DE2449530C2

DE2449530C2 - Virusuntereinheitenimpfstoff

Info

Publication number: DE2449530C2
Application number: DE2449530A
Authority: DE
Inventors: Margaret Irene Lydiate Lancashire Brady; Ian George Stephen West Kirby Wirral Merseyside Furminger
Original assignee: Duncan Flockhart Co Ltd
Current assignee: UCB Pharma Ltd
Priority date: 1973-10-18
Filing date: 1974-10-17
Publication date: 1985-08-08
Also published as: FR2248054B1; NO142024C; AU7444974A; DE2449530A1; NL7413642A; IE40187L; JPS5082228A; CA1050886A; NO743758L; AT334524B; NL181553C; ATA835074A; IE40187B1; NL181553B; CH611518A5; NO142024B; SE7413113L; BE821175A; DK138581C; DK138581B

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von pyrogenfreien Virusuntereinheitenimpfstoffen, Insbesondere von Influenzalmpfstoff und die so erhaltlichen Impfstoffe.

Die bisher Im allgemeinen verwendeten Influenzaimpfstoffe sind desaktlvierte Gesamtvlrus-Vacclnen, die neben den Influenza-Vlrionen etwas Elproteln enthalten, das sich von der Allantols-Flüsslgkelt herleitet. In der der Virus geerntet wurde. Bei der Injektion kann diese Vacclneart eine Hypersensltlvltat hervorrufen, die durch das Eiproteln und durch die Vlrlonen bedingte pyrogene Effekte bedingt ist.

Das Influenza-Vlrus und ähnliche Viren des gleichen Typs, d. h. Orthomyxovlren und Paramyxovlren, sind durch eine äußere Membrane charakterisiert, die »Spikes« von Antlgenen mit haemagglutlnlerenrier Wirkung und Neuramlnldase-Wlrkung tragen. Diese äußere Membrane kann durch Lösungsmittel wie Äther oder durch oberflächenaktive MIttel gespalten werden, wobei als Untereinheiten Antigene freigesetzt werden, die eine haemagglutlnlerende Wirkung und eine Neuramlnldase-Wlrkung aufweisen. Die sogenannten »Spllt-Vlrus«- Vacclnen, die bisher auf diese Welse hergestellt wurden, zeigten eine geringere Pyrogenltät als entsprechende Gesamtvlrus-Vacclnen, obwohl kein Versuch unternommen wurde, die Antigene mit Neuramlnldase-Wlrkung und Haemagglutlnln-Wlrkung von Pyrogenen und anderen unerwünschten Materlallen, vle anderen Antlgenen und Nucleinsäuren zu trennen.

Es wurde nun jedoch gefunden, daß die Antigene mit haemagglutlnlerender Wirkung und mit Neuramlnldase-Wlrkung nicht selbst pyrogen oder In anderer Weise toxisch sind und daß daher eine noch weitere Verminderung der Pyrogenltät durch Erzielung der gewünschten Antigene, Im wesentlichen frei von anderem ungewünschtem Material erzielt werden kann.

Es wurde nun versucht, die Komponenten eines gespaltenen Viruspräparats (Spllt-Virus) durch Zonen-Ultrazentrlfugieren zu trennen. Es zeigte sich jedoch, daß das ansatzweise Beladen eines Ultrazentrlfugen-Rotors für Produktionen Im großen Maßstab nicht durchführbar war und es erwies sich als notwendig, eine kontinuierlich beladbare Zonenzentrifuge zu verwenden, worin die relativ verdünnte Suspension der Vlrus-Untereinhelten In den Rotor geleitet wird und durch das zentripetale Ende eines Konzentrationsgradienten fließt. Es wurde jedoch gefunden, daß die sehr kleinen Teilchen der gewünschten Antigene mit Haemagglutinln- und Neuramlnidase-Wirkung nur widerstrebend in den Gradienten mit Fließgeschwindigkeiten eingebracht werden konnten, die mit einer Produktion Im großen Maßstab In Einklang standen.

