DE1915970A1 - Verfahren zur Herstellung von Produkten auf der Basis aktiver Proteinsubstanzen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Produkten auf der Basis aktiver ProteinsubstanzenInfo
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Description
Köln, den 26.3.1969 Ke/Ax
Agenoe Nationale de Valorisation de la Recherche (ANVAR),
5,
Rue Bellini, Puteaux (Hauts-De-Seine) (Frankreich).
Verfahren zur Herstellung von Produkten auf der Basis
aktiver Proteinsubstanzen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Produkten auf Basis von aktiven Proteinsubstanzen»
Enzyme und unlösliche Träger wurden bereits mit Hilfe von Adsorptionsverfahren kombiniert (I.Langmir und V.Schaefer,
J.Am.Chem.Soc. 60, 1351 (1938), aber die erhaltenen Produkte denaturierten feilweise,"und die Enzyme wurden allmählich
freigesetzt, während sie sich mit den Substraten
in Berührung befanden. Die Fixierung der Enzyme war somit nicht stabil mit der Zeit oder blieb gegenüber äußeren
Einwirkungen schlecht.
Kombinationen von Cellulosederivaten und Enzymen wurden von A.Mitz und J*Summaria hergestellt (Nature 189,576
(1961)), die beispielsweise eine Carboxymethylcellulose in die Azidform überführten und dann dieses Azid mit
einer stabilisierten lösung eines Enzyms umsetzten.
Ein ähnliches Verfahren wird von J.Epstein und B.Anfinsen
in J.Biol.,Chem., 237 (1962) beschrieben,, Hierbei handelt
es sich um eine Kupplung arischen Carboxymethylcellulose
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und Ribonuklease oder Trypsin*
Von P.Bernfeld wird in Science 142, 678 (1963) ein Verfah-'
ren beschrieben, bei dem Antigene und Enzyme durch Bindung in Netzen von synthetischen Polymeren unlöslich gemacht
werden. Das Verfahren besteht darin, daß die löslichen Makromolekularen Verbindungen in den "Maschen"
eines stark vernetzten Polymeren mechanisch eingeschlossen werden, indem gewisse synthetische Monomere in wässriger
Lösung in Gegenwart der zu fixierenden, biologisch aktiven, makromolekularen Substanz polymerisiert werden·
Die vorstehend genannten Verfahren haben insbesondere die folgenden Nachteile: Die Ausbeuten an fixierten Proteinen
sind gering» Die Fixierung der Proteine ist nicht dauerhaft,
und während ihrer Fixierung werden die Proteine de~
naturiert.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, das die oben genannten Nachteile nicht aufweist, und das die Herstellung
von Produkten, die aktive Proteinsubstanzen enthalten, mit hoher Ausbeute an fixierten Proteinen ermöglicht.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung
von Produkten auf Basis von aktiven Proteinen, wobei die Fixierung der Proteine stabil iste
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Bindung von aktiven Proteinen auf einem Substrat, in dem die Proteine
während ihrer Fixierung nicht denaturiert werden.
In seiner allgemeinen Form ist das Verfahren gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger mit
einer Lösung wenigstens einer aktiven Proteinsubstanz in
Gegenwart eines "Brüokenbildners" (agent pontant) in Berührung
bringt und anschließend den Träger, auf dem die aktive Proteinsubstanz fixiert ist, isoliert»
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Ein solches Verfahren hat zahlreiohe Anwendungen und kann daher mit einer Vielzahl von Varianten durchgeführt werden.
Diese Varianten werden in der folgenden Beschreibung näher ■beschrieben, wo Beispiele von Trägern und aktiven Proteinsubstanzen,
auf die die Erfindung anwendbar ist, gegeben werden»
Die aktiven Proteinsubstanzen, die für die Zwecke der
Erfindung geeignet sind, können allgemein natürliche oder durch Synthese erhaltene Produkte sein, die im Rohzustand
oder nach vorheriger Reinigung verwendet werden können» Diese Substanzen werden aus Enzymen, Antikörpern, Antigenen,
Allergenen, Hormonen, Mikroben und Viren ausgewählt.
