JPS602200A - 酵素学的腫瘍診断試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は被検者体内に発生した腫瘍細胞の有無を診断す
るための血清又は他の体液検体中のホスホフルクトキナ
ーゼ阻害物質の検出による酵素学的腫瘍診断試薬に関す
る。

本発明者は、ヒトを含めて哺乳動物におけるエネルギー
代謝系、特にエネルギー産生に係わる解糖酵素系（ＴＣ
Ａサイクル）を研究中に、担癌患者から採取した血清は
、フルクトース−６−リン酸からフルクトース−１，６
−２リン酸の産生反応を触媒するフルクトース−６−ホ
スホトランスフェラーゼ、すなわちホスホフルクトキナ
ーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｅｔｏｋｉｎａｓｅ、　Ｐ
ＦＫと略記することがあり、Ｄ　−ｆｒｕｃｔｏｓｅ　
６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　１−ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎ
ｓ−ｆｅｒａｓｅ　と言われることもある；生ｆヒ学実
験講座１２、［エネルギー代謝と生体酸化］上巻。

ｐｐ、１２６〜１３８２日本主１３８２日東京化学同人
発行、１９７６年、参照）の酵素活性を抑制する力価が
異常に高い事実に気付いて、この被検者の血清の抗ホス
ホフルクトキナーゼ活性の力価と被検者体内の癌細胞の
有無との関係を調べた。そして担癌患者の血清からホス
ホフルクトキナーゼ阻害物質を分離すること、及びこの
阻害物質の性質を確認することに成功した。

シカモ、そのホスホフルクトキナーゼ阻害物質が被検患
者体内の癌細胞の種類の如何に拘わらずに癌細胞の発育
に伴って患者の体液、例えば血清。

胸水、腹水等中に出現すること、本阻害物質が特ｔこ患
者の癌化の初期に高単位に血中遊離物質として典清検体
中に探知されることを発見し、この事から、被検者の体
液検体の抗ホスホフルクトキナーゼ活性力価を調べるこ
とが＠瘍の早期検出、すなわち癌患者の早期診断に役立
つと考えた。そしてホスホフルクトキナーゼが被検者の
血清又はその他の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ
阻害物質の検出を介して癌診断に有用であることを知見
したものである。これらのことに基づいて本発明を完成
させた。

すなわち、第一の本発明は、ホスホフルクトキナーゼを
活性成分として含有することを特徴とする、血清又は他
の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質の検出
による酵素学的腫瘍診断試薬を要旨とする。

本発明の薬剤に用いられるホスホフルクトキナーゼは、
哺乳動物、例えばウサギ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ウマ
等の各種臓器及び筋肉組織から常法で抽出された精製品
であるのがよいが、動物臓器破砕物の形の粗酵素液であ
ることもでき、また微生物起源の粗酵素液又は精製酵素
品でもよい。

ホスホフルクトキナーゼは水溶液として用いられるのが
好ましく、この水溶液中には、例えば硫酸アンモニウム
のような酵素安定比剤を配合するのが好ましい。

本発明の薬剤を用いて検体中のホスホフルクトキナーゼ
阻害物質を検出、定量するためには、種々の方法が可能
であるけれども、ホスホフルクトキナーゼによるフルク
トース−６−リン酸からフルクトース−１、６−２１Ｊ
ン酸の産生反応がアデノシン−６リン酸（ＡＴＰと略）
の存在を必要とすることから、検体中のホスホフルクト
キナーゼ阻害物質の力価がこの検体中で起るフルクトー
ス−１、６−２１７ン酸産生反応におけるＡＴＰの消費
の阻害率に実質的に比例することの厘理を利用して酵素
学的手法で検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質を
定量できる。

すなわち、血清又は他の体液検体に対して本発明の薬剤
（ホスホフルクトキナーゼ水溶液の形であるのが奸才し
い）とフルクトース−６−リン酸とＡＴＰとを一定時間
、一定温度で反応した後の反応液中に消費されずに残っ
た残存ＡＴＰ量を直接的又は間接的に測定することによ
って、検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質の検出
、定量ができる訳である。