Es wurde nunmehr jedoch gefunden, daß Viren vom Influenza-Typ und von verwandten Typen, die leicht In den Gradient.:) einer kontinuierlich beladbaren Zonen-Ultrazentrifuge eingebracht werden können, erfolgreich aufgespalten werden können, während sie den Gradienten durchlaufen, wenn ein oberflächenaktives Mittel In der Gradientenlösung vorhanden Ist. Hierdurch wird die Herstellung von Unterelnhelten-Vacclnen, die Im wesentlichen frei von Elproteln, Pyrogenen und Vlrlon-Nuclelnsäuren sind und Im wesentlichen lediglich die gewünschten Schutzantigene mit Haemagglutinln- und Neuramlnldase-Aktlvltät enthalten, Im großen Maßstab erleichtert. Das in den sogenannten »Spikes« gefundene Haemagglutinln wird selbst durch das oberflächenaktive

Mittel zu einer monovalenten Form gespalten, die keine weitere Haemagglutlnlerung aufweist, sondern die gewünschten anilgenen Eigenschaften besitzt.

Im aligemeinen können alle ather-empfindUchen Viren durch Behandlung mit Detergentien gespalten werden und zusätzlich zu den vorstehenden Ortho- und Paramyxoviren können folgende Viren Untereinheiten-Vaccinen ergeben, die Schutzantlgenekomponenten analog dem Haemagglutlnln und der Neuraminldase ergeben, ^s nämlich:

a) Togaviren

b) Rhabdoviren

c) Leukoviren iu

d) Coronovlren

e) Arenoviren 0 Herpesvlren g) Pockenviren

Gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung von Vlrusunterelnheltenimpfstoffen geschaffen, abgeleitet aus ätherempfindlichen Viren, die frei von Pyrogenen, Virlon-Nucleinsäuren und unerwünschtem antlgenen Material sind, wobei ätherempfindliche Virussuspensionen gegebenenfalls nach Inaktivleren der Viren und Reinigen der Suspensionen durch Zentrifugation, Gelfiltration oder Adsorption einer kontinuierlichen Zonenultrazentrifugation unterworfen werden, und 1st dadurch gekennzeich- ^n net, daß für die Zonenultrazentrifugation eine Dichtegradientenlösung eingesetzt wird, die ein haemolytisches oberflächenaktives Mittel In einer Gesamtkonzentration In den Gradienten von mindestens 0,5 bis 1% (VoI/VoI) enthält, worauf die Fraktionen bzw. die Fraktion, die die Schutzariilgen-Unterelnhelten enthalten (enthält) Isoliert, vom oberflächenaktiven Mittel befreit und mit Adjuvantien zum Impfstoff konfektlert werden (wird). Die Erfindung betrifft ferner die so erhältichen Virusuntereinheitenimpfstoffe.

Es ist zwar möglich, die gesamten Vlrlonen direkt aus einem relativ verdünnten Kulturmedium, wi°. Allantols-Flüsslgkelt, zu beschicken, doch wird es Im allgemeinen bevorzug!, eine gewisse Reinigung des gesamten Viruspräparates vor dem Aufspalten In der Ultrazentrifuge durchzuführen.

Für eine derartige Reinigung kann das gesamte intakte desaktlvlerte Virus unter Anwendung üblicher Maßnahmen isoliert werden. So kann beispielsweise das Influenza-Virus in 10 bis 11 Tage alten Hühnerei-Embrlonen gezogen werden. Die geerntete Allantols-FIOsslgkelt kann anschließend behandelt werden z. B. mit /i-Proplolacton und/oder Formalin, um den Virus zu inaktivieren oder zu »töten« und anschließend durch Zentrifugieren z. B. In einer Wesiphalla-Zentrlfuge (Handelsname) mit kontinuierlichem Fluß geklärt werden.

Das Virus kann anschließend welter gereinigt werden. Dies kann durch Anwendung kontinuierlicher Sedlmentatlonszentrlfugation, Behandlung mit Fluorkohlenwasserstoffen bzw. Fluorkohlenstoffen, Gelfiltration oder Adsorption an roten Blutkörperchen oder Minerallen wie Barlumsulfat und anschließendes Eluleren erfolgen, es ist jedoch aufgrund der Geschwindigkeit und der leichten Handhabung in der Masse bevorzugt, eine kontinuierliche Zonenzentrifugatlon anzuwenden, beispielsweise unter Verwendung einer KIl-Apparatur beschrieben von Anderson et al. In Analytical Blochem. 32, 400-494 und 495-5U (1969).

Ein KII-Rotor mit einem Fassungsvermögen von 3,2 1 mit einem Saccharose-Dlchtegradlenten Ist besonders 4Π wirksam. Es kann die Methode von Reimer et al (Journal of Virology Vol. 1, Nr. 6, Selten 1207-1216) angewendet werden. Nach der Reinigung können die Vlrlonen enthaltenden Fraktionen, wie durch den Haemagglutlnlerungstiter bestimmt, anschließend vereint und verdünnt und dlalyslert werden, um die Dichte auf einen für die Einbringung In einen Gradienten in der zweiten Ultrazentrifuglerstufe geeigneten Maßstab zu vermindern.