Diese aktiven Proteinsubstanzen v/erden im allgemeinen in gepufferten wässrigen Medien gelöst» Die Puffer sind in
den meisten lallen mineralische Puffer, z.B. auf Basis von Alkaliphosphaten oder Erdalkaliphosphaten und sind
allgemein bekannte
Beim Verfahren gemäß der Erfindung können alle geeigneten Träger verwendet werden, die mit der aktiven Proteinsubstanz
verträglich sind, d.h. diese Substanz nicht denaturieren. Wie nachstehend näher ausgeführt wird, können die
Produkte, die nach einem solchen Verfahren erhalten werden, die verschiedensten Formen haben«
Die Produkte können in wässrigen Medien löslich sein und
somit die Form einer wässrigen Lösung haben, oder sie können in wässrigen Medien suspendiert werden. Die Produkte
können die Form von Gelen, Feststoffen in Form von 3-ranulat, Pillen, Tabletten, Platten, Kuchen und anderen
geformten Massen haben. Die verwendeten Träger können ferner dem Produkt seine endgültige Form, z.B. die Form
eines Films, einer Membran oder eines inerten und porösen Materials verleihen. Als makromolekulare Träger eignen
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sich Cellulose, Amylose» Polysaccharide, Alginate, Kollagen,
Polyvinylalkohol, Polysilane, Polyacrylamid und deren •Substitutionsprodukte. Weitere Beispiele geeigneter Träger
werden in der folgenden ausführlichen Beschreibung genannt,
Der hier gebrauchte Ausdruok "Brückenbildner" bezeichnet
jedes Mittel, das sich chemisch mit wenigstens zwei Molekülen der chemischen Körper, mit denen es in Berührung gebracht
wird, zu verbinaefy. Es handelt sich somit im allgemeinen
um bifunktionelle Verbindungen. Als Brückenbildner eignen sich somit gleiche oder verschiedene mehrfunktionelle Verbindungen wie Diazo-bis-benzidin, Diazo-bis-oanisidin,
Diepoxyde, Triepoxyde, Chlor-5-triazine, Diisocyanate, Disulfochloride, Dialdehyde wie Glutaraldehyd,
Bis-maleinsäureimide, Difluordinitrophenylsülfon, Epihalogenhydrine,
p-Nitrophenyldiazoacetat; Chlor-fluor-dinitrobenzol,
Ithylchlorcarbonat, Carbodiimide und Phenylisoxazoliumsulfonate
Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht somit durch die Wirkung des Brückenbildners die Bildung von chemischen
Brückenbindungen zwischen den Molekülen von Proteinsubstanzen und gegebenenfalls zwischen dem Träger und diesen
Substanzen«
Wenn der Träger ein makromolekulares Material ist und sich von der Lösung der Proteinsubstanzen durchdringen läßt,
bleiben die Moleküle der Proteinsubstanzen in den Maschen des Netzes des Trägers haften. Wenn ferner der Träger
funktionelle Gruppen enthält, die mit den Gruppen des
Brückenbildners reaktionsfähig sind, entstehen chemische Bindungen unmittelbar zwischen dem Träger und den Proteinsubstanzen,
wodurch die Fixierung noch stärker wird, ohne daß die Proteinsubstanzen verändert werden.
Nachstehend werden einige Ausführungsbeispiele und Anwendungen des Verfahrens gemäß der Erfindung beschrieben.
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Bei einer Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung fixiert man ein Enzym, ZoB. Glucoseoxydase, Carboanhydrase,
Chymotrypsin oder Trypsin, mit Hilfe eines Brückenbildners wie Diazo-bis-o-dianisidin, auf einem Träger, der beispielsweise
aus Cellulose, regenerierter Cellulose (Cellophan), Dextran oder Polyvinylalkohol besteht und die Form
von Granulat oder Mien haben kann.
Bei einer weiteren Anwendung des Verfahrens gemäß der
Erfindung fixiert man ein Enzym wie (Jl uo öse oxy das e durch
Copolymerisation auf einem als Träger dienenden inerten Protein, Z0B. Albumin, in Gegenwart eines Brückenbildners
wie Glutaraldehyde In der gleichen Weise wird ein Film
aus aktivem Protein durch Bildung von Brückenbindungen
zwischen Albuminmolekülen und Carboanhydrase mit Hilfe einer bifunktionellen reaktionsfähigen Verbindung, im vorliegenden
Fall Glutaraldehyd, hergestellt. Der auf diese Weise erhaltene Film hat wertvolle Eigenschaften und kann
beispielsweise als biologische Membran verwendet werden. Es ist auch möglich, andere Enzyme in einen solchen Film
einzubauen, wobei man ihm die spezifischen Eigenschaften des jeweiligen Enzyms verleiht, wie dies bei,Carboanhydrase
der Fall ist·
Bei einer weiteren Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung
wird ein Film aus Carboanhydrase, bei dem die Brückenbindungen durch eine bifunktioneile reaktionsfähige
Verbindung, speziell Gluraldehyd, gebildet worden isind, auf die Oberfläche einer hydrophoben Membran, insbesondere
einer Membran auf Siliconbasis, aufgebracht. Die Aufbringung dieses Films aus Carboanhydrase auf die Oberfläche
einer solchen Membran steigert erheblich die Durchgangsgeschwindigkeit von Gasen, insbesondere Kohlensäure, durch
die Membran»
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß
der Erfindung stellt man ein Gewebe her, auf das proteo-
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lytische Enzyme aufgepfropft sind, indem man das ursprüngliche
Gewebe zuerst mit einer Lösung, die reich an hydrolytischen Enzymen ist, und dann mit einer Lösung eines
Brückenbildners, im vorliegenden Fall Glutaraldehyd, tränkt. Nach dem Spülen erhält man ein Gewebe, in dem die Enzyme
ihre Aktivität bewahren«
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung polymerisiert man in Gegenwart eines Brückenbildners
ein aktives Protein, Z0B0 ein Enzym, ein Antigen
oder eine analoge Proteinsubstanz, in Gegenwart eines als Träger dienenden inerten Proteins und unterbricht die Polymerisation
so, daß das erhaltene Produkt in wässrigen Lösungsmitteln löslich bleibt. In diesem Falle werden die
aktiven Proteine auf einen Träger gepfropft, der aus einer
Proteinkette besteht, die in wässrigen Medien löslich ist.
Als Brückenbildner eignet sich Glutaraldehyd. Als inertes Protein, das sich als Träger eignet, kann beispielsweise
Plasma-Albumin verwendet werden.
