DE2600383B2 - Analyseverfahren und -vorrichtung zur Bestimmung wenigstens einer primären und einer sekundären Aminosäure in einem Flüssigkeitsprobenstrom - Google Patents
Analyseverfahren und -vorrichtung zur Bestimmung wenigstens einer primären und einer sekundären Aminosäure in einem FlüssigkeitsprobenstromInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Analyseverfahren nach dem
Oberbegriff des Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 7.
Primäre und sekundäre Aminosäuren, die aus einer
einzigen chromatografischen Trennsäule ausgewaschen
werden, lassen sich mit Hilfe von Fluoreszenz quantitativ ermitteln. Eine entsprechende Anordnung ist
in einem Aufsatz von Felix und Terkelsen mit dem Titel »Total Fluorometric Amino Acid Analysis using
Fluorescamine« (»Fluorometrische Aminosäuren-Gesamtanalyse unter Verwendung von Fluorescamin«) in
Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 15, Nr. 1, Juli 1973, beschrieben. Die gleiche Anordnung ist auch in
einem weiteren Aufsatz der gleichen Verfasser mit dem
Titel »Determination of Hydoxyproline in Fluorometric
Amino Acid Analysis with Fluorescamine« (»Bestimmung von Hydroxyprolin in der fluorometrischen
Aminosäurenanalyse mit Fluorescamin«) in Analytical Biochemistry, Vol.56, Nr.2, Dezember 1973, Seite 610,
beschrieben. Bei den durch die Verfasser beschriebenen Versuchen wurden Standardaminosäurengemische vermittels Standardpufferlösungen aus chromatografischen
Trennsäulen ausgewaschen. Das Fluorescamin wurde der Lösung zugesetzt, bevor diese einem Fluoreszenz
messer zugeführt wurde. Wenn der Probenstrom eine
sekundäre Aminosäure enthält, wird ein Oxidationsmittel, nämlich N-Chlorosuccinimid (abgekürzt: NCS) vor
Reaktion mit dem Fluorescamin zugesetzt Durch dieses Oxidationsmittel wird die sekundäre Aminosäure
so umgewandelt, so daß sie nach Reaktion mit dem
Fluorescamin vermittels des Fluoreszenzmessers anzeig- und meßbar ist
Die sekundären Aminosäuren wie z. B. Prolin und 4-Hydroxy-Prolin in dem nacheinander eluierten Pro
benstrom müssen in eine andere Form umgewandelt
werden, um durch Reaktion mit herkömmlichen Fluoreszenzmitteln wie z. B. Fluorescamin oder O-Phthalaldehyd, anzeig- und meßbar gemacht zu werden. Eine
Umwandlungstechnik besteht darin, diese mit einem
W) Oxidationsmittel, nämlich N-Chlorosuccinimid zur
Reaktion zu bringen, wie in den vorgenannten beiden Aufsätzen dargestellt ist. Das Oxidationsmittel wirkt
sich jedoch bekanntlich nachteilig auf die quantitative Anzeige der primären Aminosäuren im Probenstrom
aus. Aus diesem Grunde wird das Oxidationsmittel dem Probenstrom erst dann zugesetzt, wenn dieser die
sekundäre Aminosäure führt, wobei das Oxidationsmittel in diesem Zeitpunkt »impulsartig« in den Proben-
strom eingespritzt wird.
Ein Nachteil dieses Vorgehens ist darin zu sehen, daß
die impulsartige Oxidationsmittelabgabe zu einer plötzlichen Durchsatzsteigerung durch den Fluoreszenzmesser
führt Dadurch wird nämlich wiederum eine erhebliche Basislinienverlagerung in den aufgezeichneten
Chromatogrammen hervorgerufen, wie im einzelnen aus den vorgenannten Aufsätzen ersichtlich ist Zum
Ausgleich dieser Basislinienverlagerungen sind komplizierte elektronische Schaltungen erforderlich. Die
Basislinienverlagerungen selbst führen zu einer Verfälschung des Analyseergebnisses, indem auch die
Impulsdauer bei der Eichung nicht einwandfrei berücksichtigt werden kann. Das gleiche Problem ergibt sich
bei anderen fluoro metrischen Meßvorrichtungen, bei denen ein Oxidationsmittel während des Vorhandenseins
nur einer sekundären Aminosäure impulsartig eingeführt wird.