この残存ＡＴＰ量の間接的測定法としては、例えば次の
諸法（イ）〜（へ）が可能である。

（イ）　６−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）の
存在下に残存ＡＴＰにグリセレート−３−ホスフェート
を作用させ、生成したグリセレート−１゜３−Ｐ２にＮ
ＡＤＨにコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド還元
型）、水素カチオン、　ＧＡＰＤＨ（ゲルタールアルデ
ヒド・リン酸脱水素酵素）を作用させ、生成したグリセ
ルアルデヒド−３−５ＰとＮＡＤのうちのＮＡＤ　の濃
度を光学的比色定量法の手法で測定するジヨウレフらの
方法（Ｊａｗｒｅｋ、　Ｄ、、　Ｇｒｕｂｅｒ、　Ｗ、
、　＆　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ、　Ｈ，Ｕ、。

［Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　−５４−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ、　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈ　５−　
Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ　Ｋｉｎａｓｅ、　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ　Ｊ　ｅｄｉｔｅｄ　ｂｅ　Ｈ，Ｕ、　Ｂｅｒｇ
ｍｅｙｅｒ。

ｐｐ　２０９７　、１９７４　、　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｂ
ｅｍｉｅ　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ　＆　Ｌｏｎｄｏｎ＠）。

（ｏｌ　残存人ＴＰに対してホスホフルクトキナーゼの
存在下にフルクトース−６−リン酸を作用させ、生成し
たフルクトース−１，６−２リン酸とＡＤＰとのうちの
ＡＤＰにＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）の存在下にＰＥＰ
（ホスホエノールピルビン酸）を作用させ、生成したＡ
ＴＰとピルビン酸のうちのピルビン酸に対してＬＤＨ（
乳酸脱水素酵素）の存在下にＮＡＤＨにコチンアミドア
デニンジヌクレオチド還元型）と水素カチオンとを作用
させ、Ｌ−ラクテートとＮＡＤを生成させ、この際、残
存したＮＡＤＨの濃度を光学的比色定量法の手法で測定
するベルクメヤーらの方法（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　ｚＨ
，Ｕ、、　Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
　Ｋｉｎａｓｅ。

［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｂｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａ
ｌｙｒ＋ｉｓ　Ｊ　ｅｄｉｔｅｄｂｙ　Ｈ，Ｕ、Ｂｅｒ
ｇｍｅｙｅｒ、　ｐｐ　４５１．１９７４　、　Ｖｅｒ
ｌａｇＣｂｅｍｉｅ　ＷＢｉｎｈｅｉｍ　Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、　ＮｅｗＹｏｒｋ　＆　
Ｌｏｎｄｏｎ、　）。

（ハ）へキソキナーゼの存在下にＡＴＰにグルコースを
作用させ、生成したグルコース−６−リン酸にグルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素の存在下にＮＡＤＰ＋　にコ
チンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸）を作用
させて６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンとＮＡＤＰＨ
とＨとを生成させ、このうちのＮＡＤＰＨの濃度を比色
定量するラムプレヒトらの方法　（Ｌａｍ、ｐｒｅｃｈ
ｔ、　Ｗ、、　＆　Ｔｒａｕｔｓｃ、ｈｏｌｄ。

１、　、　［Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　−５’　−ｔｒｉｐ
ｈｏｓｐｈａｔｅ。

ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｈｅｘｏｋｉ
ｎａｓｅ　ａｎｄ　Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｏｆＢｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｊ　
ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｈ，Ｕ。

Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ、　ｐｐ　２１０１　、１９７４　
、　Ｖｅｒｌａｇ　ＣｈｅｍｉｅＷｅｉｎｈｅｉｍ、　
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　
Ｙｏｒｋ　＆Ｌｏｎｄｏｎ、　）。

に）　ＡＴＰの分解により生ずるＡＤＰの量を、ＮＡＤ
Ｈの減少量の測定を介して比色定量するジョワレクらの
方法　（Ｊａｗｏｒｅｋ、　Ｄ、、　Ｇｒｕｂｅｒ、　
Ｗ、、　＆Ｂｅｒｇｍｅｙ、ｅｒ、　Ｈ，Ｕ、、　［Ａ
ｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅａｎ
ｄ　Ａｄｅ”ｔＢｓｉｎｅ−５’−ｍｏｎｏｐｈｏａｐ
ｈａｔｅ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃ
　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｊ　ｐｐ、　２１２７，１９７４
゜Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、　
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ、　）。

（ホ）　ホルミルテトラハイドロフオレート・シンセタ
ーゼを用いて比色定量するラビノウイチらの方法　（Ｒ
ａｂｉｎｏｗｉｔｚ、Ｊ、Ｃ，、［Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ
−５’−１ｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈＦｏｒｍｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒ
ｏｆｏｌａｔｅ　５ｙｎｔｈｅｔａｓｅ、　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　
Ｊ　ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｈ，Ｕ。

Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ、　ｐｐ、　２１１０　、１９７４
　、　Ｖｅｒｌａｇ　ＣｈｅｍｉｅＷｅｉｎｈｅｉｍ、
　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ　＆Ｌｏｎｄｏｎ、　）　。

（へ）残存ＡＴＰに対してホタル由来ルシフェラーゼの
存在下にルシフＺ　ＩＪンを作用させ、生成したアデニ
ル・ルシフェリンに酵素を作用させる時に発生ずる蛍光
を利用して蛍光分光光度分析法の手法で定量するステラ
−の方法　（５ｔｅｈｌｅｒ、　Ｂ。

Ｌ、、　［Ａｄｅｎｏａｉｎｅ−５’−ｔｒｉｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ　ａｎｄ　ＣｒｅａｔｉｎｅＰｈｏｓｐｈａ
ｔｅ、　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｌｕ
ｃｉｆｅｒａｓｅ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｂｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ、　Ｊ　ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙＨ，Ｕ、　Ｂｅｒ
ｇｍｅｙｅｒ、　Ｉ）ｐ＠　２１１２　、１９７４　、
　Ｖｅｒｌａ、ｇＣｈｅｍｉｅ　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、　ＮｅｗＹｏ
ｒｋ　＆　Ｌｏｎｄｏｎ、　）　。

しかしながら、本発明者が実験的に確めたところによれ
ば、前記の（ロ）のベルクメヤーらの方法に準じて、フ
ルクト−ス−６−リン酸、フルクトース−１，６−２リ
ン酸、Ｍｇ５Ｏ，、ホスホエノールピルビン酸、ＮＡＤ
Ｈ，ピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素、ＡＴＰを用
意しておき、これらの薬剤を、被検者の血清、胸水、腹
水等の検体とホスホフルクトキナーゼとの混合液に添加
し、一連の酵素反応を起させ、この際に消費される補酵
素（ＮＡＤＨ）の消費量を、比色定量的に測定すること
によって、被検者の血清又は他の体液検体中のホスホフ
ルクトキナーゼ阻害物質の検出、定量を行うのが腫瘍診
断に極めて良く適することを知見した。

従って、第二の本発明によると、ホスホフルクトキナー
ゼ水溶液である第１液と、アデノシン−６リン酸の水溶
液である第２液と、ホスホエノールピルビン酸、β−ニ
コチンアミドアデニン・ジヌクレオチド（還元型）、ピ
ルビン酸キナーゼ及び乳酸脱水素酵素の混合物の水溶液
である第５液とを組合せてなることを特徴とする、血清
又は他の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ阻、害物
質の検出による腫瘍診断試薬が提供される。

上記の第二の本発明による腫瘍診断試薬を用いて、血清
又は他の体液検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質
を定量する方法の原理は次の反応式による。

ＦＫ （イ）　Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−Ｐ　＋　ＡＴＰ　−＞
Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ＰＨ＋　ＡＤＰＫ （口ｌ　ＡＤＰ＋ＰＥＰ　ＡＴＰ＋　Ｐｙｒｕｖａｔｅ
＋　ＬＤＨ （ハ）　Ｐｙｒｕｖａｔｅ　＋　ＮＡＤＨ＋　Ｈ−一−
−→Ｌ−Ｌａｃｔａｔｅ　＋　ＮＡＤ十 検体中のホスホキナーゼ阻害物質がホスホフルクトキナ
ーゼの酵素活性を抑制すると、ＡＴＰの消費が抑えられ
ＡＤＰへの変化が起りにくくなる。

その結果、ピルビン酸とＮＡＤＨから乳酸が産生され難
くなり、ＮＡＤＨの消費が抑えられるので、上記の一連
の（イ）、（ロ）、（ハ）の酵素反応を完了後の反応液
中に残存するＮＡＤＨの残存量は、元の検体中に阻害物
質がある場合は無い場合に比べて多い。

上記の反応ｅ１の完了后の反応液中のＮＡＤＨの残存量
は、分光光度計で波長３４０ｎｍでの吸光度を測定し、
その測定値を、ＮＡＤＨＱ度と吸光度との関係を示すよ
うに作成された標準曲線と照合することによって定量す
ることが可能である。しかしながら、使用試薬の品質、
測定条件などは測定部度にバラつくことが多いので、標
準曲線をそれに応じてその都度作成することは煩雑であ
る。本発明者が知見したところによれば、上記の反応（
イ）。