Für die Spaltungsstufe des Virus werden die. Virionen vorzugsweise nach der Reinigung wie vorstehend beschrieben auf eine Dichtegradienten-Lösung einer Zonen-Ultrazentrlfuge mit kontinuierlicher Belndbarkelt aufgebracht. Was die Reinigung des Virus betrifft, so besteht ein zweckmäßiges Medium für den Gradienten In einer Lösung eines Zuckers, Insbesondere Saccharose, vorzugsweise In gepufferter Salzlösung bei einem für den Virus geeigneten pH-Wert. Im allgemeinen Ist ein pH-Wert von wenig über 7 erwünscht und es Ist zweckmäßig, 0,01 m-Phosphat als Puffer vom pH-Wert 7,2 zu verwenden. Ein Dlchtegradlent von etwa 1,02 bis etwa 1,24 g/ml ist geeignet. Andere Lösungen, die zur Bildung eines Dichtegradienten dieser Größenordnung verwendet werden können, umfassen Polyole, wie Glycerin und Salze, wie Tartrate oder Cäsiumchlorid. Der Gradient kann durch halbes Auffüllen des Rotors mit einer Lösung der geringsten Dichte des gewünschten Gradienten und Zugabe eines gleichen Volumens einer Lösung mit der höchsten Dichte hergestellt werden. Durch Drehen des Rotors bei mäßigen Geschwindigkeiten stellt sich dann der Gradient ein.

Wie vorstehend ausgeführt, enthält die Dlchtegradlent-Lösung ein oberflächenaktives Mittel, um das Virus zu spalten, während es den Gradienten durchläuft. Im allgemeinen kann das oberflächenaktive Mittel in wäßriger Lösung In den Gradienter« eingebracht werden und der Zentrifugenrotor wird eine gewisse Zelt rotiert, um das Eindringen des oberflächenaktiven Mittels In die Gradlentenlösung sicherzustellen. Alternativ kann das oberflächenaktive Mittel In der Gradlentenlösung vorliegen, wenn sie in den Rotor beschickt wird. Viele der haemoly- μ tischen oberflächenaktiven Mittel, die erfindungsgemäß verwendet werden können, bilden unterschiedliche Banden In dem Gradienten, obwohl die Bandenbildung kein wesentliches Charakterlstlkum darstellt. Die Lage der Bande In dem Gradienten ist nicht kritisch, da die Virtonen, die relativ dicht sind, den Gradienten durchlaufen, bis sie diese Bande erreichen; nach der Aufspaltung können Untereinheiten In Zonen geeigneter Dichte wandern, die sich auf der Seite der oberflächenaktiven Bande mit geringer Dichte befinden. e,5

Wie bereits ausgeführt, sollte das oberflächenaktive Mittel ein haemolytisches oberflächenaktives Mittel sein. Darunter Ist ein oberflächenaktives Mittel zu verstehen, das ein positives Ergebnis bei der folgenden Untersuchung liefert:

Rote Blutzellen von Kücken (0,5% Vol/Vol in 0,01 m-Phosphat gepufferter Salzlösung vom pH-Wert 7,0; 0,25 ml) werden zu einer l%igen Gew./Vo!. wäßrigen Lösung des oberflächenaktiven Mittels (0,25 ml) gefügt. Für iin positives Ergebnis muß eine vollständige Haemolyse innerhalb von 5 Minuten bei 22° C auftreten.

Diese Kategorie umfaßt die folgenden Typen von oberflächenaktiven Mitteln: Allgemeine Namen:

ζ. B. Nonldet P40 Tergitol NPX Triton NlOl Renex 698

W⁵

Il Belloid EMP

Adinol C0630

Nlchtlonüche Arylätheraddukte von Äthylenoxid Alkylphenol-Äthylenoxid-Kondensate

oder

Alkylphenol-polyoxyäthylene

oder

Polyäthoxyalkyl-phenole Octylphenol-polyoxyäthylen

oder

Polyäthoxyoctyl-phenol Nony lphenol-10,5 -oxyäthy len

oder

10,5-Äthoxynonyl-phenol

Nonylphenol-9-lO-oxyäthylen

oder

9-10-Äthoxynonyl-phenol

Nonylphenol-9-9,5-oxyäthylen

oder

9 -9,5-Äthoxynony I -phenol

Ociyiphenol-polyoxyäthylen

oder

PolySthoxyoctyl-phenol Polyoxyäthylennonyl-phenol Allgemeine Namen:

?g z. B. BrIj 96

;■*» Tergitol TMNlO ν Tergitol 15-S-7

Allphatlsche Ätheraddukte von Äthylenoxid

aliphatisch^ Alkohol-polyoxyäthylene

oder

Polyäthoxy-allphatische Alkohole Oleylalkohol-10-oxyäthylen

oder

10-Äthoxy-oleylalkolhol

Trlmethy lnonanol- 10-äthylenoxld Linearalkohol Cn-Ci₅ 7-Äthylenoxld

■;■■■» 5

ύ Allgemeine Namen:

_;' z. B. Clthrol 4ML 400

.^Esteraddukte von Äthylenoxid

Fettsäureester-polyoxyäthylene

oder

Polyäthoxyester von Fettsäuren Polyäthylenglykol-monolaurat

oder

Laurlnsäure 400-Polyäthylenglykolester

Allgemeine Namen: z. B. Ethomeen 18/25

Ethomeen C/25 «5 Ethomeen S/15

Amlnaddukte von Äthylenoxid Fettamln-polyoxyäthylene

oder

Polyäthoxyfettamlne Stearylamln-15-oxyäthylen

oder

15-Äthoxystearylamln

Kokosfettam Ine-15-oxyäthy len

oder

15-Äthoxykokosfettamlne (durchsch.^Utl. Mol-Gew. 860)

Sojafettamlne-5-oxyäthylen

oder

5 Äthoxysojafettamlne

Alkanolamldaddukie von Äthylenoxid

Allgemeine Namen: Alkanolamld-polyoxyäthylene

oder

Polyäthoxyalkanolamlde

z.B. Conox J 754 genaue Zusammensetzung nicht bekannt

Anionische

z. B. Texapon N25/5 Natriumsalz von sulfatislertem Lauryl(Dehydag)-alkohol-dloxyäthylen i< >

oder

Dloxyäthylennatrlum-Iaurylsulfat

Adlnol T Natrium-N-methyl-N-oleyltaurin

Solumln T 45 S Natrtumsalz von sulfonierten! Fettalkohol-45-oxyäthylen

oder is

45-Äthoxyfettalkohol-natrlumsulfonat
Teepol 610 Natrlum-sekundär-alkylsulfat

Sodlumdeoxycholat anlonlsches Gallensalz bzw. Gallensäuresalz

Pentrone A4 Aminsal7 vnn A|ky|arylsu!fons<ture

Verschiedene

z. B. Belloid M3 Polyoxyäthylen-3-kondensat mit einem aliphatischen Alkohol

Galoryl MT5

Im allgemeinen sollte die minimal wirksame Menge von oberflächenaktivem Mittel verwendet werden, um spätere Entfernungsprobleme zu vermindern. Für das bevorzugte oberflächenaktive Mittel, einem Arylätheraddukt von Äthylenoxid, speziell Triton NlOl, beträgt vorzugsweise die Gesamtkonzentration In dem Gradienten mindestens 0,5% (Vol/Vol), vorteilhaft 1,0% (VoI/VoI). Die Konzentration In der lokalisierten Bande In dem Gradienten ist selbstverständlich höher. Etwas oberflächenaktives Mittel liegt normalerweise Im gesamten Gradienten vor, wo die Untereinheiten der Vlrlonenbande gewünscht sind, was die Reaggregation der Untereinheiten verhindert oder auf ein Minimum herabsetzt. Tritt eine derartige Aggregation auf, so Ist die Abtrennung von unerwünschtem anligenen Material gering.

