JPS602200A - 酵素学的腫瘍診断試薬 - Google Patents
酵素学的腫瘍診断試薬Info
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- JPS602200A JPS602200A JP58109419A JP10941983A JPS602200A JP S602200 A JPS602200 A JP S602200A JP 58109419 A JP58109419 A JP 58109419A JP 10941983 A JP10941983 A JP 10941983A JP S602200 A JPS602200 A JP S602200A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は被検者体内に発生した腫瘍細胞の有無を診断す
るための血清又は他の体液検体中のホスホフルクトキナ
ーゼ阻害物質の検出による酵素学的腫瘍診断試薬に関す
る。
るための血清又は他の体液検体中のホスホフルクトキナ
ーゼ阻害物質の検出による酵素学的腫瘍診断試薬に関す
る。
本発明者は、ヒトを含めて哺乳動物におけるエネルギー
代謝系、特にエネルギー産生に係わる解糖酵素系(TC
Aサイクル)を研究中に、担癌患者から採取した血清は
、フルクトース−6−リン酸からフルクトース−1,6
−2リン酸の産生反応を触媒するフルクトース−6−ホ
スホトランスフェラーゼ、すなわちホスホフルクトキナ
ーゼ(phosphofruetokinase、 P
FKと略記することがあり、D −fructose
6−phosphate 1−phosphotran
s−ferase と言われることもある;生fヒ学実
験講座12、[エネルギー代謝と生体酸化]上巻。
代謝系、特にエネルギー産生に係わる解糖酵素系(TC
Aサイクル)を研究中に、担癌患者から採取した血清は
、フルクトース−6−リン酸からフルクトース−1,6
−2リン酸の産生反応を触媒するフルクトース−6−ホ
スホトランスフェラーゼ、すなわちホスホフルクトキナ
ーゼ(phosphofruetokinase、 P
FKと略記することがあり、D −fructose
6−phosphate 1−phosphotran
s−ferase と言われることもある;生fヒ学実
験講座12、[エネルギー代謝と生体酸化]上巻。
pp、126〜1382日本主1382日東京化学同人
発行、1976年、参照)の酵素活性を抑制する力価が
異常に高い事実に気付いて、この被検者の血清の抗ホス
ホフルクトキナーゼ活性の力価と被検者体内の癌細胞の
有無との関係を調べた。そして担癌患者の血清からホス
ホフルクトキナーゼ阻害物質を分離すること、及びこの
阻害物質の性質を確認することに成功した。
発行、1976年、参照)の酵素活性を抑制する力価が
異常に高い事実に気付いて、この被検者の血清の抗ホス
ホフルクトキナーゼ活性の力価と被検者体内の癌細胞の
有無との関係を調べた。そして担癌患者の血清からホス
ホフルクトキナーゼ阻害物質を分離すること、及びこの
阻害物質の性質を確認することに成功した。
シカモ、そのホスホフルクトキナーゼ阻害物質が被検患
者体内の癌細胞の種類の如何に拘わらずに癌細胞の発育
に伴って患者の体液、例えば血清。
者体内の癌細胞の種類の如何に拘わらずに癌細胞の発育
に伴って患者の体液、例えば血清。
胸水、腹水等中に出現すること、本阻害物質が特tこ患
者の癌化の初期に高単位に血中遊離物質として典清検体
中に探知されることを発見し、この事から、被検者の体
液検体の抗ホスホフルクトキナーゼ活性力価を調べるこ
とが@瘍の早期検出、すなわち癌患者の早期診断に役立
つと考えた。そしてホスホフルクトキナーゼが被検者の
血清又はその他の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ
阻害物質の検出を介して癌診断に有用であることを知見
したものである。これらのことに基づいて本発明を完成
させた。
者の癌化の初期に高単位に血中遊離物質として典清検体
中に探知されることを発見し、この事から、被検者の体
液検体の抗ホスホフルクトキナーゼ活性力価を調べるこ
とが@瘍の早期検出、すなわち癌患者の早期診断に役立
つと考えた。そしてホスホフルクトキナーゼが被検者の
血清又はその他の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ
阻害物質の検出を介して癌診断に有用であることを知見
したものである。これらのことに基づいて本発明を完成
させた。
すなわち、第一の本発明は、ホスホフルクトキナーゼを
活性成分として含有することを特徴とする、血清又は他
の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質の検出
による酵素学的腫瘍診断試薬を要旨とする。
活性成分として含有することを特徴とする、血清又は他
の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質の検出
による酵素学的腫瘍診断試薬を要旨とする。
本発明の薬剤に用いられるホスホフルクトキナーゼは、
哺乳動物、例えばウサギ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ウマ
等の各種臓器及び筋肉組織から常法で抽出された精製品
であるのがよいが、動物臓器破砕物の形の粗酵素液であ
ることもでき、また微生物起源の粗酵素液又は精製酵素
品でもよい。
哺乳動物、例えばウサギ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ウマ
等の各種臓器及び筋肉組織から常法で抽出された精製品
であるのがよいが、動物臓器破砕物の形の粗酵素液であ
ることもでき、また微生物起源の粗酵素液又は精製酵素
品でもよい。
ホスホフルクトキナーゼは水溶液として用いられるのが
好ましく、この水溶液中には、例えば硫酸アンモニウム
のような酵素安定比剤を配合するのが好ましい。
好ましく、この水溶液中には、例えば硫酸アンモニウム
のような酵素安定比剤を配合するのが好ましい。
本発明の薬剤を用いて検体中のホスホフルクトキナーゼ
阻害物質を検出、定量するためには、種々の方法が可能
であるけれども、ホスホフルクトキナーゼによるフルク
トース−6−リン酸からフルクトース−1、6−21J
ン酸の産生反応がアデノシン−6リン酸(ATPと略)
の存在を必要とすることから、検体中のホスホフルクト
キナーゼ阻害物質の力価がこの検体中で起るフルクトー
ス−1、6−217ン酸産生反応におけるATPの消費
の阻害率に実質的に比例することの厘理を利用して酵素
学的手法で検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質を
定量できる。
阻害物質を検出、定量するためには、種々の方法が可能
であるけれども、ホスホフルクトキナーゼによるフルク
トース−6−リン酸からフルクトース−1、6−21J
ン酸の産生反応がアデノシン−6リン酸(ATPと略)
の存在を必要とすることから、検体中のホスホフルクト
キナーゼ阻害物質の力価がこの検体中で起るフルクトー
ス−1、6−217ン酸産生反応におけるATPの消費
の阻害率に実質的に比例することの厘理を利用して酵素
学的手法で検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質を
定量できる。
すなわち、血清又は他の体液検体に対して本発明の薬剤
(ホスホフルクトキナーゼ水溶液の形であるのが奸才し
い)とフルクトース−6−リン酸とATPとを一定時間
