DE69107815T2

DE69107815T2 - Verfahren zur Herstellung neuer nichtkovalenten Polysaccharid-Protein-Zusammensetzungen mit pharmakologischen Eigenschaften.

Info

Publication number: DE69107815T2
Application number: DE69107815T
Authority: DE
Inventors: Lacy Boville Rafael De; Gomez-Pamo Antonio Guerrero; Tuduri Jose Antonio Matji; Ranieri Juan Pablo Pivel
Original assignee: Corlay SA; Industrial Farmaceutica Cantabria SA
Current assignee: Industrial Farmaceutica Cantabria SA
Priority date: 1990-12-18
Filing date: 1991-07-22
Publication date: 1996-07-25
Anticipated expiration: 2011-07-23
Also published as: ES2027518A6; DE69107815D1; EP0491114B1; JPH05262661A; EP0491114A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung nichtkovalenter Polysaccharid-Protein-Verbindungen (im folgenden PS- PR NCA) und ihre Anwendung in der Human- und Tiermedizin in verschiedenen pharmazeutischen Formen.

Hintergrund der Erfindung

Die wissenschaftliche und technische Literatur (Chihara et al., Cancer Res. 30, 2776, 1970; Chihara et al., Nature, 222, 687, 1969; Teukagoshi, Cancer chemotherapy, 1, 251, 1974 und Kamei et al., Cancer Chemotherapy, 4, 166, 1977) beschreibt die Herstellung und pharmakologischen Eigenschaften von Polysacchariden (PS), die aus Kulturen bestimmter Pilze, Hefen und Bakterien isoliert wurden. Besonders wichtig unter anderen interessanten Eigenschaften sind die anti-Tumor, anti-viralen, immunomodulierenden, hypocholesterinämischen, hypolipidämischen, hypoglykämischen, Reticulo-Endothelial- System-aktivierenden usw. Aktivitäten.
Der nächstliegende Stand der Technik für die vorliegende Erfindung ist ES 543855, worin ein Verfahren für die Herstellung eines nitrogenierten Polysaccharids (N-Ps) beschrieben ist, wobei die Fermentation erreicht wird durch zeitlich getrennte aufeinanderfolgende Impfung mit zwei reinen Kulturen zweier verschiedener Bakterienarten, Zymomonas und Pediococcus. Anschließend folgt ein Lyse-Hydrolyse-Prozeß durch chemische und enzymatische Einwirkung, Futration und Herstellung des pharmakologisch aktiven N-Ps-Adsorbats.
Die bekannten Verfahren leiden unter verschiedenen Nachteilen, die definiert werden als solche, die durch den Umgang mit reinen mikrobiellen Kulturen entstehen, wie die Notwendigkeit der Verwendung steriler Medien, Verunreinigungen, Bewahrung der genetischen Integrität der Stämme genauso wie solche, die vom begrenzten biologischen Potential der einzelnen spezifischen angeimpften Mikroorganismen relativ zur Behandlung des Substrats herrühren. Ungünstige Konsequenzen davon sind Variabilität der Substrat-Umwandlung oder Biosynthese der Produkte, was Mangel an Reproduzierbarkeit hinsichtlich der Ausbeuten und/oder Charakteristika des Endprodukts bedeutet, die durch nachfolgende Verfahren der Fraktionierung und Reinigung nicht korrigiert werden können.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein von den obigen Nachteilen freies Verfahren, da der beschriebene Prozeß eine "gemischte Kultur" in Übereinstimmung mit der Definition und mit den entsprechenden Vorteilen wie von Hesseltine vorgeschlagen darstellt (C. W. Hesseltine, 1983, Ann. Rev. Microbiol. 37, 575-601), bestehend im wesentlichen aus einem spontanen Fermentationsprozeß, d. h. ohne reine Animpfung, dessen Entwicklung wesentlich basiert auf dem biologischen Selektionsdruck, der durch ein spezielles Kulturmedium ausgeübt wird, das einzigartig für die vorliegende Erfindung ist, das dieselben natürlichen Mikroorganismen stets zum Wachstum in derselben Zeitfolge veranlaßt, wodurch ein Fermentationsstandard definiert wird. Darüber hinaus bietet die Erfindung den Vorteil, daß das Medium einen Fermentationsstandard und Extraktionscharakteristika so produziert, daß die Verwendung verschiedener Vorläufer ermöglicht wird. Diese, immer in derselben Art verarbeitet, führen zu ihren entsprechenden Endprodukten. Die Vorteile können daher wie folgt zusammengefaßt werden:
1. Es wurde ein Verfahren entwickelt, das das Ersetzen reiner Impfmaterialien aus Laborstämmen durch natürlich vorkommende Mikroorganismen erlaubt, die sich durch Selektionsdruck in "gemischter Kultur" entwickelt haben, mit der entsprechenden Eliminierung des Risikos des Prozeßverlustes durch Kontamination oder Modifikation der genetischen Merkmale der verwendeten Stämme.
2. Ein Prozeß wurde entwickelt, der, indem er eine gemischte Kultur natürlich vorkommender Stämme darstellt, die Verarbeitung verschiedener Vorläufer sowohl der Polysaccharidkomponente als auch der Proteinkomponente verschiedener Endprodukte, die als Ps-Pr NCA definiert sind, gestattet. Diese Vielseitigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist nicht möglich mit auf reinen Impfstämmen basierenden Verfahren, die lediglich zur Modifikation ihrer spezifischen Substrate in effizienter Weise in der Lage sind. Daher werden verschiedene neue pharmakologisch aktive Ps-Pr NCA hergestellt.
3. Andere Reinigungsverfahren für Ps-Pr NCA wurden entwickelt, die die Verwendung in anderen wirksameren galenischen Formen gestatten.
Die Ps-Pr NCA haben ihre eigenen pharmakologischen Eigenschaften, die die Anwendung in der Human- und Tiermedizin gestatten.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren für die Herstellung pharmakologisch aktiver nicht-kovalenter Polysaccharid-Protein- Verbindungen (Ps-Pr NCA), bestehend aus:
a) Herstellung eines Kulturmediums durch Zugabe unter Rühren von Metalloxiden, divalenten Metalisalzen, Bakteriostatika, elementarem Schwefel und den die Proteinfraktion und die Polysaccharidfraktion generierenden Vorläufern zu einem speziellen Volumen deionisierten Wassers. Die Suspension wird nach Homogenisierung ohne Rühren bei einer Temperatur im Bereich von 35 bis 45ºC gehalten, wobei unter diesen Bedingungen eine Fermentation entsteht, die charakterisiert ist durch Ansäuern des Mediums, das fortgesetzt wird, bis ein pH im Bereich von 3 bis 5 erreicht wird.
b) Durchführung einer kontrollierten chemischen und enzymatischen Hydrolyse bei pH 1,0 bis 2,8 und bei einer Temperatur von 35 bis 45ºC, indem zu dem zuvor filtrierten Fermentationsmedium eine starke anorganische oder organische Säure (pKa 0,1-3,0), ein chaotropes Mittel und eine in saurem Medium aktive Protease gegeben werden, um als einzige Makromoleküle in der Lösung die Komponenten des Ps-Pr NCA zu erhalten; und
c) Reinigen des Ps-Pr NCA durch Entfernen der niedermolekulargewichtigen Kontaminanten durch i) Dialyse/erschöpfende Ultrafiltrations-Verfahren unter Verwendung geeigneter Membranen, die das reine Ps-Pr NCA in wahrer Lösung liefern, oder ii) Fällung durch Zugabe zu einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines anorganischen Calciumsalzes in unlöslicher Adsorbat-Form. Beide Verfahren liefern Produkte, die für die Herstellung der verschiedenen pharmazeutischen Formen verwendet werden.
Die Vorläufer sind empirisch ausgewählte biologische Materialien, die die Moleküle tragen, die das Endprodukt, das Ps-Pr NCA, bildenden produzieren. Solche Moleküle bilden Teile von Gewebe oder Zellstrukturen, aus denen sie zur Extraktion und Modifikation freigesetzt werden. Die die Proteinfraktion (Pr) generierenden Vorläufer umfassen eine Anzahl natürlich vorkommender Produkte, unter denen sie von einem oder verschiedenen Samen, Körnern oder Nüssen ausgewählt werden wie Rapssamen, Erdnüsse, Castorbohnen, Sonnenblumenkerne, Sojabohnen, Reis, ihren entfetteten Rückstandsmischungen oder Mehlen. Die Polysaccharid (Ps)-Fraktions-generierenden Vorläufer sind getrocknete tote Hefen, ausgewählt unter den Arten Candida, Saccharomyces, Rhodotorula, Sporobolomyces, Hansenula, Picchia oder ihre Trockenextrakte.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können mögliche Polysaccharid-Fraktions-Vorläuferpaare (im folgenden Pr- Ps)/Proteinfraktionsvorläufer oder Vorläufer (im folgenden PR(s)-Pr) wahlweise benutzt werden ausgewählt aus den oben erwähnten. Jedes PR-PsS/PR(s)-Pr-Paar ergibt nach einem durch die Bedingungen des Mediums und nachfolgende Reinigung definierten Fermentationsprozeß ein entsprechendes pharmakologisch aktives Ps-Pr NCA.
