DE69021724T2 - Modifizierte Protease, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende kosmetische Zusammensetzungen. - Google Patents
Modifizierte Protease, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende kosmetische Zusammensetzungen.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft eine von Bacillus-Organismen stammende polysaccharidmodifizierte Protease, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und eine die modifizierte Protease enthaltende kosmetische Zusammensetzung.
- Proteasen tierischer, pflanzlicher oder mikrobieller Herkunft werden allgemein mit gutem Erfolg in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet, beispielsweise als Detergentien, pharmazeutische Produkte, wie zum Beispiel verdauungsfördernde Mittel, entzündungshemmende Mittel usw., Kosmetika, Fleischzartmacher, Seidenentbastungsmittel, in der Bierherstellung usw..
- Es ist jedoch darauf hingewiesen worden, daß diese in Detergentien, Kosmetika und pharmazeutischen Produkten etc. enthaltenen Proteasen, die für den Menschen Fremdeiweiß sind, Probleme durch Antigenreaktionen und Überempfindlichkeitsreaktionen der Haut mit sich bringen und gelegentlich bei einigen Individuen zu heftigen Reizantworten führen. Ein weiteres Problem dieser Enzyme ist ihre relative Instabilität. Insbesondere in Medien mit hohem Wassergehalt oder in wäßrigen Lösungen werden Proteasen nicht nur denaturiert, sondern sie unterliegen auch der Autolyse. Ferner ist bekannt, daß die Lagerung bei Umgebungstemperatur rasch zur Inaktivierung führt. Aus diesem Grund war es bisher schwierig, dem Verbraucher stabile proteasehaltige Produkte zur Verfügung zu stellen.
- Um die Antigenitäts- und sonstigen Sicherheitsprobleme derartiger Enzyme zu lösen, d.h. die Antigenität zu unterdrücken und die Bluthalbwertszeit des Enzyms in systemischen Verabreichungen zur Behandlung von Krankheiten zu verlängern, wurde vorgeschlagen, Uricase oder Asparaginase mit Polyethylenglykol zu modifizieren (japanische Patentveröffentlichung 61-42558) oder Streptokinase mit Polyethylenglykol zu modifizieren (japanische Kokai-Patentveröffentlichung 57-118789). Bei der Beschäftigung mit dem Stabilitätsproblem der Proteasen wurde für Chymotrypsin und bestimmte andere Enzyme gezeigt, daß eine chemische Modifikation, die zur intramolekularen Brückenbildung beiträgt, wirksam ist (Biochimica et Biophysica Acta 522, 277-283, 1987 und 485 1-12, 1977). Ferner ist gezeigt worden, daß die Bindung eines wasserlöslichen Polymers, beispielsweise eines Polysaccharids, von Polyethylenglykol, eines Proteins oder dergleichen an eine Mangansuperoxiddismutase zur Unterdrückung der Antigenität und zu einer höheren Wärmebeständigkeit des Enzyms führt (japanische Kokai-Patentveröffentlichung 58-16685).
- Jedoch ist keine Verfahrensweise bekannt, die zur Reduzierung des Antigenitäts- und des Hautsensibilisierungspotentials und gleichzeitig zur Stabilität des Enzyms beiträgt. Da Überempfindlichkeitsreaktionen der Haut unter anderem sehr heikle Reaktionen sind, ist die Unterbindung dieser Reaktionen technisch sehr schwierig zu lösen. Da die Substrate zu modifizierender Proteasen im allgemeinen hochmolekulare Substanzen sind, werden durch die Modifikation ferner, je nach dem Grad der Modifikation, die Enzymaktivität und die Wärmebeständigkeit ernstlich beeinträchtigt. Auch deshalb ist jede Modifikation der Enzyme schwierig.
- Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben daher dieses Technologiegebiet im Hinblick darauf durchforstet, die Stabilität von Proteasen zu verbessern, ohne ihre Aktivität zu opfern, damit diese Enzyme in einem breiten Anwendungsspektrum, beispielsweise in Detergentien, Kosmetika, Arzneimitteln usw., besser genutzt werden können. Die erwähnte Durchforstung und die sich daran anschließende Forschung haben zur vorliegenden Erfindung geführt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft daher eine modifizierte Protease mit verringertem Hautsensibilisierungs- und Antigenitätspotential, verbesserter Stabilität und hoher Aktivität, ein Verfahren zur Herstellung dieser modifizierten Protease und eine die modifizierte Protease enthaltende kosmetische Zusammensetzung.
- Zur Lösung der vorgenannten Aufgaben stellt die vorliegende Erfindung zur Verfügung: (1) eine von Bacillus-Organismen stammende modifizierte Protease, die dergestalt modifiziert ist, daß eine Protease über einen Triazinring an ein Polysaccharid gebunden ist, (2) ein Verfahren zur Herstellung einer von Bacillus-Organismen stammenden modifizierten Protease mit den Schritten, daß man ein Polysaccharid zur Bildung eines an einen Triazin-Ring gebundenen Polysaccharids mit Cyanursäuretrichlorid umsetzt und dann dieses an einen Triazin-Ring gebundene Polysaccharid mit einer von Bacillus-Organismen stammenden Protease umsetzt, und (3) eine kosmetische Zusammensetzung, die eine von Bacillus-Organismen stammende modifizierte Protease enthält, wobei die von Bacillus-Organismen stammende Protease über einen Triazin-Ring an ein Polysaccharid gebunden ist.
- Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlich beschrieben.
- Die im Rahmen der Erfindung verwendbaren Proteasen umfassen von Bacillus- Organismen stammende Proteasen.
- Die für die Zwecke der Erfindung verwendbaren Polysaccharide schließen verschiedene natürlich vorkommende Polysaccharide, beispielsweise Agarose, Guargummi, Inulin, Stärke, Dextran, Pullulan, Xanthangummi, Carragenin, Pektin, Alginsäure usw. sowie Derivate davon, Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose usw. ein. Insbesondere Dextran und Pullulan sind dadurch von Vorteil, daß sie - auch bei Verwendung ziemlich hochmolekularer Vertreter - der Lösung eine ausreichend niedrige Viskosität verleihen, um die Reaktion zu erleichtern, so daß die sich ergebende modifizierte Protease einheitlicher in der Wirkung und stabil ist.
- Hinsichtlich des Molekulargewichts des Polysaccharids gilt, daß der Unterdrückungseffekt der Erfindung auf Antigenität und Hautüberempfindlichkeit nicht ausreicht, wenn das Molekulargewicht zu niedrig ist. Daher ist es wünschenswert, ein Polysaccharid mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von nicht unter 10.000 und vorzugsweise von nicht unter 40.000 zu verwenden.
- Der Grad der Unterdrückung der Antigenität und der Hautüberempfindlichkeitsreaktion sowie der Grad der Stabilisierung, die durch die Modifikation im Vergleich zur unmodifizierten Protease erzielt werden können, hängen nicht nur von Art und Molekulargewicht des verwendeten Polysaccharids ab, sondern ändern sich auch mit dem Grad der Modifikation. Der nach der nachstehend beschriebenen TNBS-Methode ermittelte Modifikationsgrad für Oberflächenaminogruppen in der erfindungsgemäßen modifizierten Protease liegt vorzugsweise bei nicht unter 30 % und stärker bevorzugt bei nicht unter 50 %.