、一定温度で反応した後の反応液中に消費されずに残っ
た残存ATP量を直接的又は間接的に測定することによ
って、検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質の検出
、定量ができる訳である。
(ホスホフルクトキナーゼ水溶液の形であるのが奸才し
い)とフルクトース−6−リン酸とATPとを一定時間
、一定温度で反応した後の反応液中に消費されずに残っ
た残存ATP量を直接的又は間接的に測定することによ
って、検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質の検出
、定量ができる訳である。
この残存ATP量の間接的測定法としては、例えば次の
諸法(イ)〜(へ)が可能である。
諸法(イ)〜(へ)が可能である。
(イ) 6−ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)の
存在下に残存ATPにグリセレート−3−ホスフェート
を作用させ、生成したグリセレート−1゜3−P2にN
ADHにコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド還元
型)、水素カチオン、 GAPDH(ゲルタールアルデ
ヒド・リン酸脱水素酵素)を作用させ、生成したグリセ
ルアルデヒド−3−5PとNADのうちのNAD の濃
度を光学的比色定量法の手法で測定するジヨウレフらの
方法(Jawrek、 D、、 Gruber、 W、
、 & Bergmeyer、 H,U、。
存在下に残存ATPにグリセレート−3−ホスフェート
を作用させ、生成したグリセレート−1゜3−P2にN
ADHにコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド還元
型)、水素カチオン、 GAPDH(ゲルタールアルデ
ヒド・リン酸脱水素酵素)を作用させ、生成したグリセ
ルアルデヒド−3−5PとNADのうちのNAD の濃
度を光学的比色定量法の手法で測定するジヨウレフらの
方法(Jawrek、 D、、 Gruber、 W、
、 & Bergmeyer、 H,U、。
[Adenosine −54−triphospha
te、 determinationwith 5−
Phosphoglycerate Kinase、
Methods ofEnzymatic Analy
sis J edited be H,U、 Berg
meyer。
te、 determinationwith 5−
Phosphoglycerate Kinase、
Methods ofEnzymatic Analy
sis J edited be H,U、 Berg
meyer。
pp 2097 、1974 、 Verlag Cb
emie Weinheim。
emie Weinheim。
Academic Press Inc、 、 New
York & London@)。
York & London@)。
(ol 残存人TPに対してホスホフルクトキナーゼの
存在下にフルクトース−6−リン酸を作用させ、生成し
たフルクトース−1,6−2リン酸とADPとのうちの
ADPにPK(ピルビン酸キナーゼ)の存在下にPEP
(ホスホエノールピルビン酸)を作用させ、生成したA
TPとピルビン酸のうちのピルビン酸に対してLDH(
乳酸脱水素酵素)の存在下にNADHにコチンアミドア
デニンジヌクレオチド還元型)と水素カチオンとを作用
させ、L−ラクテートとNADを生成させ、この際、残
存したNADHの濃度を光学的比色定量法の手法で測定
するベルクメヤーらの方法(Bergmeyer zH
,U、、 Fructose−6−phosphate
Kinase。
存在下にフルクトース−6−リン酸を作用させ、生成し
たフルクトース−1,6−2リン酸とADPとのうちの
ADPにPK(ピルビン酸キナーゼ)の存在下にPEP
(ホスホエノールピルビン酸)を作用させ、生成したA
TPとピルビン酸のうちのピルビン酸に対してLDH(
乳酸脱水素酵素)の存在下にNADHにコチンアミドア
デニンジヌクレオチド還元型)と水素カチオンとを作用
させ、L−ラクテートとNADを生成させ、この際、残
存したNADHの濃度を光学的比色定量法の手法で測定
するベルクメヤーらの方法(Bergmeyer zH
,U、、 Fructose−6−phosphate
Kinase。
[Methods of Bnzymatic Ana
lyr+is J editedby H,U、Ber
gmeyer、 pp 451.1974 、 Ver
lagCbemie WBinheim Academ
ic Press Inc、、 NewYork &
London、 )。
lyr+is J editedby H,U、Ber
gmeyer、 pp 451.1974 、 Ver
lagCbemie WBinheim Academ
ic Press Inc、、 NewYork &
London、 )。
(ハ)へキソキナーゼの存在下にATPにグルコースを
作用させ、生成したグルコース−6−リン酸にグルコー
ス−6−リン酸脱水素酵素の存在下にNADP+ にコ
チンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸)を作用
させて6−ホスホグルコノ−δ−ラクトンとNADPH
とHとを生成させ、このうちのNADPHの濃度を比色
定量するラムプレヒトらの方法 (Lam、prech
t、 W、、 & Trautsc、hold。
作用させ、生成したグルコース−6−リン酸にグルコー
ス−6−リン酸脱水素酵素の存在下にNADP+ にコ
チンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸)を作用
させて6−ホスホグルコノ−δ−ラクトンとNADPH
とHとを生成させ、このうちのNADPHの濃度を比色
定量するラムプレヒトらの方法 (Lam、prech
t、 W、、 & Trautsc、hold。
1、 、 [Adenosine −5’ −trip
hosphate。
hosphate。
determination with Hexoki
nase and Glucose−6−phosph
ate Dehydrogenase、 Method
s ofBnzymatic Analysis J
edited by H,U。
nase and Glucose−6−phosph
ate Dehydrogenase、 Method
s ofBnzymatic Analysis J
edited by H,U。
Bergmeyer、 pp 2101 、1974
、 Verlag ChemieWeinheim、
Academic Press Inc、、 New
York &London、 )。
、 Verlag ChemieWeinheim、
Academic Press Inc、、 New
York &London、 )。
に) ATPの分解により生ずるADPの量を、NAD
Hの減少量の測定を介して比色定量するジョワレクらの
方法 (Jaworek、 D、、 Gruber、
W、、 &Bergmey、er、 H,U、、 [A
denosine−5’−diphosphatean
d Ade”tBsine−5’−monophoap
hate、 Methods ofEnzymatic
Analysis J pp、 2127,1974
゜Verlag Chemie Weinheim、
Academic Press Inc、。
Hの減少量の測定を介して比色定量するジョワレクらの
方法 (Jaworek、 D、、 Gruber、