Die Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung pharmakologisch aktiver Polysaccharid-Protein-Verbindungen, die in der Human- und Tiermedizin von Interesse sind. Zu diesem Zweck wird ein Verfahren beschrieben, charakterisiert durch:
- eine Anzahl Vorläufer der Proteinfraktion und Polysaccharidfraktion des Ps-Pr NCA, empirisch ausgewählt auf der Basis der biologischen Aktivität des korrespondierenden Endprodukts, aus der die die Fraktionen bildenden Moleküle erhalten werden.
- ein Fermentations-/Extraktionsmedium, charakterisiert durch Eigenschaften der Kontrolle des Fermentationsprozesses der natürlich vorkommenden Mikroorganismen durch ihre organischen Komponenten und Extraktion und Modifikation der Moleküle, die das Ps-Pr NCA bilden.
- selektive kontrollierte chemische, physikalische und enzymatische Bedingungen der Hydrolyse zum Zweck der Hydrolyse aller extrahierten makromolekularen Komponenten außer denen, die Teil des pharmakologisch aktiven Ps-Pr NCA sind.
- Ps-Pr-Reinigungsverfahren durch Dialyse/Ultrafiltration oder Bildung eines die Produkte liefernden unlöslichen Adsorbats, die für die Herstellung der verschiedenen galenischen Formen verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird dadurch charakterisiert, daß es die folgenden Stufen umfaßt:
In einer ersten Stufe wird ein Kulturmedium hergestellt durch Zugabe unter Rühren von Metalloxiden wie Mangandioxid, Mangan und Kobaltsalzen mit Anionen der Salzsäure oder Schwefelsäure, bekannten Bakteriostatika wie Campher, elementarem Schwefel und organischen Säuren der Abietingruppe in ihrer natürlichen Form von Colophonium (70 % Säure) zu einem speziellen Volumen deionisierten Wassers. Nach Homogenisieren wird die Suspension bei einer Temperatur im Bereich von 35 bis 45ºC gehalten.
In einen zweiten Schritt werden die Ps-Pr NCA-Vorläufer hergestellt und zu dem Kulturmedium gegeben.
In einer dritten Stufe läßt man das Fermentationsmedium bei kontrollierter Temperatur im Bereich von 35 bis 45ºC ruhen. Beim Erreichen eines pH im Bereich von 3 bis 5 wird der Prozeß während weiterer 4 bis 13 Tage fortgesetzt, wonach diese Verfahrensstufe für beendet erklärt wird, und ein vierter Schritt durchgeführt wird, in dem das flüssige Filtrat des Fermentationsprozesses mit starken Säuren mit einem pKa von 0,1 bis 3,0 wie Salzsäure, Trichloressigsäure, Trifluoressigsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure bis zu einem pH im Bereich von 1 bis 2,8 und mit chaotropen Mitteln und Lyse-Enzymen, die im pH-Bereich von 1 bis 3 aktiv sind, welche ausgewählt werden können unter Pepsin, Papain, Chemopapain und Bromelin, unter Inkubation während 6 bis 72 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von 35 bis 45 ºC behandelt wird. Das Ps-Pr NCA wird nach den oben beschriebenen Behandlungen in Lösung gefunden.
Der fünfte Schritt des Verfahrens besteht aus Konzentrieren der Lösung der vorherigen Stufe. Nach Futration zum Reinigen des Mediums wird tangentiale Ultrafiltration durch Membranen mit einer molekularen Abtrennung (cut-off) von 10000 bis 50000 Dalton durchgeführt. Auf diese Art wird das Volumen auf das Endvolumen im Bereich von 1/3 bis 1/18 des Anfangsvolumens reduziert.
In der sechsten Stufe kann das Material alternativ durch selektive Adsorption oder durch erschöpfende Dialyse und anschließendes Eindampfen zur Trockene oder Trocknen in Anwesenheit von Salzen gereinigt werden:

Alternative (a):

Die Reinigung durch selektive Adsorption wird durchgeführt durch Zugabe von Calciumchlorid und Einstellen des Medium-pH, gefolgt von Wechsel der Polarität durch Zugabe eines wassermischbaren oganischen Lösungsmittel wie Ethanol oder Aceton, wodurch Ps-Pr NCA in Form eines unlöslichen Adsorbats abgetrennt wird.

Alternative (b):

Die Reinigung durch erschöpfende Dialyse wird durchgeführt durch Diafiltration der Lösung aus der fünften Stufe gegen deionisiertes Wasser unter Verwendung von Membranen mit einer molekularen Abtrennung von 10000 bis 50000 Dalton. Eindampfen zur Trockene durch Lyophylisieren oder Sprühtrocknen liefert die lösliche Form des Endprodukts.

Alternative (c):

Trocknen in einem Muffelofen in Gegenwart eines anorganischen stabilisierenden Salzes wie Calciumsulfaten oder Phosphaten liefert die unlösliche Form, ähnlich dem Adsorbat.
Im siebten Schritt werden die in der vorhergehenden Stufe erhaltenen Produkte zur Herstellung der verschiedenen galenischen Formen verarbeitet:
- Kapseln, Säckchen (Sachets) oder Tabletten werden aus den stabilisierten unlöslichen anorganischen Salz-Formen hergestellt (Alternativen (a) oder (c)).
- Wäßrige Lösungen mit oder ohne Absorptionspromotoren, Suspensionen, Mikroemulsionen, Suppositorien, injizierbare oder topische Präparate werden aus den löslichen Formen hergestellt (Alternative (b).
Die wie in den Verfahren der Beispiele 1 bis 4 beschrieben hergestellten Produkten zeigen eine Anzahl von pharmakologischen Eigenschaften, die im folgenden beschrieben werden und die Basis der therapeutischen Verwendung in der Human- und Tiermedizin sind.

Reduktion der Tumornecrosefaktor (TNF)-Spiegel im Serum von mit bakteriellem Endotoxin (LPS) behandelten Mäusen

Das in Beispiel 1 herstestellte Produkt wurde Balb/c-Mäusen oral bei einem Dosisniveau von 150 mg/kg während 6 aufeinanderfolgenden Tagen vor der intravenösen Belastung mit 25 µg/Tier E. coli Endotoxin Serotyp 055 B5 gegeben. Das Ergebnis der Behandlung mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Produkt führt zu einer Inhibierung von über 50 % in den Serum TNF-Spiegeln, erhalten 90 Minuten nach der Gabe von LPS. Gleiche Ergebnisse wurden mit gegen Endotoxin mit Zymosan oder dem Calmette-Guerin-Bazillus sensibilisierten Tieren erzielt. Die TNF-Bestimmungen wurden durchgeführt durch Messen der Zytotoxizität des Serums gegenüber der Zellinie L929.

Reduktion des Cholesterin-Spiegels in mit Triton behandelten hypercholesterinämischen Ratten

Die i.p.-Gabe von Triton WR1239, gelöst in Kochsalzlösung, bei Dosisniveaus von 500 mg/kg an Wistar-Ratten induziert Hypercholesterinämie. Als das in Beispiel 1 beschriebene Produkt bei einem Dosisniveau von 500 mg/kg, enthalten in der Triton-Lösung, gegeben wurde, trat eine Reduktion der Serum- Cholesterin-Spiegel von über 40 % gegenüber einer Kontrollgruppe auf. Das Serum-Cholesterin wurde 18 Stunden nach i.p.-Gabe der Produkte gemessen.

Anstieg der Basis-Corticosteron-Spiegel in Mäusen

Als das in Beispiel 1 beschriebene Produkt oral Balb/c-Mäusen bei einem Dosisniveau von 150 mg/kg gegeben wurde, trat ein Anstieg von mehr als 200 % relativ zum Basis-Corticosteron- Serum-Spiegel auf, gemessen mit einer Radio-Immunoanalyse 5 Stunden nach der Produktgabe.
Ein gleiches Ergebnis wurde erhalten, als das in Beispiel 2 beschriebene Produkt via rectum bei einem Dosisniveau von 1600 mg/kg gegeben wurde.

Anstieg der Hämatopoetin-Aktivität, gemessen durch die Anzahl von Vorläuferzellen (CFU-S und CFU-GM)

Intravenöse Gabe des in Beispiel 3 beschriebenen Produkts an C57B1/6-Ratten bei einem Dosisniveau von 0,4 mg/kg verursachte einen Anstieg von über 150 % in der Anzahl der pluripotenten Milz-Zellen (CFU-S) und 200 % in der Anzal der Granulozyten- Macrophagen-Linienvorläufer-Milzzellen (CFU-GM), gemessen 5 Tage nach Gabe verglichen mit einer Kontrolle.

