FI59678B - Diagnostiskt medel foer att paovisa aeggvita i kroppsvaetskor - Google Patents

Description

R3C71 r.i KUULUTUSjutKAisu e o a 7 o 3®· w <">uTiAGCNiMe$s«irr iy6/e 5¾¾ C (45) Tatcnt!:i oy:!nr.: ty 10 o'9 l'-Gl ^ * ' (51) Kv.iic.3/int.ci.3 G 01 N 33/68 SUOMI —FINLAND (21) P«*n«lh*k.mu«-P»t.frtirt»eknln, 760578 (22) HakmnltpUvt —Ameknlnpdag 05.03*76 (23) AlkupUvt·—GHtighutadug 05.03*76 (41) Tullut JulktMksi — Mlvlt effumllg 13.09.76 PMtti. )· rekifterihmllltu· NlhtivUulp»». j. kuuMuHutam

Patunt- och refictontyralMMi AmOkm uttagd och utUkriftan pubHcurud 29-05-81 (32)(33)(31) Pyy*«tty «uo<kMs-B«iird prtoritut 12.03.75

Saksan Li i 11 ot as av alt a-Förbun ds r e pub liken Tyskland(DE) P 2510633.6 (71) Boehringer Mannheim GmbH,, Mannheim-Waldhof, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Walter Rittersdorf, Mannheim-Waldhof, Werner Giithlein, Mannheim-Neckarau, Wolfgang Werner, Mannheim-Vogelstang, Hans-Georg Rey, Mannheim-Waldhof, Peter Rieckmann, Mannheim-Waldhof, Saksan Liitto-tasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7I*) Berggren Oy Ab (5^) Diagnostinen väline valkuaisaineen osoittamiseksi kehon nesteissä -Diagnostiskt medel för att pdvisa äggvita i kroppsvätskor

Valkuaisaineen osoittamisella kehon nesteissä, varsinkin virtsassa, on tärkeä asema munuaissairauksien diagnostiikassa. Pika-diagnosti-sia välineitä valkuaisaineen osoittamiseksi ja määrittämiseksi virtsassa on siten ollut kehitettyinä jo pitemmän aikaa. Nämä ovat enimmäkseen testipapereita, joihin on imeytetty puskuriainetta ja ns. valkuaisaine-virheindikaattoria. Valkuaisainevirhe-indikaattorit ovat pH-indikaattoreita, joiden pK-arvo siirtyy valkuaisaineiden läsnäollessa. Aina riippuen siitä, mihin suuntaan valkuaisaine siirtää pK-arvoa, on puskurin säädettävä pH-arvo sellaiseksi, että se on pK-arvon ylä- tai alapuolella, edullisesti juuri indikaattorin värin-muutosalueen ulkopuolella. Edullisia ovat sellaiset indikaattorit, jotka kastettaessa valkuaisainetta sisältämättömään virtsaan ovat vähemmän värillisessä muodossa, niin että valkuaisaineen läsnäolo saa aikaan indikaattorin enemmän tai vähemmän täydellisen muuttumisen vahvemman väriseen muotoon, ja tuloksena on siten herkkä värin-muutos. Tunnetuimpia tällaisia valkuaisaine-virheindikaattoreita ovat tetrabromifenoliftaleiinietyyliesteri ja tetrabromifenolisininen 59678 (oktabromifenolisulfoftaleiini). Kirjallisuudessa on kuvattu joukko tällaisia valkuaisainetestipapereita, jotka eroavat toisistaan enimmäkseen vain lisäaineiden, kuten anionisten pinta-aktiivisten aineiden, väriaineiden, epäorgaanisten sulfaattien tms. käytön suhteen, ja joilla yleensä saadaan herkkä valkuaisainenäyttö.

Kaikilla tunnetuilla testipapereilla on kuitenkin pahana haittana, että ne reagoivat virtsassa usein esiintyvien lääkeaineiden metabo-liittien, kuten kiniinin, kinidiinin, resokiinin ja muiden typpipitoisten aineiden, metaboliittien kanssa samalla tavalla kuin valkuaisaineen kanssa.

Keksinnön kohteena on siten sellaisten testipaperien valmistus, joissa näiden typpipitoisten yhdisteiden häiritsevää vaikutusta ei esiinny tai joissa se on niin vähäinen, että se voidaan jättää huomioimatta, ilman että valkuaisaineen osoittamisherkkyyttä samalla vähennetään tunnettuihin testipapereihin verrattuna.