W、、 &Bergmey、er、 H,U、、 [A
denosine−5’−diphosphatean
d Ade”tBsine−5’−monophoap
hate、 Methods ofEnzymatic
Analysis J pp、 2127,1974
゜Verlag Chemie Weinheim、
Academic Press Inc、。
New York and London、 )。
(ホ) ホルミルテトラハイドロフオレート・シンセタ
ーゼを用いて比色定量するラビノウイチらの方法 (R
abinowitz、J、C,、[Adenosine
−5’−1riphosphate、determin
ation withFormyltetrahydr
ofolate 5ynthetase、 Metho
dsof Enzymatic Analysis、
J edited by H,U。
ーゼを用いて比色定量するラビノウイチらの方法 (R
abinowitz、J、C,、[Adenosine
−5’−1riphosphate、determin
ation withFormyltetrahydr
ofolate 5ynthetase、 Metho
dsof Enzymatic Analysis、
J edited by H,U。
Bergmeyer、 pp、 2110 、1974
、 Verlag ChemieWeinheim、
Academic Press Inc、、 New
York &London、 ) 。
、 Verlag ChemieWeinheim、
Academic Press Inc、、 New
York &London、 ) 。
(へ)残存ATPに対してホタル由来ルシフェラーゼの
存在下にルシフZ IJンを作用させ、生成したアデニ
ル・ルシフェリンに酵素を作用させる時に発生ずる蛍光
を利用して蛍光分光光度分析法の手法で定量するステラ
−の方法 (5tehler、 B。
存在下にルシフZ IJンを作用させ、生成したアデニ
ル・ルシフェリンに酵素を作用させる時に発生ずる蛍光
を利用して蛍光分光光度分析法の手法で定量するステラ
−の方法 (5tehler、 B。
L、、 [Adenoaine−5’−triphos
phate and CreatinePhospha
te、 Determination with Lu
ciferase。
phate and CreatinePhospha
te、 Determination with Lu
ciferase。
Methods of Bnzymatic Anal
ysis、 J edited byH,U、 Ber
gmeyer、 I)p@ 2112 、1974 、
Verla、gChemie Weinheim、A
cademic Press Inc、、 NewYo
rk & London、 ) 。
ysis、 J edited byH,U、 Ber
gmeyer、 I)p@ 2112 、1974 、
Verla、gChemie Weinheim、A
cademic Press Inc、、 NewYo
rk & London、 ) 。
しかしながら、本発明者が実験的に確めたところによれ
ば、前記の(ロ)のベルクメヤーらの方法に準じて、フ
ルクト−ス−6−リン酸、フルクトース−1,6−2リ
ン酸、Mg5O,、ホスホエノールピルビン酸、NAD
H,ピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素、ATPを用
意しておき、これらの薬剤を、被検者の血清、胸水、腹
水等の検体とホスホフルクトキナーゼとの混合液に添加
し、一連の酵素反応を起させ、この際に消費される補酵
素(NADH)の消費量を、比色定量的に測定すること
によって、被検者の血清又は他の体液検体中のホスホフ
ルクトキナーゼ阻害物質の検出、定量を行うのが腫瘍診
断に極めて良く適することを知見した。
ば、前記の(ロ)のベルクメヤーらの方法に準じて、フ
ルクト−ス−6−リン酸、フルクトース−1,6−2リ
ン酸、Mg5O,、ホスホエノールピルビン酸、NAD
H,ピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素、ATPを用
意しておき、これらの薬剤を、被検者の血清、胸水、腹
水等の検体とホスホフルクトキナーゼとの混合液に添加
し、一連の酵素反応を起させ、この際に消費される補酵
素(NADH)の消費量を、比色定量的に測定すること
によって、被検者の血清又は他の体液検体中のホスホフ
ルクトキナーゼ阻害物質の検出、定量を行うのが腫瘍診
断に極めて良く適することを知見した。
従って、第二の本発明によると、ホスホフルクトキナー
ゼ水溶液である第1液と、アデノシン−6リン酸の水溶
液である第2液と、ホスホエノールピルビン酸、β−ニ
コチンアミドアデニン・ジヌクレオチド(還元型)、ピ
ルビン酸キナーゼ及び乳酸脱水素酵素の混合物の水溶液
である第5液とを組合せてなることを特徴とする、血清
又は他の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ阻、害物
質の検出による腫瘍診断試薬が提供される。
ゼ水溶液である第1液と、アデノシン−6リン酸の水溶
液である第2液と、ホスホエノールピルビン酸、β−ニ
コチンアミドアデニン・ジヌクレオチド(還元型)、ピ
ルビン酸キナーゼ及び乳酸脱水素酵素の混合物の水溶液
である第5液とを組合せてなることを特徴とする、血清
又は他の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ阻、害物
質の検出による腫瘍診断試薬が提供される。
上記の第二の本発明による腫瘍診断試薬を用いて、血清
又は他の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質
を定量する方法の原理は次の反応式による。
又は他の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質
を定量する方法の原理は次の反応式による。
FK
(イ) Fructose−6−P + ATP −>
Fructose−1,6−PH+ ADPK (口l ADP+PEP ATP+ Pyruvate
+ LDH (ハ) Pyruvate + NADH+ H−一−
−→L−Lactate + NAD十 検体中のホスホキナーゼ阻害物質がホスホフルクトキナ
ーゼの酵素活性を抑制すると、ATPの消費が抑えられ
ADPへの変化が起りにくくなる。
Fructose−1,6−PH+ ADPK (口l ADP+PEP ATP+ Pyruvate
+ LDH (ハ) Pyruvate + NADH+ H−一−
−→L−Lactate + NAD十 検体中のホスホキナーゼ阻害物質がホスホフルクトキナ
ーゼの酵素活性を抑制すると、ATPの消費が抑えられ
ADPへの変化が起りにくくなる。
その結果、ピルビン酸とNADHから乳酸が産生され難
くなり、NADHの消費が抑えられるので、上記の一連
の(イ)、(ロ)、(ハ)の酵素反応を完了後の反応液
中に残存するNADHの残存量は、元の検体中に阻害物
質がある場合は無い場合に比べて多い。
くなり、NADHの消費が抑えられるので、上記の一連
の(イ)、(ロ)、(ハ)の酵素反応を完了後の反応液
中に残存するNADHの残存量は、元の検体中に阻害物
質がある場合は無い場合に比べて多い。
上記の反応e1の完了后の反応液中のNADHの残存量
は、分光光度計で波長340nmでの吸光度を測定し、
その測定値を、NADHQ度と吸光度との関係を示すよ
うに作成された標準曲線と照合することによって定量す
