DE2527884A1 - Verfahren zur immobilisierung von biologisch aktiven substanzen auf traegermaterialien - Google Patents
Verfahren zur immobilisierung von biologisch aktiven substanzen auf traegermaterialienInfo
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DR. BERG DIPL.-ING. STAPF
DIPL.-ING. SCHWAßE DR. DR. SANDMAIR Z 3 Z / ö 8
DIPL.-ING. SCHWAßE DR. DR. SANDMAIR Z 3 Z / ö 8
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Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf und Partner, 8 München 86, PO. Box 860245
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London S.W.l/ England
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"Verfahren zur Immobilisierung von biologisch
aktiven Substanzen auf Trägermaterialien"
aktiven Substanzen auf Trägermaterialien"
Die vorliegende Erfindung betrifft die Immobilisierung von biologisch aktiven Substanzen, beispielsweise von Enzymen,
auf einem Trägermaterial.
Biologisch aktive Substanzen, wie beispielsweise Enzyme, sind X/R - 2 -
t (089)988272 Telegramme: BERGSTAPFPATENT München Banken: Bayerische Vereinsbank München 453 !00
987043 TELEX: 0524560 BERG d Hypo-Bank München 3892623
983310 tiflQÖÖ"3/1ft*3Q Postscheck Mün;hen 65343-808
in gewissen Verfahren (z.B. Amylpglucosidase bei der Herstellung
von Glucose aus Stärke) als Katalysatoren brauchbar. Jedoch wird in der Praxis häufig festgestellt, daß
biologisch aktive Substanzen, wie beispielsweise Enzympräparate, lediglich in solchen Formen verfügbar sind, die
wasserlöslich sind. Dies bedeutet, daß eine derartige Substanz bei Beendigung eines Verfahrens nicht ökonomisch isoliert
werden kann, mit dem Ergebnis, daß die Substanz entweder in der erschöpften Flüssigkeit verlorengeht, oder das
Produkt verunreinigt.
Es kann daher vorteilhaft sein, eine biologisch aktive Substanz auf einem Trägermaterial zu immobilisieren, so daß
diese aus den Reaktionsmedien durch physikalische Techniken, wie beispielsweise durch Filtration oder Sedimentation, abgetrennt
werden kann. Außerdem sind biologisch aktive Substanzen, die auf einem Trägermaterial immobilisiert sind, für
eine "lokalisierte" Verwendung, beispielsweise als Bett in einer Säule, verfügbar.
Eine biologisch aktive Substanz wird auf einem Trägermaterial als immobilisiert angesehen, wenn sie an dieses Material in
einer derartigen Weise fixiert ist, daß es ermöglicht wird, zumindest einen Hauptanteil der Substanz durch das Trägermaterial
unter den besonderen Verfahrensbedingungen, bei denen
_. "X —
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das Trägermaterial und die biologisch aktive Substanz eingesetzt werden, zurückzuhalten.
Es wurden bereits verschiedene Verfahren für ein "Fixieren" oder "Immobilisieren" (oftmals auch als "Unlöslichmachen"
bezeichnet) von biologisch aktiven Substanzen auf Trägermaterialien vorgeschlagen. Jedoch sind diese Verfahren insofern
nicht zufriedenstellend, als die Produkte aus diesen Verfahren Nachteile aufweisen. Beispielsweise wird die biologisch
aktive Substanz entweder bei der Verwendung aus dem Trägermaterial "ausgelaugt", und/oder es ist die physikalische,
chemische oder mikrobiologische Stabilität der Substanz/Trägermaterial-Kombination
nicht zufriedenstellend, mit dem Ergebnis, daß die Substanz für eine fortgesetzte
Wiederverwendung über längere Zeiträume hinweg, nicht verfügbar ist.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Trägermaterials zu schaffen,
das eine darauf immobilisierte biologisch aktive Substanz enthält, welches das zeitweilige Zurückhalten einer biologisch
aktiven Substanz auf einem Trägermaterial und das Behandeln der biologisch aktiven Substanz zur Erzielung einer
Vernetzung, um die biologisch aktive Substanz auf dem Trägermaterial zu immobilisieren, umfaßt.
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Der Ausdruck "biologisch aktive Substanz", wie er in dieser Beschreibung angewandt wird, umfaßt unter anderem proteinhaltige
Substanzen (z.B. Enzyme), und schließt Substanzen ein, die als solche biologisch aktiv sind und solche,die
es nicht sind, die jedoch nach Immobilisierung aktiviert werden können, um sie biologisch aktiv zu machen.
Außerdem soll der Ausdruck "biologisch aktive Substanz" so verstanden werden, daß er unter anderem diejenigen Substanzen
umfaßt, welche im Stande sind, an spezifischen Wechselwirkungen teilzunehmen, wobei derartige Substanzen beispielsweise
solche biologischen Ursprungs und solche, die auf den lebenden Organismus einwirken, umfassen. Substanzen synthetischen
Ursprungs, die sich an Reaktionen beteiligen können, einbezogen spezifische Wechselwirkungen analog denjenigen,
die bei natürlich vorkommenden Substanzen auftreten können, werden ebenfalls in den Ausdruck "biologisch aktive Substanz"
einbezogen.