Keksinnön tarkoitus toteutettiin valmistamalla diagnostinen väline valkuaisaineen osoittamiseksi kehon nesteissä, joka väline koostuu imukykyisestä kantajasta, joka on imeytetty valkuaisainevirheen osoittavalla pH-indikaattorilla ja sopivalla puskuriaineella, ja keksinnölle on tunnusomaista, että indikaattori on valittu oktahalo-geenisulfoftaleiineista ja että väline sisältää ainakin yhtä veden kanssa sekoittumatonta, lineaarista tai haarautunutta polypropy-leeniglykolia, jonka molekyylipaino on 500-10000 ja joka voi sisältää vielä muita alempia oksialkyleeniryhmiä.

Imukykyisinä kantajina tulevat kysymykseen varsinkin suodatinpaperi, mutta myös kuitumatto, asbesti tms.

Keksinnössä käytettäviä polypropyleeniglykoleja ovat ennen kaikkea lineaariset polypropyleeniglykolit, edelleen propyleenioksidin ja etyleenioksidin massapolymeerit sekä haarautuneet yhdisteet, joissa propyleenioksidi on polymeroitu moniarvoisen alkoholin, kuten esim. trimetylolipropaanin, glyserolin tai pentaerytritolin kanssa, ja joka on mahdollisesti lisäksi modifioitu etyleenioksidilla. Näiden propyleeniglykolien molekyylipainon tulee olla noin 500-10000.

Tämänkaltaiset polypropyleeniglykolit ovat sinänsä tunnettuja, ja niitä käytetään tekniikassa mitä erilaisimpiin tarkoituksiin, esim.

5 59678 voiteluaineina, hydraulisina nesteinä, liuottimina, polyuretaanien raaka-aineina, pinta-aktiivisina aineina ym.

Kiiden keksinnön mukaista vaikutusta ei voitu ennakoida, ja se oli erittäin yllättävä, sillä tähän ryhmään kuuluvat vesiliukoiset edustajat, kuten esim. polypropyleeniglykoli, jonka molekyylipaino on noin 400, tai puhtaat polyetyleeniglykolit eivät vaikuta halutulla tavalla.

On huomattava, että haluttuja ominaisuuksia omaavia testipaperelta voidaan valmistaa keksinnön mukaisten polypropyleeniglykolien avulla vain käyttäen valkuaisainevirheindikaattoreita oktahalogeenisulfo-ftaleiinien luokasta. Muiden muuten käyttökelpoisten valkuaisaine-virheindikaattorien, kuten esim. tetrabromifenoliftaleiinietyyli-esterin kanssa saadaan testipapereita, joissa reaktio valkuaisaineen kanssa on myös vahvasti heikentynyt. Indikaattoreina tulevat kysy-mukseen seuraavat:

Oktabromifenolisulfoftaleiini (tetrabromifenolisininen), oktakloori-fenolisulfoftaleiini (tetrakloorifenolisininen) sekä sekahalogenoi-dut indikaattorit, esim. 3f,3",5',5"-tetrabromifenoli-3,4,5,6-tet-rakloorisulfoftaleiini, 3',3",5',5"-tetrakloorifenoli-3,4,5,6-tetrabromisulfoftaleiini ja 3',3M-dikloori-5’,5"-dibromifenoli- 3,4,5,6-tetrakloorisulfoftaleiini.

Kolmen ensimmäisen yhdisteen ollessa kirjallisuudesta tunnettuja ovat kolme muuta indikaattoria uusia; ne voidaan kuitenkin valmistaa tunnetuin menetelmin, esim. saattamalla tunnetut tetrahalogeeni-bentseeni-sulfokarbonihappoanhydridit reagoimaan fenolin tai 2-halo-geenifenolien kanssa Lewis-happojen, esim. tina-IV-kloridin, läsnäollessa ja klooraamalla tai bromaamalla syntyneet fenolisulfofta-leiinit inerteissä liuottimissa, esim. kloorilla tai bromilla jää-etikassa.

Erityisen edullisia ovat indikaattorit, joissa on 3',3",5'^"-asemassa 4 klooriatomia, koska typpiemästen häiritsevä vaikutus niihin on vielä heikompi kuin vastaaviin bromattuihin yhdisteisiin.