- Gemäß der Methode von Haynes (Haynes, R. et al., Biochemistry 6, 541, 1967) wird die Menge nicht umgesetzter Aminogruppen an der Oberfläche der modifizierten Protease gemessen als Reaktionsmenge von Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS), und der Modifikationsgrad der Oberflächenaminogruppen errechnet sich aus dem Verhältnis dieser Menge zur Menge der Oberflächenaminogruppen der unmodifizierten Protease.
- Das Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen modifizierten Protease wird im folgenden beschrieben.
- Die erfindungsgemäße, von Bacillus-Organismen stammende modifizierte Protease kann dadurch hergestellt werden, daß man das Polysaccharid zur Bildung eines an einen Triazin-Ring gebundenen Polysaccharids mit Cyanursäuretrichlorid umsetzt und das Reaktionsprodukt dann mit einer Protease umsetzt. Eine modifizierte Protease mit noch höherer Stabilität erhält man, indem man das vorgenannte Reaktionsprodukt einer Nachbehandlung unterwirft, bei der Lysin, Glycin, Aminoethanol und dergleichen zugesetzt werden, um überschüssige aktive Gruppen des Polysaccharids zu blockieren. Die so erhaltene modifizierte Protease kann mit bekannten Techniken, beispielsweise durch Ultrafiltration, Gelfiltration, Flüssigchromatographie usw., gereinigt werden. Wenn es gewünscht wird, kann das modifizierte Protease-Produkt zu einem fein verteilten Präparat verarbeitet werden.
- Bei dem vorstehend beschriebenen Herstellungsverfahren kann mit verbesserter Reproduzierbarkeit eine stabilere von Bacillus-Organismen stammende modifizierte Protease erzielt werden, wenn dafür gesorgt wird, daß während der Umsetzung des an einen Triazin-Ring gebundenen Polysaccharids mit der Protease der reaktive Chlorgehalt des an einen Triazin-Ring gebundenen Polysaccharids zwischen 0,4 und 1,2 mmol (Milligramm-Atome)/Gramm liegt und daß das Molverhältnis von Chlor zu den reaktiven Aminogruppen der Protease nicht unter 2 liegt. Um einen solchen reaktiven Chlorgehalt des an einen Triazin- Ring gebundenen Polysacchaids sicherzustellen, ist es von Vorteil, als Lösungsmittel für das Cyanursäuretrichlorid bei dessen Umsetzung mit dem Polysaccharid ein nichtwäßriges, mit Wasser mischbares Lösungsmittel zu verwenden, das gegenüber Cyanursäuretrichlorid inert ist. Es wird außerdem empfohlen, die Umsetzung nach Einstellung eines pH-Werts des Reaktionssystems bestehend aus einer Lösung von Cyanursäuretrichlorid und einer Lösung des Polysaccharids auf 7,5 bis 9,5, insbesondere auf 8 bis 9, durchzuführen. Als Beispiel für das nichtwäßrige Lösungsmittel zur Herstellung der Cyanursäuretrichloridlösung können Aceton, Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylsulfoxid usw. genannt werden. Im Hinblick auf die einfache Anwendung und die anschließende Beseitigung ist Aceton am besten geeignet. In einigen Fällen sollte die Cyanursäuretrichloridlösung vorzugsweise mit Wasser verdünnt werden, da sich jedoch das Cyanursäuretrichlorid in Gegenwart von Wasser allmählich zersetzt, ist es in diesen Fällen erforderlich, die Cyanursäuretrichloridlösung nach dem Ansatz unverzüglich zu der wäßrigen Polysaccharidlösung hinzuzugeben.
- Mit dem vorbeschriebenen Verfahren können die erforderlichen aktiven Gruppen mit guter Reproduzierbarkeit in das Polysaccharid eingebracht, die Reaktionseffizienz verbessert und die Menge an Cyanursäuretrichlorid verringert werden. Das Ausmaß der Einführung aktiver Gruppen kann auf dem gewünschten Niveau gehalten werden, indem das Verhältnis von Polysaccharid zu Cyanursäuretrichlorid entsprechend eingestellt wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung liegt das Gewichtsverhältnis von Polysaccharid zu umzusetzendem Cyanursäuretrichlorid vorzugsweise im Bereich von 1:0,5 bis 1:0,1. Die Reaktionstemperatur liegt vorzugsweise im Bereich der Zimmertemperatur (15 bis 25 ºC). In Anbetracht der Tatsache, daß die Zersetzung der in das Polysaccharid eingeführten aktiven Gruppen zeitabhängig ist, sollte die Reaktionsdauer vorzugsweise nicht mehr als 30 Minuten betragen. Die Reaktion kann durch Ansäuern des Reaktionssystems auf etwa pH=3 gestoppt werden.
- Bei Durchführung der Kupplungsreaktion zwischen dem an einen Triazin-Ring gebundenen Polysaccharid und der Protease hat es sich bewährt, bezogen auf das Gewicht der Protease mindestens die dreifache Menge an Triazin-Ringgebundenem Polysaccharid zu verwenden und dafür zu sorgen, daß das Molverhältnis des reaktiven Chlors im Triazin-Ring-gebundenen Polysaccharid zu den reaktiven Aminogruppen der Protease mindestens das Zweifache beträgt. Noch wünschenswerter ist es, daß das Molverhältnis des reaktiven Chlors zu den reaktiven Aminogruppen nicht weniger als das Fünffache beträgt. Je größer dieses Verhältnis ist, desto größer ist die Menge an modifiziertem Enzym, und insbesondere, wenn das Molverhältnis 5 beträgt oder darüber liegt, erhält man eine sehr stabile modifizierte Protease. Obwohl man auch dann noch eine ziemlich stabile modifizierte Protease erhält, wenn das vorstehend angegebene Gewichtsverhältnis von aktiviertem Polysaccharid zu Protease nicht eingehalten wird, ergibt sich dann keine ausreichende Unterdrückung von Antigenität und Hautüberreizung.
- Außerdem besteht eine Tendenz zu zunehmender Stabilität der modifizierten Protease, je höher der Modifikationsgrad ist, jedoch ist dann zu einem gewissen Grad die erhaltene Enzymaktivität reduziert. Daher kann, wenn die Produktform auf eine verbesserte Stabilität der Protease abzielt, ein etwas geringerer Modifizierungsgrad gewählt werden. Abhängig von der Reinheit der verwendeten Protease können andere Proteinbestandteile und niedermolekulare aminogruppenhaltige Substanzen vorhanden sein, und diese Aminogruppen reagieren mit dem reaktiven Chlor des aktivierten Polysaccharids und ändern so den Modifizierungsgrad der Protease. Der Ausdruck "reaktive Aminogruppen der Protease" bezeichnet daher in dieser Beschreibung die Gesamtheit der Oberflächenaminogruppen der Protease und der Aminogruppen der genannten Verunreinigungen.