Bei der Immobilisierung einer biologisch aktiven Substanz wird diese Substanz zeitweilig auf dem Trägermaterial zurückgehalten,
derart, daß eine wesentliche Konzentration an dieser Substanz auf dem Träger für eine Immobilisation durch
Vernetzung verfügbar ist. Der Ausdruck "zeitweiliges Zurückhalten" soll sich im besonderen nicht auf die Verweilzeit
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der Substanz auf dem Träger beziehen, sondern er soll die
Natur dieser Retentionsstufe von der permanenteren Immobilisierung unterscheiden, die durch die Vernetzung erhalten wird.
Natur dieser Retentionsstufe von der permanenteren Immobilisierung unterscheiden, die durch die Vernetzung erhalten wird.
Wenn auch eine Adsorption von biologisch aktiver Substanz
durch das Trägermaterial während einer zeitweiligen Retention erfolgen kann, wurde jedoch gefunden, daß die Verwendung einer Adsorption allein zur Erzielung einer zeitweiligen Retention eine niedrige Ausbeute an immobilisierten
Enzym liefern kann. Daher umfaßt die zeitweilige Retention gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung in sehr bevorzugter Weise das Behandeln der Substanz derart, daß mehr als eine bloße adsorptive Retention durch das Trägermaterial erfolgt.
durch das Trägermaterial während einer zeitweiligen Retention erfolgen kann, wurde jedoch gefunden, daß die Verwendung einer Adsorption allein zur Erzielung einer zeitweiligen Retention eine niedrige Ausbeute an immobilisierten
Enzym liefern kann. Daher umfaßt die zeitweilige Retention gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung in sehr bevorzugter Weise das Behandeln der Substanz derart, daß mehr als eine bloße adsorptive Retention durch das Trägermaterial erfolgt.
Die zeitweilige Retention von biologisch aktiver Substanz
auf dem Trägermaterial kann beispielsweise durch Ausfällen aus einer Lösung einer biologisch aktiven Substanz unter Verwendung eines Fällungsmittels bewirkt werden. Wahlweise kann Gefriertrocknung in Verbindung mit einem Fällungsmittel zur Erzielung einer zeitweiligen Retention angewandt werden.
auf dem Trägermaterial kann beispielsweise durch Ausfällen aus einer Lösung einer biologisch aktiven Substanz unter Verwendung eines Fällungsmittels bewirkt werden. Wahlweise kann Gefriertrocknung in Verbindung mit einem Fällungsmittel zur Erzielung einer zeitweiligen Retention angewandt werden.
Die Gefriertrocknung kann auch allein angewandt werden, um eine zeitweilige Retention zu erreichen, obgleich festgestellt
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wurde, daß dies weniger wirksam sein kann, als wenn man ein Fällungsmittel verwendet.
Obwohl ein Teil einer biologisch aktiven Substanz an der Außenfläche eines Trägermaterials immobilisiert werden kann,
ist es in den meisten Fällen in hohem Maße wünschenswert, die Poren eines porösen Trägermaterials nutzbar zu machen,
da auf diese Weise das Verhältnis von Oberflächenbereich/Volumen
des Trägermaterials erheblich vergrößert und so eine größere Menge an biologisch aktiver Substanz immobilisiert
wird. In diesen Fällen sollte die Porengröße und Porenstruktur des porösen Trägermaterials so beschaffen sein, daß das
Eindringen der zu immobilisierenden Substanz und gegebenenfalls das Eindringen von Stoffen, mit denen die immobilisierte
Substanz in Wechselwirkung treten soll, ermöglicht wird.
Daher ermöglicht es das Verfahren der vorliegenden Erfindung bei Verwendung eines porösen Trägermaterials und einer biologisch
aktiven Substanz, die in die Poren desselben eindringen kann, diese biologisch aktive Substanz in den Poren
eines porösen Trägermaterials zu immobilisieren. Daher wird nach einer zeitweiligen Retention und Vernetzung die auf
dem porösen Trägermaterial immobilisierte biologisch aktive Substanz in den Poren des Materials als auch auf seiner
Außenfläche zugegen sein. Beispielsweise ist zu erwarten,
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daß im Falle eines teilchenförmigen porösen Trägermaterials ein Hauptanteil der immobilisierten Substanz eher in den Poren
als auf der Außenfläche der Teilchen vorhanden ist.
Gemäß einer anderen Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird ein Trägermaterial geschaffen, das darauf durch zeitweilige
Retention und Vernetzung eine biologisch aktive Substanz
immobilisiert enthält.
immobilisiert enthält.
Gemäß einer besonderen Ausfuhrungsform der Erfindung wird
die zeitweilige Retention durch Ausfällung bewirkt und die Ausfällungs- und Vernetzungsverfahren werden nacheinander
durch Behandeln der vorher auf das poröse Trägermaterial
eingeführten biologisch aktiven Substanz mit einem Fällungsmittel und anschließend einem Vernetzungsmittel zur Vernetzung der biologisch aktiven Substanz, durchgeführt.
die zeitweilige Retention durch Ausfällung bewirkt und die Ausfällungs- und Vernetzungsverfahren werden nacheinander
durch Behandeln der vorher auf das poröse Trägermaterial
eingeführten biologisch aktiven Substanz mit einem Fällungsmittel und anschließend einem Vernetzungsmittel zur Vernetzung der biologisch aktiven Substanz, durchgeführt.