Valkuaisainetestipaperissa on käytettävä vahvaa puskuria, joka pitää pH:n vakiona kastettaessa paperi kehon nesteeseen, jolla on mahdol- 4 59678 lisesti toinen pH-arvo, niin että indikaattorin värinmuutos johtuu selvästi valkuaisaineen aiheuttamasta pK-arvon siirtymästä eikä pH-arvon muutoksesta. Tavallisesti sulfoftaleiini-indikaattoreita käytettäessä puskurin pH säädetään arvoon, joka on jonkin verran indikaattorin pH-muutosalueen alapuolella, niin että indikaattori on täysin vähemmän värillisessä happamassa muodossa. Parempi herkkyys erittäin pienien valkuaisainepitoisuuksien suhteen saadaan kuitenkin, kun puskurin pH-arvo on indikaattorin muutosalueella. Tämä aiheuttaa kuitenkin sen, että virtsaan kastamisen jälkeen osa indikaattorista on jo muuttunut ja negatiivivärjäys on vaikeampi erottaa heikosta valkuaisainevärj äyksestä.

Toisena odottamattomana ominaisuutena keksinnön mukaisilla polypro-pyleeniglykoleilla on että ne estävät tämän alkavan indikaattorin värinmuutoksen ilman, että herkkyys vakuaisaineen suhteen olennaisesti kärsii.

Indikaattorin "muutosalueella1’ käsitetään yleensä pH-aluetta, joka on puhtaassa vedessä yksikön verran pK-arvon ylä- ja alapuolella. Keksinnön mukaisiin valkuaisainetestipapereihin valitaan tarkoituksenmukaisesti pH-arvoja, jotka ovat alueella noin 1,0 yksiköstä käytetyn indikaattorin pK-arvon alapuolella noin 0,5 yksikköön pK-arvon yläpuolelle. Koska nämä ovat alueella 3»5 - 0, riittää sopivaksi pH- alueeksi noin pH 2,5 - noin pH 4,5· Alemmilla arvoilla esiintyy yleensä valkuaisainereaktion heikkeneminen, korkeammilla arvoilla typpiemästen ja normaalivirtsan reaktion vahvistuminen. Edullinen pH-arvo riippuu indikaattorin ohella keksinnön mukaan käytetystä polypropyleeniglykolin lajista ja muiden reagenssien laadusta, ja se voidaan helposti saada selville yksinkertaisin sarjakokein, joissa pH-arvoa ja puskurimäärää vaihdellaan siten, että indikaattori osoittaa kastamisen jälkeen valkuaisainetta sisältämättömään virtsaan pelkästään puhtaan "happamen" värin.

Puskureina tulevat kysymykseen kaikki, joilla on hyvä puskurikapa-siteetti mainitulla alueella, esim. sitruunahapon, omenahapon, viinihapon jne. seokset alkali- tai ammoniumsuolojensa kanssa.

Vaikka keksinnön mukaisilla polypropyleeniglykoleilla on osittain pinta-aktiivisia ominaisuuksia, voi kuitenkin olla tarkoituksenmukaista lisätä vielä tavallisia tensidejä. Tällöin tulevat kysymyk- 5 59678 seen ennen kaikkea ionittomat pinta-aktiiviset aineet, varsinkin etoksiloidut rasva-alkoholit ja fenolit, joissa on 1-^ oksietyleeni-ryhmää. Anioniset pinta-aktiiviset aineet vahvistavat reaktiota typpiemästen kanssa, kun taas kationiset tensidit saavat aikaan vahvan väärän positiivisen indikaattorireaktion, jollei käytetä erittäin happamia puskureita, jotka estävät valkuaisainereaktion. Nämä molemmat tensidiluokat ovat siten sopimattomia.

Voidaan tietenkin lisätä myös turpoavia aineita tai paksunnosaineita, jotka pystyvät hidastamaan reagenssien tihkumista kastetuista testi-papereista, jolloin on mahdollisesti kokeiltava, sopivatko nämä yhteen puskuriaineiden kanssa. Sopiviksi ovat osoittautuneet esim. hydroksietyyli- ja hydroksipropyyliselluloosa.

Edelleen reagensseihin voidaan lisätä vielä kompleksinmuodostajia, varsinkin magnesiumsulfaattia.