ることが可能である。しかしながら、使用試薬の品質、
測定条件などは測定部度にバラつくことが多いので、標
準曲線をそれに応じてその都度作成することは煩雑であ
る。本発明者が知見したところによれば、上記の反応(
イ)。
は、分光光度計で波長340nmでの吸光度を測定し、
その測定値を、NADHQ度と吸光度との関係を示すよ
うに作成された標準曲線と照合することによって定量す
ることが可能である。しかしながら、使用試薬の品質、
測定条件などは測定部度にバラつくことが多いので、標
準曲線をそれに応じてその都度作成することは煩雑であ
る。本発明者が知見したところによれば、上記の反応(
イ)。
(ロ)に続く反応e→が生起しつつある反応液について
、反応開始時にNADHの至適吸光度(340nmにお
ける)を先づ測定しくa値)、その後の一定の反応時間
、例えば10分間経過后に再び吸光度(54゜nmにお
ける)を測定しくb値)、この一定時間経過中の吸光度
の減少値、すなわち吸光度測定開始時の測定値から2回
目測定時の測定値を差引いた値(a−b)(すなわち、
NADHの消費量に比例する値)を算出し、この算出さ
れた吸光度減少値(a−b)を、元の体液検体中にホス
ホキナーゼ阻害物質を存在させた場合と、存在させない
、場合とで比較すれば、吸光度減少値(a−h)は検体
中に該阻害物質が存在する場合には存在しない場合に比
べて相対的に小さいことになる(検体中の該阻害物質の
含量について逆比例的に小さくなる)から、このように
吸光度減少値同志の比較により、換言すれば反応中のN
ADH消費量の減少の比較により、元の検体中の該阻害
物質の相対的な定量が可能になり、しかも、測定条件な
どの測定部度のバラつきの影響も補償できて便利である
。
、反応開始時にNADHの至適吸光度(340nmにお
ける)を先づ測定しくa値)、その後の一定の反応時間
、例えば10分間経過后に再び吸光度(54゜nmにお
ける)を測定しくb値)、この一定時間経過中の吸光度
の減少値、すなわち吸光度測定開始時の測定値から2回
目測定時の測定値を差引いた値(a−b)(すなわち、
NADHの消費量に比例する値)を算出し、この算出さ
れた吸光度減少値(a−b)を、元の体液検体中にホス
ホキナーゼ阻害物質を存在させた場合と、存在させない
、場合とで比較すれば、吸光度減少値(a−h)は検体
中に該阻害物質が存在する場合には存在しない場合に比
べて相対的に小さいことになる(検体中の該阻害物質の
含量について逆比例的に小さくなる)から、このように
吸光度減少値同志の比較により、換言すれば反応中のN
ADH消費量の減少の比較により、元の検体中の該阻害
物質の相対的な定量が可能になり、しかも、測定条件な
どの測定部度のバラつきの影響も補償できて便利である
。
第二の本発明による診断薬に用いる第1液には、硫酸ア
ンモニウム等のホスホフルクトキナーゼ安定化剤が添加
、溶解されているのが好ましい。
ンモニウム等のホスホフルクトキナーゼ安定化剤が添加
、溶解されているのが好ましい。
また、第3液には、トリス緩衝液、硫酸マグネシウム、
塩化カリウム、フルクトース−6−リン酸 ナトリウム
塩、フルクトース−1,6−2リン酸が添加、溶解され
ているのが好ましい。第3液中のホスホエノール・ピル
ビン酸はシクロヘキシルアンモニウム塩(CHA塩)で
あるのが好ましい。
塩化カリウム、フルクトース−6−リン酸 ナトリウム
塩、フルクトース−1,6−2リン酸が添加、溶解され
ているのが好ましい。第3液中のホスホエノール・ピル
ビン酸はシクロヘキシルアンモニウム塩(CHA塩)で
あるのが好ましい。
さらに、第三の本発明によると、被検者から採取された
血清又は他の体液検体へホスホフルクトキナーゼ水溶液
(第1液)を添加し、次いで、その反応液にアデノシン
−6リン酸水溶液(第2液)を加え6分間以内に、さら
にその反応混合液に対して、ホスホエノールピルビン酸
、β−ニコチンアミドアデニン・ジヌクレオチド(還元
型)、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸脱水素酵素の混合物
の水溶液(第6液)を添加して反応させ、その反応液の
波長340nmでの吸光度を連続に測定し、さらにその
測定開始時の吸光度測定値から、一定の反応時間経過後
に測定した吸光度測定値を差引いた値(これを吸光度減
少値という)′を算出し、この吸光度減少値を、腫瘍の
ない健康□正常者から採取された血清試料について前記
の第1液、第2液。
血清又は他の体液検体へホスホフルクトキナーゼ水溶液
(第1液)を添加し、次いで、その反応液にアデノシン
−6リン酸水溶液(第2液)を加え6分間以内に、さら
にその反応混合液に対して、ホスホエノールピルビン酸
、β−ニコチンアミドアデニン・ジヌクレオチド(還元
型)、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸脱水素酵素の混合物
の水溶液(第6液)を添加して反応させ、その反応液の
波長340nmでの吸光度を連続に測定し、さらにその
測定開始時の吸光度測定値から、一定の反応時間経過後
に測定した吸光度測定値を差引いた値(これを吸光度減
少値という)′を算出し、この吸光度減少値を、腫瘍の
ない健康□正常者から採取された血清試料について前記
の第1液、第2液。
第3液を前記と同じ要領で添加2反応させた反応液につ
いて前記と同じ要領で波長340nmでの吸光度の連続
測定及び算出で得られた吸光度減少値を標準値として、
これと比較することを特徴とする、血清又は他の体液検
体の抗ホスホフルクトキナーゼ活性力価の測定方法が提
供される。
いて前記と同じ要領で波長340nmでの吸光度の連続
測定及び算出で得られた吸光度減少値を標準値として、
これと比較することを特徴とする、血清又は他の体液検
体の抗ホスホフルクトキナーゼ活性力価の測定方法が提
供される。
次に、本発明を参考例、実施外及び試験例について具体
的に説明する。
的に説明する。
参考例
本例は、医学的な諸方法で担癌(肺癌)が確認された患
者の血清からホスホフルクトキナーゼ阻害物質を抽出、
精製した例を示す。
者の血清からホスホフルクトキナーゼ阻害物質を抽出、
精製した例を示す。
肺癌患者の血清、腹水又は膨水100−にプロナーゼ1
.Olを加え、室温で1時間消化する。
.Olを加え、室温で1時間消化する。
500−のDNA抽出用緩衝液(0,1M Tris緩
衝液、 pH8,0、10mM BDTA 、 1%8
DB。
衝液、 pH8,0、10mM BDTA 、 1%8
DB。
0.4MNaC)を含む)を加え撹拌する。600−の
クロロホルム−イソアミルアルコール混合液(クロロホ
ールム:イソアミルアルコール=25:1)を加え10
分間振盪する。4℃にて10,000回転15分間遠心
し、水層を分離し、等量の水飽和フェノールを加え、1
0分間激しく振盪する。4℃にてi o、o o o回
転10分間遠心分離し、水層を分取する。2倍量の無水
エタノールを加え一20℃にて静置する。10,000
回転30分遠心し、上清を捨て、沈渣を70%エタノー
ルで数回洗浄する。
クロロホルム−イソアミルアルコール混合液(クロロホ
ールム:イソアミルアルコール=25:1)を加え10
分間振盪する。4℃にて10,000回転15分間遠心
し、水層を分離し、等量の水飽和フェノールを加え、1
0分間激しく振盪する。4℃にてi o、o o o回
転10分間遠心分離し、水層を分取する。2倍量の無水
エタノールを加え一20℃にて静置する。10,000
回転30分遠心し、上清を捨て、沈渣を70%エタノー
ルで数回洗浄する。
エタノールを蒸発させた後、DNA融解緩衝液(10m