Die folgenden aktiven Proteine können in eine Kette aus
inertem Protein wie Plasma-Albumin eingebaut werden;
Hydrolasen, z.B. insbesondere proteolytische, lipolytische und amylolytische Hydrolasen des Verdauungstraktes sowie
Urease, Asparaginase und andere hydrolytische Enzyme, Oxydasen, z.B. Uricase, Glucoseoxydase, Peroxydase, Katalase,
Hydroxylasen, z.B. Phenylalaninhydroxylase, die Isomerasen und Transferasen, z.B. Gä-astosephosphaturidyltransferase,
und die Lyasen, die die C-C-, C-O- und C-F-Bindungen lösen.
Aktive Proteine, die die löslichen Antigene und Allergene umfassen, können ebenfalls wie die Enzyme aufgepfropft
werden, nachdem diese Proteinffaktionen vorher von ihrem natürlichen unlöslichen Träger isoliert worden sind. Ein
solches Verfahren kann für die Herstellung von Produkten.
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angewandt werden, die in der Therapie wirksam sind, und in denen die Wirkungsweise der aktiven Proteine verbessert
ist. Zum Beispiel können die nach diesem Verfahren aufgepfropften proteolytischen Enzyme oral verabfolgt werden,
um die Verdauung zu erleichern oder zu aktivieren»
Die erhaltenen Lösungen von Enzymen können intravenös injiziert werden. Gewisse Enzyme, z.B. Urioase und Aspariginase,
die eine therapeutische Wirkung "bei Gioht "bzw. bei akuter Leukose haben, können ebenfalls durch Injektion
verabfolgt werden»
Galactosephosphat-Uridyltransferase kann ebenso wie Phenyl·
alaninhydroxylase zugeführt werden, um Personen, die gewisse Enzyme nicht mehr oder nur in ungenügenden Mengen
bilden können, normalen Stoffwechsel zu ermöglichen.
Die Injektion von aufgepfropften Antigenen führt zu bleibender Bildung von Antikörpern über einen langen Zeitraum,
und die Injektion von Allergenen ermöglicht es, den empfangenden Organismus dauerhaft zu desensibilisieren.
In allen Fällen hat die Konstitution der nach einem solchen Verfahren erhaltenen aufgepfropften Proteine bei der Verabfolgung
protiahierte Wirkungen oder lang anhaltende therapeutische Wirkungen zur Folge.
Bei einer Variante des Verfahrens gemäß der Erfindung polymerisiert man aktive Proteine in .Gegenwart eines
Biückenbildners mit einem inaktiven Proteinträger, um feine unlösliche Teilchen zu bilden, die in einer physiologischen
Lösung oder einer wässrigen Lösung suspendiert werden können. In diesem Fall werden die aktiven Proteine,
z.B. die Enzyme, auf einen Träger gepfropft, der aus einem feinteiligen Protein in Suspension besteht.
Als inerter Proteinträger kann Plasma-Albumin und als Vernetzungsmittel oder Brückenbildner Glutaraldehyd verwendet
werden. Die Moleküle der pfropfbaren aktiven Pro-
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teine sind EnHyme, Antigene, Allergene oder andere Proteinsubstanzen.
Bei diesem Verfahren können Suspensionen gebildet werden, die proteolytische Enzyme, Oxydoreduktasen,
Lyasen, die die C-O-, C-O- und C-N-Bindungen lösen, Isomerasen,
Transferasen oder andere Enzyme enthalten* Außerdem werden bei diesem Verfahren Suspensionen erhalten, die
in der Therapie verwendet werden können. Beispielsweise können aufgepfropfte proteolytische, lipolytisohe und
amylolytische aufgepfropfte Enzyme oral verabfolgt werden,
um die Verdauung zu aktivieren Suspensionen von Enzymen wie Uricase oder Asparaginase sind subkutan oder intramuskulär
oder intravenös injizierbar, um gewisse toxische oder schädliche Produkte wie Harnsäure oder Asparagin
abzubauen oder um die ungenügende Versorgung gewisser Personen, beispielsweise mit G-alactosephosphaturidyltransferase
bei Fällen von Galactosämie zu ergänzen« In der gleichen Weise können Antigene subkutan injiziert werden,
um die langanhaltende Bildung von entsprechenden Antikörpern zu bewirken. Ebenso kann die Injektion von Allergenen,
die auf feine Teilchen aufgebracht sind, die Desensibilisierung gegenüber diesen Proteinen begünstigen·
Ferner ist es möglich, Membrane bakteriellen Ursprungs
oder ganze Bakterien'mit Albuminmolekülen so zu koppeln, ,
daß feine Teilchen gebildet werden, die die Bildung von antibakteriellen Antikörpern in sehr dauerhafter Weisebewirken.
