. B. 5-20 Methanol, oder man arbeitet nach der kontinuierlichen Gradientenelutionsmethode. Das Antibiotikum wird vorzugsweise bei einer Methanolkonzentration von 10% eluiert. Das Reinigungsverfahren kann gegebenenfalls wiederholt werden.
Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (z. B. mit Chloroform-Methanol oder mit Essigester-Aceton-Wasser als Elutionsmittel) und Bioautographie mit Candida albicans kann man mindestens wei antibiotisch aktive Komponenten, Papulacandin A und Papulacandin B isolieren, deren Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel in Tabelle I angegeben sind; System 1 bezeichnet Chloroform-Methanol (4:1), zweimaliges Durchlaufen; System 2 bezeichnet Essigester Aceton-Wasser (72:24:4), zweimaliges Durchlaufen.
Tabelle I
Substanz System 1 System 2
KomponenteA 0,35 0,41
Komponente B 0,27 0,32 Ca. 75 % des Antibiotikums besteht aus der Hauptkomponente B, ca. 10% aus der Komponente A.
Für die Komponenten A und B wurden im Reihenverdünnungstest mit Candida albicans als Testorganismus minimale Hemmkonzentrationen (MIC) zwischen 0,006 und 0,1 y/ml gefunden.
Zum Testieren der Antibiotikawirkung in den einzelnen Isolierungsstufen - wie auch im Kulturmedium - eignet sich als Testorganismus besonders gut Candida albicans.
Das Antibiotikum besteht - der Elementaranalyse der Hauptkomponenten A incl. B gemäss - nur aus den Elemen tenC,HundO.
Das Antibiotikum Papulacandin B weist folgende chemische and physikalische Eigenschaften auf:
Es ist eine schwach saure, in Pulverform weisse Substanz.
Sie ist löslich in Alkoholen, z. B. Niederalkanolen wie Methanol, Aethanol, n-Propanol, sowie in Ketonen, z. B. Diniederalkylketonen wie Aceton, Methylisobutylketon, ferner in Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid; sie ist schwer löslich in Essigester und chlorierten Kohlenwasserstoffen wie Methylenchlorid, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff (10-100 mg/ Liter); in Wasser, Petroläther, Äther, Hexan ist die Verbindung praktisch unlöslich. F. 193-197 (Zers.).
Elementaranalyse für C47H64017:
C H berechnet 62,65% 7,16% gefunden 61,28% 7,18% [a]D = + 50,0 + 1" (c = 0,46 in Methanol).
UV-Spektrum in Äthanol: X max 232 nm (E = 42 000)
240 nm (E = 42 400)
268 nm (E = 44 800)
300 nm (E = 31 200)
IR-Spektrum in KBr, s. Beispiel 3
100 MHz- NMR-Spektrum, s. Fig. 1.
Aufgrund der dampfdruck-osmometrischen Molekulargewichtsbestimmung des Acetylderivats kann das Molekulargewicht zu etwa 900-950 geschätzt werden. Das Antibiotikum besitzt keine freien Carboxyl- und keine O-Methylgruppen. Im Massenspektrum sind nur kleinere Fragmente erkennbar. Ein Molekulion fehlt. Im l3C-NMR.-Spektrum sind die Signale von 45-48 C-Atomen feststellbar. Zusammen mit den Ergebnissen der Elementaranalyse und der Abbauversuche von Papulacandin lässt sich folgende Bruttoformel berechnen C47H64017.
Mit Essigsäureanhydrid und Pyridin konnten mehrere Hydroxylgruppen, davon 2 phenolische, acetyliert-werden. Die Anzahl der Acetylgruppen lässt sich spektroskopisch nur schwer abschätzen. Im 100 MHz-NMR-Spektrum sind bei ca.
2 ppm die Signale mehrerer Acetylgruppen sichtbar. Aufgrund der Abbauversuche dürften 9 Acetylgruppen vorhanden sein.
Das Molekulargewicht wurde osmometrisch zu 1267 bestimmt.
Für das Acetylderivat wurden folgende physikalisch-chemische Daten erhalten.
Elementaranalyse fürC6sHs2026:
C H berechnet 61,02% 6,46% gefunden 60,74% 6,50%
UV-Spektrum (in Äthanol) hmax 216 nm (E = 23 200)
242 nm (E = 25 600)
268 nm (E = 27 600)
295 nm (Schulter).
IR-Spektrum, s. Beispiel 5 [a]D = -6fl" (c= 0,765 in Chloroform).
Bei der Hydrierung von Papulacandin B wurden 7 Mol Wasserstoff aufgenommen. Im lH-NMR.-Spektrum des Hydrierungsproduktes sind alle Signale von olefinischen Protonen verschwunden. Zwei aromatische Protonen bei 6,3 ppm sind noch sichtbar. Das IR-Spektrum in KBr ist in Beispiel 6 angegeben. Das Hydrierungsprodukt weist folgende physikalisch-chemische Daten auf:
Elementaranalyse für C47H78017:
C H O berechnet 61,69% 8,59% 29,72% gefunden 60,94% 8,56% 30,10% F.125-130 C
UV-Spektrum (in Äthanol) h max. 270 nm (E = 3100) [a]D = +7 +1" (c = 0,214 in Methanol).
Das Antibiotikum Papulacandin Komponente A weist folgende chemische und physikalische Eigenschaften auf: Es ist eine schwach saure, in kristalliner Form weisse Substanz, die die gleichen Löslichkeitseigenschaften wie die Komponente B aufweist.
F. 171-1730C (Zersetzung)
Elementaranalyse
C H gefunden 61,88% 7,34%
UV-Spektrum (in Äthanol): max 232 nm Schulter
242 nm (Emax = 425)
265 nm (Emax = 520)
IR-Spektrum in KBr, s. Beispiel 3 [a]i7, +30 rel" (c = 0,419 in Methanol).
Die Figur 2 zeigt das 100 MHz-NMR.-Spektrum. Papulacandin A besitzt keine freien Carboxyl- und O-Methylgruppen. Im Massenspektrum sind nur kleinere Fragmente erkennbar. Ein Molekülion fehlt. Folgende Bruttoformel ist wahrscheinlich für Papulacandin A C 5o-53H72-75O17-19.
Mit Essigsäureanhydrid und Pyridin konnten verschiedene Hydroxylgruppen acetyliert werden. Das IR-Spektrum des Acetylderivates in Methylenchlorid ist in Beispiel 7 angegeben. Die Anzahl der Acetylgruppen lässt sich nur schwer abschätzen. Vermutlich sind 9-11 Acetylgruppen vorhanden.
Das Acetylderivat von Papulacandin A weist folgende physikalisch-chemische Eigenschaften auf: Elementaranalyse:
C H O gefunden 61,91% 7,22% 30,81% UV-Spektrum (in Äthanol) max 240 nm (Emax = 270)
262 nm (Emax = 330) [a]D = - 15 (c = 0,249 in Chloroform) Bei der Mikrohydrierung von Papulacandin A werden 7 Mol Wasserstoff aufgenommen.
Strukturaufklärung von Papulacandin B
Bei der alkalischen Hydrolyse von Papulacandin B in 0,5 N.-methanolischer Kaliumhydroxid-Lösung lassen sich 3 Bruchstücke isolieren.
Formelschema 1
Alkalische Hydrolyse von Papulacandin B
EMI3.1
<tb> <SEP> Papulacandin <SEP> B
<tb> <SEP> 0,5NKOH
<tb> <SEP> CH30H/H20 <SEP> 2Std./RT
<tb> ROOC <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> VH <SEP> HO <SEP> CH2 <SEP> CH2S
<tb> <SEP> > 0S <SEP> X0v0 <
<tb> <SEP> = <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> H3 <SEP> 3 <SEP> yÜ2Oi <SEP> 00/\W
<tb> <SEP> tI <SEP>
<tb> <SEP> la: <SEP> R <SEP> = <SEP> H: <SEP> C15H2503 <SEP> H
<tb> <SEP> lb: <SEP> R <SEP> = <SEP> CH3 <SEP> M+306
<tb> <SEP> 6-Hydroxy-7,13-dimethylpentadeca- <SEP> 3 <SEP> C19H26013
<tb> <SEP> 1,3,7,9-tetra-en-carbonsäure
<tb> <SEP> v
<tb>
EMI3.2
2a: R=H: C1oH1403 2b:
R= CH3 7-Hydroxy-nona- 1,3 ,5-trien-cnrbonsäure
1) 6-Hydroxy-7, 1 3-dimethyl-pentadeca- 1,3 ,7,9-tetra-en- carbonsäure-methylester
Die Verbindung wurde durch Extraktion der Reaktionslösung mit Essigester bei pH 7,5 und anschliessende Veresterung mit Diazomethan erhalten.