M Tris−HC) 、pH7,5,10mM Na
C! 、1mMBDTA)に溶解し、分光々度計により
濃度を測定する。7%アクリルアミドゲル(アクリルア
ミド・ジメチルアミンプロピオニ) IJル混合ゲル)
を作成し、抽出弊品を載せ400■にて電気泳動する。
M Tris−HC) 、pH7,5,10mM Na
C! 、1mMBDTA)に溶解し、分光々度計により
濃度を測定する。7%アクリルアミドゲル(アクリルア
ミド・ジメチルアミンプロピオニ) IJル混合ゲル)
を作成し、抽出弊品を載せ400■にて電気泳動する。
電気泳動終了後ゲルの一部を切り、エチジウムブロマイ
ド染色をし、蛍光を発する部位を定め、切り出し、乳鉢
中にて破砕する。少段のDNA融解緩傭液を加え、10
,000xf、30分間遠心分離した後、上清を貯め、
99%冷エタノールを2倍量加え一20℃−夜装置する
。10,000回転30分遠心し、沈渣としてホスホフ
ルクトキナーゼ阻害物質の260μmを得た。これを0
.1M’Trig緩衝液(pH8,5)にとかし、−7
0℃にて凍結保存した。
ド染色をし、蛍光を発する部位を定め、切り出し、乳鉢
中にて破砕する。少段のDNA融解緩傭液を加え、10
,000xf、30分間遠心分離した後、上清を貯め、
99%冷エタノールを2倍量加え一20℃−夜装置する
。10,000回転30分遠心し、沈渣としてホスホフ
ルクトキナーゼ阻害物質の260μmを得た。これを0
.1M’Trig緩衝液(pH8,5)にとかし、−7
0℃にて凍結保存した。
上記のようにして白色粉末としで得られた血清中のホス
ホフルクトキナーゼ阻害物質について、抗ホスホフルク
トキナーゼ活性力(B (50%活性阻害IC,。)を
調べたところ4.06μ? / 1.2μf PFKで
あった。
ホフルクトキナーゼ阻害物質について、抗ホスホフルク
トキナーゼ活性力(B (50%活性阻害IC,。)を
調べたところ4.06μ? / 1.2μf PFKで
あった。
さらに、上記の白色粉末の物理化学的及び酵素学的性状
を調べたところ、下記の性質を示した。
を調べたところ、下記の性質を示した。
(1)約2000塩基対に相当する核酸様物質。
(21DNA分解酵素(デオキシリボヌクレアーゼ)に
感受性を有する。
感受性を有する。
(31FLNA分解酵素(リボヌクレアーゼ)に部分的
に感受性を有する。
に感受性を有する。
(4) 凍結融解、加熱(90℃、10分間)に抵抗性
。
。
(5)非透析性。
(6) タンパク質分解酵素(protease )に
抵抗性。
抵抗性。
(7)アクリルアミドゲル電気泳動法により、2000
塩基対を有する標準DNA(λフアージDNAをHin
du制限酵素で分解した標品)と相同の部位にバンドと
して識別し得る物質。
塩基対を有する標準DNA(λフアージDNAをHin
du制限酵素で分解した標品)と相同の部位にバンドと
して識別し得る物質。
実施例1
第1液:3.2M硫酸アンモニウム水溶液に溶解したウ
キギ筋由来ホスホフルクトキナ ーゼ(120μm/d)水溶液 10μノ第2液: A
TP水溶液(10η/’m蒸留水) Q、1+m/第6
液:次の6液の混合物 2.606d計 2.606d を先づ調製して用意する。
キギ筋由来ホスホフルクトキナ ーゼ(120μm/d)水溶液 10μノ第2液: A
TP水溶液(10η/’m蒸留水) Q、1+m/第6
液:次の6液の混合物 2.606d計 2.606d を先づ調製して用意する。
+114m/容量の分光々変針用セルに被検者の血清検
体0.15−を分取し、第1液(酵素液)の10μノを
加え撹拌後、10分間室温に放置する。
体0.15−を分取し、第1液(酵素液)の10μノを
加え撹拌後、10分間室温に放置する。
(2)セルに第2液(ATP液)の0.1 ml!を加
え6分以内室温に放置する。
え6分以内室温に放置する。
(6)第3液の2.6dをセルに加える。
(4)ただちに分光光度計に上記のセルをセットし、吸
光度(540nmにおける)を10分間連続に測定する
。測定開始時の吸光度測定値falから、反応10分間
経過后の吸光度測定値tb)を差引いた値(a −b
)を、吸光度減少値+1)とする。
光度(540nmにおける)を10分間連続に測定する
。測定開始時の吸光度測定値falから、反応10分間
経過后の吸光度測定値tb)を差引いた値(a −b
)を、吸光度減少値+1)とする。
他方、本芙施例における前記の組成の第1液、第2液及
び第6液を用いて前記の検査法で健康正常人の多数から
採取した血清検体の多数について、最終反応液における
340nmでの吸光度の10分間の減少的変化を実測し
て調べたところ、吸光度減少値(I[lは0.8!10
±0.061 (平均値士標準偏差)の範囲内であると
実測された。
び第6液を用いて前記の検査法で健康正常人の多数から
採取した血清検体の多数について、最終反応液における
340nmでの吸光度の10分間の減少的変化を実測し
て調べたところ、吸光度減少値(I[lは0.8!10
±0.061 (平均値士標準偏差)の範囲内であると
実測された。
被検者の血清について実測した吸光度減少値(前記のt
Il値)が健漿正常人血清の実測吸光度減少値(Ill
(0,830±0.061)の範囲を有意に下回るこ
とは、この被検者の血清中に残存A T P ・i (
あるいは最終反応液中のβ−NADH残存量)が相対的
に多かったこと、さらにホスホフルクトキナーゼ阻害物
質の量が異常に多かったことを意味し、被検者の血清は
陽性と判定され、その被検者は担癌の疑いがあるので、
精密診断を要する。
Il値)が健漿正常人血清の実測吸光度減少値(Ill
(0,830±0.061)の範囲を有意に下回るこ
とは、この被検者の血清中に残存A T P ・i (
あるいは最終反応液中のβ−NADH残存量)が相対的
に多かったこと、さらにホスホフルクトキナーゼ阻害物
質の量が異常に多かったことを意味し、被検者の血清は
陽性と判定され、その被検者は担癌の疑いがあるので、
精密診断を要する。
上記の検査法で検査したところ、被検者A、B及びCの
三者の血清検体の吸光度減少値(640nm )の実測
値は夫々に0.840,0.632.及び0859であ
り、このうちの被検者Bの血清によるホスホフルクトキ
ナーゼ活性抑制率は24.76%となり、別途精密診断
したところ、早期胃癌が発見された。
三者の血清検体の吸光度減少値(640nm )の実測
値は夫々に0.840,0.632.及び0859であ
り、このうちの被検者Bの血清によるホスホフルクトキ
ナーゼ活性抑制率は24.76%となり、別途精密診断
したところ、早期胃癌が発見された。
試験例1
実施例1に記載された組成の第1液、第2液。
第6液を用いて、実施例1に記載された検査法により、
担癌の確認されている患者の血清検体を処理し、その処
理した血清検体について10分間の吸光度減少値(54
0nm)を分光光度計で実測したところ、次表に示す結
果を得た。
担癌の確認されている患者の血清検体を処理し、その処
理した血清検体について10分間の吸光度減少値(54
0nm)を分光光度計で実測したところ、次表に示す結
果を得た。
表I
表1のつづき
注)抑制率のマイナスは正常値を基準としたPFK活性
の減少H分率を示す。
の減少H分率を示す。
上記の表で、判定の項目における+は陽性(担癌の疑い
)、−は陰性を示す。
)、−は陰性を示す。
なお、表IK示された早期胃痛で当該検査で10性と出
た患者で、手術後−カ月間に本発明で血清検査したとこ
ろ、陰性化(正常化)した例が7名諸疾1忠々者血清中
に含まれているホスホフルクトキナーゼ阻害物質による
吸光度減少値を測定した表1の結果を要約すると、実施