Es wurde gefunden, daß es möglich ist, viele biologisch aktive Substanzen mit einem Fällungs- und einem Vernetzungsmittel,
oder -mitteln gleichzeitig zu behandeln. Dies ist
möglich im Falle von Enzymen (z.B. Amyloglucosidase), wobei die Zeit, die für das Ablaufen der Vernetzung erforderlich ist, die Zeit, die zur Ausfällung des Enzyms benötigt wird, weit übersteigt.
möglich im Falle von Enzymen (z.B. Amyloglucosidase), wobei die Zeit, die für das Ablaufen der Vernetzung erforderlich ist, die Zeit, die zur Ausfällung des Enzyms benötigt wird, weit übersteigt.
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Die zeitweilige Retention von einigen biologisch aktiven Substanzen kann durch Vorbehandeln der Substanz zur Erzielung
eines Grades an Vernetzung erleichtert werden; in solchen Fällen kann ein gewisser Vernetzungsgrad der Ausfällung
vorangehen.
Bevorzugt wird ein poröses Trägermaterial zuerst in einer konzentrierten Lösung einer biologisch aktiven Substanz
(z.B. eines Enzyms) eingeweicht und anschließend mit einem Fällungsmittel, das die Substanz nicht denaturiert, zur
zeitweiligen Retention der biologisch aktiven Substanz auf dem porösen Trägermaterial, und einem Vernetzungsmittel zur
Vernetzung und Immobilisierung der Substanz auf dem porösen Trägermaterial, behandelt.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird ein poröses Trägermaterial in einer konzentrierten Lösung von biologisch aktiver Substanz (z.B.
einem Enzym) eingeweicht, die biologisch aktive Substanz zeitweilig auf dem porösen Trägermaterial durch Gefriertrocknen
gebunden und das poröse Trägermaterial und die zeitweilig gebundene biologisch aktive Substanz mit einem Vernetzungsmittel
unter Bedingungen derart behandelt, daß im wesentlichen keine temporär gebundene Substanz in Lösung geht, um eine
Vernetzung und Immobilisierung der Substanz auf dem Träger-
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material zu bewirken.
Gegebenenfalls kann nach der zeitweiligen Bindung der Substanz an das poröse Trägermaterial durch Gefriertrocknen
weitere biologisch aktive Substanz auf das poröse Trägermaterial vor der Vernetzung durch Eintauchen in eine konzentrierte
Lösung der Substanz und temporäre Bindung durch Behandeln mit einem Fällungsmittel aufgebracht werden.
Es ist ohne weiteres ersichtlich, daß bei der Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung mit einem porösen
Trägermaterial biologisch aktive Substanz in Lösung eingeführt werden kann, um das Porenvolumen des Materials auszufüllen
und dann in einer solchen Weise behandelt werden kann, daß wesentliche Mengen der Substanz nicht aus den Poren verdrängt
werden, und so die aus der Lösung kommende Substanz hierdurch veranlaßt wird, sich zeitweilig an das Trägermaterial
zu binden. Die temporär gebundene Substanz, die auf dem Trägermaterial "lokalisiert" ist, wird nachfolgend zur Immobilisierung
derselben in den Poren vernetzt.
Die Immobilisierung von biologisch aktiven Substanzen auf einem Trägermaterial gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung
bezieht Sorption, Einschluß und Vernetzung ein.
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Unter Verwendung es erfindungsgemäßen Verfahrens wurde Arayloglucosidase unter Verwendung von Gallusgerbsäure als
Fällungsmittel und Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel an
den folgenden anorganischen Materialien, die jedoch lediglich beispielsweise angegeben sind, immobilisiert: Poröse
Titanerde-Kügelchen, poröse Calciumphosphat-Kügelchen, poröse Tonerde-Kügelchen, poröse Zirkonerde-Kügelchen, Glas mit
gesteuerter Porenbildung (Corning-Glastypen CPG1O-24O;
10-370; 10-1250; 30-370 und 30-2000), gemahlener Thermalitblock,
Laporte Spent Catalyst, Crossfield Spent Catalyst (Laporte Spent Catalyst und Crossfield Spent Catalyst enthalten
poröse Aluminosilicat-Teilchen). Es ist selbstverständlich, daß neben den vorerwähnten Beispielen auch andere
Materialien für eine Verwendung als Trägermaterialien geeignet sind. Beispielsweise sind poröse natürliche Erden, wie
zum Beispiel Celite, geeignete Trägermaterialien und es wurden gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren an porösen, aus
Celite hergestellten Kügelchen Enzyme immobilisiert. Außerdem können organische Materialien, wie beispielsweise Holz,
Viskose, Sephadex (ein vernetztes Dextran) und Biogel (ein Polyacrylamidgel) als Trägermaterialien verwendet werden.