（ロ）に続く反応ｅ→が生起しつつある反応液について
、反応開始時にＮＡＤＨの至適吸光度（３４０ｎｍにお
ける）を先づ測定しくａ値）、その後の一定の反応時間
、例えば１０分間経過后に再び吸光度（５４゜ｎｍにお
ける）を測定しくｂ値）、この一定時間経過中の吸光度
の減少値、すなわち吸光度測定開始時の測定値から２回
目測定時の測定値を差引いた値（ａ−ｂ）（すなわち、
ＮＡＤＨの消費量に比例する値）を算出し、この算出さ
れた吸光度減少値（ａ−ｂ）を、元の体液検体中にホス
ホキナーゼ阻害物質を存在させた場合と、存在させない
、場合とで比較すれば、吸光度減少値（ａ−ｈ）は検体
中に該阻害物質が存在する場合には存在しない場合に比
べて相対的に小さいことになる（検体中の該阻害物質の
含量について逆比例的に小さくなる）から、このように
吸光度減少値同志の比較により、換言すれば反応中のＮ
ＡＤＨ消費量の減少の比較により、元の検体中の該阻害
物質の相対的な定量が可能になり、しかも、測定条件な
どの測定部度のバラつきの影響も補償できて便利である
。

第二の本発明による診断薬に用いる第１液には、硫酸ア
ンモニウム等のホスホフルクトキナーゼ安定化剤が添加
、溶解されているのが好ましい。

また、第３液には、トリス緩衝液、硫酸マグネシウム、
塩化カリウム、フルクトース−６−リン酸　ナトリウム
塩、フルクトース−１，６−２リン酸が添加、溶解され
ているのが好ましい。第３液中のホスホエノール・ピル
ビン酸はシクロヘキシルアンモニウム塩（ＣＨＡ塩）で
あるのが好ましい。

さらに、第三の本発明によると、被検者から採取された
血清又は他の体液検体へホスホフルクトキナーゼ水溶液
（第１液）を添加し、次いで、その反応液にアデノシン
−６リン酸水溶液（第２液）を加え６分間以内に、さら
にその反応混合液に対して、ホスホエノールピルビン酸
、β−ニコチンアミドアデニン・ジヌクレオチド（還元
型）、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸脱水素酵素の混合物
の水溶液（第６液）を添加して反応させ、その反応液の
波長３４０ｎｍでの吸光度を連続に測定し、さらにその
測定開始時の吸光度測定値から、一定の反応時間経過後
に測定した吸光度測定値を差引いた値（これを吸光度減
少値という）′を算出し、この吸光度減少値を、腫瘍の
ない健康□正常者から採取された血清試料について前記
の第１液、第２液。

第３液を前記と同じ要領で添加２反応させた反応液につ
いて前記と同じ要領で波長３４０ｎｍでの吸光度の連続
測定及び算出で得られた吸光度減少値を標準値として、
これと比較することを特徴とする、血清又は他の体液検
体の抗ホスホフルクトキナーゼ活性力価の測定方法が提
供される。

次に、本発明を参考例、実施外及び試験例について具体
的に説明する。

参考例 本例は、医学的な諸方法で担癌（肺癌）が確認された患
者の血清からホスホフルクトキナーゼ阻害物質を抽出、
精製した例を示す。

肺癌患者の血清、腹水又は膨水１００−にプロナーゼ１
．Ｏｌを加え、室温で１時間消化する。

５００−のＤＮＡ抽出用緩衝液（０，１Ｍ　Ｔｒｉｓ緩
衝液、　ｐＨ８，０、１０ｍＭ　ＢＤＴＡ　、　１％８
ＤＢ。

０．４ＭＮａＣ）を含む）を加え撹拌する。６００−の
クロロホルム−イソアミルアルコール混合液（クロロホ
ールム：イソアミルアルコール＝２５：１）を加え１０
分間振盪する。４℃にて１０，０００回転１５分間遠心
し、水層を分離し、等量の水飽和フェノールを加え、１
０分間激しく振盪する。４℃にてｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ回
転１０分間遠心分離し、水層を分取する。２倍量の無水
エタノールを加え一２０℃にて静置する。１０，０００
回転３０分遠心し、上清を捨て、沈渣を７０％エタノー
ルで数回洗浄する。

エタノールを蒸発させた後、ＤＮＡ融解緩衝液（１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ）　、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｎａ
Ｃ！　、１ｍＭＢＤＴＡ）に溶解し、分光々度計により
濃度を測定する。７％アクリルアミドゲル（アクリルア
ミド・ジメチルアミンプロピオニ）　ＩＪル混合ゲル）
を作成し、抽出弊品を載せ４００■にて電気泳動する。