Keksinnön mukaisia polypropyleeneja sekä muita aineosia lisätään impregnointiliuokseen 100 ml:aa kohti seuraavat määrät:

Keksinnön mukaisia polypropyleeniglykoleja 0,5 - 5 g, edullisesti 1 - 2 g; puskuria 10 - 30 g, edullisesti 15 - 20 g; indikaattoria 0,02 - 0,2 g, edullisesti 0,05 - 1,0 g; pinta-aktiivista apuainetta 0,0 - 1,0 g, edullisesti 0,2 - 0,5 g.

Aineosien liuottimina tulevat kysymykseen veden ja alempien alkoholien seokset, joihin kaikki aineosat ovat liukenevia. Voidaan kuitenkin ensin esi-impregnoida puskuri vesiliuoksesta ja sitten jälki-impregnoida muut aineosat orgaanisen liuottimen liuoksesta.

Valmiita testipapereita voidaan käyttää sellaisenaan, tai ne voidaan liimata sinänsä tunnetulla tavalla pitämiin, edullisesti sulkea muovien ja hienosilmäisten verkkojen väliin. Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavilla esimerkeillä, jolloin tehokkuutta typpiemästen suhteen valaistaan sillä, että ilmoitetaan kiniinimäärä, joka värjää kuten 5 mg-ί albumiinipitoisuus (normaalin erottamisen yläraja).

Mitä suurempi tämä määrä siis on, sitä vähemmän kiniini häiritsee koetta. Muiden typpiemästen, kuten esim. kinidiinin, resokiinin, 6 59678 bentsydamiinin jne. häiritsevät vaikutukset ovat samaa suuruusluokkaa kuin kiniinin.

Esimerkki 1

Suodatinpaperi (Schleicher & Schtlll 2316) impregnoidaan peräkkäin seuraavilla kahdella liuoksella ja kuivataan aina 60°C:ssa:

Liuos 1 sitruunahappo, monohydraatti 20 g ammoniakki, 25~#:nen vesiliuos n. 10 ml vesi, tisl. ad. 100 ml

Liuoksen pH säädetään 4,l:ksi.

Liuos 2 3’,3”,5', 5"-tetrakloorifenoli-3,i< »5,6- tetrabromi-sulfoftaleiini (pK = 3,9) 50 mg polypropyleeniglykoli, keskimääräinen mol.p. 1200 (Polyglykol P 1200 (R)) 2 g metanoli ad. 100 ml

Normaalivirtsa antaa testipapereilla keltaisen reaktion ja albumiini-pitoinen virtsa vihreästä sinivihreään väriin, jonka voimakkuus kasvaa .

Virtsat, joiden kiniinipitoisuus on n. 100 mg-# antavat saman vihreän värin kuin virtsat, joissa on 5 mg-# albumiinia.

Testipaperi, jolla on sama koostumus, mutta ilman polypropyleenigly-kolia, reagoi normaalivirtsan kanssa muodostaen vihreän värin. 5 mg-#:lla albumiinia saatu vihreä väri ei ole varmasti erotettavissa tästä negatiiviväristä. Tämän vuoksi verrataan 25 mg-#:n albumiinin aiheuttamaan reaktioon: jo n. 25 mg-# kiniiniä antaa tämän valkuaisai-nemäärän kanssa sekoittuvan tuloksen.

Kaupallisia pikatestejä käytettäessä harhauttavat 2-5 mg-# kiniiniä jo 5 mg-# albumiinimäärän.

Esimerkki 2

Suodatinpaperi (Schleicher & SchUll 2316) impregnoidaan peräkkäin seuraavilla kahdella liuoksella ja kuivataan aina 60°C:ssa: 7 59678

Liuos 1 sitruunahappo, monohydraatti 20 mg ammoniakki, 25_$:nen vesiliuos n. 6 ml vesi, tisl. ad. 100 ml

Liuoksen pH säädetään 3,l:ksi.

Liuos 2 3’,3",5’,5”,3,4,5,6-oktabromifenolisulfoftaleiini (tetrabromifenolisininen, pK = 3,6) 50 mg polypropyleeniglykoli, keskimääräinen mol.p.2000 (Polyglykol P 2000 (R)) 1 g nonyylifenoli, eetteröity 1-2 oksietyleeni- ' tähteellä (Antarox CO 210 (R)) 0,4 g metanoli ad. 100 ml Nämä molemmat liuokset voidaan valmistaa myös käyttäen puolta määrää liuotinta ja yhdistää liuokset ennen impregnointia.