Beispielsweise wurde Amyloglucosidase an Holzspänen unter Verwendung von Gallusgerbsäure als Pällungsmittel und Glutaraldehyd
als Vernetzungsmittel immobilisiert. Das Trägermaterial sollte wünschenswerterweise im wesentlichen unter den
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Verfahrensbedingungen und in den Reaktionsmedien, in denen das Trägermaterial und die biologisch aktive Substanz eingesetzt
werden, unlöslich sein.
Nachfolgend sind Beispiele von biologisch aktiven Substanzen angegeben, die bereits an porösen Titanerde-Kügelchen (mit
einer Teilchengröße von 500 μ Durchmesser, wobei 60 % der Porendurchmesser im Bereich von 2700 bis 10 000 8) unter
Verwendung von Gallusgerbsäure als Fällungsmittel und Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel immobilisiert wurden: Amyloglucosidase
(4 Typen), Lactase (4 Typen), a-Amylase, Chymotrypsin,
Trypsin, Urease, Glucoseoxydase, Lipoxydase, Glucoseisomerase und Papain.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann mehr als eine biologisch aktive Substanz an dem gleichen Träger immobilisiert
werden. So wurden Amyloglucosidase und a-Amylase zusammen immobilisiert.
Eine Anzahl von verschiedenen Reagentien wurden bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Fällungsmittel benutzt. So wurde unter Verwendung von Glutaraldehyd
als Vernetzungsmittel eine kommerziell verfügbare Amyloglucosidase (verfügbar unter dem Namen "Agidex") an porösen Titanerde-Kügelchen
(Teilchengröße und Porengröße wie oben ange-
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geben) immobilisiert, wobei man die folgenden Beispiele von
Fällungsmitteln anwandte: Gallusgerbsäure in 70 % Äthanol,
Gallusgerbsäure in 50 % Aceton, Gallusgerbsäure in 2 : 1 Wasser/Isopropanal, synthetische Polyphenole in 50 % Aceton
(verfügbar unter den Namen Tannia, Fixoflex, Fixin, Hysolad
von Harshaw Chemicals Ltd.)» Aceton, LT 24 Floccular (ein Flockungsmittel, erhältlich von Allied Colloids Ltd.), wässerige
Lösungen von Gallusgerbsäure, Salminsulfat, Alginsäure,
Protaminsulfat, Pektin, Gallussäure, Pyrogallol, Polyäthylenglykol,
DEAE-Dextran, Dextransulfat, Polygalacturonsäure und Polyäthylenimin.
Amyloglucosidase (Agidex) wurde ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung an porösen Titanerde-Kügelchen (Teilchen-
und Porengröße wie oben angegeben) unter Verwendung von Formaldehyd als Vernetzungsmittel und Gallusgerbsäure als
Fällungsmittel immobilisiert, und, zusätzlich, unter Verwendung von Diäthylpyrocarbonat als Vernetzungsmittel und
jedem der nachfolgenden Beispiele von Fällungsmitteln: Wässerige Gallusgerbsäure, Salminsulfat, Alginsäure, Protaminsulfat,
Pektin und Gallusgerbsäure in 70 % Äthanol. Zusätzlich
wurde Amyloglycosidase (Agidex) an porösen Titanerde-Kügelchen (Teilchengröße und Porengröße wie oben angegeben)
unter Verwendung von Gallusgerbsäure als Fällungsmittel und alkalischer Oxidation zur Erzielung einer Vernetzung immobili-
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siert. Andere Vernetzungsmittel umfassen Glyoxal und Bisdiazoniumsalze.
Ebenso wurde gemäß der vorliegenden Erfindung Glucoseoxydase an Titanerde-Kügelchen unter Verwendung von Gallusgerbsäure
und Diathylpryocarbonat und Papain an Titanerde-Kügelchen unter Verwendung von Gallusgerbsäure und Formaldehyd immobilisiert.
Die optimalen Bedingungen für die Immobilisierung biologisch aktiver Substanzen gemäß der vorliegenden Erfindung hängen,
zumindest zum Teil, von den biochemischen Eigenschaften der Substanz ab. Demzufolge wird die Auswahl von beispielsweise
dem Fällungsmittel, dem Vernetzungsmittel und der Vernetzungszeit am günstigsten durch einen Versuch ermittelt.
Die Zeit für eine Immobilisierung kann zwischen etwa 0,5 Stunden bis 2k Stunden variieren, je nach der biologisch
aktiven Substanz.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa k° C durchgeführt. Es wurde
beobachtet, daß eine Inaktivierung von gewissen biologisch aktiven Substanzen bei höheren Temperaturen erfolgen kann.
Jedoch hängt dies von der Substanz ab und es können höhere
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oder niedrige Temperaturen geeignet sein.