電気泳動終了後ゲルの一部を切り、エチジウムブロマイ
ド染色をし、蛍光を発する部位を定め、切り出し、乳鉢
中にて破砕する。少段のＤＮＡ融解緩傭液を加え、１０
，０００ｘｆ、３０分間遠心分離した後、上清を貯め、
９９％冷エタノールを２倍量加え一２０℃−夜装置する
。１０，０００回転３０分遠心し、沈渣としてホスホフ
ルクトキナーゼ阻害物質の２６０μｍを得た。これを０
．１Ｍ’Ｔｒｉｇ緩衝液（ｐＨ８，５）にとかし、−７
０℃にて凍結保存した。

上記のようにして白色粉末としで得られた血清中のホス
ホフルクトキナーゼ阻害物質について、抗ホスホフルク
トキナーゼ活性力（Ｂ　（５０％活性阻害ＩＣ，。）を
調べたところ４．０６μ？　／　１．２μｆ　ＰＦＫで
あった。

さらに、上記の白色粉末の物理化学的及び酵素学的性状
を調べたところ、下記の性質を示した。

（１）約２０００塩基対に相当する核酸様物質。

（２１ＤＮＡ分解酵素（デオキシリボヌクレアーゼ）に
感受性を有する。

（３１ＦＬＮＡ分解酵素（リボヌクレアーゼ）に部分的
に感受性を有する。

（４）　凍結融解、加熱（９０℃、１０分間）に抵抗性
。

（５）非透析性。

（６）　タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ　）に
抵抗性。

（７）アクリルアミドゲル電気泳動法により、２０００
塩基対を有する標準ＤＮＡ（λフアージＤＮＡをＨｉｎ
ｄｕ制限酵素で分解した標品）と相同の部位にバンドと
して識別し得る物質。

実施例１ 第１液：３．２Ｍ硫酸アンモニウム水溶液に溶解したウ
キギ筋由来ホスホフルクトキナ ーゼ（１２０μｍ／ｄ）水溶液　１０μノ第２液：　Ａ
ＴＰ水溶液（１０η／’ｍ蒸留水）　Ｑ、１＋ｍ／第６
液：次の６液の混合物　２．６０６ｄ計　２．６０６ｄ を先づ調製して用意する。

＋１１４ｍ／容量の分光々変針用セルに被検者の血清検
体０．１５−を分取し、第１液（酵素液）の１０μノを
加え撹拌後、１０分間室温に放置する。

（２）セルに第２液（ＡＴＰ液）の０．１　ｍｌ！を加
え６分以内室温に放置する。

（６）第３液の２．６ｄをセルに加える。

（４）ただちに分光光度計に上記のセルをセットし、吸
光度（５４０ｎｍにおける）を１０分間連続に測定する
。測定開始時の吸光度測定値ｆａｌから、反応１０分間
経過后の吸光度測定値ｔｂ）を差引いた値（ａ　−ｂ　
）を、吸光度減少値＋１）とする。

他方、本芙施例における前記の組成の第１液、第２液及
び第６液を用いて前記の検査法で健康正常人の多数から
採取した血清検体の多数について、最終反応液における
３４０ｎｍでの吸光度の１０分間の減少的変化を実測し
て調べたところ、吸光度減少値（Ｉ［ｌは０．８！１０
±０．０６１　（平均値士標準偏差）の範囲内であると
実測された。

被検者の血清について実測した吸光度減少値（前記のｔ
Ｉｌ値）が健漿正常人血清の実測吸光度減少値（Ｉｌｌ
　（０，８３０±０．０６１）の範囲を有意に下回るこ
とは、この被検者の血清中に残存Ａ　Ｔ　Ｐ　・ｉ　（
あるいは最終反応液中のβ−ＮＡＤＨ残存量）が相対的
に多かったこと、さらにホスホフルクトキナーゼ阻害物
質の量が異常に多かったことを意味し、被検者の血清は
陽性と判定され、その被検者は担癌の疑いがあるので、
精密診断を要する。

上記の検査法で検査したところ、被検者Ａ、Ｂ及びＣの
三者の血清検体の吸光度減少値（６４０ｎｍ　）の実測
値は夫々に０．８４０，０．６３２．及び０８５９であ
り、このうちの被検者Ｂの血清によるホスホフルクトキ
ナーゼ活性抑制率は２４．７６％となり、別途精密診断
したところ、早期胃癌が発見された。