Ebenso können Koppelungen zwischen Viren und inaktiven Pr&teinen wie Albumin verwirklicht werden. Diese
Koppelungen ermöglichen wirksame Impfungen, insbesondere örtliche Impfungen, wie dies bei der Impfung im Nasenrachenraum
der Fall ist, oder die Zuführung von Konkurrenzkeimen einer gestörten Darmflora.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung polymerisiert man ein aktives Protein in
Gegenwart eines Brückenbildners und eines inaktiven Proteins, das als Träger dient, bis eine feste und unlösliche
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Masse von genügender Größe erhalten wird, die die aktiven Proteine enthält, die ihre ursprünglichen Eigenschaften
bewahrt haben. In diesem Fall sind die aktiven Proteine in einen Träger gepfropft, der aus einer unlöslichen
Proteinmasse besteht und beispielsweise die Form von Granulat, Pillen oder Tabletten hat. Zahlreiche Enzyme können
auf diese Weise in ein Polymeres von Plasma-Albumin eingearbeitet werden, insbesondere proteolytische, lipolytische
und amylolytische Hydrolasen. Das gleiche gilt für gewisse Mikroorganismen, die an Albuminmoleküle durch die Proteine
ihrer Wand gebunden werden können» Diese Proteine und diese aufgepfropften Mikroorganismen können oral genommen werden,
um die Verdauung zu aktivieren oder um eine pathologische Darmflora kompetitiv zu hemmen.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung polymerisiert man in Gegenwart eines Brückenbildners
ein Enzym oder ein beliebiges anderes aktives Protein allein oder in.Kombination mit einem anderen aktiven
oder inaktiven Protein im Innern eines inerten Materials, z.B. einer Prothese, einer Plastik usw., das an
der Oberfläche leicht porös ist, wodurch die Proteine eindringen und fixiert werden können. In diesem Pail werden
die aktiven Proteine auf einen Träger gepfropft, der aus einem unlöslichen inerten und leicht porösen Material besteht.
Die Verwendung solcher Prothesen, auf die entweder ein einfacher Proteinfilm oder ein Film als Träger von enzymatischen
Funktionen gepfropft ist, kann in Fällen empfohlen werden, in denen entweder die Bedeckung der Oberflächen
der Prothese mit angrenzendem Gewebe erleichtert oder diese Bedeckung verhindert werden soll· Dies ist insbesondere
der Fall bei Prothesen, die bei plastischen Operationen verwendet werden, bei Starr-Klappen, bei Teilen,
die bei der Osteosynthese verwendet werden, und bei allen Oberflächen von unlöslichem und inertem Material, das in
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den Organismus als Plastik oder Prothese eingeführt wird.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht ferner die
Herstellung von Produkten, bei denen die Enzyme auf einen Träger gepfropft sind, der aus einem Proteinfilm besteht.
Solche Filme können naoh entsprechender Behandlung auch
in der Kosmetik und !Therapie verwendet werden ο
Die nach dem Aufpfropfen der Enzyme erhaltenen Filme müssen anschließend getrocknet und durch Bestrahlung mit
Ultraviolettlicht sterilisiert werden, bevor sie in sterilen Beuteln konditioniert werden·
Die kutane Anwendung solcher Filme oder ihre Aufbringung
auf leicht zugängliche Schleimhäute ermöglicht die örtliche Einwirkung gewisser Enzyme, insbesondere proteolytischer
Enzyme wie Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Keratinase und Elastase, Subtilisin, Pronase, Kollagenase,
Pepsin usw„ Diese Enzyme können eine therapeutische Wirkung
bei gewissen Hautkrankheiten und bei gewissen Störungen der Narbenbildung haben.
Die Proteinfilme als Enzymträger können auch in der Kosmetik für die Hautpflege verwendet werden.
Außer für die oben genannten Anwendungen eignen sich die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Produkte
für die Verwendung auf dem Gebiet der aktiven Filtration, der selektiven Adsorption, der Elektrophorese, der Chromatographie
und für andere analoge Anwendungen.
Beispielsweise kann man bei der aktiven und selektiven
Filtration durch Filtration durch eine Membran, die Träger eines proteolytischen Enzyms wie Trypsin ist, eine Lösung
von Proteinen zu entsprechenden Aminosäuren und Peptiden abbauen« ■
Bei der Elektrophorese und bei der Chromatographie kann
man die Affinitäts- und Umwandlungskonstanten einer Ver-
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"bindung, die durch ein Enzym angreifbar ist, "bestimmen,
indem man diese Verbindung in einem Film, der Enzymträger ist, wandern läßt.
Beispiel 1
Fixierung von Gluooseoxydase auf Filterpapier
Auf 1 dm Filterpapier (Watman Nr.3) wird eine Lösung, die
2 mg Glucoseoxydase pro ml Wasser enthält, mit einer Pipette
aufgebracht, bis das Papier vollständig imprägniert ist. Das V/asser wird durch Belüftung in einer Kühlkammer
bei etwa 4°0 abgedampft. Die vorstehende Behandlung wird wiederholt, wobei ein Filterpapier erhalten wird, das etwa
ρ
0,1 mg Glucoseoxydase pro cm enthält. Mit einer Pipette wird das Papier erneut imprägniert, jedoch in diesem Fall mit einer wässrigen Lösung, die θβά ρΗ 6,8 mit einer 0,02-molaren Lösung gepuffert wird, die Mononatriumphosphat und Dinatriumphosphat im Verhältnis von 3s1 und Diazo-bis-o-dianisidin in einer Menge von Ά0 mg/ml enthält. Kach 1 Stunde bei 370C wird das Papier gespült, um die nicht fixierten Moleküle der Gluooseoxydase zu entfernen. Das Papier 'wird anschließend durch Lyophilisierung getrocknet und trocken aufbewahrt. Wenn das in dieser Weise behandelte Papier verwendet werden soll, wird es erneut in das oben genannte Puffermedium gegeben,
0,1 mg Glucoseoxydase pro cm enthält. Mit einer Pipette wird das Papier erneut imprägniert, jedoch in diesem Fall mit einer wässrigen Lösung, die θβά ρΗ 6,8 mit einer 0,02-molaren Lösung gepuffert wird, die Mononatriumphosphat und Dinatriumphosphat im Verhältnis von 3s1 und Diazo-bis-o-dianisidin in einer Menge von Ά0 mg/ml enthält. Kach 1 Stunde bei 370C wird das Papier gespült, um die nicht fixierten Moleküle der Gluooseoxydase zu entfernen. Das Papier 'wird anschließend durch Lyophilisierung getrocknet und trocken aufbewahrt. Wenn das in dieser Weise behandelte Papier verwendet werden soll, wird es erneut in das oben genannte Puffermedium gegeben,
Fixierung von Glucoseoxydase auf Folien aus regenerierter Cellulose ("Gellophan").