Es wurde festgestellt, daß man bei der Immobilisierung von Amyloglucosidase (Agidex) an porösen Titanerde-Kügelchen
(Teilchengröße und Porengröße wie oben angegeben) durch Fällung und Vernetzung vom Standpunkt der Enzymaktivität des
immobilisierten Enzyms am besten so vorgeht, daß man Gallusgerbsäure als Fällungsmittel und Glutaraldehyd als "Vernetzungsmittel
anwendet. Beispielsweise wurde gefunden, daß unter Verwendung dieser besonderen Kombination von Fällungsmittel
und Vernetzungsmittel die augenscheinliche Enzymaktivität von an porösen Titanerde-Kügelchen immobilisierter
Amyloglucosidase (Agidex) bis zu 20 % der Enzymaktivität der als Quelle der Amyloglucosidase eingesetzten
wässerigen Enzymzubereitung betragen kann.
Es wurde unter Verwendung von 5 % Gallusgerbsäure in 5 : 1
Aceton/Wasser als Fällungsmittel und Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel eine Charge von an porösen Titanerde-Kügelchen
(Teilchengröße und Porengröße wie oben angegeben) immobilisierter Amyloglucosidase aus 1^IlO g Titanerde-Kügelchen
und 30 ml Agidex hergestellt, und unter Bildung eines Bettes in eine 60 cm hohe Säule mit einem Volumen von 100 ml
gepackt.
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Eine mit Säure angeschärfte Stärkelösung wurde durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von zwischen 52 und 230 ml/
Stunde hindurchgeführt. Die Säule wurde während 8 Tagen auf
einer Temperatur von 60° gehalten, während welcher Zeit 9 Liter der Lösung behandelt wurden.
Das Dextrose-Äquivalent (D.E.) des Produktes aus der Säule war so hoch wie dasjenige, das man erwartete, wenn ein lösliches
Enzym für das gleiche Umwandlungsverfahren eingesetzt wird. Der Hydrolysegrad des Produktes war während 7 Tagen
des ständigen Gebrauchs der Säule konstant.
Es wurde eine Säule von an porösen Titanerde-Kügelchen immobilisierter
Amyloglucosidase kontinuierlich für die Hydrolyse einer Dextrinlösung während eines Zeitraums von 735 Tagen
eingesetzt. Das Produkt aus der Säule hatte einen konstanten D.E.-Wert, der eine nahezu totale Umwandlung des Ausgangsmaterials
anzeigte. Nachfolgend wurde die Säule von der Dextrinlösung freigewaschen, 5 Wochen bei Raumtemperatur
aufbewahrt und für das gleiche Hydrolyseverfahren wiederverwendet. Es wurde gefunden, daß der D.E.-Wert des Produktes
der gleiche wie derjenige Wert war, den man vorher erhalten hatte. Die Säule wurde weitere 11 Wochen lang gelagert und
es wurde gefunden, daß kein ernsthafter Verlust der Enzymaktivität auftrat.
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Es wurde festgestellt, daß Titanerde-Kügelchen mit daran
immobilisierter Amyloglucosidase gemäß der vorliegenden Erfindung entweder als Bettpackung, wie oben beschrieben,
in einem Wirbelbettreaktor oder in einem gerührten Tankreaktor eingesetzt werden können. Es ist durchaus zu erwarten,
daß dies in gleicher Weise auch für viele teilchenförmige TrägermateriaUen mit daran gemäß der vorliegenden Erfindung
immobilisierten, biologisch aktiven Substanzen Gültigkeit hat.
Amyloglucosidase wurde an porösen Titanerde-Kügelchen (Teilchengröße
und Porengröße wie oben angegeben) unter Anwendung der Gefriertrocknung und eines Fällungsmittels zur
Erzielung einer zeitweiligen Retention und Glutaraldehyd zur Erzielung einer Vernetzung, immobilisiert.
Enzyme wurden in situ an einer Kolonne von porösen Titanerde-Kügelchen
immobilisiert.
Während der in situ-Immobilisierung kann die überschüssige,
biologisch aktive Substanz, die nicht temporär an das Trägermaterial gebunden ist, für ein Im-Kreis-führen durch Waschen
des Trägermaterials (z.B. mit Aceton/Gallusgerbsäure) vor dem Vernetzen, zurückgewonnen werden.
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-u-
Verbrauchtes immobilisiertes Enzym wurde von Titanerde-Kügelchen
entfernt und die Kügelchen für eine weitere Immobilisierung wiederverwendet. Konzentrierte Salpetersäure, konzentriertes
Natriumhydroxid oder Erhitzen in einem Ofen sind zur Entfernung des Enzyms von den Kügelchen geeignet.
Es kann ein weiter Bereich von biologisch aktiven Substanzen auf einem weiten Bereich von Tragermaterialien gemäß dem
erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert werden. Demzufolge bietet die vorliegende Erfindung den Vorteil der Flexibilität
über bekannte "Immobilisierungsverfahren" insofern, als ein Trägermaterial aus einem weiten Bereich von Materialien
auf Basis seiner Eigenschaften ausgewählt werden kann, um für eine besondere Anwendung geeignet zu sein.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.