試験例１ 実施例１に記載された組成の第１液、第２液。

第６液を用いて、実施例１に記載された検査法により、
担癌の確認されている患者の血清検体を処理し、その処
理した血清検体について１０分間の吸光度減少値（５４
０ｎｍ）を分光光度計で実測したところ、次表に示す結
果を得た。

表Ｉ 表１のつづき 注）抑制率のマイナスは正常値を基準としたＰＦＫ活性
の減少Ｈ分率を示す。

上記の表で、判定の項目における＋は陽性（担癌の疑い
）、−は陰性を示す。

なお、表ＩＫ示された早期胃痛で当該検査で１０性と出
た患者で、手術後−カ月間に本発明で血清検査したとこ
ろ、陰性化（正常化）した例が７名諸疾１忠々者血清中
に含まれているホスホフルクトキナーゼ阻害物質による
吸光度減少値を測定した表１の結果を要約すると、実施
例１の検査法により検出される疾患は、悪性腫瘍及び糖
尿病である。即ち両疾患々者血清中にはホスホフルクト
キナーゼ活性を抑制する物質が含まれている事が解る。

該た、本発明の桑剤を用いる検査法の特長は、早期癌（
特に胃、膵、肺、卵巣等）を少量の血清を用いてスクリ
ーニング出来るところにあると言える。癌好発年令に近
づ＜３０才以上の集団から、初期癌患者を検出し、精密
検をにより確定診断を下し、手術等により出来るたけ早
い時期化治療を開始し得る資料になろう。更に患者の経
過を観察する際にも、治療法の適否及び再発の有無を判
定する資料となり得る。

手続補正書（自発） 昭和５８年９月２１日 特許庁長官殿 ■、事件の表示 昭和　５８　年特許願第１０９４１９号２、発明の名称 酵素学的腫瘍診断試薬 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 任　所　神奈川県相模原市古淵３１３０−１０氏名　中
　村　國　衛 ４、代理人 ５、補正の対象 明細聰の特許請求の範囲の欄及び発明の詳細な説り」の
札 ６、補正の内容 （１）特許請求の範囲を別紙のとお９補正する。

（２）明細書第１５頁第１６行の「血清」の次に「又は
他の体液」を挿入する。

（３１ＢＡ細細組第２６負下ら４行と下から５行との間
に次の記載を挿入する。

「上の表１における１−ＰＦＫ活性に及ぼす抑制率又は
九進率（％）」は次式で計算された値である。

但し、式中の（１）は被検者の吸光度減少値を表わし、
（［）は健康正常人の吸光度減少値を表わすものである
。」 ２、特許請求の範囲 １．　ホスホフルクトキナーゼを含有する腫瘍診断薬。

２、　ホスホフルクトキナーゼ水溶液である第１液と、
アデノシン−６リン酸の水＠液である第２液ト、ホスホ
エノールピルビン散、β−ニコチンアミドアデニン・ジ
ヌクレオチド（還元型）、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸
脱水素酵素の混合物の水溶液である第３液とを組合せて
なることを特徴とする、血清又は他の体液検体中のホス
ホフルクトキナーゼ阻害物質の検出にょる肺癌診断試薬
。

試薬。

の他のホスホフルクトキナーゼ安定化剤が添加。

６、　第１液には、硫酸アンモニウム、又はその他のホ
スホフルクトキナーゼ安定化剤が添加、溶解されている
特許請求の範囲第２項記載の試薬。

Ｚ　第３液には、トリス緩衝液、硫酸マグネシウム、塩
化カリウム、フルクトース・６−リン酸ナトリウム塩、
フルクトース・１．６−２リン酸が添加、＠解されてい
る特許請求の範囲第２項記載の試薬。

８、被検者から採取された血清又は他の体液検体へホス
ホフルクトキナーゼ水溶液（第１液）を添加し、次いで
その反応液にアデノシン−３リン酸水溶液（第２液）を
加え３分間以内に、さらにその反応混合液に対して、ホ
スホエノールピルビン酸、β−ニコチンアミドアデニン
・ジヌクレオチド（還元型）、ピルビン酸キナーゼ及び
乳酸脱水素酵素の混合物の水溶液（第６液）を添加して
反応させ、その反応液の波長３４０ｎｍでの吸光夏を連
続に測定し、さらにその測定口始時の吸光度測定値から
、一定の反応時間経過後に測定した吸光度測定値を差引
いた値（これを吸光度減少値という）をｐ、出し、この
吸光度減少値を、腫瘍のない健康正常者から採取された
血清又は他の体液試別について前記の第１液、第２液、
第６液を前記と同じ要領で添加１反応させた反応液につ
いて前記と同じ要領で波長３４０ｎｍでの吸光度の連続
測定及び算出で？９られた吸光度減少値を標準値として
、これと比較することを特徴とする、血清又は他の体液
検体の抗ホスホフルクトキナーゼ活性力価の測定方法。