- Eine modifizierte Protease, die selbst in pulverförmigem Zustand stabil ist, erhält man, wenn die Menge des an den Triazin-Ring der fertigen modifizierten Protease gebundenen atomaren Halogens in der Nachbehandlung nach der Kupplungsreaktion von Protease und Polysaccharid auf 500 ppm verringert wird. Bei dieser Nachbehandlung wird die durch die Kupplungsreaktion erhaltene modifizierte Protease vorzugsweise in einer wäßrigen Lösung einer aminohaltigen niedermolekularen Verbindung behandelt. Während die Art der aminohaltigen niedermolekularen Verbindung nicht entscheidend ist, können Aminosäuren, wie beispielsweise Glycin, Alanin, Lysin, Serin, Glutamin usw., Monoethanolamin und andere Verbindungen, die keine Überempfindlichkeitsreaktionen auslösen und die Struktur der modifizierten Protease nicht beeinträchtigen, verwendet werden. Die Anzahl der an den Triazin-Ring gebundenen Halogenatome, die in der modifizierten Protease verbleiben, nimmt mit der Dauer der Behandlung ab, und das Ausmaß der Abnahme erhöht sich tendenziell mit steigender Temperatur und/oder steigendem pH-Wert. Um eine hohe Behandlungseffizienz sicherzustellen und gleichzeitig die Denaturierung und Inaktivierung der Protease zu vermeiden, wird daher das Behandlungssystem auf einem pH-Wert von 6,5 bis 9,5 gehalten. Die Behandlungstemperatur liegt vorzugsweise zwischen 50 und 75 ºC und zur Erzielung eines noch besseren Ergebnisses zwischen 55 und 70 ºC. Ist die Temperatur zu niedrig, dauert es lange, bis die Menge des gebundenen atomaren Halogens auf nicht mehr als 500 ppm reduziert ist. Wenn andererseits die Behandlungstemperatur zu hoch ist, nimmt die Inaktivierung der Protease parallel zum Nachbehandlungseffekt zu, so daß die Aktivität der modifizierten Protease eingebüßt wird. Der vorgenannte Temperaturbereich ist auch im Hinblick auf eine einfache Steuerung wünschenswert. Die Behandlungsdauer ist abhängig von Behandlungstemperatur und pH-Wert. Wie bereits erwähnt, ist die derart nachbehandelte modifizierte Protease selbst in pulverförmigem Zustand stabil, so daß die Herstellung einer pulverförmigen Zubereitung der modifizierten Protease möglich wird. Zur Herstellung einer solchen pulverförmigen modifizierten Protease können Techniken, wie die Vakuumverdampfung, die Gefriertrocknung, die Ausfällung aus einem Lösungsmittel mit geringem Lösungsvermögen, wie Ethanol, usw., verwendet werden.
- Unter Verwendung der modifizierten Protease kann eine Vielzahl kosmetischer Produkte hergestellt werden. Dabei ist es vorteilhaft, diesen kosmetischen Produkten die modifizierte Protease im Verhältnis von 0,0001 bis 5 Gewichtsteilen bezogen auf 100 Gewichtsteile des kosmetischen Materials beizugeben. Wenn der Anteil der modifizierten Protease weniger als 0,0001 Gewichtsteile beträgt, erfüllt die Protease im kosmetischen Material nicht in vollem Umfang die erwartete Funktion, während die Beigabe von mehr als 5 Gewichtsteilen modifizierter Protease keine weitere Verbesserung des erwarteten Ergebnisses erbringt.
- Unter das vorerwähnte kosmetische Material fallen unter anderem verschiedene Arten von Hautcreme, Hautmilch, Reinigungscreme, Reinigungslotion, Reinigungsmilch, kühlender Creme, Cremeseife, Makeup-Grundierung, Gesichtswasser, Körpermilch, Gesichtspackungen, Zinklotion, Mischhautmattierung, Handcreme, mattierendem Puder, aufhellendem Puder, Seifenpulver, Seifenstücken, Transparentseife, Lippencreme, Lippenstift, Nährlotion, Creme-Makeup, Gesichtspuder, Lidschatten in Pulverform, Puder-Makeup, Nagellackentferner, Haarwasser, Hair Liquid, Haarcreme, Haarbehandlungsmitteln, Kopfhautbehandlungsmitteln, Shampoo, Haarspülung, Haarspray, Sonnenöl, Sunblocker, Rasierschaum, Rasiercreme, Babyöl und so weiter.
- Die Erfindung wird mit den nachfolgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen weiter erläutert.
- 2,5 g Dextran (mittleres Molekulargewicht 4 x 10&sup4;) wurden in 50 ml Wasser aufgelöst. Dieser Lösung wurde eine Lösung von 1,3,5-Trichlortriazin (Cyanursäuretrichlorid) (1 g) in einem Lösungsmittelgemisch von Wasser und Aceton (Volumenverhältnis 0,5 : 2,5) tropfenweise bei Zimmertempertur während 8 Minuten zugegeben, während das System auf einem pH-Wert von 7,5 bis 9,5 gehalten wurde. Die pH-Wert-Einstellung wurde mit 1 N NaOH vorgenommen. Nach Beendigung der tropfenweisen Zugabe wurde das Reaktionssystem mit 0,1 N HCl auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und in 500 ml Aceton gegossen. Die sich ergebenden Kristalle wurden durch Filtration gewonnen und mit Aceton gewaschen, um aktiviertes Dextran zu erhalten.
- Dann wurden 20 mg einer von Bacillus licheniformis stammenden Protease (Esperase, hergestellt von Novo) in 10 ml 0,1 M Boratpuffer (pH=9,2) gelöst und anschließend 0,2 g des vorgenannten aktivierten Dextrans zugegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei 4 ºC umgesetzt. Dieses Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden lang bei 62 ºC mit 40 mg Glycin behandelt, und nach Ablauf dieser Zeit wurde die Lösung einer Ultrafiltration unterzogen, gereinigt, konzentriert und lyophilisiert. Das so erhaltene gefriergetrocknete Pulver wurde 2 Stunden lang bei 105 ºC hitzesterilisiert.
- Der Anteil modifizierter Oberflächenaminogruppen (bestimmt nach der vorstehend beschriebenen Methode) betrug 75 %, und der Prozentsatz der verbliebenen Enzymaktivität betrug 65 %.
- Die Schritte von Beispiel 1 wurden wiederholt, jedoch wurde statt Dextran Pullulan (mittleres Molekulargewicht: 50.000) verwendet, und als Protease wurde Bioprase (hergestellt von Nagase Biochemical) verwendet, um die modifizierte Protease zu erhalten.
- Der Anteil modifizierter Oberflächenaminogruppen der vorgenannten modifizierten Protease betrug 79 %, die verbliebene Aktivität 62 %.
- Die Schritte von Beispiel 1 wurden wiederholt, jedoch wurde statt Dextran Methylcellulose verwendet, um die modifizierte Protease zu erhalten.
- Der Anteil modifizierter Oberflächenaminogruppen der vorgenannten Protease betrug 68 %, die verbliebene Aktivität 67 %.
- Die Schritte von Beispiel 1 wurden wiederholt, jedoch wurde statt Dextran Inulin (mittleres Molekulargewicht: 50.000) verwendet, und als Protease wurde Bioprase verwendet, um die modifizierte Protease zu erhalten.