Mehrere "Oellophan"-Blätter von 0,05 mm Dicke (550 PT 00
von Rhone Poulenc) werden etwa 5 Minuten mit einer Lösung imprägniert, die 2 mg Glucoseoxydase pro ml enthält. Anschließend
wird die Lösung durch Belüftung in einer Kühlkammer bis zur Trockene eingedampft. Diese Behandlung wird
einmal bis dreimal wiederholt, wobei Blätter mit unterschiedlicher
Aktivität erhalten werden. Die Blätter werden anschließend mit einer Lösung imprägniert, die 5 mg Diazo-909841/1373
bis-o-dianisidin pro ml enthält und mit einer 0,02-molaren
Lösung, die 3 Seile Monoisatriumphosphat und 1 Teil Dinatriumphosphat
enthält, auf pH 6,8 gepuffert wird. Die Moleküle der Glucoseoxydase, die nicht chemisch gebunden
oder mechanisch eingeschlossen worcbisind, werden entfernt,
indem die Blätter duroh mehrere bewegte Spülbäder geführt werden. Die Blätter eignen sich als Membrane . für die
verschiedensten Zwecke.
Die in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Versuche wurden wiederholt, wobei jedoch Oarboanhydrase, Chymotrypsin
und Trypsin an Stelle von Glucoseoxydase .verwendet wurden. Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, , _
Ebenso wurden Enzyme dieser Art auf andere1'Träger wie
Dextran und Polyvinylalkohol fixiert, wobei analoge Ergebnisse erhalten wurden.
Herstellung eines Films aus einem Copolymeren von Glucoseoxydase und Albumin
;
50 mg Glucoseoxydase" werden in 0,7 ml eines Phosphatpuffers
von Pu 6,8 gelöst. Ferner werden 50 mg Albumin in 0,7 ml des gleichen Puffers gelöst. Die beiden Lösungen
werden gemischt und bewegt, bis ein homogenes Gemisch erhalten wird. Anschließend wird eine Lösung, die 2,5 Gew.-^
Glutaraldehyd enthält, unter Bewegung zugetropft. Die
hierbei erhaltene Lösung wird in eine Glasform mit flachem
ρ
Boden, der eine Fläche von 40 cm hat, gegeben. Nach einer Stunde wird eine Membran einer Dicke von 0,1 bis 0,2 mm erhalten, die in Wasser aufbewahrt wird, um Austrocknung zu vermeiden*
Boden, der eine Fläche von 40 cm hat, gegeben. Nach einer Stunde wird eine Membran einer Dicke von 0,1 bis 0,2 mm erhalten, die in Wasser aufbewahrt wird, um Austrocknung zu vermeiden*
Wenn ein Träger verwendet wird, der für Probeinlosungen
und für Lösungen von Brückenbildnern undurchlässig ist, wird ein abstreifbarer Film erhalten, der allein oder nach
Aufbringung auf einen anderen Träger verwendbar ist.
909841/1373
Bei3piel 4
3 mg Carboanhydrase» die aus roten Blutkörperchen, von
Rinderblut hergestellt worden ist, werden in 2 ml destilliertem
Wasser gelöst. Zu dieser Enzymlösung wird 1 ml
einer 2,5$igen Glutaraldehydlösung in einem 0,,02-molaren
Phosphatpuffer gegeben, der einen ρττ-Wert "von 6,8 hat·
Dieses Gemisch wird auf der Oberfläche einer hydrophoben
Siliconmembran verteilt (Handelsbezeichnung "Silastio
500-3", Hersteller Dow Corning), Die Vernetzung erfolgt
"bei 4°C in 12 Stunden, worauf das Lösungsmittel abgedampft
wird. Hierbei wird ein Film erhalten, der auf der Träger-*
membran fest haftet. Der Überschuss des Brückenbildungsmittels wird durch mehrmaliges Waschen mit destilliertem
Wasser entfernt. Die Membran wird anschließend in einer 0,022-molaren Veronalpufferlösung, die einen p„-Wert von
7,35 hat, gespült.