Das die gereinigten Vlrlonen enthaltende Medium wird anschließend durch die Zonenultrazentrlfuge so geleitet, daß sie in den Gradienten eintreten und durch das oberflächenaktive Mittel aufgespalten werden und sich gegebenenfalls Banden von abgetrennten Untereinheiten bilden. Im allgemeinen sollten die Vlrlonen in einem Ausmaß von etwa 2,8 Rotor-Volumina pro Stunde, z. B. etwa 10 1 pro Stunde, bei einem 3,6-1-KH-Rotor beschickt werden. (Werden die Vlrlonen gereinigt, ohne daß eine Aufspaltung eintritt, so kann die Beladungsgeschwindigkeit höher sein, z. B. 30 1 pro Stunde). Im allgemeinen kann die Umdrehungsgeschwindigkeit während der Beladung des Gradienten mindestens 20 000 Umdrehungen/Min., zweckmäßig 35 000 Umdrehungen/Min, betragen, was in der Kll-Zentrlfuge 90 000 g ergibt. Nach vollständiger »Beladung« wird der Uitrazentrlfugenrotor während eines weiteren Zeitraums, z. B. 2 bis 3 Stunden, rotiert, um die Banden welter zu trennen und zu verfestigen und nachdem der Rotor langsam verlangsamt und zum Stillstand gebracht wurde, werden die Inhalte des Gradienten in Fraktionen abfließen gelassen. Fraktionen, die die gewünschten Untereinheiten enthalten, können anschließend vereint bzw. gelagert werden.

Im Falle von Viren, die Neuraminidase oder analoges Material freisetzen, kann dieses nach Standarduntersuchungsmethoden festgestellt werden, z. B. nach der Methode von Warren (J. Blol. Chem. 234, 1959, Seite 1971). Im Falle von Viren, die einwertiges Haemagglutinln oder analoges Material freisetzen, kann dieses nicht durch Untersuchung der Haemagglutlnlerung Identifiziert werden, da das erhaltene Haemagglutinln In der einwertigen Form vorliegt und eine derartige Aktivität nicht entwickelt. Es Ist daher notwendig, den antlgenen Effekt der Proben (z. B. durch den Inhibiefüfigsiiter der Slaernagg'ut'nicrung oder den »single radis!« D'ffusions-Test) zu bestimmen oder ein physikalisches Charakterlstlkum, wie die optische Dichte, U.V.-Absorptlon usw. zu messen. In einigen Fällen findet man das Haemagglutinin In den gleichen Fraktionen wie die Neuraminidase.

Das verwendete Virus ist äther-empflndllch und hat so die notwendige abstreifbare Hülle, die antlgenes Material enthält. Das bevorzugte Virus ist ein Influenza-Vlrus, jedoch schließen andere geeignete Viren Masern- und menschliche Mumps- und Newcastle-Disease-Viren (NDV) des Geflügels (die alle Myxoviren sind) und das Rinder-Rhinotracheitis-Virus (das ein Herpes-Virus 1st) ein.

Zur Verwendung als Impfstoff müssen die vereinten Fraktionen von antlgenen Untereinheiten Im wesentlichen frei von jeglichem oberflächenaktiven Mittel sein, und dies kann im Falle von nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln, wie Triton NlOl, durch Senken des Flockungspunktes durch Zugabe von ionischem Material zu dem verdünnten wäßrigen Medium erzielt werden, so daß sich das oberflächenaktive Mittel als eine neue Phase abtrennt. Es hat sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, die Untereinheiten durch selektive Adsorption an kolloidales Aluminiumhydroxid (z. B. »Alhydrogel«) abzutrennen, wobei das oberflächenaktive Mittel in LOsung zurückbleibt. Dieses Verfahren kann, wo es anwendbar ist, wünschenswert als zweite Stufe nach der Senkung des Flockungspunktes durchgeführt werden. Die Anwendung des Aluminiumhydroxids hat den -Vorteil, daß die Antigene in einer Adjuvant-Form erhalten werden, die als solche als Impfstoff verwendbar ist. Alternativ können die Antigene nach Entfernung des oberflächenaktiven Mittels mit anderen geeigneten Adjuvantien, wie Ölemulsionen, z.B. Emulsionen von Wasser In einem öligen Fettsäureglycerid, wie ErdnttBol, In

Adjuvantienm übergeführt werden. Solche Emulsionen können nlcht-ionlsche Emulgatoren, wie Sorbitan-Trloleat und einen Stabilisator, wie Alumlniummonostearat, enthalten.

Die Wirksamkeit (Potenz) der an »Alhydrogel« adsorbierten Influenza-Untereinhelten-Impfstoffe wurde mit einem wäßrigen Influenza-Gesamtvirus-Impfstoff verglichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Die Wirksamkeit wurde durch Intramuskuläre Impfung von Gruppen von 5 Kücken in das Bein mit 0,5 ml Impfstoff-Verdünnungen am Tage 0 und am Tage 14 und Ausbiuten am Tage 28 bewertet. Es wurden die Inhibierung der Haemagglutlnatlon und die Antineuramlnidase-Antlkörperchen bestimmt.