Anstieg der Hämatopoetin-Milzaktivität, gemessen durch Anstieg der Anzahl der plurinotenten Zellen (CFU-S) nach sublethaler Bestrahlung

Orale Gabe des in Beispiel 4 beschriebenen Produkts an C57BL/6- Ratten bei einem Dosisniveau von 150 mg/kg während 6 aufeinanderfolgender Tage nach einer sublethalen Bestrahlung mit 5,5-6,0 Gy ergab einen Anstieg von 80 % in der Anzahl der pluripotenten Milzzellen (CFU-S) gegenüber der Kontrolle.

Anstieg im Überleben von mit Listeria monocytogenes infizierten immununterdrückten Mäusen

Orale Gabe des in Beispiel 4 beschriebenen Produkts an Schweizer Mäuse (Swiss mice) bei einem Dosisniveau von 150 mg/kg während 6 Tagen vor der Infektion bewirkte Schutz von mit Silica immungeschwächten Ratten, die mit Listeria monocytogenes infiziert wurden. Die Immununterdrückung wird durch Behandlung mit 120 mg/kg i.p. Silica einen Tag vor Verursachen der Infektion induziert. Der Schutz wird durch einen Anstieg der LD&sub5;&sub0; angezeigt, der bei den behandelten Tieren einen Wert gleich dem der nicht immununterdrückten Tiere erreichte.

Schutzeffekt bei lethaler Bestrahlung unterworfenen Mäusen

Das entsprechend Beispiel 3 hergestellte Produkt ergibt bei Gabe in einer einzelnen i.v.-Dosis von 0,4 mg.kg&supmin;¹ an C57816- Mäusen einen Tag vor Erhalt einer lethalen Bestrahlungsdosis (7,75 Gy) 100 % Überlebensrate, gemessen 15 Tage danach.
Das analytische Profil der verschiedenen bei Durchführung bis zu einschließlich Stufe 6 der in Beispiel 1 bis 4 beschriebenen Verfahren hergestellten Produkte ist in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1 Organisches Material % (m/m) Salze Polysaccharid-Fraktion Proteinfraktion (1): Entsprechend nach der Methode von Dubois (Dubois A. et al. Anal. Chem. 28, 350, 1956). (2): Bestimmt entsprechend der Methode von Lowry (Lowry O. H. et al., J. Biol. Chem. 193, 265, 1951).
Polysaccharidfraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10&sup4; bis 3 x 10&sup5; (gebildet mit einem Heteropolysaccharid (gebildet aus Mannose (70-90 % m/m), Glucose (5-20 % m/m) und Galactose (0-3 % m/m) mit 1-6 und/oder 1-2, 1-3 oder 1-4 Bindungen). Proteinfraktion mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10&sup4; bis 2 x 10&sup5;.
Die IR-Spektren (KBR) der nicht-kovalenten Ps-Pr-Verbindungen, hergestellt entsprechend Beispielen 1 bis 4, sind jeweils in Figuren 1 bis 4 dargestellt.
Die Infrarot-Spektren der nicht-kovalenten Polysaccharid- Protein-Verbindungen, hergestellt bei Durchführung der in Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Prozesse, sind jeweils in Figuren 1 bis 4 dargestellt. Die Spektren wurden mit Kaliumbromidtabletten aufgenommen, mit einer Probenkonzentration von 2 % in einem Perkin-Elmer Modell 881 Infrarot-Spektrophotometer, Durchlauf von 4000 bis 600 cm&supmin;¹ in 6 Minuten mit variabler Blende, Auflösung 1000 cm&supmin;¹ und spektrales Rauschen 0,5 % T. Die Spektren sind elektronisch korrigiert durch das Savitzky-Golay-Verfahren dargestellt, und automatisch in der Absorption expandiert.

Beispiel 1

Erste Stufe: Herstellung des Kulturmediums.

0,2 bis 0,4 g Mangandioxid , 5,2 bis 7,1 g Mangansulfat, 2 bis 5 g Colophonium, 2,4 bis 4,2 g Kobaltchlorid, 4 bis 6 g Campher und 4,5 bis 6,5 g Schwefel, ausgefällt in einem 2 1- Reaktor, wurden zu 1000 ml deionisiertem Wasser gegeben. Die Mischung wurde bei einer Temperatur im Bereich von 35 bis 4 5ºC gehalten.