Die Struktur dieser 4fach ungesättigten C-16-Fettsäure wurde folgendermassen bewiesen (s. Formelschema 2):
EMI4.1
Acetylierung des Methylesters 1b ergab das Monoacetat 5 mit der Masse 348. Die 13-Stellung der Methylgruppe ergab sich aus der Interpretation des 13C-NMR.-Spektrums von 5. Das Hydrierungsprodukt 6 von 5 zeigte im MS ein Molekülion bei m/e 356. Hydrierung des Methylesters 1b anderseits ergab 7 Hydroxy-8, 14-dimethyl-palmitinsäure-methylester 7, dessen Molekülion im MS bei m/e 314 gefunden wurde. Dessen Monoacetat war wiederum identisch mit der oben beschriebenen Verbindung 6. Die postulierte Struktur des aliphatischen Restes wurde dann durch einen Ozan-Abbau des Methylesters lb bewiesen.
Dabei konnten aus dem Reaktionsgemisch gaschromatographisch Oxalsäuredimethylester 8 und 4 Methylcapronsäure-methylester 9 durch Vergleich mit authentischem Material nachgewiesen werden.
2) 7-Hydrox-nona- 1,3,5,-trien-carbonsäuremethylester
Die Verbindung wurde durch Extraktion der Reaktionslö sung mit Essigester bei pH 2,5 und anschliessende Veresterung mit Diazomethan erhalten. Mit Hilfe von UV.-, IR-, und
Massenspektrum (MS, mit Hochauflösung) und NMR.-Spektroskopie (mit Doppelresonanzversuchen) des Methylesters konnte die oben postulierte Struktur aufgestellt werden.
Die Struktur dieser 3fach ungesättigten Fettsäure wurde durch Oxidation des Methylesters mit CrO3 (Jones-Reagens) zum entsprechenden Keton 4 bestätigt:
EMI5.1
Im MS des Ketons ist ein Molekülion bei m/e 194 vorhanden.
Im NMR-Spektrum ist das Proton in 7-Stellung verschwunden.
3) Zuckerteil Ct9H26Ol3
Dieses Bruchstück wurde aus der restlichen Reaktionslösung nach Neutralisation auf pH 7,5 durch Chromatographie an Sephadex - LH-20 erhalten.
Die Interpretation des MS, der 100 MHz- und 360 MHz NMR.-Spektren und des '3C-NMR-Spektrums mit off-Resonanz-Entkopplung des Acetats 10a (siehe Formelschema 3)
Formelschema 3: Abbau des Zuckerbruchstücks
EMI5.2
EMI6.1
<tb> <SEP> Eornc!sch-:ma <SEP> 3:
<tb> R3 <SEP> ? <SEP> Abbau <SEP> des <SEP> Zucke:-bmchs,ücks
<tb> <SEP> oc <SEP> CII <SEP> 2011
<tb> <SEP> t <SEP> ,OCs <SEP> /
<tb> <SEP> OR <SEP> ( < <SEP> 3
<tb> <SEP> OR <SEP> 3
<tb> <SEP> r= <SEP> U <SEP> JO
<tb> 13a: <SEP> R <SEP> = <SEP> H <SEP> : <SEP> a-D-Form <SEP> 3
<tb> 13b: <SEP> R <SEP> = <SEP> H:P-D-Form <SEP> 15:R= <SEP> H:M+:328 <SEP> yIo
<tb> 14a: <SEP> R <SEP> = <SEP> COCH3: <SEP> a-D-Form <SEP> 16: <SEP> R= <SEP> -COCH3: <SEP> M+: <SEP> 496.
<SEP> 9 <SEP> oOl
<tb> 14b: <SEP> R <SEP> = <SEP> COCH3: <SEP> ss-D-Form
<tb> <SEP> OL
<tb> <SEP> NOCH3
<tb> <SEP> 17: <SEP> mm <SEP> 194
<tb> spricht für die vorgeschlagene Struktur. Im MS des Acetats 10a wird ein Molekülion bei m/e 840 gefunden. Acetylierung mit Deutero-Essigsäureanhydrid ergab 10b, dessen Molekülion im MS bei m/e 867 gefunden wurde. Damit ist die Anwesenheit von 9 Acetylgruppen bewiesen.
Die Methanolyse von 3 ergab keine befriedigenden Ergebnisse. Vor allem konnte das aromatische Bruchstück nicht isoliert werden. Daher wurde 3 mit Diazomethan in das Dimethylderivat 11 übergeführt, das nach Acetylierung ein Heptaacetat 12 mit M+ bei m/e 784 lieferte. Methanolyse von 11 lieferte dann 3 Bruchstücke, nämlich Methyl-ct-D-galacto- pyranosid 13a, wenig Methyl-B-D-galacto-pyranosid 13b, deren Tetraacetate 14a und 14b mit authentischem Material identisch waren, und Verbindung 15, die im MSein Molekülion bei m/e 328 (Hochauflösung: ClsH200s) lieferte. Acetylierung von
15 lieferte das Tetraacetat 16 mit M+ bei m/e 496. Perjodatspaltung schliesslich von 15 mit Perjodsäure ergab Verbindung
17, die im MS ein Molekülion bei m/e 194 zeigte.
Aufgrund der Interpretation des 360-MHz-NMR.-Spektrums von 10a ist der Galactoserest ssglycosidisch mit dem restlichen Teil des Moleküls verknüpft.
Addiert man die Bruttoformeln der 3 gefundenen Bruchstücke unter der Annahme, dass die beiden Fettsäuren esterartig mit dem Zuckerbruchstück verknüpft sind, kommt man zu folgender Bruttoformel für Papulacandin B: C47H64017 MG 900. Sie stimmt mit den Ergebnissen der Elementaranalyse überein.
Aufgrund weiterer analytischer Untersuchungen, insbesondere des 360 MHz NIMR- und 13C-NMR-Spektrums und der Resultate der Massenspektroskopie konnte folgende Formel für Papulacandin B ermittelt werden:
EMI6.2
Struktur von Papulacandin A
Nach spektroskopischen Vergleichen von Papulacandin A und Papulacandin B und präliminären Hydrolyseversuchen enthält Komponente A ebenfalls 6-Hydroxy-7,13-dimethylpentadeca-1,3,7,9-tetraen-carbonsäure und das gleiche Zukkerbruchstück und unterscheidet sich vermutlich in der zweiten Fettsäure durch 1 zusätzliche Methyl- und 3-4 zusätzliche Methylengruppen.
Aufgrund ähnlicher analytischer Untersuchungen wie die oben für Papulacandin B erwähnten liess sich für Papulacandin A folgende Formel ermitteln:
EMI6.3
Unter Derivaten des Antibiotikums sind im vorangehenden wie im folgenden einerseits Ester des Antibiotikums, andererseits Hydrierungsprodukte und deren Ester zu verstehen. Ester sind beispielsweise solche, in denen die alkoholischen Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren oder Thiocarbonsäuren mit 120 Kohlenstoffatomen verestert sind. Solche Säuren sind vor allem gegebenenfalls substituierte Niederalkansäuren mit 1-6 Kohlenstoffatomen wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Pivalinsäure, ferner gegebenenfalls substituierte monooder bicyclische aromatische oder araliphatische Säuren wie Benzoesäure, Thiobenzoesäure, Naphthalinsäure, Phenylniederalkansäuren wie Phenylessigsäure, Phenylpropionsäure.