Normaalivirtsalla saadaan testipaperilla keltainen reaktio ja albu-miinipitoisella virtsalla vihreä väri, jonka voimakkuus kasvaa.

Virtsat, joiden kiniinipitoisuus on n. 50 mg-%, antavat saman vihertävän värin kuin 5 mg-JK albumiinia sisältävät.

Testipaperi, jonka koostumus on sama, mutta ilman polypropyleeni- s glykolia, reagoi normaalivirtsan kanssa antaen heikosti vihertävän värin.

i

Noin 10 mg-% kiniiniä aiheuttaa näillä testipapereilla saman reaktion kuin 5 mg-$ albumiinia.

Jos nonyyli fenolin sijasta, joka sisältää 1-2 oksietyleenitähdettä (Antarox CO 210) käytetään 0,4 g kookosalkoholia, joka on eetteröity 2 oksietyleenitähteellä (Genapol C 020 (R)) tai 0,2 g tributyylife- ^ nolia, joka on eetteröity 4 oksietyleenitähteellä (Sapogenat T 040 (R)), niin saadaan käytännöllisesti katsoen identtisiä testipaperei-ta.

i

Esimerkki 3 s

Suodatinpaperi (Schleicher & Schilll 2316) esi-impregnoidaan natrium- i a vetysitraatin 15-#:sella vesiliuoksella (pH 3,5) ja kuivataan 60° '' * f : 1· -· 8 59678 C:ssa. Jälki-impregnointi suoritetaan seuraavilla liuoskoostumuksil-la, jolloin kuivatus tapahtuu aina 60°C:ssa: a) 3',3"»5',5”?3j^,5»6-oktakloorifenoli- sulf oftaleiini 50 mg polypropyleeniglykoli taulukon 1 mukaan 1 g metanoli ad. 100 ml Tämän testipaperin ominaisuudet vastaavat olennaisesti esimerkin 1 paperin ominaisuuksia.

b ) 3' ,3"-dibromi-51,5"_dikloorifenoli-3,4,5,6- tetrakloorisulfoftaleiini 50 mg

Desmophen 7200 (R) 1 g metanoli ad. 100 ml Tämän testipaperin ominaisuudet vastaavat olennaisesti esimerkin 2 paperin ominaisuuksia.

c ) 3' ,3",5’ ,5,,-tetrabromifenoli-3,4,5,6- tetrakloorisulfoftaleiini 50 mg

Desmophen 7200 (R) 1 g metanoli ad. 100 ml Tämän testipaperin ominaisuudet vastaavat olennaisesti esimerkin 2 paperin ominaisuuksia.

9 59678 >> >> co rvi σν vo vo r-- -=r cr\ r— X 3 -=r ·=τ -3- tn cm vo cm m

O X

d 3 d dcc c ddd

Oi—I ·Η ·Η ·Η Ή ·Η Ή ·Η ·Η >ί·Η ο ο ο ο Ο ο ο ο K h c ddd d ddd d φ o d d •H ·Η xö cö d a co o o o o o ooo o XÖ -H O o ooo o ooo o

XÖ H O 00 H LO O ΓΟ VO CO LTV CO

E >s -=r ro ro ro ro vo cm ro -3- ro •H ί>>

X Φ CO H Φ O

« e

I I

•H ·Η ·Η d d hi d φ φ o >j <ö φ φ x a d CÖ H H I >> O Φ .x >»>. >jd Hdd 3 o, ex a h i ω a ·η E O O O -rl >a -H >> d d d d d h d h Cö d aa a cö o φ o cö φ >>>i >, «s a φ a φ CO i—I H H CU H d

X O O O O ·Η P >5 P H

d a cv h a d h 3 ad h p h a o d o d •H H O O P ·Η .X 3 d 3 d o d d 3 h >> p a-p -p

E d d >»dOHd >sd-H

H d d H d rl M CÖ HCÖ O

H P P hO -P >3·Η Ci O Ci ·Η d d -Hd-Pdrö acö «m

d CÖ CÖ d CÖ Φ Φ CÖ CÖ *H

H CÖ ·Η Ci Ci Φ d E Φ· £5 P ,d Ό

•ra H CÖ CÖ Φ CÖ ·Η H d O

ocöocö cö h m e >i (d dcö e P .X .d JS >> jd P a > d> .x co >> cv odPdcö d-HHd d o 3 3 d p 3 p «h HE bflp p d p P a co Cö CO ό d h ·Η -H H a -H -H >» d Ci d ·Η