Zweite Stufe: Herstellung und Zugabe von Vorläufern.

5 bis 25 g Sojabohnen, vorher gewaschen und in Wasser eingeweicht, wurden gemahlen und zum in der vorherigen Stufe hergestellten Kulturmedium gegeben. Anschließend wurden 3 bis 12 g tote, getrocknete Candida utilis zugegeben.

Dritte Stufe: Fermentation- Extraktion.

Die Fermentationsmischung wurde bei einer Temperatur im Bereich von 350 bis 45 ºC ruhengelassen, bis der pH des Mediums zwischen 3,0 und 5,0 lag, wobei der Prozeß anschließend während weiterer 4 bis 13 Tage aufrechterhalten wurde.

Vierte Stufe: Chemische und enzymatische Hydrolyse.

Das Reaktionsmedium wurde mit einem Büchner-Trichter durch eine Schicht Diatomeenerde filtriert, und 85 %ige Phosphorsäure wurde zur Einstellung des pH zwischen 1,0 und 2,8 zu dem Filtrat gegegen. Anschließend wurden 6 bis 12 g Harnstoff und 0,1 bis 0,6 g Pepsin zugegeben. Nach Homogenisierung wurde die Mischung während 6 bis 72 Stunden bei 35 bis 45ºC ruhengelassen.

Fünfte Stufe: Konzentrierung.

Die Reaktionsmischung aus der vorherigen Stufe wurde mit einem Büchner-Trichter durch eine Schicht Diatomeenerde filtriert und durch Ultrafiltration durch eine Polysulfon-Membran mit einem molekularen Abtrennung-Level von 10000 bis 50000 Dalton konzentriert. So wurde das Volumen auf etwa 1/5 des Ausgangsvolumens reduziert.

Sechste Stufe, Alternative a: Adsorbat.

10 bis 25 g wasserfreies Calciumchlorid wurden zum Konzentrat der vorherigen Stufe gegeben und der pH anschließend durch Zugabe von 10 %iger NaoH-Lösung auf 3,5 bis 4,4 eingestellt. Die Lösung wurde in Aceton gegossen, wobei der Endanteil an Aceton auf 25 bis 40 % (Volumen/Volumen) eingestellt wurde. Die Mischung wurde während 24 Stunden stehengelassen, und anschließend wurde der Hauptanteil der überstehenden Flüssigkeit dekantiert. Der Niederschlag wurde mit einem Büchner- Trichter filtriert und erschöpfend mit einer Aceton/Wasser- Mischung zwischen 25 und 40 % (Volumen/Volumen) gewaschen und in einem Ofen mit Luft-Belüftung getrocknet.

Siebte Stufe: Galenische Form.

Das in der vorheigen Stufe hergestellte Produkt wurde mit einer Mischung von CaHPO&sub4;.2H&sub2;O/CaSO&sub4;.2H&sub2;O 2:1 verdünnt, bis die mit der Dubois-Methode gemessene Gesamtzuckerkonzentration etwa 1,2-2,0 % (m/m) betrug.

Beispiel 2

Erste Stufe: Herstellung des Kulturmediums.

Das Kulturmedium war identisch zu dem in Beispiel 1 beschriebenen.

Zweite Stufe: Herstellung und Zugabe von Vorläufern.

Es wurden genauso 5-25 g Sojabohnen, gewaschen, in Wasser eingeweicht und gemahlen, verwendet. In diesem Fall war die Polysaccharid-Quelle 3-12 g tote, getrocknete Saccharomyces cerevisiae.

Dritte Stufe: Fermentation-Extraktion.

Die Fermentationsmischung wurde auf die gleiche Art wie in Beispiel 1 aufgearbeitet.

Vierte Stufe: Chemische und enzymatische Hydrolyse.

Die Filtration, Ansäuerung und Hydrolyse wurden identisch wie in der in Beispiel 1 beschriebenen Methode durchgeführt.
Fünfte Stufe: Konzentrierung.
Das filtrierte Medium wurde durch Ultrafiltration unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben konzentriert. Das Endvolumen ist 1/5 des Ausgangsvolumens.

Sechste Stufe, Alternative b: Lösliches Produkt.