Substituenten der Säuren sind beispielsweise Halogen wie Fluor, Chlor, Brom, Jod, Trifluormethyl, Nitro, freie, ver esterte oder verätherte Hydroxylgruppen, z. B. Niederalkanoyloxy wie Acetoxy, Niederalkoxy wie Methoxy, Niederalkylmercapto wie Methylmercapto, freie oder funktionell abgewandelte Carboxylgruppen, z. B. Niederalkoxycarbonyl wie Methoxycarbonyl, Carbamoyl, Cyan, gegebenenfalls substituierte Aminogruppen, z. B. mono- oder di-nieder-alkylierte oder N-acylierte Aminogruppen, z. B. Methylamino, Dimethylamino, Niederalkanoylamino, z. B. Acetylamino.
Das Antibiotikum Papulacandin und seine Derivate weisen neben ihrer antifungischen Wirkung auf Fadenpilze (Hyphomyceten) wie z. B. Trichoderma mentagrophytes, vorallem eine sehr gute spezifische Wirkung gegenüber verschiedenen Arten hefeartiger Pilze wie Candida albicans, Torulopsis dattila, Torulopsis famata, und Hansenula anomala auf. So beträgt z. B. bei der in vitro-Prüfung im Gradienten-Platten Strichtest (W. Szibalski, Science 116, 46 [1 925j) gegenüber ca.
20 verschiedenen klinisch vorkommenden Stämmen von Candida albicans die minimale Hemmkonzentration 0,006 bis 0,1 ml. Papulacandin zeichnet sich durch sehr geringe Toxizität im Vergleich zu bekannten antifungisch wirkenden Antibiotika aus. Das neue Antibiotikum und seine Derivate können daher zur Bekämpfung von Infektionen, die durch die genannten Pilze, insbesondere Candida albicans, hervorgerufen werden oder als Desinfektionsmittel verwendet werden.
Das Antibiotikum Papulacandin und seine Derivate können, wie erwähnt als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die topische, enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Betracht, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, pflanzliche Oele, Benzylalkohole, oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremen oder Salben vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel.
Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Die Figuren stellen dar: Fig. 1: lH-NMR-Spektrum in CD30D, von Papulacandin B Fig. 2: 'NMR-Spektrum in CD3OD von Papulacandin A.
Beispiel I
Ein gut bewachsenes Schrägagarröhrchen des Papularia sphaerosperma A 32283 wird mit 5 ml 0,2-m. Phosphatpuffer pH 7 aufgeschwemmt. 3 Erlenmeyerkolben mit 1 Schikane: Einbuchtung, mit je 100 ml Nährlösung, welche pro Liter Leitungswasser 20 g Sojabohnenmehl und 20 g Mannit enthält und deren pH vor der Sterilisation mit 1-n. Natronlauge auf 8,5 eingestellt wurde, werden mit je 1 ml der Papularia-Suspension beimpft und 48 Stunden auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 250 upm bei 23 inkubiert. Je 25 ml der so gewonnenen Kultur werden in 6 2-Liter Erlenmeyerkolben mit 4 Schikanen und 500 ml der obigen Nährlösung geimpft. Die Kolben werden anschliessend bei 23"C auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 120 upm 48 Stunden inkubiert.
1,5 Liter der Kultur aus den 2 Liter-Kolben werden in einen 50-Liter Fermenter, der 30 Liter der obigen Nährlösung enthält, übertragen und 48 Stunden bei 23 inkubiert. Dann werden 15 Liter der Kultur in einem Fermenter mit 300 Liter der obigen Nährlösung übertragen. Dieser Fermenter weist ein Totalvolumen von 500 Liter auf und besitzt einen 6-blätterigen Turbinenrührer und 4 Schikanen (Prallbleche). Die Züchtungsbedingungen im Fermenter sind: Druck 1 atü, Rührgeschwindigkeit 450 upm, Temperatur 23 C, Luftdurchsatz 1 Liter V/V/Min. Die Bedingungen entsprechen einer in Sulfitlösung gemessenen Sauerstoffabsorptionsrate von 200 mM O2/ 1/h. Die optimale Bildung des Antibiotikums A 32283 erfolgt nach ca. 60 Stunden Inkubation. Die Kulturlösung weist dann einen pH von 6,7 auf.
Sie hat eine Aktivität von 10-12 mm Hemmhof im Agardiffusionstest mit Candida albicans unter Verwendung von Whatmann A discs 6 mm.
Beispiel 2
600 Liter der nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturlösung werden unter Zugabe von 2% Filterhilfsmittel Decalite (Diatomeenerde) filtriert 560 Liter Kulturfiltrat werden mit Natronlauge auf pH 8,6 gestellt und auf einem kontinuierlichen Extraktor zweimal mit Essigester im Verhältnis 2:1 extrahiert.
Das inaktive wässerige Raffinat wird verworfen. 600 Liter Essigesterphase werden im Vakuum konzentriert. Es resultiert ein Konzentrat von 45 Litern.
91 kg Mycel aus obiger Filtration werden 1 x mit 200 Liter und 1 X mit 100 Litern Methanol verrührt und jeweils filtriert. Das inaktive Mycel wird verworfen. 300 Liter Methanolextrakt werden im Vakuum konzentriert. Es resultiert ein wässeriger Mycel-Extrakt von 33 Litern, der mit NaOH auf pH 8,4 gestellt und 2 x mit je 66 Litern Essigester extrahiert wird. Das inaktive wässerige Raffinat wird verworfen.
120 Liter Mycel-Essigester-Extrakt werden mit obigen 45 Litern Kulturfiltrat-Essigester-Extrakt vereinigt und im Vakuum konzentriert. Es resultieren 1,85 Liter Essigesterextrakt-Konzentrat, die mit 2 Liter 85 %igem Methanol versetzt und 3 X mit je 2 Liter Petroläther extrahiert werden. Die inaktiven Petrolätherphasen werden verworfen und die Methanolphase wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Es resultieren 51 g dunkelbrauner, zähflüssiger Rückstand, der in 200 ml 85%igem Methanol gelöst und 2 X mit je 300 ml Heptan extrahiert wird. Die inaktiven Heptanphasen werden verworfen. Die Methanolphase wird eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Es resultieren 41,8 g Extrakt-Rückstand.
Beispiel 3
Von dem nach Beispiel 2 erhaltenen Extrakt-Rückstand werden 18 g auf einer Säule ( 5,4 cm, h = 140 cm), welche aus einer (95:5 Gew.: Gew .)-Mischung von 1000 g Silicagel (Merck Korngrösse 0,05 - 0,2 mm) und 50 g Aktivkohle NoritOR besteht, chromatographiert. Die Mischung von Silicagel-Aktivkohle wurde vorher 3 mal mit Methanol und anschliessend 3mal mit Chloroform aufgeschlämmt und filtriert.
Die 12,3 g Extrakt-Rückstand werden in 50 ml Methanol gelöst, mit 50 g Silicagel vermischt und das Gemisch wird zur Trockne eingedampft. Der getrocknete pulverige Rückstand wird auf die Säule gegeben. Die Elution erfolgt in Fraktionen zu je 1 Liter mit Chloroform-Methanolmischungen unter stufenweiser Steigerung der Konzentration von Methanol. Man beginnt mit einem Methanolgehalt von 4% und hört auf mit 50% Methanol. Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 500 ml/ Std. Die Fraktionen werden im Vakuum eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Fraktionen werden dann aufgrund dünnschichtchromatographischer und bioautographischer Prüfung vereinigt. Die Fraktionen 1-16 (eluiert mit 1-4% Methanol) sind nur schwach aktiv und werden verworfen.