Es ist bereits bekannt, am Detektor einer chromatografischen
Trenneinrichtung, mit der die Trennung von Gasmischungen, insbesondere Kohlenwasserstoffmischungen,
bezweckt wird, einen konstanten Durchsatz aufrechtzuerhalten, indem der schwankende Ausgangsgasstrom
aus einer Trennsäule in der Ausgangsleitung durch die Zugabe einer Hilfsgasströmung über ein r>
Ventil, eine Hilfssäule sowie Hilfsleitungen zu einer konstanten Gasströmung in der zu einem Detektor
führenden Leitung ergänzt wird. Das Problem der Basislinienverlagerungen, das bei einer Bestimmung
wenigstens einer primären und einer sekundären Aminosäure auftritt bei der nur während des Vorhandenseins
der sekundären Aminosäure ein flüssiges Oxidationsmittel zugesetzt wird, besteht bei dieser
bekannten Einrichtung nicht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein J Analyseverfahren und eine Vorrichtung der eingangs
genannten Gattung zu schaffen, bei denen das Auftreten von Basislinienverlagerungen vermieden ist
Ein diese Aufgabe lösendes Verfahren besteht erfindungsgemäß aus den in dem kennzeichnenden Teil *»
des Patentanspruchs 1 angegebenen Maßnahmen.
Möglichkeiten zur vorteilhaften weiteren Ausgestaltung dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 6
angegeben.
Eine die Erfindungsaufgabe lösende Vorrichtung weist erfindungsgemäß die in dem kennzeichnenden
Teil des Patentanspruchs 7 genannten Merkmale auf.
Eine solche Vorrichtung läßt sich durch das in dem Patentanspruch 8 -gekennzeichnete Merkmal vorteilhaft
weiter ausgestalten. so
Das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung ermöglichen die Vermeidung von Basislinienverlagerungen
in der Fluoreszenzanzeige in einer bestimmten Reihenfolge auftretender primärer und
sekundärer Aminosäuren, bei denen nur sie sekundäre Aminosäure mit einem Oxidationsmittel versetzt wird,
um sie durch Reaktion mit dem Fluoreszenzmittel anzeigbar zu machen.
Da der Probenstrom den Detektor in einem gleichmäßigen Durchsatz durchsetzt, werden Basisli- i>"
nienverlagerungen vermieden. Auf der Abstromseite der vorbestimmten Stelle wird ein Detektorreagenz
zugesetzt, das an dieser Stelle quantitativ mit primärer und sekundärer Aminosäure reagiert und diese anzeigbar
macht. Zum Zwecke der Fluoreszenzmessung ist *« eine Quelle für ein fluoreszenzerregendes Mittel auf der
Abstromseite des Schaltventils mit der Probenleitung verhunden.
Das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung werden im nachfolgenden der Einfachheit
halber anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels erläutert
F i g. 1 ist eine schematische Darstellung einer zur
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Vorrichtung und
F i g. 2 zeigt zwei vermittels einer derartigen Vorrichtung erhaltene Chromatogramme von primären und
sekundären Aminosäuren aus einer einzigen, fortlaufend
ausgewaschenen Probe, wobei die Chromatogramme keine Basislinienverlagerung zeigen.
Wie bereits oben ausgeführt, erscheinen primäre und sekundäre Aminosäure in bekannter Reihenfolge in dem
Flüssigprobenstrom, wobei die Anzeigbarkeit der primären Aminosäure durch Reaktion mit einem
Oxidationsmittel herabgesetzt, und die Anzeigbarkeit der sekundären Aminosäure durch Reaktion mit dem
gleichen Reagenz verbessert ist Zur Anzeige wird eine fluorometrische Messung ausgeführt
Ein übliches Gemisch von primären und sekundären Aminosäuren mit Standardpufferlösungen wird unter
konstantem Druck einer chromatografischen Trennsäule 11 zugeführt, so daß sich ein vorbestimmter
Durchsatz durch die Trennsäule ergibt Die Aminosäuren werden in einer bestimmten Reihenfolge aus der
Säule eluiert und bilden einen Probenstrom, der in einem konstanten Durchsatz die zu einem herkömmlichen
Fluorometer 13 führende Probenleitung 12 durchsetzt. Das Fluorometer 13 ist mit einem Aufzeichnungsgerät
14 gekoppelt In der Probenleitung befinden sich Verzögerungsglieder in der Form von Verzögerungsschlangen
16 und 18, vermittels welcher eine ausreichend hohe Verweilzeit vorgegeben v/ird. Eine
Quelle 19 eines unter Druck stehenden Umsetzreagenz für die sekundäre Aminosäure und eine Quelle 20 eines
unter Druck stehenden inerten, flüssigen Verdünnungsmittels, wie z. B. Wasser, sind an ein gemeinsames
Schaltventil 21 angeschlossen, das seinerseits an einer ausgewählten Stelle 22 mit der Probenleitung 12
verbunden ist
Das Schaltventil 21 führt in einer ersten Stellung nur Flüssigkeit von der Quelle 19, und in einer zweiten
Stellung nur Flüssigkeit von der Quelle 20 zu. Vermittels einer hier nicht dargestellten äußeren Stellvorrichtung,
die entweder von Hand oder auch selbsttätig betätigbar ist, kann abwechselnd Flüssigkeit von Quelle 19 oder
Quelle 20 in die Probenleitung 12 zugeführt werden.