Die Aufbringung eines Carboanhydrasefilms auf eine solche
Membran verdoppelt die Geschwindigkeit des Kohlensäure-Übergangs zwischen zwei Flüssigkeiten, die sich beiderseits
dieser Membran befinden. Diese Wirkung erklärt sich durch die Beschleunigung der Umwandlung CO-H""—CO2 + 0H~,
die notwendig ist, um von der ionisierten Form zur Gasform von GO2 überzugehen, die allein die "Silastic"-Membran
durchdringen kann, und der Umwandlung CO2 + OH" —— T
die die Löslichmachung und somit die Entfernung von 2
von der anderen Seite der Membran ermöglicht»
Eine Lösung von 3 mg Garboanhydrase in 0,4 ml eines 0,02
molaren Phosphatpuffers, der einen Ρττ-Wert von 6,8 hat,
wird mit einer Lösung von 50 mg Plasma-Albumin in 1,4 ml
des gleichen Puffers gemischt,, Zu dieser Lösung werden
1,2 ml einer Lösung gegeben, die 2,5$ Glutaraldehyd in
destillier kein Wasser enthält. Die Vernetzung findet bei 40O im Verlauf von 12 Stunden statt. Erhalten wird ein
90 9 8A1/1373
-H-
geschlossener und geschmeidiger Proteinfilm, der gute mechanische Eigenschaften hat. Die nicht umgesetzten Moleküle
werden durch Spülen mit destilliertem Wasser entfernt
Ein solcher PiIm hat nach guter Spülung gewisse Eigenschaften von biologischen Membranen. Insbesondere verändert
er nicht die Elemente von Blut, die mit ihm in Berührung kommen.
An Stelle von Carbo-*anhydrase können auch andere Enzyme
in einen solchen Film eingearbeitet werden. Die Einarbeitung von Carboanhydrase macht diesen PiIm sehr durchlässig
für Kohlensäure und ermöglicht seine Verwendung in Membranoxygenatoren.
Eine Lösung wird hergestellt, die pro ml 150 mg eines
enzymreichen Protexngemisches enthält, das unter der Bezeichnung "Rapidase" im Handel ist. Mit 300 ml dieser
ρ
Lösung kann 1 m Gewebe getränkt werden. Das Lösungsmittel läßt man bei der Temperatur des Laboratoriums vollständig verdunsten. Das Gewebe wird anschließend mit 500 ml einer 2,5/^igen Glutaraldehydlösung getränkt. Die Vernetzung findet vorzugsweise im Verlauf von 1 bis 10 Stunden statt. Das Gewebe wird anschließend mit destilliertem Wasser gut gespült.
Lösung kann 1 m Gewebe getränkt werden. Das Lösungsmittel läßt man bei der Temperatur des Laboratoriums vollständig verdunsten. Das Gewebe wird anschließend mit 500 ml einer 2,5/^igen Glutaraldehydlösung getränkt. Die Vernetzung findet vorzugsweise im Verlauf von 1 bis 10 Stunden statt. Das Gewebe wird anschließend mit destilliertem Wasser gut gespült.
Die in das Gewebe eingeführten Enzyme bewahren ihre Aktivität und sind insbesondere in der Lage, natürliche Stoffe,
mit denen das Gewebe iaprägniert ist, abzubauen. Blutflecken, Schweißflecken und Eiflecken werdön anschließend
durch einfaches Spülen mit Wasser aus dem Stoff entfernt. Eine Festlegung auf eine Theorie ist nicht beabsichtigt,
jedoch kann diese Wirkung durch einen begrenzten Abbau der natürlichen Moleküle, die mit dem imprägnierten
Stoff in direkte Berührung kommen, erklärt werden. Der Resb der natürlichen Substanz haftet nicht mehr am
909841/1373
Stoff und löst sich von diesem unter der einfachen Wirkung von Wasser0
Man mischt eine Lösung von 10 mg G-lucoseoxydase in 0,4 ml
eines 0,02-molaren Phosphatpuffers, der einen p^-Wert von
6,8 hat, mit einer Lösung, die 50 mg Plasma-Albumin in
1,4 ml des gleichen Puffers enthält. Man gibt zu dieser Lösung 1,2 ml einer Lösung von 2,5$ G-lutaraldehyd in
destilliertem Wasser, Man läßt die Vernetzung 1 Stunde bei der Laboratoriumstemperatur vonstatten gehen« Man gibt
anschließend zum Reaktionsgemisch 0,05 ml eines 0,05-molaren Tris(hydroxymethyl)aminoäthan-HCl-Puffers, der einen
Ρττ-Wert von 7»8 hat, wodurch die Polymerisation unmittelbar
vor dem Erscheinen einer unlöslichen Phase verhindert wird. Man erhält hierbei Albuminverknüpfungen, an die eine,
zwei oder mehrere Glucoseoxydasemoleküle gebunden sind. Die Glucoseoxydase bewahrt ihre Aktivität und Spezifität»
Wie die Messung des Molekulargewichts ergibt, sind Polymere gebildet worden.
Die kleinen Moleküle, z.B. die Glutaraldehydmoleküle, die
nicht umgesetzt worden sind, werden durch Dialyse gegen 10 Volumina Pufferlösung und dann gegen 10 Volumina Wasser
entfernt. Jede Flüssigkeit der Gegendialyse wird dreimal von Stunde zu Stunde erneuert.