Die Fraktionen 17-23 (eluiert mit 4 bis 7% Methanol) enthalten Papulacandin D und E (weitere Reinigung siehe Beispiel 5). Die Fraktionen 24-27 (eluiert mit 7% Methanol) enthalten Papulacandin A. Die Fraktion 28 (eluiert mit 10% Methanol) enthält ein Gemisch von Papulacandin A und B. Die Fraktionen 29-31 (eluiert mit 10% Methanol) enthalten Papulacandin B. Die Fraktionen 32 und 36 (eluiert mit 1020% Methanol) enthalten neben Papulacandin B auch Papulacandin C mit kleinerem Rf-Wert. Die restlichen Fraktionen (eluiert mit 2050% Methanol) enthalten noch weitere aktive Substanzen in kleinen Mengen.
Zur Isolierung von Papulacandin B wird der Rückstand der Fraktionen 29-31 (1,86 g) aus Aceton/Äther gefällt. Es resultieren 1,5 g reines Papulacandin B als farbloses Pulver vom F.
193-197 C (Zersetzung).Zur Isolierung von reinem Papulacandin A wird der Rückstand der Fraktionen 24-27 (1,5 g) aus Aceton/Äther kristallisiert. Es resultieren 1,2 g reines Papulacandin A als farbloses Pulver vom F. 171-1730C.
Papulacandin B
Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C: 60,45 % H = 6,99% 0 = 32,62%. Das Antibiotikum zeigt im IR-Spek trum in Kaliumbromid Banden bei 3450, 2975, 2925, 2875,
1690, 1640 (Schulter), 1615, 1465, 1380, 1345, 1300, 1260,
1180, 1150, 1070, 1035, 1005, 970, 865 und 845 cm-l. Im UV-Spektrum in Aethanol sind folgende Maxima vorhanden: ymax232 nm (E = 42 000), 240 nm (± = 42 400), 268 nm (E = 44 800), 300 nm (E = 31 200). Die optische Drehung beträgt [a]20 = + 50 + 1 (c = 0,458 in Methanol). Die Bruttofor mel lautet C47 Htt 017.
Das lH-NMR-Spektrum in CD30D ist in Fig. 1 gegeben.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel (Kieselfertigplatten F254 der Fa. Merck) im System Chloroform-Methanol (4:1) ist der Rf-Wert = 0,4 bei dreimaligem Durchlaufen. Nachweis mit UV, Jod oder konz. Schwefelsäure und Erhitzen. Bei der Microhydrierung werden 7 Aequivalente Wasserstoffe verbraucht.
Papulacandin A
Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C = 62,98% H = 7,45% 0 = 29,09%. Das Antibiotikum zeigt im IR. Spektrum in Kaliumbromid Banden bei 3450, 2950, 2870,
1690, 1630, 1610, 1465, 1410, 1380, 1340, 1300, 1265, 1155,
1075, 1035, 1010, 975, 860 und 845 cm-l. Im UV-Spektrum in Äthanol sind die folgenden Maxima vorhanden: Xmax (E?): 232 nm (Schulter), 242 nm (E = 425) und 265 nm (E = 520).
Das lH-NMR.-Spektrum in CD30D ist in Fig. 2 wiedergegeben. Die Verbindung zeigt eine optische Drehung [a]20 = + 3 1 + lo (C = 0,451 in Methanol). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel (Kieselgelfertigplatten F254 der Fa. Merck im System Chloroform-Methanol (4:1) ist der Rf-Wert = 0,50 bei dreimaligem Durchlaufen. Nachweis mit UV, Jod oder konz. Schwefelsäure und Erhitzen. Bei der Microhydrierung werden 6-7 Aequ. Wasserstoff verbraucht. Die ungefähre Bruttoformel lautet Csss3H72-7sOl7-ls.
Beispiel 4
Von den nach Beispiel 3 erhaltenen Fraktionen 67-70, die Papulacandin B enthalten, werden 2,1 g auf eine Säule ( = 4 cm, h = 50 cm), gefüllt mit SephadexQ-LH-20 (5,5 Liter) chromatographiert. Sephadex-LH-20 (alkyliertes vernetztes Dextran) wurde vorher 4 Stunden in Methanol gequollen. Die 2,1 g Papulacandin B werden in 5 ml Methanol gelöst und auf die Säule gegeben. Die Elution erfolgt mit Methanol in Fraktionen von 22 ml. Die Geschwindigkeit beträgt 90 ml/Stunde.
Die Fraktionen werden im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Eluate der Fraktionen 1-15 (120 mg) sind nur schwach aktiv und werden verworfen. Die Fraktionen 16-27 enthalten 1,9 g reines Papulacandin B, die aus Aceton/Äther gefällt wird.
Eigenschaften siehe Beispiel 3.
Beispiel 5
Papulacandin B wird wie folgt acetyliert: 250 mg Papulacandin B werden mit je 2 ml Pyridin und Essigsäureanhydrid während 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Dann wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und an 30 g Kieselgel mit Chloroform, welches 1% Methanol enthält, chromatographiert. Es werden 300 mg farbloses, amorphes Acetat erhalten, welches zweimal aus Äther und Hexan gefällt wird. Im IR-Spektrum in Methylenchlorid des Acetylderivats sind folgende Banden vorhanden: 2970, 2870, 1755, 1645, 1620, 1425, 1375, 1225, 1195, 1125, 1080, 1050, 1015, 970 und 890 cm-1. Das UV-Spektrum in Aethanol weist Maxima bei 216 nm (e = 23200), 242 nm (E = 25 600), 268 nm (E = 27 600) und 295 nm (Schulter) auf. Die Elementaranalyse ergibt: C = 60,74% H = 6,51%. Osmometrisch wird ein Molekulargewicht von 1250 gefunden.
Beispiel 6
Papulacandin B wird wie folgt hydriert. Zu 50 mg Platinoxid, die in 15 ml Äthanol in einer Hydrierungsapparatur vorhydriert wurden, gibt man 250 mg Papulacandin B. Es werden 44 ml Wasserstoff aufgenommen, was 6,8 Aequivalenten entspricht. Nach Filtration und Eindampfen des Filtrates werden 243 mg farbloser Rückstand erhalten, der an 50 g Kieselgel mit Chloroform, welches 8% Methanol enthält, chromatographiert wird. Es werden 106 mg reines Hydrierungsprodukt erhalten.
Das IR.-Spektrum (in KBr) zeigt Banden bei: 3500, 2950, 2860, 1720, 1610, 1465, 1385, 1250, 1185, 1150, 1095, 1070, 1030, 1005, 980 cm-l. Im lH-NMR.-Spektrum sind die Signale der olefinischen Protonen der Komponente B verschwunden.
Weitere physikalisch-chemische Eigenschaften: siehe den allgemeinen Teil der Beschreibung.
Beispiel 7
Das Antibiotikum Papulacandin A wird wie folgt acetyliert: 100 mg Papulacandin A werden mit je 1 ml Pyridin und Essigsäureanhydrid während 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und an 20 g Kieselgel mit Chloroform, welches 1% Methanol enthält, chromatographiert. Es werden 75 mg farbloses, amorphes Acetat erhalten, welches zweimal aus Äther und Hexan gefällt wird. Im IR.-Spektrum (in Metyhlenchlorid) des Acetylderivates sind folgende Banden vorhanden: 2920, 2860, 1755, 1690, 1640, 1605, 1510, 1460, 1370, 1225, 1175, 1125, 1040, 965 cm-l. Das UV.-Spektrum in Äthanol weist Maxima bei 242 nm (El5 m = 240) und 262 (El tm = 370) auf. Die Anzahl der Acetylgruppen liess sich nicht eindeutig bestimmen.
Aufgrund des lH-NMR.-Spektrums sind 9-11 Acetylgruppen anzunehmen.
The invention relates to the new water-insoluble antibiotic papulacandin, which is present in the form of its main components A and B and several secondary components, or mixtures of 2 or more of these components (for the sake of simplicity, such mixtures are referred to below as papulacandin [antibiotics A 32283]) and derivatives of the antibiotic, as well as preparations containing these compounds, and processes for producing these substances.