例1の検査法により検出される疾患は、悪性腫瘍及び糖
尿病である。即ち両疾患々者血清中にはホスホフルクト
キナーゼ活性を抑制する物質が含まれている事が解る。
た患者で、手術後−カ月間に本発明で血清検査したとこ
ろ、陰性化(正常化)した例が7名諸疾1忠々者血清中
に含まれているホスホフルクトキナーゼ阻害物質による
吸光度減少値を測定した表1の結果を要約すると、実施
例1の検査法により検出される疾患は、悪性腫瘍及び糖
尿病である。即ち両疾患々者血清中にはホスホフルクト
キナーゼ活性を抑制する物質が含まれている事が解る。
該た、本発明の桑剤を用いる検査法の特長は、早期癌(
特に胃、膵、肺、卵巣等)を少量の血清を用いてスクリ
ーニング出来るところにあると言える。癌好発年令に近
づ<30才以上の集団から、初期癌患者を検出し、精密
検をにより確定診断を下し、手術等により出来るたけ早
い時期化治療を開始し得る資料になろう。更に患者の経
過を観察する際にも、治療法の適否及び再発の有無を判
定する資料となり得る。
特に胃、膵、肺、卵巣等)を少量の血清を用いてスクリ
ーニング出来るところにあると言える。癌好発年令に近
づ<30才以上の集団から、初期癌患者を検出し、精密
検をにより確定診断を下し、手術等により出来るたけ早
い時期化治療を開始し得る資料になろう。更に患者の経
過を観察する際にも、治療法の適否及び再発の有無を判
定する資料となり得る。
手続補正書(自発)
昭和58年9月21日
特許庁長官殿
■、事件の表示
昭和 58 年特許願第109419号2、発明の名称
酵素学的腫瘍診断試薬
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
任 所 神奈川県相模原市古淵3130−10氏名 中
村 國 衛 4、代理人 5、補正の対象 明細聰の特許請求の範囲の欄及び発明の詳細な説り」の
札 6、補正の内容 (1)特許請求の範囲を別紙のとお9補正する。
村 國 衛 4、代理人 5、補正の対象 明細聰の特許請求の範囲の欄及び発明の詳細な説り」の
札 6、補正の内容 (1)特許請求の範囲を別紙のとお9補正する。
(2)明細書第15頁第16行の「血清」の次に「又は
他の体液」を挿入する。
他の体液」を挿入する。
(31BA細細組第26負下ら4行と下から5行との間
に次の記載を挿入する。
に次の記載を挿入する。
「上の表1における1−PFK活性に及ぼす抑制率又は
九進率(%)」は次式で計算された値である。
九進率(%)」は次式で計算された値である。
但し、式中の(1)は被検者の吸光度減少値を表わし、
([)は健康正常人の吸光度減少値を表わすものである
。」 2、特許請求の範囲 1. ホスホフルクトキナーゼを含有する腫瘍診断薬。
([)は健康正常人の吸光度減少値を表わすものである
。」 2、特許請求の範囲 1. ホスホフルクトキナーゼを含有する腫瘍診断薬。
2、 ホスホフルクトキナーゼ水溶液である第1液と、
アデノシン−6リン酸の水@液である第2液ト、ホスホ
エノールピルビン散、β−ニコチンアミドアデニン・ジ
ヌクレオチド(還元型)、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸
脱水素酵素の混合物の水溶液である第3液とを組合せて
なることを特徴とする、血清又は他の体液検体中のホス
ホフルクトキナーゼ阻害物質の検出にょる肺癌診断試薬
。
アデノシン−6リン酸の水@液である第2液ト、ホスホ
エノールピルビン散、β−ニコチンアミドアデニン・ジ
ヌクレオチド(還元型)、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸
脱水素酵素の混合物の水溶液である第3液とを組合せて
なることを特徴とする、血清又は他の体液検体中のホス
ホフルクトキナーゼ阻害物質の検出にょる肺癌診断試薬
。
試薬。
の他のホスホフルクトキナーゼ安定化剤が添加。
6、 第1液には、硫酸アンモニウム、又はその他のホ
スホフルクトキナーゼ安定化剤が添加、溶解されている
特許請求の範囲第2項記載の試薬。
スホフルクトキナーゼ安定化剤が添加、溶解されている
特許請求の範囲第2項記載の試薬。
Z 第3液には、トリス緩衝液、硫酸マグネシウム、塩
化カリウム、フルクトース・6−リン酸ナトリウム塩、
フルクトース・1.6−2リン酸が添加、@解されてい
る特許請求の範囲第2項記載の試薬。
化カリウム、フルクトース・6−リン酸ナトリウム塩、
フルクトース・1.6−2リン酸が添加、@解されてい
る特許請求の範囲第2項記載の試薬。
8、被検者から採取された血清又は他の体液検体へホス
ホフルクトキナーゼ水溶液(第1液)を添加し、次いで
その反応液にアデノシン−3リン酸水溶液(第2液)を
加え3分間以内に、さらにその反応混合液に対して、ホ
スホエノールピルビン酸、β−ニコチンアミドアデニン
・ジヌクレオチド(還元型)、ピルビン酸キナーゼ及び
乳酸脱水素酵素の混合物の水溶液(第6液)を添加して
反応させ、その反応液の波長340nmでの吸光夏を連
続に測定し、さらにその測定口始時の吸光度測定値から
、一定の反応時間経過後に測定した吸光度測定値を差引
いた値(これを吸光度減少値という)をp、出し、この
吸光度減少値を、腫瘍のない健康正常者から採取された
血清又は他の体液試別について前記の第1液、第2液、
第6液を前記と同じ要領で添加1反応させた反応液につ
いて前記と同じ要領で波長340nmでの吸光度の連続
測定及び算出で?9られた吸光度減少値を標準値として
、これと比較することを特徴とする、血清又は他の体液
検体の抗ホスホフルクトキナーゼ活性力価の測定方法。
ホフルクトキナーゼ水溶液(第1液)を添加し、次いで
その反応液にアデノシン−3リン酸水溶液(第2液)を
加え3分間以内に、さらにその反応混合液に対して、ホ
スホエノールピルビン酸、β−ニコチンアミドアデニン
・ジヌクレオチド(還元型)、ピルビン酸キナーゼ及び
乳酸脱水素酵素の混合物の水溶液(第6液)を添加して
反応させ、その反応液の波長340nmでの吸光夏を連
続に測定し、さらにその測定口始時の吸光度測定値から
、一定の反応時間経過後に測定した吸光度測定値を差引
いた値(これを吸光度減少値という)をp、出し、この
吸光度減少値を、腫瘍のない健康正常者から採取された
血清又は他の体液試別について前記の第1液、第2液、
第6液を前記と同じ要領で添加1反応させた反応液につ
いて前記と同じ要領で波長340nmでの吸光度の連続
測定及び算出で?9られた吸光度減少値を標準値として
、これと比較することを特徴とする、血清又は他の体液
検体の抗ホスホフルクトキナーゼ活性力価の測定方法。
手続補正書(自発)
昭和59年8月31日
特許庁長官殿
■、小事件表示
昭和58 年特許願第109419号
2、発明の名称
酵素学的腫瘍診断試薬
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
任 所 神奈川県相模原市古淵3130−10氏名 中
村 國 衛 − −1□− 一へ、31 。
村 國 衛 − −1□− 一へ、31 。
物産ビル別館 電話(591) 02615、補正の対
象 明細書の発明の詳細な説明の欄 &補正の内容 (1) 明細書第6頁18行の「フルクトース」の前に
「夫々に既知量の」を挿入する。
象 明細書の発明の詳細な説明の欄 &補正の内容 (1) 明細書第6頁18行の「フルクトース」の前に
「夫々に既知量の」を挿入する。
(2)同第、。6行よ。行よ4間3次。8.載を挿入す
る。
る。
「この残存ATPiの直接的測定法としては、例えば高
速液体クロマトグラフィー(HPLC)による方法があ
る。」 (3)同第7頁4行の「この」を削除して「1だ、」を