Das Polymere wird anschließend lyophilisiert. Die Sterilisation wird durch Ultraviolettbestrahlung vorgenommen. Das
Produkt wird in einer injizierbaren physiologischen Lösung aufgenommen. Das Polymere ist besonders beständig gegenüber
einer Temperaturerhöhung und widersteht den meisten proteolytischen Enzymen»
Ebenso gute Ergebnisse werden erhalten, wenn bei dem vorstehend beschriebenen Beispiel die Glucoseoxydase durch
eines der folgenden Enzyme ersetzt wird: proteolytische,
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lipolytische und amyloIytische Hydrolasen des Verdauungstraktes,
Urease, Asparaginase und andere hydrolytische Enzyme, Oxydasen, z.B. Uritase, Peroxydase, Katalyse,
Hydroxylasen, z.B. Phenylalanin-hydroxylase, Isomerasen und Transferasen, z.B. Galactosephosphat-uridyltransferase,
Lyasen, die die C-C-, C-O- und C-N-Bindungen lösen, und
lösliche Antigene oder Allergene, die vorher vom natürlichen unlöslichen Träger befreit worden sind.
Man mischt eine Lösung von 15 mg a-Amylase in 0,4 ml 0,02-
Wk molarem Phosphatpuffer vompg 6,8 mit einer Lösung von
50 mg Plasma-Al"bumin in 1,4 ml des gleichen Puffers, Zu
dieser Lösung gibt man 1,2 ml einer Lösung, die 2,5% Glutaraldehyd in destilliertem Wasser enthalte Man überläßt
das Gemisch 3 Stunden der Vernetzung "bei der Laboratoriumstemperatur,
worauf sanft bewegt wird. Wenn eine unlösliche Phase erscheint, wird die Menge der unlöslichen
Phase durch Nephelometrie gemessen. Wenn die Erscheinung die gewünschte Intensität erreicht hat, gibt man 0,5 ml
0,05-molaren Tris-(hydroxymethyl)aminoäthan-HCl-Puffer,
der einen ρττ-Wert von 7,8 hat, zu. Dieser Puffer bricht
die Polymerisation ab. Man erhält hierbei eine Suspension von polymerisierten inaktiven feinteiligen Proteinen, die
w aus dem Albumin gebildet wurden, und auf denen die Moleküle
der a-Amylase fixiert sind. Diese Moleküle behalten ihre Eigenschaften und ihre Spezifität.
Äquivalente Ergebnisse werden erhalten, wenn bei dem vorstehend
beschriebenen Versuch die a-Amylase durch ein proteolytisches Enzym, eine Oxydoreduktase, eine Lyase,
die die C-C-, C-O- und C-N-Bindungen löst, eine Isomerase, eine Transferase oder ein anderes Enzym sowie durch ein
Antigen oder ein Allergen ersetzt wird.
Die aufgepfropften aktiven Moleküle, z.B. Enzyme, Antigene und Allergene, bleiben bei einer Erhöhung der Temperatur
90984 1/1373
auf 5O0C stabil und widerstehen dem Angriff von proteolytischen
Enzymen·
Die feinen Teilchen werden durch Filtration mit einer Glaafritte
isoliert und dann reichlich mit dem Puffer und dann mit destilliertem Wasser gewaschen, bis das Waschwasser
kein Licht von 280 mti Wellenlänge mehr absorbiert. Diese Teilchen werden getrocknet, pulverisiert und durch Ultraviolettbestrahlung
sterilisiert. Das Pulver wird anschliessend in einer injizierbaren physiologischen Lösung aufgenommen.
Man mischt eine Lösung von 11 mg Trypsin in 0,4 ml 0,02-molarem Phosphatpuffer, der einen p^-Wert von 6,8 hattmit
einer Lösung vo& 50 mg Albumin in 1,4 ml des gleiohen Puffers· Man gibt zu dieser Lösung 1,2 ml einer Lösung von
2,5$ Grlutaraldehyd in destilliertem Wasser. Das G-emisch
wird in Formen der gewünschten Gestalt gegeben. Man läßt die Vernetzung 48 Stunden bei der Temperatur des Laboratoriums
vonstatten gehen, bis das in der Form enthaltene Material vollständig erstarrt ist. Man entformt die auf
diese Weise gebildeten Teilchen, die anschließend gut gespült werden, um nicht umgesetzte Moleküle zu eluieren.
Die Wirksamkeit der Spülung wird durch Absorption von Licht einer Wellenlänge von 280 mu. überprüft. Die Spülung
gilt als beendet, wenn keine Absorption bei dieser Wellenlänge stattfindet. Die in dieser Masse fixierten aktiven
Moleküle bewahren ihre Aktivität und ihre Spezifität,
Äquivalente Ergebnisse werden erhalten, wenn bei dem vorstehend beschriebenen Versuch das Trypsin durch eine
proteolytische, lipolytische oder amylolytische Hydrolase
ersetzt wird.