- Der Anteil modifizierter Oberflächenaminogruppen der vorgenannten Protease betrug 71 %, die verbliebene Aktivität 45 %.
- In 30 ml wasserfreiem Acetonitril wurden 5,0 g Monomethoxypolyethylenglykol (mittleres Molekulargewicht: 5.000) und 0,6 g p-Nitrophenylchlorkohlensäureester gelöst und anschließend 0,3 g Triethylamin zugegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei einer Umgebungstemperatur von 25 ºC gerührt, und nach Ablauf dieser Zeit wurden 200 ml Diethylether zugegeben. Das Gemisch wurde zur Auskristallisation 24 Stunden lang bei 4 ºC stehengelassen. Die entstandenen Kristalle wurden durch Filtration abgetrennt, aus einem Lösungsmittelgemisch von Diethylether/Acetonitril umkristallisiert, gründlich mit Diethylether gewaschen und unter verringertem Druck getrocknet, um 4,5 g aktiviertes Polyethylenglykol in Form weißer Kristalle zu erhalten.
- Dann wurden 50 mg derselben Protease, wie sie für Beispiel 1 verwendet wurde, in 20 ml 75 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,8) gelöst und anschließend 100 mg des vorgenannten aktivierten Polyethylenglycols zugegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei 4 ºC gerührt. Dieses Reaktionsgemisch wurde 5 Stunden lang mit 100 mg Glycin behandelt und dann durch Ultrafiltration gereinigt, konzentriert und lyophilisiert.
- Die verbliebene Aktivität der so erhaltenen modifizierten Protease betrug 28%.
- In 25 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) wurden 50 mg derselben Protease gelöst, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, und anschließend wurden 1,5 ml einer 1,4-prozentigen wäßrigen Glutaraldehydlösung bei Zimmertemperatur tropfenweise während 25 Minuten unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang weiter gerührt, und nach Ablauf dieser Zeit wurden 10 mg Glycin zugegeben. Nach Durchführung dieser Behandlung während 5 Stunden wurden für eine Reduktionsreaktion 10 mg Natriumborhydrid zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde durch Ultrafiltration gereinigt, konzentriert und lyophilisiert.
- Die verbliebene Aktivität dieser modifizierten Protease betrug 48 %.
- In 20 ml Wasser wurden 200 mg Carboxymethylcellulose gelöst, und die Lösung wurde mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 4,75 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden 380 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid und 20 mg derselben Protease, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, zugegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 4 ºC gerührt. Diesem Reaktionsgemisch wurden 120 ul Essigsäure und 120 ul Monoethanolamin zugesetzt, und das Gemisch wurde 20 Minuten lang gerührt. Abschließend wurde die Lösung durch Ultrafiltration gereinigt, konzentriert und lyophilisiert.
- Die verbliebene Aktivität dieser modifizierten Protease betrug 52 %.
- In 100 ml Wasser wurden 0,5 g desselben Dextrans wie bei Beispiel 1 aufgelöst, und anschließend wurden 0,32 g Natriumperiodat zugegeben. Das Gemisch wurde 5 Stunden lang bei 50 ºC umgesetzt. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 50 ml Ethylenglykol gestoppt, und das nicht umgesetzte Material wurde mittels Ultrafiltration entfernt. Das Filtrat wurde mit 75 mmol Phosphatpuffer (pH 7,8) gewaschen und auf 10 ml konzentriert. Diesem Konzentrat wurden 50 mg derselben Protease wie bei Beispiel 1 zugesetzt, und die Umsetzung wurde 24 Stunden lang bei 4 ºC durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit NaBH&sub4; chemisch reduziert, und das Reaktionsprodukt wurde mittelts Ultrafiltration gereinigt, konzentriert und lyophilisiert.
- Die Restaktivität dieser modifizierten Protease betrug 45 %.
- In Tabelle I sind die Bewertungsergebnisse für Wärmebeständigkeit, Hautreizungspotential und Antigenität der Produkte gemäß den Beispielen 1 bis 4 und den Vergleichsbeispielen 1 bis 4 zusammengefaßt. Wärmebeständigkeit, Hautreizungspotential und Antigenität eines jeden Produkts wurden mit den folgenden Methoden ermittelt:
- Eine Probe einer modifizierten Protease wurde in 50 mmol Phosphatpuffer (pH 6,8) aufgelöst, bis eine Konzentration von 0,5 mg Protein/ml erreicht war. Diese Probenlösung wurde 6 Stunden lang bei 60 ºC inkubiert, und dann wurde die Enzymaktivität in der Probenlösung ermittelt.
- Es wurde ein Hautüberempfindlichkeitstest nach der Maximierungsmethode (Bertil, M. und Albert, M.K.; J. Invest. Derm. 52 (3), 268, 1969) durchgeführt. Die Expositionskonzentration betrug sowohl für die intakte als auch für die modifizierte Protease 0,05 Gewichtsprozent Protein. Das Hautreizungspotential wurde ausgedrückt als Mittelwert, der sich aus folgender Gleichung errechnet:
- Mittelwert =Σ Reaktionsintensität (0-5) / Anzahl Versuchstiere
- Zu 0,4 ml einer Lösung modifizierter Protease mit einer bestimmten Konzentration (0,3 mg Protein/ml) wurden 0,4 ml eines getrennt bereitgestellten Antiserums hinzugegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 30 ºC inkubiert. Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen, dreimal mit 1-ml-Mengen von 75-mmol-Phosphatpuffer (pH 7,8) gewaschen und in 3 ml 0,1 N-NaOH gelöst. Unter Verwendung dieser Lösung wurde die dekadische Extinktion bei 285 nm gemessen. Auf der Grundlage des Extinktionswerts wurde die Antigenität der Probe nach folgenden Kriterien geschätzt: dekadische Extinktion Antigenität Tabelle 1 Restaktivität (%) Wärmebeständigkeit (%) *1 Hautreizungspotential *2 Antigenität unmodifiziert Beispiel Vergleichsbeispiel *1: Die modifizierte Protease wurde warmebehandelt und die Restaktivität in Prozent bestimmt. *2: Mittelwert
- Wie aus den vorstehenden Ergebnissen zu ersehen ist, waren bei allen modifizierten Proteasen gemäß den Beispielen für die Erfindung, bei denen an die Protease über einen Triazin-Ring ein Polysaccharid gebunden ist, im Vergleich zu den Produkten gemäß den Vergleichsbeispielen die Wärmebeständigkeit deutlich verbessert und die Antigenität sowie das Hautreizungspotential unterdrückt. Außerdem zeichnen sich die Beispielprodukte durch eine geringere Aktivitätseinbuße durch die Modifikation und damit eine höhere Aktivität aus.
- Es wurden modifizierte Proteasen entsprechend der Arbeitsweise von Beispiel 1 hergestellt, jedoch wurde jeweils ein anderes Dextran genommen, wie in Tabelle 2 angegeben und das Gewichtsverhältnis aktiviertes Dextran/Protease wurde ebenfalls wie in Tabelle 2 angegeben verändert. Ferner wurde zur Synthese des aktivierten Dextrans eine Lösung von 1 g Cyanursäuretrichlorid in 30 ml Aceton verwendet. Der Gehalt des aktivierten Dextrans an reaktivem Chlor betrug 1,0 mmol/g und der Gehalt der Protease an reaktiven Aminogruppen betrug 0,9 mmol/g. Der Modifikationsgrad der Oberflächenaminogruppen, die Restaktivität, die Wärmebeständigkeit und das Hautreizungspotential der wie vorstehend erhaltenen modifizierten Proteasen wurden mit den nachstehend beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 wiedergegeben.