The antibiotic papulacandin is created during the cultivation of a new microorganism that is stored in our laboratories under the name A32283. The strain A 32283 is of the species Papularia sphaerosperma (Pers.) Höhnel, formerly known as Arthrinium phaesospermum (Corda) Ellis, order Moniliales. The species is from Ellis in Ellis M.B. Dematiaceous Hyphomycetes 1971, p. 569 described in detail under Arthrinium phaeospermum. The strain A 32283 was found in the Northern Regional Research Lab. US Department of Agriculture, Peoria, Illinois under NO. NRRL 8086 deposited. It was found in 1969 on the Susten Pass (Switzerland) as a saprophyte on fallen leaves of an undetermined plant species. The isolation took place on a yeast nutrient agar of the following composition: yeast extract 4 g / l.
Malt extract 10 g / l, glucose 4 g / l, agar agar 20 g / l, pH after sterilization: 7.0
The antibiotic Papulacandin is produced when the species Papularia sphaerosperma, in particular the strain NRRL 8086, is bred. For the production of Papulacandin Papularia sphaerosperma or a Papulacandin-forming mutant is aerobically grown in an aqueous nutrient solution containing a carbon or nitrogen source and inorganic salts until the nutrient solution shows a substantial antibiotic effect, and the antibiotic papulacandin is isolated thereupon. The antibiotic papulacandin forming mutants can e.g. B. obtained under the action of ultraviolet or X-rays or nitrogen mustard oils.
Examples of carbon sources include: assimilable carbohydrates, e.g. B. glucose, sucrose, lactose, mannitol, starch, glycerol, and also inositol. Nitrogen-containing nutrients that may be mentioned are: amino acids, peptides and proteins and their breakdown products such as peptone or tryptone, also meat extracts, water-soluble parts of cereal grains such as maize and wheat, distillation residues from alcohol production, yeast, beans, especially the soy plant, seeds, for example of the cotton plant, etc., but also ammonium salts and nitrates. Of other inorganic salts, the nutrient solution can contain, for example, chlorides, carbonates, sulfates, phosphates of alkali or alkaline earth metals, of magnesium, iron, zinc and manganese.
The cultivation takes place aerobically, for example in static surface culture or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shake flasks or the known fermenters. A suitable temperature is between 18 and 400C, preferably approx. 230C. The nutrient solution generally shows a substantial antifungal effect after 1½ to 5 days. It is preferred to cultivate in several stages, i. you first produce one or more precultures in liquid nutrient medium, which are then transferred to the actual production medium, e.g. B. in proportion
1:20 to be vaccinated. The preculture is obtained, for example, by inoculating a sporadic mycelium that has been grown on a solid nutrient medium for around 14 days into a liquid medium and letting it grow for 48 hours.
The antibiotic is isolated from the culture medium by methods known per se, taking into account the chemical, physical and biological properties of the antibiotic.
For example, the antibiotic can be extracted from the unfiltered culture broth with an organic solvent which is not very miscible with water, e.g. B. ethyl acetate, are extracted.
This so-called whole-broth method is preferably used because the antibiotic is located both in the mycelium and in the culture filtrate. The antibiotic collects in the water-containing organic phase, e.g. B. in ethyl acetate and this phase is separated from the extracted culture liquid and the sludge (extracted mycelium and nutrient solution solids). The residue obtained in the extraction can be subjected to one or more renewed extractions with the same or a different solvent.
You can also use the z. B. extract the mycelium filtered off with filter aids or the culture filtrate alone. The washed with water mycelium (together with the filter aid) is preferably with a water-miscible organic solvent, z. B. a lower alkanol with 1-4 carbon atoms, such as methanol, ethanol, propanol, isopropanol, also dimethyl sulfoxide, formamide, dimethylformamide, methylacetamide, dioxane, tetrahydrofuran, acetone, or with mixtures of these solvents with water, especially with hydrous methanol. The culture filtrate is mixed with a water-immiscible solvent z. B. with ethyl acetate, water-immiscible alcohol such as n-butanol, higher aliphatic ketones z. B. methyl isopropyl ketone extracted.
To purify the crude product obtained after evaporation of the solvent you can z. B. the extraction, the precipitation, the distribution between immiscible solvent phases or the absorption, especially chromatography. So can from the raw product, for. B.
Acetic ester extract from the culture broth, significant proportions of accompanying substances through successive simple cleaning processes such as extraction of the dried or dissolved crude product with solvents in which the antibiotic is insoluble, e.g. B. hydrocarbons such as petroleum ether, cyclohexane, or anhydrous halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, carbon tetrachloride, can be removed. You can also solve the crude product, e.g. B.
in methanol, and by adsorbents such as activated carbon, silica gel, magnesium silicate, aluminum oxide or mixtures thereof or adsorption resins, e.g. B. Separate crosslinked dextrans such as Sephadex (from Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) from accompanying substances. For example, the crude product can be purified by repeated column chromatography using silica gel, expediently with small additions of activated carbon. The antibiotic is preferably eluted by the gradient method with mixtures of chloroform or tetracarbon and methanol, the percentage content of the more polar solvent being increased in stages. If the extract obtained by extracting the culture broth on a mixture of silica gel with z. B. 5 wt. Percent activated carbon and z. B.
Chromatographed with chloroform / methanol as the elution liquid, almost the entire amount of the antibiotic extracted from the culture broth is found distributed over the eluates with a methanol concentration of 5-20%.
The above-mentioned distribution between immiscible solvent phases can also be carried out as a countercurrent distribution using a Craig apparatus. A mixture of ethyl acetate, cyclohexane, methanol and water, for example, serves as the solvent system.
To obtain the individual uniform components of the antibiotic, their separation and isolation can, for. B.
by the method of preparative thin-layer chromatography under the conditions described for the analytical detection. The separation by means of column chromatography is more advantageous, where the adsorbent z. B. silica gel with a content of 1-5 percent activated carbon and the elution is preferably effected by the gradient method with a mixture of chloroform and methanol.
The concentration of the more polar solvent is expediently increased in smaller percentages, e.g. B. 5-20 methanol, or you work according to the continuous gradient elution method. The antibiotic is preferably eluted at a methanol concentration of 10%. The cleaning process can be repeated if necessary.
In thin-layer chromatography on silica gel (e.g. with chloroform-methanol or with ethyl acetate-acetone-water as the eluent) and bioautography with Candida albicans, at least two antibiotic active components, papulacandin A and papulacandin B, can be isolated, their Rf values in the thin layer chromatogram indicated on silica gel in Table I; System 1 refers to chloroform-methanol (4: 1), two passes; System 2 refers to ethyl acetate, acetone-water (72: 24: 4), run twice.
Table I.
Substance system 1 system 2
Component A 0.35 0.41
Component B 0.27 0.32 Approx. 75% of the antibiotic consists of the main component B, approx. 10% of the component A.
Minimum inhibitory concentrations (MIC) between 0.006 and 0.1 μg / ml were found for components A and B in the serial dilution test with Candida albicans as the test organism.
Candida albicans is particularly suitable as a test organism for testing the antibiotic effect in the individual isolation stages - as well as in the culture medium.
The antibiotic consists - according to the elemental analysis of the main components A including B - only from the elements tenC, HundO.
The antibiotic Papulacandin B has the following chemical and physical properties:
It is a weakly acidic substance, white in powder form.
It is soluble in alcohols, e.g. B. lower alkanols such as methanol, ethanol, n-propanol, and in ketones, z. B. Di-lower alkyl ketones such as acetone, methyl isobutyl ketone, also in dimethylformamide and dimethyl sulfoxide; it is sparingly soluble in ethyl acetate and chlorinated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform and carbon tetrachloride (10-100 mg / liter); The compound is practically insoluble in water, petroleum ether, ether and hexane. F. 193-197 (decomp.).
Elemental analysis for C47H64017:
C H calculated 62.65% 7.16% found 61.28% 7.18% [a] D = + 50.0 + 1 "(c = 0.46 in methanol).