手続補正書（自発） 昭和５９年８月３１日 特許庁長官殿 ■、小事件表示 昭和５８　年特許願第１０９４１９号 ２、発明の名称 酵素学的腫瘍診断試薬 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 任　所　神奈川県相模原市古淵３１３０−１０氏名　中
　村　國　衛　− −１□− 一へ、３１　。

物産ビル別館　電話（５９１）　０２６１５、補正の対
象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ＆補正の内容 （１）　明細書第６頁１８行の「フルクトース」の前に
「夫々に既知量の」を挿入する。

（２）同第、。６行よ。行よ４間３次。８．載を挿入す
る。

「この残存ＡＴＰｉの直接的測定法としては、例えば高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法があ
る。」 （３）同第７頁４行の「この」を削除して「１だ、」を
挿入する。

（４）　同第７百１５行、第９頁５行、及び第９頁１５
行の「＆」を削除して「及び」を挿入する・（５）同第
７頁１８行のｒ　ｅｄｉｔｅｄ　ｂｅ　Ｊを削除して「
編集者」を挿入する。

（６）　同第８頁１４−１５行及び第１０頁６行のｒ　
ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｊを削除して「編集者」を挿入す
る。

（７）同第８頁１６行の「Ｅ」をＶｅＪと補正する。

（８１同第９頁１５行のｒ　Ｊａｗｏｒｅｋｊを「Ｊａ
ｗｒｅｋ　Ｊと補正する。

（９）同第１０頁１２行の「酵素」を「酸素」と補正す
る。

（１０）同第１０頁１７行のｒ　ｅｄｉｔｅｄ　ｌ）ｙ
　Ｊを削除して「編集者」を挿入する。

圓　同第１０゛頁末行の下に次の記載を挿入する。

［また検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質（の力
価が検体中で起こるフルクトース−１，６−２リン酸生
成反応の阻害率に実質的に比例することのＭ理を利用し
て検体中のホスホフルクトキナーゼ阻害物質を定量でき
る。

すなわち、血清又は他の体液検体に対して本発明の薬剤
（ホスホフルクトキナ−上水溶液の形であるのが好まし
い）とフルクトース−６−リン酸とＡＴＰとを一定時間
、一定温度で反応した後の反応液中に生成されたフルク
トース−１，６−２リン酸を定量することによってホス
ホフルクトキナーゼ阻害物質の検出、定量ができる訳で
ある。

この生成フルクトース−１，６−２リン酸量の測定法と
しては、例えばラッカーの方法［Ｅ、　Ｒａｃｋｅｒｒ
　Ｊ、Ｂ、ＣＪ　１６７巻、８４３頁、（１９４７）］
が可能である。」 Ｆ１２）　同第１４負６行の「を存在させ一一一一一な
い」を削除して「が存在した場合と、存在しない」を挿
入する。

０３）　同第１４頁１２行の「補償」を削除して「相殺
」を挿入する。

υ４）　同第１６頁８行の「、精製」を削除する。

θ９　同第１６頁９行〜第１８頁１７行の記載を削除し
て次の記載を挿入する。

「肺癌患者の血清１００４にｉｆｔ　Ｑ’ｔアンモニウ
ム３０１加え撹拌した。１０．０００　ｘ　ｆの加速度
で６０分間遠心後、硫酸アンモニウム３０ｆが浴解して
いる上清にさらに２０１のｈ’Ｌ　［４ｆ２アンモニウ
ムを加え。

充分撹拌後１０．ＯＤＤ　Ｘ　ｒの加速度で３０分遠心
し上清を分ける。こうして得られた各分画、すなわち硫
酸アンモニウム３０１で血清から沈澱した分画と、硫酸
アンモニウム６０〜５０　ｆで沈澱した分画と、硫酸ア
ンモニウム５０９で沈澱しなかった分画とを透析チュー
ブにつめ、蒸溜水を数回取り替えなから硫酸アンモニウ
ムを除去した０このように透析された各分画を凍結乾燥
し、一定量を健康人由来血清に尋解し、ＰＦＫ抑制活性
を検討した。