CÖCÖ do O >s O OH Ci CÖ Ci CO

E-l > φ H ·Η H H ·Η O Φ CÖ Φ — φ a a o a a a a da o i—I ·Η Ή a Ή ·Η ·Η cost'd Ό OOPd cöd d ·η d ao o pood-H >·η φ h E oE E dEEd-n d-π ojo 3d d ddPdH^ci P aCÖ CÖ dCÖCÖPCÖHCOCÖ >>>s

CO >> H H PHHdCÖHdCÖ pH

o hh h dHHcö ao e. a φ to

O O -H H CÖ H ·Η Ci O X Φ O -H

λ: a ό το CiOTdcöCi^aci cöd •H «H CÖ Ή ·Η ·Η CÖ a H a ·Η Η Φ d deo CO CÖ CO H 03 C *H bO d ·Ηι—I i—1φ

Φ d> X X JZ X o X H H -H H O ·· H

d do o οϋ o cö od ·η ολ! >> H ·Η H ·Η d Ή >J H > H φ H H >» a h Ci d-π dH -h dndd >>φ o >> h oo H CÖ ΦΗ (UH cö Φ fcO Φ p pH Ci P faO H Ci CÖ CÖ Φ O ΦΟ P φ ·Η Φ CO Φ >s Φ Φ·Η a •h φ r-\ χ r-{ χ P HerHd E a co Ed ·>>

E d >5>» >3>>·Η >ϊ Φ >ϊ d Ή Ο >ί·ΗΦ X H

<u H PH PH CO ΡφΡΦ dd H d Φ CÖO

te h φ to Φω o φη φ a p a W) ph e a

»""N /«“N

CC tt

—- — K

O K CC CC CC -=r O CC cc cc o — — '-r -— LO -3- '— ' —

-=J- O O O O VO LO ro CM H

o o o o cm tr- σν o

a CM H cö p- [i] H

t- o- ro ro a a «« •H H E-l E-ι S S d E O d d d d

Ή X & Φ φ Φ H H HH O

d >> d d d d o o oo h dna a a a o o oo e a ω o o o o cö cö cöcö o a >> E E EEd d dd d 3 H co CO CO CO 3 3 33 3

CÖ O Φ Φ CU CU H i—I i—I H i—I

«aa ω Ω Ω a a aa a 10 5967 8

Esimerkki b

Suodatinpaperi (Schleicher & SchUll 2316) impregnoidaan peräkkäin seuraavilla 2 liuoksella, jolloin kuivatus on aina 60°C:ssa:

Liuos 1 omenahappo 15 g 6-n natriumhydroksidi n. 16 ml hydroksietyyliselluloosa (Natrosol 250 G (R)) 2 g vesi, tisl. ad. 100 ml

Liuoksen pH säädetään 3>5:een.

Liuos 2 tetrabromifenolisininen 0,6 g

Polyglykol P 1200 (R) 3 g kloroformi ad. 100 ml Tämän testipaperin ominaisuudet vastaavat olennaisesti esimerkin 2 paperin ominaisuuksia.

Esimerkki 5 31,3"-dikloorifenoli-3,^,5,6-tetrakloorisulfoftaleiini 25,7 g (0,2 moolia) o-kloorifenolia sekoitetaan tetrakloori-o-sulfo-bentsoehappoanhydridin (*J5 g, 0,14 moolia) kanssa, seokseen lisätään 9 ml = 20,il g tina-IV-kloridia, ja seosta kuumennetaan sekoittaen 12 tuntia öljyhauteella 120-130°C:ssa. Sitten ylimääräinen kloorifenoli poistetaan vesihöyryn avulla, ja jäännös puhdistetaan liuottamalla useampaan kertaan 4-n natriumkarbonaattiliuokseen ja saostamalla suolahapolla, lopuksi kiteytetään uudelleen jääetikasta. Saadaan 5,3 g = 47 % vaaleanpunaista 3',3"“dikloorifenoli-3,^,5,6-tetrakloorisulfo-ftaleiinia, joka sisältää 1 moolin etikkahapooa, sp. 244—245°C (mole-kyylipaino: C-^HgClgO^S · C2H4O2 = 621,13).