UV spectrum in ethanol: X max 232 nm (E = 42,000)
240 nm (E = 42 400)
268 nm (E = 44 800)
300 nm (E = 31 200)
IR spectrum in KBr, s. Example 3
100 MHz NMR spectrum, see p. Fig. 1.
Based on the vapor pressure osmometric molecular weight determination of the acetyl derivative, the molecular weight can be estimated at about 900-950. The antibiotic has no free carboxyl or O-methyl groups. Only smaller fragments can be seen in the mass spectrum. One molecular ion is missing. The signals of 45-48 carbon atoms can be determined in the 13C-NMR spectrum. Together with the results of the elemental analysis and the degradation tests of papulacandin, the following gross formula can be calculated: C47H64017.
Several hydroxyl groups, 2 of which are phenolic, could be acetylated with acetic anhydride and pyridine. The number of acetyl groups is difficult to estimate using spectroscopy. In the 100 MHz NMR spectrum, approx.
2 ppm the signals of several acetyl groups are visible. Based on the degradation attempts, 9 acetyl groups should be present.
The molecular weight was determined to be 1267 osmometrically.
The following physicochemical data were obtained for the acetyl derivative.
Elemental analysis for C6sHs2026:
C H calculated 61.02% 6.46% found 60.74% 6.50%
UV spectrum (in ethanol) hmax 216 nm (E = 23 200)
242 nm (E = 25 600)
268 nm (E = 27 600)
295 nm (shoulder).
IR spectrum, s. Example 5 [a] D = -6fl "(c = 0.765 in chloroform).
During the hydrogenation of Papulacandin B, 7 moles of hydrogen were taken up. In the 1 H-NMR spectrum of the hydrogenation product, all signals of olefinic protons have disappeared. Two aromatic protons at 6.3 ppm are still visible. The IR spectrum in KBr is given in Example 6. The hydrogenation product has the following physical-chemical data:
Elemental analysis for C47H78017:
C HO calcd 61.69% 8.59% 29.72% found 60.94% 8.56% 30.10% F.125-130 C
UV spectrum (in ethanol) h max. 270 nm (E = 3100) [a] D = +7 +1 "(c = 0.214 in methanol).
The antibiotic papulacandin component A has the following chemical and physical properties: It is a weakly acidic substance that is white in crystalline form and has the same solubility properties as component B.
F. 171-1730C (decomposition)
Elemental analysis
C H found 61.88% 7.34%
UV spectrum (in ethanol): max 232 nm shoulder
242 nm (Emax = 425)
265 nm (Emax = 520)
IR spectrum in KBr, s. Example 3 [a] i7, +30 rel "(c = 0.419 in methanol).
FIG. 2 shows the 100 MHz NMR spectrum. Papulacandin A has no free carboxyl or O-methyl groups. Only smaller fragments can be seen in the mass spectrum. One molecular ion is missing. The following gross formula is likely for Papulacandin A C 5o-53H72-75O17-19.
Various hydroxyl groups could be acetylated with acetic anhydride and pyridine. The IR spectrum of the acetyl derivative in methylene chloride is given in Example 7. The number of acetyl groups is difficult to estimate. Presumably 9-11 acetyl groups are present.
The acetyl derivative of Papulacandin A has the following physicochemical properties: Elemental analysis:
C H O found 61.91% 7.22% 30.81% UV spectrum (in ethanol) max 240 nm (Emax = 270)
262 nm (Emax = 330) [a] D = - 15 (c = 0.249 in chloroform) During the microhydrogenation of papulacandin A, 7 mol of hydrogen are taken up.
Structure elucidation of Papulacandin B
During the alkaline hydrolysis of papulacandin B in 0.5N methanolic potassium hydroxide solution, 3 fragments can be isolated.
Formula scheme 1
Alkaline hydrolysis of papulacandin B
EMI3.1
<tb> <SEP> Papulacandin <SEP> B
<tb> <SEP> 0.5NKOH
<tb> <SEP> CH30H / H20 <SEP> 2h / RT
<tb> ROOC <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> VH <SEP> HO <SEP> CH2 <SEP> CH2S
<tb> <SEP>> 0S <SEP> X0v0 <
<tb> <SEP> = <SEP> 3 <SEP> 5 <SEP> H3 <SEP> 3 <SEP> yÜ2Oi <SEP> 00 / \ W
<tb> <SEP> tI <SEP>
<tb> <SEP> la: <SEP> R <SEP> = <SEP> H: <SEP> C15H2503 <SEP> H
<tb> <SEP> lb: <SEP> R <SEP> = <SEP> CH3 <SEP> M + 306
<tb> <SEP> 6-hydroxy-7,13-dimethylpentadeca- <SEP> 3 <SEP> C19H26013
<tb> <SEP> 1,3,7,9-tetra-ene-carboxylic acid
<tb> <SEP> v
<tb>
EMI3.2
2a: R = H: C1oH1403 2b:
R = CH3 7-hydroxy-nona-1,3,5-triene-carbonic acid
1) 6-Hydroxy-7, 1, 3-dimethyl-pentadeca-1,3, 7,9-tetra-enecarboxylic acid methyl ester
The compound was obtained by extracting the reaction solution with ethyl acetate at pH 7.5 and subsequent esterification with diazomethane.
The structure of this 4-fold unsaturated C-16 fatty acid has been proven as follows (see formula scheme 2):
EMI4.1
Acetylation of the methyl ester 1b gave the monoacetate 5 with a mass of 348. The 13-position of the methyl group resulted from the interpretation of the 13C-NMR spectrum of 5. The hydrogenation product 6 of 5 showed a molecular ion at m / e 356 in the MS. Hydrogenation of the methyl ester 1b, on the other hand, gave 7-hydroxy-8,14-dimethylpalmitic acid methyl ester 7, the molecular ion of which was found in the MS at m / e 314. Its monoacetate was again identical to the compound 6 described above. The postulated structure of the aliphatic radical was then proven by ozone degradation of the methyl ester Ib.
It was possible to detect dimethyl oxalate 8 and 4 methylcaproate 9 from the reaction mixture by gas chromatography by comparison with authentic material.
2) 7-hydrox-nona-1,3,5-triene-carboxylic acid methyl ester
The compound was obtained by extracting the reaction solution with ethyl acetate at pH 2.5 and subsequent esterification with diazomethane. With the help of UV., IR, and
The structure postulated above could be established by mass spectrum (MS, with high resolution) and NMR spectroscopy (with double resonance experiments) of the methyl ester.
The structure of this triple unsaturated fatty acid was confirmed by oxidation of the methyl ester with CrO3 (Jones reagent) to give the corresponding ketone 4:
EMI5.1
In the MS of the ketone one molecular ion is present at m / e 194.
The proton in the 7-position has disappeared in the NMR spectrum.
3) Sugar part Ct9H26Ol3
This fragment was obtained from the remaining reaction solution after neutralization to pH 7.5 by chromatography on Sephadex - LH-20.
The interpretation of the MS, the 100 MHz and 360 MHz NMR spectra and the '3C-NMR spectrum with off-resonance decoupling of the acetate 10a (see equation 3)
Formula scheme 3: Breakdown of the sugar fragments
EMI5.2
EMI6.1
<tb> <SEP> Eornc! sch-: ma <SEP> 3:
<tb> R3 <SEP>? <SEP> Breakdown <SEP> of the <SEP> Zucke: -bmchs, ücks
<tb> <SEP> oc <SEP> CII <SEP> 2011
<tb> <SEP> t <SEP>, OCs <SEP> /
<tb> <SEP> OR <SEP> (<<SEP> 3
<tb> <SEP> OR <SEP> 3
<tb> <SEP> r = <SEP> U <SEP> JO
<tb> 13a: <SEP> R <SEP> = <SEP> H <SEP>: <SEP> a-D-form <SEP> 3
<tb> 13b: <SEP> R <SEP> = <SEP> H: P-D-Form <SEP> 15: R = <SEP> H: M +: 328 <SEP> yIo
<tb> 14a: <SEP> R <SEP> = <SEP> COCH3: <SEP> a-D-Form <SEP> 16: <SEP> R = <SEP> -COCH3: <SEP> M +: <SEP> 496.