Tabelle

Impfstoff (Influenza-Virus Stamm A/Hongkong/l/68X)

Titer der Inhibierung der Haemagglutination

mittlerer geometrischer Titer (GMT)

2 Wochen 4 Wochen

Antineuraminidase-Titer

G. M. T. 4 Wochen

wäßriger Gesamtvirus einfache Stärke (singie strength)

wäßriger Gesamtvirus 1 :4-Verdünnung

wäßriger Gesamtvirus 1 : 10-Verdünnung

wäßriger Gesamtvirus 1 :100-Verdünnung

adsorbierte Untereinheit einfache Stärke (single strength)

adsorbierte Untereinheit 1 :4-Verdünnung

adsorbierte Untereinheit 1 : IQ-Verdünnung

adsorbierte Untereinheit 1 :100-Verdünnung

2 027

582

291

1536

1 163

18

75

27

137

26

36

Das wäßrige »single strengthw-Vlrus, bezogen auf den Haemagglutinationstlter, enthielt 400 I.E./mi (i.u./mi). Der »single strengthw-Unterelnhelten-Impfstoff enthielt eine äquivalente Antlgenmenge. Diese Ergebnisse zeigen, daß der adsorbierte Untereinheiten-Impfstoff eine gleiche oder bessere antigene Wirkung aufweist wie der wäßrige Gesamtvirus-Impfstoff.

Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung eines adjuvantlerten Vlrusuntereinhelten-Impfstoffs geschaffen, der antigene Schutzbestandteile enthält und Im wesentlichen frei von Pyrogenen, Nucleinsäuren und unerwünschten Antlgenen Ist, das die Stufe der Adsorption des (der) erforderlichen schützenden Antlgenbestandtells (bzw. -bestandteile), erhalten durch die vorstehende erfindungsgemäße Arbeltswelse, vorzugsweise nach einer ersten Entfernung des größten Anteils von jeglichem zurückbleibendem oberflächenaktiven Mittel, an kolloidales Aluminiumhydroxid einschließt. Nicht-Ionische oberflächenaktive Mittel können beispielsweise durch Senkung des Aüsfiockungspur.kles entfernt werden.

Das verwendete kolloidale Aluminiumhydroxid enthält zweckmäßig etwa 2% als Al(OH)₃, z. B. Alhydrogel. Die Endkonzentration des 2%igen Alumlnlumhydroxldgels In dem Impfstoff sollte Im allgemeinen vorzugsweise 6,0 bis 18% (Vol/Vol), bevorzugt etwa 12,5* (Vol/Vol) betragen. Der adsorbierte Impfstoff kann, falls gewünscht, von jeglichen assoziierten Verunreinigungen freigewaschen werden, z. B. von restlichem oberflächenaktiven Mittel, durch Zentrifugleren des Aluminiumhydroxids und Resuspendieren In frischer phosphatgepufferter Salzlösung. Der optimale pH-Wert für den pH-Wert des endgültigen Impfstoffs betragt 7 bis 8, vorteilhaft etwa 7,6.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung: Beispiel 1

Der Influenza-Virus Stamm A/Hongkong/1/68X wurde in 11 Tage alten embryonislerten Hühnereiern gezogen. Die Allantols-Flüsslgkelt wurde nach 48 Stunden geerntet, über Nacht bei Raumtemperatur mit /?-Proplolacton (1 ml pro 1000 ml Allantols-Flüssigkelt) inaktiviert und anschließend mit einer Zentrifuge mit kontinuierlichem Fluß (Westphalia, Handelsname) geklärt. Die geklärte Inaktivierte Allantols-Flüsslgkelt wurde mit 101 pro Stunde über einen aus 60» (Gew./Gew.) Saccharose in 0,01 m-phosphat-gepufferter Salzlösung vom pH 7,2 (1,81) und reiner 0,01 m-phosphat-gepufferter Salzlösung vom pH 7,2 (1,41) hergestellt. In einem KII-Rotor

eingeflößt. Die Rotorgeschwindigkeit betrug 35 000 Umdrehungen/Min. (90 000 g), und es wurde 2 Stunden rotiert, nachdem die gesamte Allantols-Fiüssigkelt eingebracht worden war. Die die Influenza-Vlrionen enthaltenden Fraktionen, wie durch ihren Haemagglutlnintiter bestimmt, wurden vereint [13 500 I.E. (l.u.) pro ml; Insgesamt 1500 ml].