Agidex-Lösung (1 ml) wurde in einem Eisbad zu porösen Titanerde-Kügelchen
(3 ml; 500 μ Teilchengröße mit 60 % der Poren im Bereich von 2700 bis 10 000 S Durchmesser) zugegeben und
man ließ die Lösung sich gleichmäßig über die Kügelchen verteilen. Es wurde eine vorher in einem Eisbad gekühlte 5 /Kige
Lösung von Gallusgerbsäure in 5 : 1 Aceton : Wasser (1,5 ml)
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zugegeben, gefolgt von einer 50 $igen wässerigen Lösung von
Glutaraldehyd (0,25 ml). Der Flüssigkeitsspiegel war dann
unmittelbar oberhalb der Oberfläche der porösen Titankügelchen. Nach 5 Stunden wurden die Kügelchen aus dem Eisbad
entfernt, gewaschen und in eine Säule gepackt, so daß man die Enzymaktivität untersuchen konnte. Zur Untersuchung der
Eigenschaften der Säule wurde eine Lösung von Dextrin verwendet und man erhielt, wenn man die Aktivität der ursprünglichen
Agidex-Lösung als 100 % annimmt, eine augenscheinliche Aktivität des immobilisierten Enzyms in der Säule von 20 %.
Eine Agidex-Lösung (4,5 ml) wurde wie in Beispiel 1 über poröse Titanerde-Kügelchen (15 ml) verteilt. Es wurde eine
gekühlte, 2 %ige Lösung von Gallusgerbsäure in Aceton (6,75 ml), in welche erst kurz vorher eine 50 #ige wässerige Lösung
von Glutaraldehyd (1,05 ml) gemischt worden war, zugegeben und die erhaltene steife Aufschlämmung sorgfältig gemischt.
Nach 5 Stunden wurden die Kügelchen gewaschen und die Enzymaktivität wie in Beispiel 1 bestimmt. Die augenscheinliche
Enzymaktivität des immobilisierten Enzyms wurde als ähnlich dem Wert, wie er in Beispiel 1 erhalten wurde, befunden.
Beispiel 3 Eine Agidex-Lösung, die in einem Verhältnis von 1 : 1 mit
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Wasser (8 ml) verdünnt worden war, wurde über poröse Titanerde-Kügelchen
(10 ml; Teilchengröße und Porengröße wie in Beispiel 1) verteilt und gefriergetrocknet (lyophilisiert).
Die Agidex-Lösung (1,5 ml) wurde über 5 ml dieser lyophilisierten
Kügelchen verteilt und eine gekühlte 2 %ige Lösung von Gallusgerbsäure in Aceton (2,25 ml) und 50 % Glutaraldehyd
(0,35 ml) in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 zugegeben. Es wurde gefunden, daß die augenscheinliche Aktivität
des immobilisierten Enzyms um 15 % höher lag als die Aktivität
eines immobilisierten Enzyms, das unter Verwendung von porösen Titanerde-Kügelchen, jedoch ohne Gefriertrocknungsstufe hergestellt worden war.
Eine Agidex-Lösung (2 ml) wurde auf einem Eisbad zu 5 ml porösen Glasteilchen (Corning CPG 10 bis 1250, 36 bis 75 y
Teilchengröße) zugegeben und gut verteilt. Es wurde eine gekühlte 5 #ige Lösung von Gallusgerbsäure in 5 : 1 Aceton :
Wasser (3 ml) zugegeben, gefolgt von einer 50 #igen wässerigen Lösung von Glutaraldehyd (0,5 ml). Nach 5 Stunden wurden
die Glaspartikelchen gewaschen und die Enzymaktivität in einem kleinen gerührten Ansatzreaktor untersucht. Die
augenscheinliche Aktivität des immobilisierten Enzyms betrug 93 % der Aktivität des immobilisierten Enzyms auf porösen
Titanerde-Kügelchen vom Typ, wie sie in den Beispielen 1,
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2 und 3 verwendet worden waren.
Eine Agidex-Lösung (1 ml) wurde über poröse Titanerde-Kügelchen
(3 ml) wie in Beispiel 1 gut verteilt. 1,5 ml einer gekühlten, 10 ?igen Lösung von Fixoflex (ein synthetisches
Polyphenol) in 5 : 1 Aceton : Wasser wurden zugegeben, gefolgt von einer 50 #igen wässerigen Lösung von Glutaraldehyd
(0,25 ml). Nach 5 Stunden wurden die Kügelchen gewaschen und
es wurde nach einer Untersuchung des immobilisierten Enzyms wie in Beispiel 1 gefunden, daß sie 82 % der Aktivität des
immobilisierten Enzyms besaßen, das mit Gallusgerbsäure in einer Aceton : Wasser-Mischung als Fällungsmittel hergestellt
worden war.
1 ml einer wässerigen Lösung von Lactase (Maxilact 75 mg/ml) wurde zu 3 ml porösen Titanerde-Kügelchen zugesetzt und
gleichmäßig verteilt. Eine gekühlte, 0,25 #ige Lösung von Gallusgerbsäure in 5 : 1 Aceton : Wasser (1,5 ml) wurde zugesetzt,
gefolgt von einer 20 55igen wässerigen Lösung von Glutaraldehyd
(0,1 ml). Nach 20 Minuten wurden die Perlen gewaschen und in eine Säule gepackt. Die augenscheinliche Aktivität
des immobilisierten Enzyms betrug 11 % der Aktivität des löslichen Enzyms, wenn o-Nitrophenyl-ß-D-galactosid
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als Substrat verwendet wurde.