<SEP> 9 <SEP> oOl
<tb> 14b: <SEP> R <SEP> = <SEP> COCH3: <SEP> ss-D-Form
<tb> <SEP> OL
<tb> <SEP> STILL3
<tb> <SEP> 17: <SEP> mm <SEP> 194
<tb> speaks for the proposed structure. A molecular ion at m / e 840 is found in the MS of acetate 10a. Acetylation with deuteroacetic anhydride gave 10b, the molecular ion of which was found in MS at m / e 867. This proves the presence of 9 acetyl groups.
The methanolysis of 3 did not give satisfactory results. In particular, the aromatic fragment could not be isolated. Therefore, 3 was converted with diazomethane into the dimethyl derivative 11, which after acetylation gave a heptaacetate 12 with M + at m / e 784. Methanolysis of 11 then yielded 3 fragments, namely methyl-ct-D-galacto-pyranoside 13a, a little methyl-BD-galacto-pyranoside 13b, the tetraacetates 14a and 14b of which were identical to authentic material, and compound 15, which in the MS contributed a molecular ion m / e 328 (high resolution: ClsH200s) delivered. Acetylation of
15 gave the tetraacetate 16 with M + at m / e 496. Periodate cleavage of 15 with periodic acid gave the compound
17, which showed a molecular ion at m / e 194 in MS.
Based on the interpretation of the 360 MHz NMR spectrum of 10a, the galactose residue is ss-glycosidically linked to the rest of the molecule.
If the gross formulas of the 3 fragments found are added, assuming that the two fatty acids are linked to the sugar fragment in an ester-like manner, the following gross formula for Papulacandin B is obtained: C47H64017 MW 900. It agrees with the results of the elemental analysis.
On the basis of further analytical investigations, in particular of the 360 MHz NIMR and 13C-NMR spectrum and the results of mass spectroscopy, the following formula for Papulacandin B could be determined:
EMI6.2
Structure of Papulacandin A
According to spectroscopic comparisons of Papulacandin A and Papulacandin B and preliminary hydrolysis tests, component A also contains 6-hydroxy-7,13-dimethylpentadeca-1,3,7,9-tetraenocarboxylic acid and the same sugar fragments and presumably differs in the second fatty acid 1 additional methyl and 3-4 additional methylene groups.
On the basis of similar analytical investigations as those mentioned above for Papulacandin B, the following formula could be determined for Papulacandin A:
EMI6.3
In the foregoing and in the following, derivatives of the antibiotic are understood to mean on the one hand esters of the antibiotic and on the other hand hydrogenation products and their esters. Esters are, for example, those in which the alcoholic hydroxyl groups are esterified with carboxylic acids or thiocarboxylic acids having 120 carbon atoms. Such acids are above all optionally substituted lower alkanoic acids with 1-6 carbon atoms such as formic acid, acetic acid, propionic acid, pivalic acid, also optionally substituted mono- or bicyclic aromatic or araliphatic acids such as benzoic acid, thiobenzoic acid, naphthoic acid, phenyl lower alkanoic acids such as phenylacetic acid, phenylpropionic acid.
Substituents of the acids are, for example, halogen such as fluorine, chlorine, bromine, iodine, trifluoromethyl, nitro, free, esterified or etherified hydroxyl groups, eg. B. lower alkanoyloxy such as acetoxy, lower alkoxy such as methoxy, lower alkyl mercapto such as methyl mercapto, free or functionally modified carboxyl groups, e.g. B. lower alkoxycarbonyl such as methoxycarbonyl, carbamoyl, cyano, optionally substituted amino groups, e.g. B. mono- or di-lower-alkylated or N-acylated amino groups, e.g. Methylamino, dimethylamino, lower alkanoylamino, e.g. B. acetylamino.
The antibiotic papulacandin and its derivatives show, in addition to their antifungal effect, on filamentous fungi (hyphomycetes) such. B. Trichoderma mentagrophytes, especially a very good specific action against different types of yeast-like fungi such as Candida albicans, Torulopsis dattila, Torulopsis famata, and Hansenula anomala. So z. B. in the in vitro test in the gradient plate streak test (W. Szibalski, Science 116, 46 [1 925j) compared to approx.
20 different clinically occurring strains of Candida albicans the minimum inhibitory concentration 0.006 to 0.1 ml. Papulacandin is characterized by very low toxicity compared to known antifungal antibiotics. The new antibiotic and its derivatives can therefore be used to combat infections caused by the fungi mentioned, in particular Candida albicans, or as disinfectants.
The antibiotic papulacandin and its derivatives can, as mentioned, as remedies, e.g. B. find use in the form of pharmaceutical preparations. These contain the compounds mentioned in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for topical, enteral or parenteral administration. For the same, such substances come into consideration that do not react with the new compound, such as. B. gelatin, milk sugar, starch, magnesium stearate, vegetable oils, benzyl alcohols, or other known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. B. as tablets, dragees, powders, suppositories or in liquid form as solutions, suspensions, emulsions, creams or ointments. If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers.
They can also contain other therapeutically valuable substances.
The invention is described in the following examples. The temperatures are given in degrees Celsius.
The figures show: Fig. 1: 1 H-NMR spectrum in CD30D, from Papulacandin B Fig. 2: 'NMR spectrum in CD3OD from Papulacandin A.
Example I.
A well-overgrown slant of the Papularia sphaerosperma A 32283 is filled with 5 ml of 0.2 m. Phosphate buffer pH 7 suspended. 3 Erlenmeyer flasks with 1 baffle: indentation, each with 100 ml nutrient solution, which contains 20 g soybean meal and 20 g mannitol per liter of tap water and whose pH is 1-n before sterilization. Sodium hydroxide solution has been adjusted to 8.5, are inoculated with 1 ml of the Papularia suspension and incubated for 48 hours on a rotating shaker at 250 rpm at 23. 25 ml each of the culture obtained in this way are inoculated into 6 2-liter Erlenmeyer flasks with 4 baffles and 500 ml of the above nutrient solution. The flasks are then incubated at 23 ° C. on a rotating shaking machine at 120 rpm for 48 hours.
1.5 liters of the culture from the 2 liter flasks are transferred to a 50 liter fermenter containing 30 liters of the above nutrient solution and incubated at 23 for 48 hours. Then 15 liters of the culture are transferred to a fermenter with 300 liters of the above nutrient solution. This fermenter has a total volume of 500 liters and has a 6-blade turbine stirrer and 4 baffles (baffle plates). The cultivation conditions in the fermenter are: pressure 1 atm, stirring speed 450 rpm, temperature 23 C, air throughput 1 liter V / V / min. The conditions correspond to an oxygen absorption rate of 200 mM O2 / 1 / h measured in sulphite solution. The optimal formation of the antibiotic A 32283 takes place after approx. 60 hours of incubation. The culture solution then has a pH of 6.7.
It has an activity of 10-12 mm inhibition zone in the agar diffusion test with Candida albicans using Whatmann A discs 6 mm.
Example 2
600 liters of the culture solution obtained according to Example 1 are filtered with the addition of 2% filter aid Decalite (diatomaceous earth). 560 liters of culture filtrate are adjusted to pH 8.6 with sodium hydroxide solution and extracted twice with ethyl acetate in a ratio of 2: 1 on a continuous extractor.
The inactive aqueous raffinate is discarded. 600 liters of ethyl acetate phase are concentrated in vacuo. The result is a concentrate of 45 liters.
91 kg of mycelium from the above filtration are stirred 1 × with 200 liters and 1 × with 100 liters of methanol and each filtered. The inactive mycelium is discarded. 300 liters of methanol extract are concentrated in vacuo. The result is an aqueous mycelium extract of 33 liters, which is adjusted to pH 8.4 with NaOH and extracted twice with 66 liters of ethyl acetate each time. The inactive aqueous raffinate is discarded.