挿入する。
速液体クロマトグラフィー(HPLC)による方法があ
る。」 (3)同第7頁4行の「この」を削除して「1だ、」を
挿入する。
(4) 同第7百15行、第9頁5行、及び第9頁15
行の「&」を削除して「及び」を挿入する・(5)同第
7頁18行のr edited be Jを削除して「
編集者」を挿入する。
行の「&」を削除して「及び」を挿入する・(5)同第
7頁18行のr edited be Jを削除して「
編集者」を挿入する。
(6) 同第8頁14−15行及び第10頁6行のr
edited by Jを削除して「編集者」を挿入す
る。
edited by Jを削除して「編集者」を挿入す
る。
(7)同第8頁16行の「E」をVeJと補正する。
(81同第9頁15行のr Jaworekjを「Ja
wrek Jと補正する。
wrek Jと補正する。
(9)同第10頁12行の「酵素」を「酸素」と補正す
る。
る。
(10)同第10頁17行のr edited l)y
Jを削除して「編集者」を挿入する。
Jを削除して「編集者」を挿入する。
圓 同第10゛頁末行の下に次の記載を挿入する。
[また検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質(の力
価が検体中で起こるフルクトース−1,6−2リン酸生
成反応の阻害率に実質的に比例することのM理を利用し
て検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質を定量でき
る。
価が検体中で起こるフルクトース−1,6−2リン酸生
成反応の阻害率に実質的に比例することのM理を利用し
て検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質を定量でき
る。
すなわち、血清又は他の体液検体に対して本発明の薬剤
(ホスホフルクトキナ−上水溶液の形であるのが好まし
い)とフルクトース−6−リン酸とATPとを一定時間
、一定温度で反応した後の反応液中に生成されたフルク
トース−1,6−2リン酸を定量することによってホス
ホフルクトキナーゼ阻害物質の検出、定量ができる訳で
ある。
(ホスホフルクトキナ−上水溶液の形であるのが好まし
い)とフルクトース−6−リン酸とATPとを一定時間
、一定温度で反応した後の反応液中に生成されたフルク
トース−1,6−2リン酸を定量することによってホス
ホフルクトキナーゼ阻害物質の検出、定量ができる訳で
ある。
この生成フルクトース−1,6−2リン酸量の測定法と
しては、例えばラッカーの方法[E、 Rackerr
J、B、CJ 167巻、843頁、(1947)]
が可能である。」 F12) 同第14負6行の「を存在させ一一一一一な
い」を削除して「が存在した場合と、存在しない」を挿
入する。
しては、例えばラッカーの方法[E、 Rackerr
J、B、CJ 167巻、843頁、(1947)]
が可能である。」 F12) 同第14負6行の「を存在させ一一一一一な
い」を削除して「が存在した場合と、存在しない」を挿
入する。
03) 同第14頁12行の「補償」を削除して「相殺
」を挿入する。
」を挿入する。
υ4) 同第16頁8行の「、精製」を削除する。
θ9 同第16頁9行〜第18頁17行の記載を削除し
て次の記載を挿入する。
て次の記載を挿入する。
「肺癌患者の血清1004にift Q’tアンモニウ
ム301加え撹拌した。10.000 x fの加速度
で60分間遠心後、硫酸アンモニウム30fが浴解して
いる上清にさらに201のh’L [4f2アンモニウ
ムを加え。
ム301加え撹拌した。10.000 x fの加速度
で60分間遠心後、硫酸アンモニウム30fが浴解して
いる上清にさらに201のh’L [4f2アンモニウ
ムを加え。
充分撹拌後10.ODD X rの加速度で30分遠心
し上清を分ける。こうして得られた各分画、すなわち硫
酸アンモニウム301で血清から沈澱した分画と、硫酸
アンモニウム60〜50 fで沈澱した分画と、硫酸ア
ンモニウム509で沈澱しなかった分画とを透析チュー
ブにつめ、蒸溜水を数回取り替えなから硫酸アンモニウ
ムを除去した0このように透析された各分画を凍結乾燥
し、一定量を健康人由来血清に尋解し、PFK抑制活性
を検討した。
し上清を分ける。こうして得られた各分画、すなわち硫
酸アンモニウム301で血清から沈澱した分画と、硫酸
アンモニウム60〜50 fで沈澱した分画と、硫酸ア
ンモニウム509で沈澱しなかった分画とを透析チュー
ブにつめ、蒸溜水を数回取り替えなから硫酸アンモニウ
ムを除去した0このように透析された各分画を凍結乾燥
し、一定量を健康人由来血清に尋解し、PFK抑制活性
を検討した。
ぞの結呆、硫酸アンモニウム30〜50f/、で塩析、
沈澱してくる分画にPFK抑制活性が認められる事が解
った。この分画をセファデックスG−75カラムにてゲ
ル1過し、幾つかの分画についてPFK抑制活性を測定
した所、アルブミンより分子量の低い分画(分子蓋20
.000以下、非透析性)にその活性を認めた。この分
画を50 m2/mtの濃度で正常血清に浴解しその1
50μtの血Taを用いて試験すると、正常血清と比べ
て大略70%のPFK抑制が認められた。これを正常血
清で稀釈すると。
沈澱してくる分画にPFK抑制活性が認められる事が解
った。この分画をセファデックスG−75カラムにてゲ
ル1過し、幾つかの分画についてPFK抑制活性を測定
した所、アルブミンより分子量の低い分画(分子蓋20
.000以下、非透析性)にその活性を認めた。この分
画を50 m2/mtの濃度で正常血清に浴解しその1
50μtの血Taを用いて試験すると、正常血清と比べ
て大略70%のPFK抑制が認められた。これを正常血
清で稀釈すると。
4倍稀釈までは比例して抑制の低下が認められたが、そ
れ以上の稀釈血清は明瞭なPFK抑制を示さなくkつた
・」 四 同第22頁3〜4行の「に及ぼす」を削除して「の
」を挿入する。
れ以上の稀釈血清は明瞭なPFK抑制を示さなくkつた
・」 四 同第22頁3〜4行の「に及ぼす」を削除して「の
」を挿入する。
αη 同第22頁末行のV(J、636±」をr O,
656Jとイift正する。
656Jとイift正する。
u8i I′0.11423頁9行のr 2.2 μt
/3.Odjを削除する。
/3.Odjを削除する。
(19)同第26頁11行の「核酸」の次にr(2,2
μg’/ 5.01t )Jを挿入する。
μg’/ 5.01t )Jを挿入する。
シ0)同第23頁12行の「のマイナス」を削除して「
K附したマイナス記号」を挿入する。
K附したマイナス記号」を挿入する。
0υ 同第2!I頁13行の「減少百分率」を削除して
「抑制があったこと」を挿入する。
「抑制があったこと」を挿入する。
(221同84JJ24頁10行の「等)」の次に「の
患者」を(1ヤ入する。
患者」を(1ヤ入する。
口AQ −
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、 ホスホフルクトキナーゼを含有する@癌診断薬。 2、 ホスホフルクトキナーゼ水溶液である第1液と、
アデノシン−6リン酸の水溶液である第2液ト、ホスホ
エノールピルビン酸、β−ニコチンアミドアデニン・ジ
ヌクレオチド(還元型)、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸
脱水素酵素の混合物の水溶液である第3液とを組合せて
なることを特徴とする、血清又は他の体液検体中のホス
ホンルクトキナーゼ阻害物質の検出による腫瘍診断試薬
。 6、 ホスホフルクトキナーゼ水溶液には、硫酸アンモ