Beispiel 7
Eine Agidex-Lösung (1,5 ml) wurde zu porösen Titanerde-Kügelchen
(500 μ, 5 ml) auf einem Eisbad zugegeben und gleichmäßig
über die Kügelchen verteilt. Eine gekühlte, 2 %ige Lösung von Gallusgerbsäure in Aceton (2,25 nil) wurde zugesetzt,
gefolgt von einer 37 $igen wässerigen Lösung von Formaldehyd (0,35 ml). Nach 5 Stunden wurden die Kügelchen
gewaschen und das immobilisierte Enzym wie in Beispiel 1 geprüft. Es wurde gefunden, daß es eine Enzymaktivität aufwies,
die 56 % derjenigen eines in ähnlicher Weise immobilisierten
Enzyms entsprach, das unter Verwendung von Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel hergestellt worden war.
Agidex (1 ml) wurde über ein Büschel von Weichholz-Spänen, die ein Volumen von 3 ml hatten, auf einem Eisbad verteilt.
Eine gekühlte, 2 #ige Lösung von Gallusgerbsäure in Aceton (1,5 ml), in welche eine 50 #ige Lösung von Glutaraldehyd
(0,25 ml) kurz vorher eingemischt worden war, wurde zugesetzt und die Reagentien sorgfältig gemischt. Nach 5 Stunden wurden
die Späne gewaschen und lose in eine kleine Kolonne gepackt, damit sie auf ihre Enzymaktivität wie in Beispiel 1
geprüft werden konnten. Die Späne hatten eine Enzymaktivität,
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die Ik % der Aktivität des immobilisierten Enzyms von
Beispiel 2 betrug.
Beispiel 9
Man ließ eine wässerige Lösung von Glucoseisomerase-Enzym
(1,5 ml, erhalten durch wässerige Extraktion von Maxazyme-GI
14 000 Zellen) in 5 g poröse Titanerde-Kügelchen (Teilchengröße 500 y Durchmesser, 60 % der Porendurchmesser im
Bereich von 2 200 bis 10 000 8) auf einem Eisbad eindringen.
Das Enzym wurde mittels einer 3 #igen Lösung von Gallusgerbsäure
in Aceton (2,25 ml) und 50 tigern wässerigen Glutaraldehyd
(0,05 ml) ausgefällt und vernetzt.
Nach einer Reaktionszeit von 1,5 Stunden auf einem Eisbad wurden die Kügelchen gewaschen und die Enzymaktivität überprüft
.
Es wurde gefunden, daß die Kügelchen 35 % der Enzymaktivität,
die in der Ausgangslösung des Enzyms vorhanden war, aufwiesen.
- 23 503483/1039
Claims (30)
- PatentansprücheΓΐ) Verfahren zur Herstellung eines Trägermaterials mit einer darauf immobilisierten biologisch aktiven Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß eine biologisch aktive Substanz auf einem Trägermaterial temporär gebunden und die biologisch aktive Substanz zur Erzielung einer Vernetzung zur Immobilisierung der biologisch aktiven Substanz auf dem Trägermaterial behandelt wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet , daß das Trägermaterial ein poröses Trägermaterial ist.
- 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die temporäre Retention der biologisch aktiven Substanz auf dem Trägermaterial durch Ausfällung aus einer Lösung einer biologisch aktiven Substanz bewirkt wird.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung einer temporären Retention eine Gefriertrocknung angewandt wird.509883/1039
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß die temporäre Retention durch Ausfällung bewirkt wird, und die Ausfällungsund Vernetzungsverfahren aufeinanderfolgend durch Behandeln der vorher auf das poröse Trägermaterial eingeführten biologisch aktiven Substanz mit einem Fällungsmittel und anschliessend einem Vernetzungsmittel durchgeführt werden.
- 6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet , daß ein poröses Trägermaterial zunächst in einer konzentrierten Lösung einer biologisch aktiven Substanz eingeweicht und dann nachfolgend mit einem Fällungsmittel, welches die Substanz nicht denaturiert, die biologisch aktive Substanz an das poröse Trägermaterial temporär bindet, und einem Vernetzungsmittel zur Vernetzung und Immobilisierung der Substanz auf dem porösen Trägermaterial, behandelt wird.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3} dadurch gekennzeichnet, daß die vorher auf das Trägermaterial eingeführte biologisch aktive Substanz gleichzeitig mit einem Fällungsmittel und einem Vernetzungsmittel, oder -mitteln, behandelt wird.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, d a -- 25 -509683/1039durch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz vorbehandelt wird, um ein gewisses Ausmaß an Vernetzung vor der Fällung zu bewirken.