120 liters of mycelium-ethyl acetate extract are combined with the above 45 liters of culture filtrate-ethyl acetate extract and concentrated in vacuo. 1.85 liters of ethyl acetate extract concentrate result, to which 2 liters of 85% methanol are added and extracted 3 times with 2 liters of petroleum ether each time. The inactive petroleum ether phases are discarded and the methanol phase is evaporated to dryness in vacuo. 51 g of dark brown, viscous residue result, which is dissolved in 200 ml of 85% strength methanol and extracted twice with 300 ml of heptane each time. The inactive heptane phases are discarded. The methanol phase is evaporated and dried in a high vacuum. 41.8 g of extract residue result.
Example 3
18 g of the extract residue obtained according to Example 2 are poured onto a column (5.4 cm, h = 140 cm) which consists of a (95: 5 wt .: wt.) Mixture of 1000 g silica gel (Merck grain size 0 , 05 - 0.2 mm) and 50 g of NoritOR activated carbon, chromatographed. The mixture of silica gel-activated charcoal was previously slurried 3 times with methanol and then 3 times with chloroform and filtered.
The 12.3 g extract residue are dissolved in 50 ml of methanol, mixed with 50 g of silica gel and the mixture is evaporated to dryness. The dried powdery residue is added to the column. Elution takes place in fractions of 1 liter each with chloroform-methanol mixtures with a gradual increase in the concentration of methanol. One starts with a methanol content of 4% and ends with 50% methanol. The flow rate is 500 ml / hour. The fractions are evaporated in vacuo and the residue is dried in a high vacuum. The fractions are then combined on the basis of thin-layer chromatographic and bioautographic testing. Fractions 1-16 (eluted with 1-4% methanol) are only weakly active and are discarded.
Fractions 17-23 (eluted with 4 to 7% methanol) contain papulacandin D and E (for further purification see Example 5). Fractions 24-27 (eluted with 7% methanol) contain papulacandin A. Fraction 28 (eluted with 10% methanol) contains a mixture of papulacandin A and B. Fractions 29-31 (eluted with 10% methanol) contain papulacandin B. Fractions 32 and 36 (eluted with 1020% methanol) contain papulacandin B and papulacandin C with a lower Rf value. The remaining fractions (eluted with 2050% methanol) also contain other active substances in small amounts.
To isolate Papulacandin B, the residue from fractions 29-31 (1.86 g) is precipitated from acetone / ether. 1.5 g of pure papulacandin B result as a colorless powder from F.
193-197 C (decomposition). To isolate pure papulacandin A, the residue from fractions 24-27 (1.5 g) is crystallized from acetone / ether. 1.2 g of pure papulacandin A result as a colorless powder with a temperature of 171-1730C.
Papulacandin B
The elemental analysis gives the following values: C: 60.45% H = 6.99% 0 = 32.62%. The antibiotic shows in the IR spectrum in potassium bromide bands at 3450, 2975, 2925, 2875,
1690, 1640 (shoulder), 1615, 1465, 1380, 1345, 1300, 1260,
1180, 1150, 1070, 1035, 1005, 970, 865 and 845 cm-l. The following maxima are present in the UV spectrum in ethanol: ymax232 nm (E = 42,000), 240 nm (± = 42,400), 268 nm (E = 44,800), 300 nm (E = 31,200). The optical rotation is [a] 20 = + 50 + 1 (c = 0.458 in methanol). The gross formula is C47 Htt 017.
The 1 H-NMR spectrum in CD30D is given in FIG.
In the thin-layer chromatogram on silica gel (ready-to-use silica plates F254 from Merck) in the chloroform-methanol (4: 1) system, the Rf value = 0.4 when it is passed through three times. Detection with UV, iodine or conc. Sulfuric acid and heating. In the case of microhydration, 7 equivalents of hydrogen are used.
Papulacandin A
The elemental analysis gives the following values: C = 62.98% H = 7.45% 0 = 29.09%. The antibiotic shows in the IR. Spectrum in potassium bromide bands at 3450, 2950, 2870,
1690, 1630, 1610, 1465, 1410, 1380, 1340, 1300, 1265, 1155,
1075, 1035, 1010, 975, 860 and 845 cm-l. The following maxima are present in the UV spectrum in ethanol: Xmax (E?): 232 nm (shoulder), 242 nm (E = 425) and 265 nm (E = 520).
The 1 H-NMR spectrum in CD30D is shown in FIG. The compound shows an optical rotation [a] 20 = + 3 1 + lo (C = 0.451 in methanol). In the thin-layer chromatogram on silica gel (silica gel plates F254 from Merck in the chloroform-methanol (4: 1) system, the Rf value = 0.50 after running three times. Detection with UV, iodine or concentrated sulfuric acid and heating 6-7 equivalents of hydrogen consumed, the approximate gross formula is Csss3H72-7sOl7-ls.
Example 4
2.1 g of the fractions 67-70 obtained according to Example 3, which contain papulacandin B, are chromatographed on a column (= 4 cm, h = 50 cm) filled with SephadexQ-LH-20 (5.5 liters). Sephadex-LH-20 (alkylated crosslinked dextran) was previously swollen in methanol for 4 hours. The 2.1 g of Papulacandin B are dissolved in 5 ml of methanol and applied to the column. Elution is carried out with methanol in fractions of 22 ml. The rate is 90 ml / hour.
The fractions are freed from the solvent in vacuo and the residue is dried in a high vacuum. The eluates from fractions 1-15 (120 mg) are only weakly active and are discarded. Fractions 16-27 contain 1.9 g of pure papulacandin B, which is precipitated from acetone / ether.
Properties see example 3.
Example 5
Papulacandin B is acetylated as follows: 250 mg of papulacandin B are left to stand for 3 hours at room temperature with 2 ml each of pyridine and acetic anhydride.
The reaction mixture is then evaporated in vacuo and chromatographed on 30 g of silica gel with chloroform which contains 1% methanol. 300 mg of colorless, amorphous acetate are obtained, which is precipitated twice from ether and hexane. The following bands are present in the IR spectrum in methylene chloride of the acetyl derivative: 2970, 2870, 1755, 1645, 1620, 1425, 1375, 1225, 1195, 1125, 1080, 1050, 1015, 970 and 890 cm-1. The UV spectrum in ethanol shows maxima at 216 nm (e = 23200), 242 nm (E = 25 600), 268 nm (E = 27 600) and 295 nm (shoulder). The elemental analysis gives: C = 60.74% H = 6.51%. A molecular weight of 1250 is found by osmometry.
Example 6
Papulacandin B is hydrogenated as follows. 250 mg of papulacandin B are added to 50 mg of platinum oxide, which has been pre-hydrogenated in 15 ml of ethanol in a hydrogenation apparatus. 44 ml of hydrogen are taken up, which corresponds to 6.8 equivalents. After filtration and evaporation of the filtrate, 243 mg of colorless residue are obtained, which is chromatographed on 50 g of silica gel with chloroform which contains 8% methanol. 106 mg of pure hydrogenation product are obtained.
The IR spectrum (in KBr) shows bands at: 3500, 2950, 2860, 1720, 1610, 1465, 1385, 1250, 1185, 1150, 1095, 1070, 1030, 1005, 980 cm-1. The signals of the olefinic protons of component B have disappeared in the 1 H-NMR spectrum.
Further physico-chemical properties: see the general part of the description.
Example 7
The antibiotic papulacandin A is acetylated as follows: 100 mg papulacandin A are left to stand for 3 hours at room temperature with 1 ml each of pyridine and acetic anhydride. The reaction mixture is then evaporated in vacuo and chromatographed on 20 g of silica gel with chloroform which contains 1% methanol. 75 mg of colorless, amorphous acetate are obtained, which is precipitated twice from ether and hexane. The following bands are present in the IR spectrum (in methylene chloride) of the acetyl derivative: 2920, 2860, 1755, 1690, 1640, 1605, 1510, 1460, 1370, 1225, 1175, 1125, 1040, 965 cm-1. The UV spectrum in ethanol has maxima at 242 nm (El5 m = 240) and 262 (El tm = 370). The number of acetyl groups could not be clearly determined.
On the basis of the 1 H-NMR spectrum, 9-11 acetyl groups can be assumed.