ニウム、又はその他のホスホフルクトキナーゼ安定化剤
が添加、溶解されている特許請求の範囲第1項記載の試
薬。 4、 ホスホフルクトキナーゼは哺乳動物、特にウサギ
、ニワトリ、ブタ、ウシ、ウマの筋肉又は臓器から抽出
された酵素である特許請求の範囲第1項記載の試薬。 5、 第1液には、硫酸アンモニウム、又はその他のホ
スホフルクトキナーゼ安定化剤が溶解されている特許請
求の範囲第2項記載の試薬。 6、 第3液には、トリス緩衝液、硫酸マグネシウム、
塩化カリウム、フルクトース・6−リン酸ナトリウム塩
、フルクトース・1.6−2リン酸が添加、溶解されて
いる特許請求の範囲第2項記載の試薬。 Z 被検者から採取された血清又は他の体液検体へホス
ホフルクトキナーゼ水溶液(第1液)を添加し、次いで
その反応液にアデノシン−3リン酸水溶液(第2液)を
加え3分間以内に、さらにその反応混合液に対して、ホ
2ホエノールピルビン酸、β−ニコチンアミドアデニン
・ジヌクレオチド(還元型)、ピルビン酸キナーゼ及び
乳酸脱水素酵素の混合物の水溶液(第3液)を添加して
反応させ、その反応液の波長340nmでの吸光度を連
続に測定し、さらにその測定開始時の吸光度測定値から
、一定の反応時間経過後に測定した吸光度測定値を差引
いた値(これを吸光度減少値という)を算出し、この吸
光度減少値を、腫瘍のない健康正常者から採取された血
清試料について前記の第1液、第2液、’@3液を前記
と同じ要領で添加2反応させた反応液について前記と同
じ要領で波長540nmでの吸光度の連続測定及び算出
で得られた吸光度減少値を標準値として、これと比較す
ることを特徴とする、血清又は他の体液検体の抗ホスホ
フルクトキナーゼ活性力価の測定方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58109419A JPS602200A (ja) | 1983-06-20 | 1983-06-20 | 酵素学的腫瘍診断試薬 |
US06/620,822 US4710460A (en) | 1983-06-20 | 1984-06-15 | Diagnostic applications of phosphofructokinase |
EP84304108A EP0130030B1 (en) | 1983-06-20 | 1984-06-18 | Diagnostic applications of phosphofructokinase |
DE8484304108T DE3471325D1 (en) | 1983-06-20 | 1984-06-18 | Diagnostic applications of phosphofructokinase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58109419A JPS602200A (ja) | 1983-06-20 | 1983-06-20 | 酵素学的腫瘍診断試薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS602200A true JPS602200A (ja) | 1985-01-08 |
JPH0571240B2 JPH0571240B2 (ja) | 1993-10-06 |
Family
ID=14509764
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58109419A Granted JPS602200A (ja) | 1983-06-20 | 1983-06-20 | 酵素学的腫瘍診断試薬 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4710460A (ja) |
EP (1) | EP0130030B1 (ja) |
JP (1) | JPS602200A (ja) |
DE (1) | DE3471325D1 (ja) |
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WO2006065967A2 (en) * | 2004-12-15 | 2006-06-22 | General Atomics | Allosteric enzyme coupled immunoassay (aecia) |
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SU635424A1 (ru) * | 1976-12-27 | 1978-11-30 | Полтавский Научно-Исследовательский Институт Свиноводства | Способ определени активности фосфофруктокиназы (к.ф.2.7.1.11) в сперме животных |
US4132600A (en) * | 1977-06-01 | 1979-01-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Enzymatic noninvasive method for detecting cancer |
US4334017A (en) * | 1979-04-16 | 1982-06-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for detecting cancer in mammalian tissue |
ATE11930T1 (de) * | 1979-04-16 | 1985-03-15 | Massachusetts Inst Technology | In vitro verfahren zum bestimmen von krebs im saeugergewebe. |
CA1130228A (en) * | 1980-05-21 | 1982-08-24 | Chiang-Chang Liao | Support matrix for amino-containing biologically active substances |
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-
1983
- 1983-06-20 JP JP58109419A patent/JPS602200A/ja active Granted
-
1984
- 1984-06-15 US US06/620,822 patent/US4710460A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-06-18 EP EP84304108A patent/EP0130030B1/en not_active Expired
- 1984-06-18 DE DE8484304108T patent/DE3471325D1/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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US4710460A (en) | 1987-12-01 |
JPH0571240B2 (ja) | 1993-10-06 |
DE3471325D1 (en) | 1988-06-23 |
EP0130030B1 (en) | 1988-05-18 |
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