Die Umschaltung zwischen den beiden Quellen 19 und 20 kann auch durch jede andere, äquivalent
arbeitende Ventilvorrichtung, wie z. B. getrennte, synchron geschaltete Absperrventile mit zusammengeschalteter
Auslaßseite, erfolgen.
Die Quellen 19 und 20 werden auf genau gleichem Überdruck gehalten, so daß durch das Schaltventil 21
stets der gleiche Flüssigkeitsdurchsatz abgegeben wird, unabhängig davon, ob Flüssigkeit von Quelle 19 oder
Quelle 20 zugeführt wird Die Einstellung eines gleichen Überdrucks kann beispielsweise vermittels von einer
gemeinsamen Quelle geliefertem Gas erfolgen. Andererseits läßt sich der Überdruck auch durch eine
beiden Quellen gemeinsame Pumpe erzeugen.
Ein fluoreszenzerregendes Reagenz wird durch einen Vierreg-Schieber 17 in gleichförmigem Durchsatz in
die Probenleitung 12 eingeführt Zur Aufrechterhaltung eines gleichförmigen Durchsatzes kann auch hier wie
oben beschrieben ein geregelter, gleichförmiger Überdruck dienen. Wenn das fluoreszenzerreeende Mittel
einen alkalischen pH-Wert zur Anzeige erforderlich macht, wie z. B. Fluorescamin, wird eine alkalische
Pufferlösung über den Vierweg-Schieber 17 in gleichförmigem Durchsatz von einer Quelle 24 einer unter
Druck stehenden Pufferlösung zugeführt.
Entsprechend dem vorgeschlagenen Analyseverfahren werden die in bekannter Reihenfolge in der
Flüssigprobe enthaltenen primären und sekundären Aminosäuren kontinuierlich zur Anzeige gebracht,
wobei Basislinienverlagerungen im aufgezeichneten Chromatogramm vermieden werden. Ein Gemisch aus
primären und sekundären Aminosäuren wird in konstantem Durchsatz in bestimmter Reihenfolge aus
der chromatografischen Trennsäule 11 eluiert. Bei einem Standardaminosäurengemisch stellen die primären
Aminosäuren die ersten vier eluierten Aminosäuren dar. Während des Durchgangs dieser Aminosäuren
durch die Stelle 22 der Probenleitung 12 fließt inertes, flüssiges Verdünnungsmittel in konstantem Durchsatz
durch das Schaltventil 21 in die Probenleitung 12 zu. Der konstante Zufluß wird dabei wie oben beschrieben
vermittels eines konstanten Überdrucks aufrecht erhalten. Der Probenstrom wird dann am Vierweg-Schieber
17 vermittels einer von der Quelle 24 zugeführten Pufferlösung (wie z. B. Lithiumborat) auf
einen alkalischen pH-Wert eingestellt, wenn ein solches für die Wirkung des fluoreszenzerregenden Mittels
erforderlich ist. Das letztere, wie z.B. Fluorescamin, wird durch den Vierweg-Schieber 17 kontinuierlich von
der Quelle 23 aus in die Probenleitung 12 eingeführt Die Verzögerungsschlange 18 führt zu einer ausreichend
hohen Verweilzeit, während welcher die Reaktion zwischen den Aminosäuren und dem Fluorescamin
erfolgen kann. Anschließend durchläuft der Probenstrom
das Fluorometer 13, wobei das Meßergebnis vermittels des Aufzeichnungsgeräts 14 aufgezeichnet
wird.
Unmittelbar vor dem Eintreten der ersten sekundären Aminosäure, typischerweise Prolin, in den Probenstrom
wird das Schaltventil 21 betätigt und schaltet damit von dem Verdünnungsmittel aus Quelle 20 auf das
Oxidationsmittel aus Quelle 19, um. Dabei tritt anstelle des flüssigen Verdünnungsmittelzusatzes der Zusatz an
Oxidationsmittel.