- Der Gehalt an reaktivem Chlor wurde gemäß nachstehendem Verfahren bestimmt.
- Es wurden 100 mg einer jeden Probe in 4 ml Wasser gelöst und anschließend 1 ml 0,5 M NaHCO&sub3; zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 100 ºC wärmebehandelt. Nach Ablauf dieser Zeit wurden 0,5 ml einer 7-prozentigen wäßrigen Chromsäurelösung zugesetzt. Nach Verdünnung mit Wasser wurde Chlor mit 0,1 N wäßriger Silbernitratlösung titriert. (Das Ergebnis wurde ausgedrückt als V&sub1; ml). Zur Gegenprobe wurde bei Proben ohne Alkalibehandlung eine ähnliche Titration vorgenommen. (Das Ergebnis wurde ausgedrückt als V&sub0; ml.) Um einen Schätzwert für den Gehalt an reaktivem Chlor zu erhalten, wurde die äquivalente Chlormenge durch Bildung der Differenz V&sub1; - V&sub0; errechnet. Tabelle 2 aktiviertes Dextran /Protease mittleres Molekulargewicht von Dextran (× 10&sup4;) Modifikationsgrad der Oberflächenaminogruppen (%) Restaktivität (%) Wärmebeständigkeit *1 (%) Hautreizungspotential *2 Beispiel *1: Die modifizierte Protease wurde wärmebehandelt und die Restaktivität in % gemessen. *2: Mittelwert
- Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß durch Wahl des geeigneten Reaktionsverhältnisses von aktiviertem Dextran zu Protease die Wärmebeständigkeit der modifizierten Protease beachtlich verbessert werden kann und ihr Hautreizungspotential entweder beträchtlich reduziert oder ganz beseitigt werden kann.
- Die nach den Beispielen 1 bis 4 und den Vergleichsbeispielen 1 bis 4 hergestellten modifizierten Proteasen wurden jeweils in Gegenwart von 10 % eines Tensids auf ihre Wärmebeständigkeit untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben. Tabelle 3 Restaktivität (%) Tensid * nicht verwendet Triron X-100 MES-7H Proteasetyp unmodifiziert 12 10 7 Beispiel Vergleichsbeispiel *: Triron X-100 (hergestellt von Wako Pure Chemical) MES-7H (hergestellt von Nippon Shokubai Kagaku)
- Aus vorstehender Tabelle ist zu ersehen, daß die modifizierte Protease (Beispiel-Produkte), bei der ein Polysaccharid über einen Triazin-Ring an die Protease gebunden ist, unterschiedslos eine hohe Wärmebeständigkeit zeigt, sogar in Gegenwart von Tensiden.
- In 2,5 l Wasser wurden 125 g desselben Dextrans gelöst wie bei Beispiel 1. Dieser Lösung wurde eine Lösung von 25 g Cyanursäuretrichlorid in 625 ml Aceton tropfenweise bei Zimmertemperatur während einer Dauer von 8 Minuten zugesetzt, wobei der pH-Wert des Systems mit 1 N NaOH auf 7 bis 9 eingestellt wurde. Nach Beendigung der tropfenweisen Zugabe wurde das Reaktionsgemisch mit 0,1 N HCl auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und in 20 l Aceton gegossen. Die sich ergebenden Kristalle wurden durch Filtration gewonnen und mit Aceton gewaschen, um 144 g aktiviertes Dextran zu erhalten.
- 9 g dieses aktivierten Dextrans wurden in 90 ml Wasser gelöst. Dieser Lösung wurde eine Lösung von 1 g derselben Protease wie bei Beispiel 1 in 10 ml Wasser zugesetzt; anschließend wurden 100 ml 0,2 M Boratpuffer (pH=9,2) zugesetzt. Das Gemisch wurde 18 Stunden lang bei 25 ºC umgesetzt.
- Dann wurden 1,2 g Glycin in dieser wäßrigen Lösung modifizierter Protease gelöst, und die Lösung wurde in 40-ml-Portionen aufgeteilt. Diese Portionen wurden während der nachstehend in Tabelle 4 angegebenen Zeitabschnitte bei 60 ºC wärmebehandelt, und jede behandelte Lösung wurde 4 Mal ultrafiltriert, um niedermolekulare Verunreinigungen zu entfernen, konzentriert und lyophilisiert, um ein braunes Pulver zu erhalten.
- Die Produkte der Beispiele 11 bis 13 wurden 7 Tage lang einer trockenen Wärmebehandlung bei 60 ºC unterworfen; anschließend wurden Aktivität, Chlorgehalt, Modifikationsverhältnis der Oberflächenaminogruppen und Hautreizungspotential eines jeden behandelten Produkts bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben. Der Chlorgehalt wurde mittels Röntgenfluoreszenzspektroskopie unter Verwendung einer aus 100 mg der pulverförmigen Probe geformten Scheibe bestimmt. Die übrigen Parameter wurden mit den oben beschriebenen Methoden bestimmt. Tabelle 4 Dauer der Wärmebehandlung (Std.) Aktivitätsergebnis *1 (%) Modifikationsverhältnis der Oberflächenaminogruppen (%) Chlorgehalt (ppm) Hautreizungspotential Pulver nach 7 Tagen Wärmebehandlung bei 60 ºC Wasserlöslichkeit Restaktivität (%) *2 Wärmebestandigkeit in waßrigem Medium (%) Beispiel leichte Unlöslichkeit leicht löslich *1: Ergebnis errechtet auf der Grundlage der Aktivität bei Synthese *2: Restaktivität in % bezogen auf Aktivität vor der trockenen Wärmebehandlung
- Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die modifizierte Protease trotz eines hohen Chlorgehalts durch trockene Wärmebehandlung zum Gelieren neigte (Unlöslichkeit in Wasser), wobei die Proben, die durch die thermische Behandlung einen Gehalt an aktivem Chlor von weniger als 500 ppm hatten, kein Gelieren durch die trockene Wärmebehandlung zeigten und wenig von ihrer Aktivität einbüßten. Eine Verminderung von Aktivität und Sensibilisierung wurde nicht bewirkt; eine Abnahme der Wärmebeständigkeit in Gegenwart von Wasser wird nicht beobachtet. Ferner ergibt sich aus den Aktivitätswerten der 24 und 36 Stunden lang wärmebehandelten Proben mit einem Chlorgehalt von weniger als 500 ppm, daß die Abnahme der Aktivität durch die Wärmebehandlung sehr gering ist. Sogar bei Heißluftsterilisation dieser Proben beträgt die Aktivitätsabnahme weniger als 10 % und eine Änderung der physikalischen Eigenschaften wurde überhaupt nicht beobachtet.