- 9· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis k3 dadurch gekennzeichnet, daß ein poröses Trägermaterial in einer konzentrierten Lösung von biologisch aktiver Substanz eingeweicht, die biologisch aktive Substanz temporär an das poröse Trägermaterial durch Gefriertrocknung gebunden wird, und dann das poröse Trägermaterial und die temporär gebundene, biologisch aktive Substanz mit einem Vernetzungsmittel unter Bedingungen derart behandelt werden, daß im wesentlichen keine temporär gebundene Substanz in Lösung geht, um eine Vernetzung und Immobilisierung der Substanz auf dem Trägermaterial zu bewirken.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß nach der temporären Bindung der Substanz an das poröse Trägermaterial weitere biologisch aktive Substanz in das poröse Trägermaterial vor der Vernetzung durch Eintauchen in eine konzentrierte Lösung der Substanz eingeführt und temporär durch Behandlung mit einem Fällungsmittel gebunden wird.
- 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8 und 10, d a -- 26 -509883/1039durch gekennzeichnet, daß das Fällungsmittel Gallusgerbsäure in Äthanol, Gallusgerbsäure in Aceton, Gallusgerbsäure in Wasser/Isopropanal, ein synthetisches Polyphenol in Aceton, Aceton, ein Flockungsmittel, oder eine wässerige Lösung von Gallusgerbsäure, Salminsulfat, Alginsäure, Protaminsulfat, Pektin, Gallussäure, Pyrogallol, Polyäthylenglykol, DEAE-Dextran, Dextransulfat, Polygalacturonsäure oder Polyäthylenimin, ist.
- 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz durch Behandeln mit einem Vernetzungsmittel immobolisiert wird.
- 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekenn zeichnet , daß das Vernetzungsmittel Glutaraldehyd, Formaldehyd, Diäthylpyrocarbonat, Glyoxal oder ein Bisdiazoniumsalz ist.
- 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß das Vernetzen durch alkalische Oxidation bewirkt wird.
- 15· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Träger-- 27 -5G9BS3/1Ö33material poröse Titanerde-Kügelchen, poröse Calciumphosphat-Kügelchen, poröse Tonerde-Kügelchen, poröse Zirkonerde-Kügelchen, Glas mit geregelten Poren, zermahlener Thermalitblock, Aluminosilicat-Katalysatorteilchen, oder eine poröse natürliche Erde ist.
- 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß die natürliche Erde Celite ist.
- 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial Holz, Viskose, ein vernetztes Dextran oder ein PoIyacrylamidgel ist.
- 18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß die porösen Titanerde-Kügelchen eine Teilchengröße mit einem Durchmesser von 500 μ besitzen und 60 % der Porendurchmesser im Bereich von 2 700 bis 10 000 8 liegen.
- 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz eine proteinhaltige Substanz ist.
- 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch g e -- 28 503083/1033kennzeichnet , daß die proteinhaltige Substanz ein Enzym ist.
- 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , daß das Enzym Amyloglucosidase, Lactase, α-Amyläse, Chymotrypsin, Trysin, Urease, Glucoseoxydase, Lipoxydase, Glucoseisomerase oder Papain ist.
- 22. Trägermaterial, das durch temporäre Retention und Vernetzung eine biologisch aktive Substanz daran immobilisiert enthält.
- 23. Trägermaterial mit einer daran immobilisierten biologisch aktiven Substanz nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet , daß das Trägermaterial ein poröses Trägermaterial ist und die biologisch aktive Substanz in den Poren desselben immobilisiert ist.
- 24. Trägermaterial mit einer daran immobilisierten biologisch aktiven Substanz nach einem der Ansprüche 22 und 23, dadurch gekennzeichnet , daß das Trägermaterial poröse Titanerde-Kügelchen, poröse Calciumphosphat-Kügelchen, poröse Tonerde-Kügelchen, poröse Zirkonerde-Kügelchen, Glas mit geregelten Poren, zermahlener Thermalitblock, Aluminosilicat-Katalysatorteilchen, oder eine poröse natür-- 29 509883Π039liehe Erde ist.
- 25. Trägermaterial mit daran immobilisierter biologisch aktiver Substanz nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die natürliche Erde Celite ist.
- 26. Trägermaterial mit daran immobilisierter biologisch aktiver Substanz nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet , daß die porösen Titanerde-Kügelchen eine Teilchengröße von 5OO μ Durchmesser besitzen und 60 % der Porendurchmesser im Bereich von 2 700 bis 100 000 8 liegen.
- 27· Trägermaterial mit daran immobilisierter biologisch aktiver Substanz nach einem der Ansprüche 22 und 23» dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial Holz, Viskose, ein vernetztes Dextran oder ein PoIyacrylamidgel ist.
- 28. Trägermaterial mit daran immobilisierter biologisch aktiver Substanz nach einem der Ansprüche 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz eine proteinhaltige Substanz ist.- 30 509883/10 39
- 29· Trägermaterial mit daran immobilisierter biologisch aktiver Substanz nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die proteinhaltige Substanz ein Enzym ist.
- 30. Trägermaterial mit daran immobilisierter biologisch aktiver Substanz nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet , daß das Enzym Amyloglucosidase, Lactase, α-Amyläse, Chymotrypsin, Trysin, Urease, Glucoseoxydase, Lipoxydase, Glucoseisomerase oder Papain ist.509883/1039
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