Das Konzentrat aus dem vorherigen Schritt wurde durch Konzentrationszyklen mit Ultrafiltration und Zugabe von deionisiertem Wasser bis zum Ursprungsvolumen erschöpfender Dialyse unterworfen. Die Dialyse wurde fortgesetzt, bis die elektrische Leitfähigkeit des Permeats einen Wert gleich dem des deionisierten Wassers hatte. Die Lösung wurde dann durch Ultrafiltration auf ein Volumen im Bereich von 1/6 bis 1/10 des Originalvolumens konzentriert und wurde schließlich lyophylisiert.

Siebter Schritt: Galenische Form.

0,125 % (m/m) in Supocire BP, Träger vom Labrafil-Typ, enthaltende Suppositorien wurden aus dem lyophylisierten Produkt hergestellt.

Beispiel 3

Erste Stufe: Herstellung des Kulturmediums.

Identisch zu der in Beispielen 1 und 2 beschriebenen Methode.

Zweite Stufe: Herstellung und Zugabe von Vorläufern.

Es wurde eine Mischung aus 2,9 bis 14,6 g Sojabohnen und 2,1 bis 10,4 g Castorbohnen, gemahlen nach dem Waschen und Einweichen in Wasser, und 3 bis 12 g toter, getrocknter Candida utilis verwendet.

Dritte Stufe: Fermentation-Extraktion.

Vierte Stufe: Chemische und enzymatische Hydrolyse.

Identisch zu der in Beispielen 1 und 2 beschriebenen.

Fünfte Stufe: Konzentrierung.

Durchgeführt auf die gleiche Art wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei die Lösung 6 Mal konzentriert wurde.

Sechste Stufe, Alternative b: Lösliches Produkt.

Identisch zu der in Beispiel 2 beschriebenen.

Siebte Stufe: Galenische Form.

Das in der vorhergehenden Stufe hergestellte Produkt wurde unvorbereitet für die intravenöse Injektion in Kochsalz- Serumlösung gelöst.

Beispiel 4

Erste bis fünfte Stufe:

Auf die gleich Art wie in Beispiel 3, konzentriert auf 1/6 des Ursprungsvolumens.

Sechste Stufe, Alternative a: Adsorbat.

Genauso wie in Beispiel 1.

Siebte Stufe: Galenische Form.

Wie in Beispiel 1 beschrieben.

Claims

1. Verfahren für die Herstellung nicht-kovalenter Polysaccharid- Protein- (Ps-Pr)-Verbindungen, wobei:

a) man einen oder mehrere Vorläufer der Proteinfraktion (Pr), die aus ölhaltigen Samen, Körnern oder Nüssen ausgewählt werden, sowie einen oder mehrere Vorläufer der Polysaccharidfraktion (Ps), die unter Hefen oder deren Extrakten ausgewählt werden, bei einer Temperatur im Bereich von 35º bis 45ºC zusammen mit einem wäßrigen selektiven kontrollierten Extraktions-Fermentations- Medium zur Reaktion bringt, wobei das Medium aus Kobalt- und Manganverbindungen, elementarem Schwefel, Abietinsäure oder Abietaten und einem bakteriostatischen Mittel besteht, und wobei man die Mischung in Abwesenheit provozierter bakterieller Impfmaterialien ruhen läßt;

b) man anschließend die resultierende Ps-Pr-Lösung bei pH 1,0 bis 3,0 und derselben Temperatur einer selektiv kontrollierten chemischen und enzymatischen Hydrolyse unterwirft, indem man eine Säure mit pKa 0,1 bis 2,0, ein chaotropisches Mittel und ein Enzym zusetzt, das aus der aus Pepsin, Papain, Chemopapain oder Bromelin gebildeten Gruppe ausgewählt wird; und

c) zur Isolierung der reinen Ps-Pr-Verbindung und Herstellung der unterschiedlichen galenischen Formen das Ps-Pr-Adsorbat aus den filtrierten konzentrierten Flüssigkeiten in Anwesenheit von Salzen ausfällt, indem man dem Reaktionsmedium ein wassermischbares organisches protisches oder aprotisches Lösungsmittel beifügt, oder Dialyse-Ultrafiltration anwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das wäßrige Extraktions- Fermentations-Medlum bevorzugt mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt wird: Metalloxide, unter denen Mangandioxid bei einer Konzentration von 0,2 bis 0,4 g 1&supmin;¹ ausgewählt wird; Mangan und Kobaltsalze mit Anionen von Salzsäure oder Schwefelsäure, bei jeweiligen Konzentrationen von 1,9 bis 2,6 g 1&supmin;¹ und 4,0 bis 6,0 1&supmin;¹