- Die Schritte der Beispiele 11 bis 13 wurden wiederholt, jedoch wurde zur Erzeugung einer modifizierten Protease statt Dextran Pullulan (mittleres Molekulargewicht: 5 x 10&sup4;) verwendet. Nach Zugabe von Glycin wurde 24 Stunden lang eine Inaktivierungsbehandlung der aktiven Chlorgruppen des Triazin-Rings bei 63 ºC durchgeführt; anschließend erfolgte eine Reinigung durch Ultrafiltration und Lyophilisierung, um 9,5 g einer fertigen modifizierten Protease zu erhalten. Die Aktivitätsausbeute betrug 62 %, der Chlorgehalt 175 ppm. Eine Hautreizung war nicht gegeben, und der Mittelwert betrug Null. Bei einem Lagerbeständigkeitstest nach sechsmonatiger Lagerung des erhaltenen Produkts bei 40 ºC ergab sich eine gute Löslichkeit im Phosphatpuffer (pH 6,8); eine Aktivitätsabnahme wurde nicht beobachtet. Ferner betrug nach dem Test die Restaktivität bei der Ermittlung der Wärmebeständigkeit in Gegenwart von Wasser (60 ºC x 6 Stunden) 99 %. Es wurde keine Änderung beobachtet.
- Es wurden 125 g desselben Dextrans wie bei Beispiel 1 in 2,5 l Wasser gelöst. Diese Lösung wurde mit in 600 ml Aceton gelöstem Cyanursäuretrichlorid bei den in nachstehender Tabelle 5 angegebenen Bedingungen umgesetzt. Die pH- Wert-Einstellung wurde mit 1N NaOH vorgenommen; der Temperaturbereich betrug 18 bis 22 ºC. Nach tropfenweiser Zugabe wurden 0,1N HCl zugegeben, um den pH- Wert 3 zu erhalten, und das Ergebnis wurde zu 20 l Aceton gegeben, um die ausgefällten Kristalle abzufiltrieren und mit Aceton zu reinigen, um ein aktives Dextran zu erhalten.
- Dann wurden 10 g des vorstehenden aktiven Dextrans in 100 ml Wasser gelöst, und es wurde dieselbe Protease wie bei Beispiel 1, aufgelöst in 10 ml Wasser, zugegeben; weiterhin wurden 100 ml 0,2M-Boratpuffer (pH 9,2) zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 Stunden lang bei 25 ºC umgesetzt. Hier wurde die Protease mit 0,06 mmol/g reakiven Aminogruppen verwendet, um zu erreichen, daß das Molverhältnis von Gehalt an reaktivem Chor im aktiven Dextran zu reaktiven Aminogruppen der Protease 10 betrug.
- Nach vorstehender Modifikationsreaktion wurden 1,3 g Glycin zugegeben und im Reaktionsgemisch gelöst. Es schlossen sich eine 30-stündige Wärmebehandlung bei 60 ºC und jeweils eine viermalige Reinigung durch Ultrafiltration zur Entfernung niedermolekularer Substanzen sowie eine Konzentrierung und Lyophilisierung an, um ein hellbraunes Pulver zu erhalten.
- Diese pulverförmige modifizierte Protease wurde mit den vorerwähnten Methoden auf Aktivität, Modifikationsverhältnis der Proteinoberflächenaminogruppen, Hautreizung und Stabilität im wäßrigen Medium untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 wiedergegeben. Tabelle 5 Cyanursäuretrichlorid (g) Dauer der tropfenweisen Zugabe von Cyanursäuretrichloridlösung (min) Gehalt an reaktiven Chlor im aktiven Polysaccharid (mmol/g) Modifikationsverhältnis der Oberflächenaminogruppen (%) Hautreizungspotential Aktivitätsausbeute (%) Restaktivität (%) in waßrigem Medium Monate Beispiel *: Bei obigem Beispiel 15 wurde als Lösungsmittel für das Cyanursäuretrichlorid ein Gemisch von Wasser/Aceton (Volumenverhaltnis 1:2) verwendet.
- Aus den vorstehenden Ergebnissen ist zu ersehen, daß eine modifizierte Protease, die hinsichtlich Stabilität im wäßrigen Medium und Hautreizung hervorragend ist, hergestellt werden kann, wenn der Gehalt an reaktivem Chlor im aktiven Dextran 0,4 bis 1,2 mmol/g beträgt.
- 10 g von wie bei Beispiel 16 hergestelltem aktivem Dextran wurden in 100 ml Wasser gelöst, und es wurde wie bei den Beispielen 15 bis 18 zur Umsetzung Protease zugegeben. Es wurde eine Protease mit einem Gehalt an reaktiven Aminogruppen von 0,72 mmol verwendet, und das Verhältnis von Gehalt an reaktivem Chlor zu Gehalt an reaktiven Aminogruppen wurde so gewählt, wie in Tabelle 6 angegeben.
- Die ermittelten Eigenschaften der verschiedenen so erhaltenen modifizierten Proteasen sind ebenfalls in Tabelle 6 wiedergegeben. Tabelle 6 reaktives Chlor/reaktive Aminogruppen Modifikationsverhältnis Oberflächenaminogruppen (%) Hautreizungspotential (%) Aktivitätsausbeute (%) Restaktivität im wäßrigen Medium (%) Beispiel
- Aus den vorstehenden Ergebnissen ist zu ersehen, daß eine modifizierte Protease, die hinsichtlich Stabilität und Sicherheit ausgezeichnet ist, hergestellt werden kann, wenn das Molverhältnis von Gehalt an reaktivem Chlor zur Menge der reaktiven Aminogruppen nicht unter zwei liegt. Wenn dieser Wert nicht unter fünfliegt, können weitere bevorzugte Ergebnisse erzielt werden.
- Es wurde eine modifizierte Protease wie bei den Beispielen 15 bis 18 hergestellt. Jedoch wurden die zur Herstellung von aktivem Dextran verwendete Menge an Cyanursäuretrichlorid, der Reaktions-pH-Wert und die Reaktionsdauer so gewählt, wie in Tabelle 7 angegeben. Es wurde eine Protease mit einem Gehalt an reaktiven Aminogruppen von 0,55 mmol/g verwendet. Bei der Modifikationsreaktion wurde die achtfache Menge aktives Dextran im Gewichtsverhältnis zur Protease verwendet.
- Die für die so erhaltene modifizierte Protease ermittelten Werte sind in Tabelle 7 wiedergegeben. Tabelle 7 Cyanursäuretrichlorid (g) Dauer der tropfenweisen Zugabe von Cyanursäuretrichloridlösung (min) Gehalt an reaktiven Chlor im aktiven Polysaccharid (mmol/g) Modifikationsverhältnis der Oberflächenaminogruppen (%) Hautreizungspotential Aktivitätsausbeute (%) Restaktivität (%) in waßrigem Medium Monate Beispiel
- Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß durch geeignete Wahl der Synthesereaktionsbedingungen für das aktive Dextran eine modifizierte Protease von ausgezeichneter Stabilität und Sicherheit erzielt werden kann.