ぞの結呆、硫酸アンモニウム３０〜５０ｆ／、で塩析、
沈澱してくる分画にＰＦＫ抑制活性が認められる事が解
った。この分画をセファデックスＧ−７５カラムにてゲ
ル１過し、幾つかの分画についてＰＦＫ抑制活性を測定
した所、アルブミンより分子量の低い分画（分子蓋２０
．０００以下、非透析性）にその活性を認めた。この分
画を５０　ｍ２／ｍｔの濃度で正常血清に浴解しその１
５０μｔの血Ｔａを用いて試験すると、正常血清と比べ
て大略７０％のＰＦＫ抑制が認められた。これを正常血
清で稀釈すると。

４倍稀釈までは比例して抑制の低下が認められたが、そ
れ以上の稀釈血清は明瞭なＰＦＫ抑制を示さなくｋつた
・」 四　同第２２頁３〜４行の「に及ぼす」を削除して「の
」を挿入する。

αη　同第２２頁末行のＶ（Ｊ、６３６±」をｒ　Ｏ，
６５６Ｊとイｉｆｔ正する。

ｕ８ｉ　Ｉ′０．１１４２３頁９行のｒ　２．２　μｔ
／３．Ｏｄｊを削除する。

（１９）同第２６頁１１行の「核酸」の次にｒ（２，２
μｇ’／　５．０１ｔ　）Ｊを挿入する。

シ０）同第２３頁１２行の「のマイナス」を削除して「
Ｋ附したマイナス記号」を挿入する。

０υ　同第２！Ｉ頁１３行の「減少百分率」を削除して
「抑制があったこと」を挿入する。

（２２１同８４ＪＪ２４頁１０行の「等）」の次に「の
患者」を（１ヤ入する。

口ＡＱ　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ホスホフルクトキナーゼを含有する＠癌診断薬。 ２、　ホスホフルクトキナーゼ水溶液である第１液と、
   アデノシン−６リン酸の水溶液である第２液ト、ホスホ
   エノールピルビン酸、β−ニコチンアミドアデニン・ジ
   ヌクレオチド（還元型）、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸
   脱水素酵素の混合物の水溶液である第３液とを組合せて
   なることを特徴とする、血清又は他の体液検体中のホス
   ホンルクトキナーゼ阻害物質の検出による腫瘍診断試薬
   。 ６、　ホスホフルクトキナーゼ水溶液には、硫酸アンモ
   ニウム、又はその他のホスホフルクトキナーゼ安定化剤
   が添加、溶解されている特許請求の範囲第１項記載の試
   薬。 ４、　ホスホフルクトキナーゼは哺乳動物、特にウサギ
   、ニワトリ、ブタ、ウシ、ウマの筋肉又は臓器から抽出
   された酵素である特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ５、　第１液には、硫酸アンモニウム、又はその他のホ
   スホフルクトキナーゼ安定化剤が溶解されている特許請
   求の範囲第２項記載の試薬。 ６、　第３液には、トリス緩衝液、硫酸マグネシウム、
   塩化カリウム、フルクトース・６−リン酸ナトリウム塩
   、フルクトース・１．６−２リン酸が添加、溶解されて
   いる特許請求の範囲第２項記載の試薬。 Ｚ　被検者から採取された血清又は他の体液検体へホス
   ホフルクトキナーゼ水溶液（第１液）を添加し、次いで
   その反応液にアデノシン−３リン酸水溶液（第２液）を
   加え３分間以内に、さらにその反応混合液に対して、ホ
   ２ホエノールピルビン酸、β−ニコチンアミドアデニン
   ・ジヌクレオチド（還元型）、ピルビン酸キナーゼ及び
   乳酸脱水素酵素の混合物の水溶液（第３液）を添加して
   反応させ、その反応液の波長３４０ｎｍでの吸光度を連
   続に測定し、さらにその測定開始時の吸光度測定値から
   、一定の反応時間経過後に測定した吸光度測定値を差引
   いた値（これを吸光度減少値という）を算出し、この吸
   光度減少値を、腫瘍のない健康正常者から採取された血
   清試料について前記の第１液、第２液、’＠３液を前記
   と同じ要領で添加２反応させた反応液について前記と同
   じ要領で波長５４０ｎｍでの吸光度の連続測定及び算出
   で得られた吸光度減少値を標準値として、これと比較す
   ることを特徴とする、血清又は他の体液検体の抗ホスホ
   フルクトキナーゼ活性力価の測定方法。