elementarer Schwefel, von 4,5 bis 6,5 g 1&supmin;¹ und organische Säuren aus der von Abietinsäure in ihrer natürlichen Form von Colophonium gebildeten Gruppe, bevorzugt mit einem Säuregehalt von 70 % bei einer Konzentration von 2,0 bis 5,0 g 1&supmin;¹.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei unter den die Proteinfraktion erzeugenden natürlich vorkommenden Vorläuferprodukten Samen, Körner oder Nüsse aus der aus Rapssaat, Erdnüssen, Castorbohnen, Sonnenblumenkernen, Sojabohnen, Reis, entfetteten Rückständen oder Mehlen davon gebildeten Gruppe ausgewählt werden und wobei von den die Polysaccharidfraktion erzeugenden Vorläufern die toten getrockneten Hefen oder ihre trockenen Rohextrakte unter den Arten Candida, Saccharomyces, Rhodoturula, Sporobolomyces, Hansenula und Pichia ausgewählt werden.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge des zum Extraktions-Fermentations-Medium zugegebenen Vorläufermaterials ausgewählt wird zwischen 5,0 bis 25,0 g 1&supmin;¹ für die Samen und das Äquivalent ausgedrückt in Trockengewicht für die Mehle, und 3,0 bis 12,0 g 1&supmin;¹ für das Vorläufermaterial der Polysaccharidfraktion.

5. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei man das Extraktions- Fermentations-Medium ohne Rühren bei einer Temperatur von 35º bis 45ºC ruhenläßt wird und der Fermentationsprozeß während 4 bis 13 Tagen durchgeführt wird, wobei der pH bei 3,0 bis 5,0 kontrolliert wird, um eine Lösung zu erhalten, welche die die nicht kovalenten Polysaccharid-Protein-Verbindungen bildenden Moleküle enthält

6. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die chemische und enzymatische Hydrolyse durchgeführt wird durch Zugabe zu dem

futrierten Medium von:

einer aus der aus Salzsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Trichloressigsäure oder Trifluormethansulfonsäure mit pH 1 bis 2,8 gebildeten Gruppe ausgewählten Säure;

einem aus Harnstoff bei einer Konzentration von 6,0 bis 12, g 1&supmin;¹ ausgewählten chaotropen Mittel; Lyse-Enzymen, ausgewählt aus der von Papain, Chemopapain, Pepsin oder Bromelin gebildeten Gruppe in einer Menge von 0,1 bis 0,6 g 1&supmin;¹;

wobei die Inkubation während 6 bis 72 Stunden bei einer Temperatur von 35º bis 45 ºC durchgeführt wird.

7. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentrierung der Flüssigkeiten mit Membranen mit einer molekularen Abtrennung (cut-off) im Bereich von 10000 bis 50000 Dalton durchgeführt wird.

8. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nicht-kovalente Polysaccharid-Protein-Verbindung in unlöslicher Adsorbat-Form gereinigt wird, wenn die in der Lyse verwendete Säure Phosphorsäure ist, mit bis zu einer Endkonzentration von 10, bis 25,0 1&supmin;¹ zugesetztem Calciumchlorid, Natriumhydroxid in Lösung mit einem pH von 3,5 bis 4,4 und einem wassermischbaren Lösungsmittel wie Ethanol oder Aceton bis zu einer Endkonzentration von 25 bis 40 % (m/m).

9. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nicht-kovalente Polysaccharid-Protein-Verbindung durch erschöpfende Dialyse durch Membranen mit einer molekularen Abtrennung im Bereich von 10000 bis 50000 Dalton gereinigt wird und anschließend durch Eindampfen zur Trockne, Lyophylisierung, Sprühtrocknen oder Konzentrierung und Trocknen in Anwesenheit von Salzen wie Calciumsulfat und Phosphat isoliert wird.

10. Verwendung der nach dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellten nicht-kovalenten Polysaccharid-Protein- Verbindungen für die Herstellung eines Medikaments zur Wiederherstellung immunomodulatorischer und hämatopoetischer Aktivitäten in Menschen und Tieren.

11. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nicht-kovalenten Polysaccharid-Protein-Verbindungen immunomodulierende und Hämatopoetin-wiederherstellende pharmakologische Aktivität ausüben.

12. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ps-Pr-Verbindungen von:

Candida-Soja

Candida-Castor

Candida-Soja; Castor

Saccharomyces-Soja

Saccharomyces -Castor

Saccharomyces-Castor; Soja,

ihre Adsorbate und Mischungen mit Salzen ausgewählt werden.