- Nur 0,2 % der bei Beispiel 25 erhaltenen modifizierten Protease wurden mit verschiedenen basischen Gemischen, wie in Tabelle 8 angegeben, gemischt und sechs Stunden lang bei 60 ºC thermisch behandelt. Bei der behandelten modifizierten Protease wurden die Aktivität bestimmt und die Stabilität im Vergleich zur unmodifizierten Protease ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 wiedergegeben. Tabelle 8 Restaktivität (%) Beispiele unmodifiziert Tween 20 *1 Hyaluronsäure M-Phosphatpuffer Ethanol Glycerin *1: Tween 20 (hergestellt von Wako Pure Chemical)
- Aus vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß bei verschiedenen Musterprodukten die erfindungsgemäße modifizierte Protease gemäß den Beispielen hervorragende Stabilität zeigt.
- Beispiele für kosmetische Zusammensetzungen, in denen die erfindungsgemäße modifizierte Protease verwendet wird, werden nachstehend beschrieben.
- Gesichtswasser mit der nachstehend angegebenen Formulierung wurde auf die übliche Weise hergestellt. Formulierung des Gesichtswassers Gewichtsteile modifizierte Protease von Beispiel 17 Natriumhyaluronsäure Polyoxyethlensorbitanmonolaurat (20 E.0.) Parfüm Blue-1 gereinigtes Wasser geringe Menge Rest
- Die Schritte von Beispiel 27 wurden wiederholt, jedoch wurde zur Herstellung des Gesichtswassers statt der modifizierten Protease nach Beispiel 17 die modifizierte Protease von Beispiel 22 genommen.
- Die Schritte von Beispiel 27 wurden wiederholt, jedoch wurde zur Herstellung des Gesichtswassers statt der modifizierten Protease nach Beispiel 17 die modifizierte Protease von Beispiel 1 genommen.
- Die Schritte von Beispiel 27 wurden wiederholt, jedoch wurde zur Herstellung des Gesichtswassers statt der modifizierten Protease nach Beispiel 17 die modifizierte Protease von Beispiel 2 genommen.
- Die Schritte von Beispiel 27 wurden wiederholt, jedoch wurde zur Herstellung des Gesichtswassers statt der modifizierten Protease nach Beispiel 17 unmodifizierte Protease genommen.
- Die Schritte von Beispiel 27 wurden wiederholt, jedoch wurde zur Herstellung des Gesichtswassers statt der modifizierten Protease nach Beispiel 17 immobilisierte Protease verwendet, die wie nachstehend beschrieben hergestellt wurde.
- In 20 Teilen Wasser wurden 20 Teile Calciumchlorid gelöst. Die Lösung wurde mit 80 Teilen Methanol vermischt. Dann wurden 5 Teile Nylonpulver (mittlerer Teilchendurchmesser: 6 bis 10 um) zugesetzt. Das Gemisch wurde dispergiert und 30 Minuten lang bei 50 ºC gerührt. Nach der Ernte und dem Waschen mit Wasser wird es in 100 Teile 3,5 M HCl getaucht und 50 Minuten lang bei 45 ºC gerührt. Nach dem Waschen mit Wasser wird es in 50 Teile 0,1 M Natriumboratpuffer (pH 8,5), der 10 % Glutaraldehyd enthält, getaucht und anschließend mit demselben Puffer gewaschen. Das behandelte Pulver wurde 50 Teilen 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5), der 1 Teil derselben Protease wie bei Beispiel 1 enthielt, zugesetzt. Das Gemisch wurde 5 Stunden lang bei 10 ºC umgesetzt und dann mit Wasser gewaschen, um eine an einen Träger gebundene pulverförmige immobilisierte Protease zu erhalten.
- Bei den Produkten der Beispiele 27 bis 30 und der Vergleichsbeispiele 5 bis 6 wurden die Wärmebeständigkeit, die Antigenität, die Hautreizung, praktische Eigenschaften und die Lagerungsbeständigkeit gemessen und bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefaßt. Von den genannten Eigenschaften wurden die Wärmebeständigkeit, die Antigenität und die Hautreizung mit den vorerwähnten Methoden und andere Eigenschaften mit den nachstehend erwähnten Methoden ermittelt.
- Der Praxistest wurde einmal täglich von 20 Prüfpersonen an drei aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. Die Prüfpersonen haben einen Fragebogen mit den nachstehenden Positionen ausgefüllt.
- (1) Einfache Anwendung:
- Zahl, die angab, daß die Anwendung einfach war
- (2) Rauheit bei Anwendung:
- Zahl, die angab, daß bei Anwendung ein Rauheitsgefühl festgestellt wurde
- (3) Gefühl der Reizung nach der Anwendung:
- Zahl, die angab, daß nach der Anwendung auf der Haut oder auf der Kopfhaut ein Gefühl der Reizung festgestellt wurde
- (4) Glätte nach der Anwendung:
- Zahl, die angab, daß Haut oder Haar nach der Anwendung glatt wurden
- (5) Glanz nach der Anwendung:
- Zahl, die angab, daß nach der Anwendung Haut oder Haar glänzend waren.
- Die Proben wurden versiegelt, in ein Bad mit gleichbleibender Temperatur von 40 ºC gegeben und so drei Monate lang gegen Licht abgeschirmt belassen; anschließend wurden Farb- und Geruchsveränderungen erfaßt. Tabelle 9 Beispiele Vergleichsbeispiele Wärmebeständigkeit (%) Antigenität Hautreizungspotential praktische Eigenschaften einfache Anwendung Rauheit bei Anwendung Gefühl der Reizung Glätte nach der Anwendung Glanz nach der Anwendung Tabelle 9 Fortsetzung Beispiele Vergleichsbeispiele Lagerbeständigkeit Farbänderung Geruchsänderung keine leicht gelb
- Aus vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß alle Beispiel-Produkte den Produkten der Vergleichsbeispiele in mehreren Merkmalen überlegen sind.
- Hautcreme nachstehender Formulierung wurde wie folgt hergestellt: Formulierung der Hautcreme Gewichtsteile modifizierte Protease von Beispiel 17 Ölphase Flüssigparaffin Cetylalkohol Polyoxyethylensorbitanmonooleat (20 E.O.) Wasserphase Maltit gereinigtes Wasser Methylparaben (Methyl-p-oxybenzoat)
- Die genannten Ölphasenbestandteile wurden durch Erwärmen auf 80 ºC gleichmäßig aufgelöst, und zu den aufgelösten Ölphasenbestandteilen wurden die genannten Wasserphasenbestandteile zugegeben, die ebenfalls durch Erwärmen auf 80 ºC gleichmäßig aufgelöst wurden. Das Gemisch wurde unter Rühren auf 40ºC abgekühlt, um die modifizierte Protease zuzugeben. Nach Zusatz der modifizierten Protease wurde das Gemisch auf 30 ºC abgekühlt, um die gewünschte Hautcreme zu erhalten.