909841/1373
- 18 Beispiel 10
Man imprägniert die Oberfläche einer Folie aas regenerierter Cellulose (Handelsbezeichnung "Cellophan"), die als
inerter und unlöslicher Träger dient, mit einer Lösung, die entweder ausschließlich aus a-Chymotrypsin als aktivem
Protein oder' aus einem Gemisch von a-Chymotrypsin und
inerten Proteinen gebildet worden ist. mm» 30 mg a-Chymotrypsin
pro ml 0,02-molaren Phosphatpuffer mit einem Pjj-Wert von 6,8 enthält. Man pulverisiert anschließend
den Träger zweimal mit einer 2,5$igen lösung von Glutar-
^ aldehyd in destilliertem Wasser. Man läßt die Vernetzung 48 Stunden bei der Temperatur des laboratoriums vonstatten
gehen und wäscht dann sorgfältig zuerst mit dem Puffer und dann mit destilliertem Wasser, um Moleküle, die nicht
umgesetzt worden sind oder sich leicht vom Träger lösen, zu entfernen.
Die poröse Oberfläche der Folie aus regenerierter Cellulose wird auf diese Weise mit einem dünnen Film aus polymerisiertem
a-Chymotrypsin bedeckt. Die aktiven Proteine, die untereinander oder mit dem inerten Protein vernetzt sind,
bewahren ihre Aktivität und Spezifität. Das Produkt wird entweder durch Lyophilisierung oder durch einfache Belüf-
| tung bei niedriger Temperatur getrocknet. Die Sterilisation wird durch Ultraviolettbestrahlung vorgenommen. Das
Produkt wird in sterilen Beuteln aufbewahrt.
Ebenso gute Ergebnisse werden erhalten, wenn ein anderes Enzym an Stelle von a-Chymotrypsin bei dem vorstehend
beschriebenen Versuch verwendet wird.
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Claims (1)
- Patentansprüche1.) Verfahren zur Herstellung von Produkten auf der Basis aktiver Proteinsubstanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger mit einer Lösung mindestens einer aktiven Proteinsubstanz in Gegenwart eines Brückenbildners in Berührung bringt und anschließend den Träger, auf dem die aktive Proteinsubstanz fixiert ist, isoliert.2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man natürliche oder synthetische aktive Proteinsubstanzen im Rohzustand oder nach vorheriger Reinigung verwendet.3.) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als aktive Proteinsubstanzen Enzyme, Antikörper, Antigene, Allergene, Hormone, Mikroben oder Viren verwendet.4.) Verfahren nach Anspruch 1 bis j5, dadurch gekennzeichnet, daß man die aktiven Proteinsubstanzen in Form gegebenenfalls gepufferter wäßriger Lösungen verwendet.5.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger Filme, Membrane, Gewebe, poröse Materialien oder Feststoffe in Form von Granulat, Pillen oder Tabletten verwendet.6.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger natürliche oder synthetische makromolekulare Stoffe auf der Basis von Cellulose, Amylose, Polysacchariden, Alginaten, Kollagen, Polyvinylalkohol, Polysilanen, Polyacrylamid oder deren Substitutionsprodukten verwendet.7·) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man anorganische Träger auf der Basis von Glas oder Metall verwendet.9 09841/13 7 38.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dafi man als Brückenbildner mehrfunktionelle, insbesondere bifunktionelle Verbindungen verwendet.9·) Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Brückenbildner Diazo-bis-benzidin, Diazo-biso-anisidin, Diepoxyde, Triepoxyde, 5-Chlortriazine, Diisocyanate, Disulfochloride, Dialdehyde, Eismaleinsäurelmide, Difluordinitrophenylsulfon, Epihalogenhydrine, p-Nitrophenyldiazoacetat, Chlorfluordinitrobenzol, Äthylchlorcarbonate, Carboimide oder Phenylisoxazoliumsulfonat verwendet.10.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß man ein aktives Protein, insbesondere Enzym mit Hilfe eines Brückenbildners auf einem als Granulat oder Folie vorliegenden Träger fixiert.11.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein aktives Protein, insbesondere Enzym durch Copolymerisation auf einem inerten Protein als Träger in Gegenwart eines Brückenbildners fixiert.12.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 9* dadurch gekennzeichnet, daß man einen Brückenbindungen enthaltenden Film aus Carboanhydrase auf der Oberfläche einer hydrophoben Membran aufbringt.1^.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man auf einem Gewebe proteolytische Enzyme aufpfropft durch Tränken des Gewebes zunächst mit einer an hydrolytischen Enzymen reichen Lösung und dann mit der Lösung eines Brückenbildners.90984 1/1373l4.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 9* dadurch gekennzeichnet, daß man in Gegenwart eines Brückenbildners und eines inerten Proteins als Träger eine aktive Proteinsubstanz polymerisiert und die Polymerisation so unterbricht, daß das Produkt in wäßrigen Lösungsmitteln löslich bleibt.15·) Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man aktive Proteine in Gegenwart eines Brüokenbildners und eines inaktiven, in einer physiologischen oder wäßrigen Lösung unlösliche Teilchen bildenden Proteins als Träger polymerisiert.16.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man aktive Proteine in Gegenwart eines Brückenbildners und eines inaktiven Proteins als Träger zu einer festen und unlöslichen Masse ausreichender Größe polymerisiert.17.) Verfahren nach Anspruch 14, 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als inertes Protein Plasma-Albumin verwendet.18.) Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man aktive Proteine einzeln oder zu mehreren in Gegenwart eines Brückenbildners und gegebenenfalls in Gegenwart eines inaktiven Proteins im Innern eines inerten, an der Oberfläche leicht porösen Materials polymerisiert.909841/1373
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