Die Verzögerungsschlange 16 gibt eine ausreichend lange Verweilzeit vor, während welcher Prolin mit dem
von der Quelle 19 gelieferten Oxidationsmittel oxidieren kann. Nach dem Durchgang der sekundären Aminosäure
Prolin wird das Schaltventil 21 wiederum in seine Anfangsstellung zurückgeschaltet, so daß die Zufuhr an
Oxidationsmittel, wie z. B. N-Chlorosuccinimid, unterbrochen und die Zufuhr an inertem, flüssigem
Verdünnungsmittel wieder aufgenommen wird. In jedem Falle wird der Meßbereich des Fluorometers 13
in einem gleichförmigen Durchsatz von Flüssigkeit durchsetzt, so daß sich demzufolge auch keine
Basislinienverlagerung im aufgezeichneten Chromatogramm
ergibt
Das erfindungsgemäße Analyseverfahren ist anwendbar auf Flüssigprobenströme jeder Art, die wenigstens
zwei Substanzen enthalten, wobei die Anzeigbarkeit der
ersten Substanz durch Reaktion mit einem Umsetzreagenz behindert, und die Anzeigbarkeit der zweiten
Substanz durch Reaktion mit dem gleichen Umsetzreagenz verbessert ist Insbesondere ist das Verfahren
anwendbar auf andere fluorometrische Meßanordnungen zur quantitativen Ermittlung von primären und
sekundären Aminosäuren, auch wenn bei diesen andere fluoreszenzerregende Mittel, wie z. B. O-Phthalaldehyd
und andere Oxidations- oder Umsetzmittel, verwendet werden. Bei einigen Anordnungen kann auf die
Verwendung von Pufferlösung von der Quelle 24 verzichtet werden.
Das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung sind im nachfolgenden anhand eines praktischen
Ausführungsbeispiels noch weiter veranschaulicht
Eine das in F i g. 2 dargestellte Standardeichgemisch von neun Aminosäuren enthaltende Probe wurde durch
eine chromatografische Trennsäule 11 mit den Abmessungen 2 mm χ 30 cm durchgeleitet, die mit Kationenaustauscherharz
gefüllt war. Die Elution des Probenstroms erfolgte mit einer Pufferlösung, die 0,2 η
Natriumzitrat enthielt, einen pH-Wert 3,25 aufwies und
unter Druck durch die Säule durchgeleitet wurde. Es stellte sich ein konstanter Probenstromdurchsatz von
6 ml/h ein. Zu diesem Zweck stand die Säule unter einem Luftdruck von 28 at, der von einer Druckluftquelle
geliefert wurde. Wie in F i g. 2 dargestellt, bestanden die ersten vier aus der Säule eluierten Aminosäuren aus
den primären Aminosäuren, nämlich Aspartinsäure, Threonin, Serin und Glutaminsäure. Das in der Quelle 20
unter einem Druck von 7 at stehende Verdünnungsmittel Wasser wird während dieser Eluierungsphase in
einem Durchsatz von 6 ml/h durch das Schaltventil 21 in die Probenleitung 12 zugeführt. Unmittelbar vor
Ankunft der sekundären Aminosäure Prolin an der Stelle 22 wurde das Schaltventil 21 umgeschaltet,
wodurch die Wasserzufuhr aus Quelle 20 gesperrt und statt dessen Oxidationsmittel von Quelle 19 zugeführt
wurde, wobei es sich um eine Lösung 10~3 Mol N-Chlorosuccinimid in Wasser handelte. Dieser Umschaltzeitpunkt
ist mit »START« in der Zeitachse (Abszizze) des Chromatogramms von F i g. 2 bezeichnet
Die Quelle 19 stand dabei unter dem gleichen Oberdruck wie das Wasser, so daß sich der gleiche
Durchsatz von 6 ml/h ergab. Die Verzögerungsschlange 16 hatte eine Länge von ca. 3 m, so daß sich angenähert
eine Verweilzeit von 30 Sekunden ergab, die zur Oxidation der sekundären Aminosäuren ausreichte. Die
Verzögerungsschlange 18 hatte eine Länge von etwa 9 m und lieferte die gleiche Verweilzeit für die Reaktion
von Fluorescamin und Aminosäuren.
Das in der Quelle 23 unter einem Druck von 3,5 at
stehende fluoreszenzerregende Mittel wurde in einem Durchsatz von 3 ml/h zugesetzt und bestand aus
Fluorescamin in einer Konzentration von 30 mg auf 100 ml Azeton.