- Haarcreme mit nachstehender Formulierung wurde wie folgt hergestellt: Formulierung der Haarcreme Gewichtsteile modifizierte Protease von Beispiel 22 Ölphase Octyldodecylmyristat Cetylalkohol Sorbitansesquistearat Wasserphase Glycerin Polyoxyethylensorbitanmonooleat (20 E.O.) Methylparaben (Methyl-p-oxybenzoat) gereinigtes Wasser 34,4
- Die genannten Ölphasenbestandteile werden durch Erwärmen auf 80 ºC gleichmäßig aufgelöst. Zu den gelösten Ölphasenbestandteilen wurden die vorgenannten Wasserphasenbestandteile hinzugegeben, die ebenfalls durch Erwärmen auf 80 ºC gleichmäßig aufgelöst wurden. Das Gemisch wurde unter Rühren auf 40 ºC abgekühlt, um die modifizierte Protease hinzuzugeben. Nach Zugabe der modifizierten Protease wurde das Gemisch auf 30 ºC abgekühlt, um die gewünschte Haarcreme zu erhalten.
- Reinigungsmilch mit nachstehender Formulierung wurde wie folgt hergestellt: Formulierung der Reinigungsmilch Gewichtsteile modifizierte Protease von Beispiel 1 Ölphase Flüssigparaffin Glycerinmonostearat Cetylalkohol Sorbitansesquistearat Wasserphase Natriumcetyl sulfat Sorbitol gereinigtes Wasser
- Die genannten Ölphasenbestandteile wurden durch Erwärmen auf 80 ºC gleichmäßig gelöst. Zu den gelösten Ölphasenbestandteilen wurden die angegebenen Wasserphasenbestandteile hinzugegeben, die ebenfalls durch Erwärmen auf 80 ºC gleichmäßig gelöst wurden. Das Gemisch wurde vor Zugabe der modifizierten Protease unter Rühren auf 40 ºC abgekühlt. Nach Zugabe der modifizierten Protease wurde das Gemisch auf 30 ºC abgekühlt, um die gewünschte Reinigungsmilch zu erhalten.
- Cremeseife mit nachstehender Formulierung wurde wie folgt hergestellt: Formulierung der Cremeseife Gewichtsteile modifizierte Protease von Beispiel 2 Wasserphase Natriummyristat Natriumlaurat Glycerin gereinigtes Wasser
- Die genannten Wasserphasenbestandteile wurden durch Erwärmen auf 80 ºC während einer Stunde gleichmäßig aufgelöst. Die gelösten Wasserphasenbestandteile wurden unter Rühren abgekühlt. Die modifizierte Protease wurde bei 40 ºC hinzugegeben, und das Gemisch wurde auf 30 ºC abgekühlt, um die gewünschte Cremeseife zu erhalten.
- Ein gewünschtes Puder-Make-up wurde durch Verrühren und gleichmäßiges Vermischen von Materialien nachstehender Formulierung erhalten. Formulierung des Puder-Make-up Gewichtsteile Talkum Sericit Titanoxid Mica Farbpigment modifizierte Protease von Beispiel 10
- Die kennzeichnenden Eigenschaften und die Lagerfähigkeit wurden mittels obenerwähnter Methoden bestimmt und bewertet. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 10 zusammengefaßt. Tabelle 10 Beispiele praktische Eigenschaften Lagerfähigkeit einfache Anwendung Rauheit bei Anwendung Gefühl der Reizung nach der Anwendung Glätte nach der Anwendung Glanz nach der Anwendung Farbänderung Geruchsänderung keine
- Aus vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die modifizierten Beispiel- Proteasen sowohl bei den Gebrauchseigenschaften als auch bei der Lagerfähigkeit durchweg zufriedenstellend sind.
- Dadurch, daß die erfindungsgemäße modifizierte Protease eine Protease ist, die über einen Triazin-Ring an ein Polysaccharid gebunden ist, wurden ihre Antigenität und ihr Hautreizungspotential weitgehend oder vollständig unterdrückt und ihre Wärmebeständigkeit deutlich verbessert. Ferner zeigt die modifizierte Protease durch einen geringeren Aktivitätsverlust durch die Modifikation außerordentlich hohe Aktivität. Da ihre Stabilität auch in Gegenwart hoher Tensidkonzentrationen nicht beeinträchtigt wird, gibt es für die erfindungsgemäße modifizierte Protease zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten.
- Die erfindungsgemäße kosmetische Zusammensetzung, die die vorbezeichnete stabile und sichere modifizierte Protease enthält, ist einfach in der Anwendung, reizt die Haut nicht und löst keine allergischen Reaktionen aus. Bei der Lagerung treten keine Geruchs- oder Farbveränderungen auf. Beim Auftragen auf die Haut entfernt die modifizierte Protease außerdem die gealterte Hornschicht, glättet so die Haut und entfaltet damit eine echte kosmetische Wirkung.
Claims (10)
1. Modifizierte Protease, umfassend eine von einem Bacillus-Organismus
stammende Protease, die über einen Triazin-Ring an ein Polysaccharid
gebunden ist.
2. Modifizierte Protease nach Anspruch 1, bei dar die Menge des am Triazin-
Ring hängenden atomaren Halogens nicht mehr als 500 ppm beträgt.
3. Verfahren zum Herstellen einer modifizierten Protease, mit den Schritten,
daß man ein Polysaccharid mit Cyanursäuretrichlorid zur Bildung eines an
einen Triazin-Ring gebundenen Polysaccharids umsetzt und dann dieses an
einen Triazin-Ring gebundene Polysaccharid mit einer von einem Bacillus-
Organismus stammenden Protease umsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem man nach der Reaktion des an einen
Triazin-Ring gebundenen Polysaccharids mit der Protease das
Reaktionsprodukt in einer wäßrigen Lösung einer eine Aminogruppe aufweisende
niedermolekularen Verbindung einer Wärmebehandlung unterzieht, um die
Menge des am Triazin-Ring hängenden atomaren Halogens auf nicht mehr als
500 ppm einzustellen.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, bei dem beim Umsetzen des an einen
Triazin-Rings gebundenen Polysaccharids mit der Protease der reagierende
Chlorgehalt des an einen Triazin-Ring gebundenen Polysaccharids im
Bereich von 0,4 bis 1,2 mmol/g liegt und das Molverhältnis des reagierenden
Chlors des an einen Triazin-Ring gebundenen Polysaccharids zu den
reagierenden Aminogruppen der Protease nicht weniger als 2:1 beträgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, bei dem beim Umsetzen des an
einen Triazin-Rings gebundenen Polysaccharids mit der Protease das
Gewichtsverhältnis des an einen Triazin-Ring gebundenen Polysaccharids zur
Protease nicht weniger als 3:1 beträgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, bei dem man beim Umsetzen des
Polysaccharids mit Cyanursäuretrichlorid das Cyanursäuretrichlorid in
einem nichtwäßrigen polaren Lösemittel löst, welches gegenüber
Cyanursäuretrichlorid inert ist und das Polysaccharid in Wasser löst und das
Polysaccharid und das Cyanursäuretrichlorid in einem Gewichtsverhältnis von
1:0,5 bis 1:0,1 umsetzt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Lösemittel, in dem
Cyanursäuretrichlorid gelöst wird, Aceton ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, bei dem man das Umsetzen des
Polysaccharids mit Cyanursäuretrichlorid bei einem pH-Wert zwischen 7,5
und 9,5 durchführt.
10. Kosmetische Zusammensetzung, enthaltend eine modifizierte Protease gemäß
Anspruch 1 oder 2.
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