Samalla tavalla saadaan käytettäessä o-bromifenolia 3,,3"-dibromifeno'· li-3, i|,5,6-tetrakloorisulfoftaleiini , joka kiteytettäessä uudelleen jääetikasta kiteytyy samoin 1 etikkahappomoolin kanssa, sp. 172-1730C.

Esimerkki 6 3’,3"-dibromifenoli-3,4,5,6-tetrakloorisulfoftaleiini L>9 g (0,01 moolia) fenoli-3,^,5,6-tetrakloorisulfoftaleiinia liuotetaan 50 mlraan jääetikkaa, ja liuokseen tiputetaan sekoittaen 2()o0: u;-,n 11 59678 liuos, jossa on 1,1 ml = 3,37 g bromia (0,04 g-atomia) 50 mlissa jääetikkaa. Sekoitusta jatketaan vielä 3 tuntia, muodostuneet kiteet imusuodatetaan ja kiteytetään uudelleen jääetikasta. Saadaan 3,9 g = 55 % 3' ,3,,-dibromifenoli-3,4,5,6-tetrakloorisulfoftaleiinia, sp. 173“17^°C. Yhdiste sisältää 1 moolin kide-etikkahappoa (molekyyli-paino: C^HgB^ClijO^S · C2Hi|02 = 710,05).

Esimerkki 7 3*,3t’~dibromi-5 1,5t>~dikloorifenoli-3,^,5,6-tetrakloorisulfoftaleiini 3,55 g (0,005 moolia) 3’,3,,-dibromifenoli-3,il,5,6-tetrakloorisulfo-ftaleiinia suspendoidaan 50 ml:aan jääetikkaa. Suspensioon lisätään hitaasti ja sekoittaen liuos, jossa on 0,9^ g (0,025 g-atomia) klooria 50 ml:ssa jääetikkaa. Useampituntisen sekoittamisen jälkeen saadaan värittöminä kiteinä 3,8 g = 90,5 % 3',3"-dibromi-5*,5"-dikloori-fenoli-3,4,5,6-tetrakloorisulfoftaleiinia, sP. 265-268°C. Yhdiste kiteytyy 2 moolin kanssa etikkahappoa (molekyylipaino: C-^HgB^ClgO^S · 2 02Η^02 = 839,01).

Sama yhdiste voidaan valmistaa myös bromaamalla 3',3"-dikloorifenoli-3,^,5,6-tetrakloorisulfoftaleiini (saatu klooraamalla fenoli-3, l), 5,6-tetrakloorisulfoftaleiini , saanto 60 %).

Esimerkki 8 3' ,3” ,5’ ,5t'-tetrakloorifenoli-3,4,5,6-tetrabromisulfoftaleiini 13,8 g (0,02 moolia) fenoli-3,4,5,6-tetrabromisulfoftaleiinia suspendoidaan 100 ml:aan jääetikkaa, ja suspensioon tiputetaan sekoittaen huoneen lämpötilassa liuos, jossa on 3,6 g klooria (~O,1 g-atomia) 30 ml:ssa jääetikkaa. Sekoitusta jatketaan vielä useita tunteja, ja muodostuneet beigenväriset kiteet imusuodatetaan. Uudelleenkiteyttä- mällä jääetikka-vesiseoksesta 9:1 saadaan 11 g = 58,3 % 3*,3”,51,5"-tetrakloorifenoli-3,4,5,6-tetrabromisulfoftaleiinia värittöminä kiteinä, sp. 203-204°C (haj.).

Yhdiste kiteytyy 2 moolin kanssa etikkahappoa ja 1 moolin kanssa vettä (molekyylipaino: C-^HgBr^CljjC^S · 2 CH^COOH · H20 = 9*15,9).

Analogisella tavalla saadaan fenoli-3,^,5,6-tetrakloorisulfoftaleiinis-ta klooraamalla jääetikassa 3’ , 3" ,5 ’ ,5'’-tetrakloorifenol i-3,4,5,6-tetrakloorisulfoftaleiini, sp. 277-278°C. Yhdiste kiteytyy 1 moolin kanssa etikkahappoa (molekyylipaino: C-^HgClgC^S · 690).