Nach Durchgang des Prolins wurde an dem in F i g. 2 mit »STOP« bezeichneten Zeitpunkt das Schaltventil 21
wiederum betätigt und die Zufuhr von NCS von der Quelle 19 unterbrochen und gleichzeitig wiederum
Wasser von der Quelle 20 im gleichen Durchsatz wie zuvor zugeführt Die übrigen, in der Reihenfolge
eluierten Aminosäuren waren entsprechend Fig.2
Glyzin, Alanin, Zystin und Valin. Die beiden dargestellten
Chromatogramme wurden gleichzeitig aufgezeichnet, wobei die obere Kurve mit den größeren
Amplitudenausschlägen mit einer Empfindlichkeit von 0—10 mV, und die untere Kurve mit einer Empfindlichkeit
von 0—100 mV für das angelegte Signal aufgenommen
worden ist Beide Kurven wurden ausgehend von ein und demselben Signal aufgezeichnet
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (8)
1. Analyse verfahren zur Bestimmung wenigstens einer primären und einer sekundären Aminosäure in
bekannter Reihenfolge nacheinander in einem sich ständig mit im wesentlichen gleichförmiger Geschwindigkeit zu einer Detektorzone fortbewegenden Flüssigkeitsprobenstrom, wobei durch Reaktion
mit einem Oxidationsmittel, das dem Probenstrom erst dann, wenn dieser die sekundäre Aminosäure
führt, zugesetzt wird, die Anzeigbarkeit der primären Aminosäure herabgesetzt und die der sekundären Aminosäure gefördert wird, dadurch gekennzeichnet, daß dem in dem Strömungsweg
(12) befindlichen Probenstrom ein inerter flüssiger Verdünnungsmittelstrom in einem vorbestimmten
Durchsatz zugesetzt wird, solange der Probenstrom keine sekundären Aminosäuren enthält, und daß der
Verdünnungsmittelstrom bei Auftreten der sekundären Aminosäuren an einer bestimmten Stelle (22) des
Strömungswegs unterbrochen und gleichzeitig das flüssige Oxidationsmittel mit dem gleichen Durchsatz an der Stelle (22) wie der Verdünnungsmittelstrom zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Probenstrom auf der Abstromseite der bestimmten Stelle (22) kontinuierlich ein
quantitativ mit der primären und der sekundären Aminosäure in dem Probenstrom reagierendes, die
Aminosäuren erkennbar machendes Detektorreagenz zugesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Detektorreagenz ein fiuoreszenzerregendes Reagenz eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die primäre und sekundäre Aminosäure durch aufeinanderfolgende Elution aus einer
chromatographischen Trennsäule (U) hintereinander in den Probenstrom eingeführt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zufuhr von inertem Verdünnungsmittelstrom und Oxidationsmittel durch ein Ventil
oder miteinander gekoppelte, synchron schaltbare Ventile (21) gesteuert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zufuhr von Oxidationsmittel
unterbrochen und die Zufuhr von inertem Verdünnungsmittel wiederaufgenommen wird, wenn der
Probenstrom an der bestimmten Stelle (22) wiederum die primäre Aminosäure enthält.
7. Vorrichtung zur Bestimmung wenigstens einer primären und einer sekundären Aminosäure in
bekannter Reihenfolge nacheinander in einem sich ständig mit im wesentlichen gleichförmiger Geschwindigkeit zu einer Detektorzone fortbewegenden Flüssigkeitsprobenstrom, mit einem Behälter
mit Flüssigkeitsproben, der die in bekannter Folge abzugebende primäre und sekundäre Aminosäure
enthält, einer unter vorbestimmtem Druck stehenden Quelle eines flüssigen Oxidationsmittels, das
dazu dient, die Anzeigbarkeit der sekundären Aminosäure zu verbessern, einer Detektorvorrichtung und einer den Flüssigkeitsprobenbehälter mit
dem Detektor verbindenden Probenleitung sowie einem Schaltventil zum abwechselnden Verbinden
jeweils eines zweier Zuströmwege mit der Probenleitung, dadurch gekennzeichnet, daß der andere
Zuströmweg des Schaltventils (21) an eine Quelle
(20) eines inerten flüssigen Verdünnungsmittels angeschlossen ist, die unter dem gleichen vorbestimmten Druck steht wie die Quelle (19) des
flüssigen Oxidationsmittels, und daß der Abströmweg des Schaltventils (21) an einer Stelle (22)
zwischen dem Behälter (11) und der Detektorvorrichtung (13) in die Probenleitung mündet, so daß
dieser abwechselnd und synchron gesteuert flüssiges Verdünnungsmittel oder Oxidationsmittel zuführbar
ist
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch eine auf der Abstromseite des Schaltventils
(21) an die Probenleitung (12) angeschlossene Quelle (23) für zur Detektoranzeige der primären und der
sekundären Aminosäure dienender Detektorreagenz.
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