Die Virionen waren In den 40% Gew./Gew. Saccharose enthaltenden Fraktionen vorhanden und wurden 1:8 In 0,01 m-phosphat-gepufferter Salzlösung vom pH-Wert 7,2 auf eine Saccharosekonzentration von 5% (Gew./Gew.) verdünnt. Die verdünnten Virionen wurden In einen Saccharose-Gradienten, der 1% Triton NlOl enthielt, In den KIl-Rotor mit 10 1 pro Stunde gefüllt. Der Saccharose-G rad lent wurde durch Auffüllen des stationären Rotors mit 1,81 60%lger (Gew./Gew.) Saccharose In 0,01 m-phosphat-gepufferter Salzlösung vom pH 7,2, die auch 15b (Vol/Vol) Triton NlOl enthielt und 1,41 0,01 m-phosphat-gepufferter Salzlösung vom pH-Wert 7,2 am oberen Teil und anschließendes Beschleunigen des Rotors auf 90 000 g (35 000 Umdrehungen/Min.) hergestellt. Der Rotor wurde mit 35 000 Umdrehungen/Min. 2 Stunden rotiert, nachdem das gesamte Influenza-Virus eingebracht worden war. Die den großen Neuramlnidase- und ΤγΙιοα-Ρ'ή'-. -.-thaltenden Fraktionen wurden vereint; es war auch Haemagglutlnln anwesend (50% des Originalgehalis aurch den Haemagglutlnintiter). Zu 3 Teilen dieser Lösung wurde 1 Teil 1,6 m-Phosphatpuffer vom pH 7,6 gefügt. Die Mischung wurde trüb, und die Phasen trennten sich bei 20m!nütigem Rotleren bei 2000 g. Die untere Phase wurde gesammelt und enthielt die Neuramlnidase und das Haemagglutinln mit lediglich etwa 0,05% (Vol/Vol) Triton NlOl (Ausbeute 40%). Zu einem aliquoten Teil von 10 ml davon wurde ein gleiches Volumen »Alhydrogel« zugefügt, und die Mischung konnte über Nacht bei 4° C adsorbiert werden. Es wurden Verdünnungen gemacht, und die Wirksamkeit der Verdünnungen an Kücken bewertet. Nach Bestimmung der Verdünnung zur Bildung eines :n Impfstoffs mit adequater Wirksamkeit wurde der gesamte Impfstoff auf diese Stärke verdünnt, jedoch wurde die Endkonzentration von »Alhydrogel« bei 12,5% gehalten. Vor der Adjuvant-Blldung des Impfstoffs wurde die Wirksamkeit nach der »single radial-Dlffuslonsmethjde« von Schild, J. Gen. Virology, 16, (1972), 231-236 bestimmt.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch In dem Gradienten das Triton NlOl ersetzt wurde durch Ethomeen 18/25.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch das Triton NlOl nicht durch Senkung des Flokkungspunktes abgetrennt wurde. Anteile davon wurde zu den Fraktionen aus der Kll-Zentrifuge, die Haemagglutlnln, Neuramlnidase und Triton NlOl enthielten, 12,5% (Vol/Vol) »Alhydrogel« gefügt. Die Mischung wurde bei 4° C über Nacht stehengelassen, und das »Alhydrogel« wurde abrotiert. Die überstehende Flüssigkeit enthielt das Triton NlOl. Das Pellet wurde auf sein Originalvolumen mit 0,01 m-phosphat-gepufferter Salzlösung vom pH 7,2 suspendiert rotiert, und das Pellet erneut In seinem Originalvolumen von 0,01 m-phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert. Die Wirksamkeit des Impfstoffs wurde wie In Beispiel 1 bestimmt und der Impfstoff entsprechend verdünnt, wobei die Endkonzentration von »Alhydrogel« auf 12,5% (Vol/Vol) gehalten wurde.

Beispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit dem Influenza-Vlrusstamm B/Hongkong/8/73 unter Bildung eines wirksamen Impfstoffs wiederholt.

Beispiel 5

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit dem Influenza-Virusstamm B/Vlctorla/98926/70 unter Bildung eines so wirksamen Impfstoffs wiederholt.

Beispiel 6

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit dem Influenza-Vlrusstamm A/England/42/72 unter Bildung eines wirksamen Impfstoffs wiederholt.

Beispiel 7

»Newcastle-Dlsease«-Vlrus wurde in 10 Tage alten embryonlslerten Hühnereiern gezogen. Die Allantols-Flüs- «0 slgkelt wurde nach 96 Stunden geerntet und mit jS-Proplolacton (1 ml pro 1000 ml Flüssigkeit) wahrend 2 Stunden bei 37° C Inaktiviert. Die .Lösung wurde bei 10 000 g mit einer Flußgeschwindigkeit von 201 pro Stunde zentrifugiert, um sie zu klaren und Urate aus der Lösung zu entfernen.

Die geklärte Allantols-Flüsslgkeit wurde über einen Saccharose-Gradienten, hergestellt wie In Beispiel 1, In den KII-Rotor mit 101 pro Stünde gefüllt. Der Rotor wurde bei 35000 Umdrehungen/Min, während 2 Stunden nach der Einbringung der gesamten Allantois-Flüsslgkelt zentrifugiert. Die die Untereinheiten enthaltenden -Fraktionen, bestimmt durch den Neuramlnldasegehalt, wurden vereint. Es wurde weiter wie in Beispiel 1 beschrieben, vorgegangen.

	5	24 49 530	Beispiel 1 wurden nach m-phosphat-gepufferter Haemagglutlnln pro ml
	IO	Beispiel 8	39,5 ml 53 ml 5 ml 2,5 ml
	15	Die Influenza, Neuramlnldase und Haemagglutlnln enthaltenden Fraktionen von Entfernung des Triton NlOl durch Senkung des Flockungspunktes vereint und mit 0,0 Salzlösung vom pH 7,2 zur Bildung einer Flüssigkeit verdünnt, die 1600 I.E. (l.u.) enthielt. Es wurde anschließend In den folgenden Anteilen homogenisiert:	und das Sorbitantrloleat
	2(1	Vlrus-Unterelnhelten-Flüsslgkelt Pflanzenöl Sorbitantrloleat Alumlnlum-Monostearat
	25	(Das Aluminium-Monostearat wurde In dem Pflanzenöl zur Dlsperglerung erwärmt vor dem Vermischen mit der wäßrigen Phase zugefügt). Die antigene Wirkung dieses Impfstoffs wurde am Kückenversuch bestätigt.
	30
	35
	40
	45
	50

I	55
SH
I	60
j	65
I A
ρ
I I I	8

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen von Virus-Untereinhelten-ImpfstofTen abgeleitet aus ätherempflndllchen Viren, die frei von Pyrogenen, Vlrion-Nuclelnsäuren und erwünschtem üntlgenen Material sind, wobei atherempflndliche Virussuspensionen gegebenenfalls nach Inkrafttreten der Viren und Reinigen der Suspensionen durch Zentrifugatioa, Gelfiltration oder Adsorption einer kontinuierlichen Zonenultrazentrifugation unterworfen werden, dadurch gekennzeichnet, daß für die Zonenultrazentrifugation eine Dichtegradientenlösung eingesetzt wird, die ein haemolytisches oberflächenaktives Mittel In einer Gesamtkonzentration In den Gradienten von mindestens 0,5 bis 1% (Vol/Vol) enthält, worauf die Fraktionen bzw. die Frak- tion, die die Schutzantigen-Unterelnheiten enthalten (enthält) isoliert, vom oberflächenaktiven Mittel befreit und mit Adjuvantien zum Impfstoff konfektiert werden (wird).

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktives Mittel ein Arylätheraddukt von Äthylenoxid verwendet wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel Nonylphenol-9-10-oxyäthylen ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Virus ein Influenza-, ein Herpes-, Mumps-, Masern- oder Newcastle-Disease-V Ims einsetzt.

5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das nlcht-ionlsche oberflächenaktive Mittel aus den suspendierten Schutzantigen-Unterelnheiten durch Einstellen der lonenstärke der Suspension auf den Ausflockungspunkt des oberflächenaktiven Mittels entfernt wird.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzantigen-Unterelnheiten durch selektive Adsorption an kolloidales Aluminiumhydroxid sowohl gereinigt als auch adjuvantien werden.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das kolloidale Aluminiumhydroxid etwa 2% als AI(OH)₃ enthäh und die Konzentration des kolloidalen Aluminiumhydroxids im Impfstoff 6,0 bis 18% (Vol/Vol) beträft.

8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß das Adjuvant eine Emulsion von Wasser In Erdnußöl 1st und Sorbltantrloleat als Emulgator und Aluminlum-Mcnostearat als Stabilisator enthält.

9. Virusuntereinheitenimpfstoff, erhältlich nach den Maßnahmen der Ansprüche 1-8.