DE3009064C2

DE3009064C2 - Verfahren zur Herstellung eines Tollwutimpfstoffes

Info

Publication number: DE3009064C2
Application number: DE3009064A
Authority: DE
Inventors: Klaus R. Dr.phil. Dr.med.vet. Flamatt Schell
Original assignee: Schweiz Serum und Impfinstitut und Institut zur Erforschung der Infektionskrankheiten
Current assignee: Cilag GmbH International
Priority date: 1979-04-10
Filing date: 1980-03-10
Publication date: 1984-01-12
Also published as: GB2048066A; GB2048066B; BE882684A; FR2453651B1; CH638985A5; FR2453651A1; US4255520A; DE3009064A1; CA1127081A

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung eines wesentlich verbesserten Tollwutimpfstoffes, der durch einen hohen Wirkstoffanteil im Verhältnis zu kontaminierenden Eiweißen und Fettstoffen, d. h. eine besonders hohe spezifische Aktivität gekennzeichnet ist.

Tollwutimpfstoffe wurden bisher gewonnen aus Gehirnen von Kaninchen, Ratten oder Mäusen, In denen durch direkte intracerebrale Inokulation von Tollwutviren aus standardisierten Saatstämmen die Viren Im lebenden Tier vermehrt wurden. Diese Verfahren sind mit verschiedenen Nachteilen verknüpft.

1. Die Züchtung der Viren erfolgt am lebenden Tier, das unter der Prozedur großen Leiden ausgesetzt wird und schließlich geopfert werden muß.

2. Die Inokulation am lebenden Tier, die Haltung der Tiere und die Ernte der Viren aus deren Gehirnen kann nicht unter so vollkommenen hygienisch einwandfreien und sterilen Bedingungen erfolgen wie z. B. bei Vermehrung der Viren in vitro oder im El.

3. Die Entnahme des Gehirns bei wenigen Tagen alten Kaninchen, Ratten oder Mäusen erfordert eine recht schwierige und aufwendige Operationstechnik. Außerdem sind bei der Kleinheit und dickflüssigen Konsistenz dieser Gehirne die Verluste an Gehirnsubstanz erheblich.

4. Die an lebenden Tieren gezüchteten Viren sind mit Proteinen verunreinigt, die einen verhältnismäßig hohen Gehalt an Myelin aufweisen, einer protelnhaltlgen Substanz, die bei der Anwendung des Impfstoffes Anlaß zu Nebenreaktionen gibt, die sich bis Encephalitis steigern können. Durch Verwendung von ganz jungen, nur wenige Tage alten Tieren für die Virusvermehrung kann der Myelingehalt reduziert aber nicht vermieden werden.

Eine Verbesserung wurde durch Vermehrung der Tollwutviren In Entenembryonen erzielt. Zi-rn einen wird dadurch die Verwendung von lebenden Tieren vermieden und zum andern Ist Im embryonalen Gewebe der Gehalt an Myelin geringer wenn überhaupt schon vorhanden.

Trotzdem weist der aus Entenembryonen gewonnene Tollwutimpfstoff noch erhebliche Nachteile gegenüber dem Idealimpfstoff auf. Die aus den Embryonen gewonnene Virussuspension enthält einen hohen Anteil an Proteinen, die sich aufgrund der Beschaffenheit der Suspension aus Zellen und Viren nach bekannten Methoden wirtschaftlich nicht oder nur unvollkommen abtrennen lassen. Je höher der Protelngehait von Impfstoffen ist. um so mehr unerwünschte Nebenreaktionen treten bei dessen Anwendung auf. Diese können sich bei wiederholtem Impfen, das bei gewissen Berufsteuten wie Jägern, Förstern, Tierärzten unerläßlich Ist, zu heftigen allergischen Abwehrreaktionen gegen das artfremde Eiweiß steigern.

Ein besserer Impfstoff läßt sich durch Vermehrung der Tollwutviren in dlplolden Humanzellkulturen in vitro erzielen.

Vergleiche dazu: H. Koprowski, Labor.tory Techniques In Rabies by M. M. Kaplan and H. Koprowski, WHO Monograph Series No. 23, Chapter 28, pp. 256-60 (1973): Vaccine for mars prepared in human dlplold cells; T. J. Wiktor, Develop, biol. Standard, Vol. 37, pp. 265-66, S. Karger, Basel 1978: Production and control of rabies vaccines made on diplold cells;

T. J. Wiktor et al. Develop, biol- Standard, Vol. 40, pp. 3-9 (1978): Development and clinical trial of rabies vaccine of tissue cultur. Der so gewonnene Impfstoff enthält als Verunreinigung humane Proteine, welche weniger Nebenreaktionen erzeugen als artfremde Proteine. Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode 1st die relativ geringe Vermehrungsrate der Tollwutviren auf dlploiden Fibroblastzellen, was eine 10- bis 25fache Aufkonzentrierung für die Impfstoffherstellung nötig macht. Diese Methode 1st daher nicht leistungsfähig genug, um den weltweiten Bedarf an Tollwutimpfstoff Im Rahmen der wirtschaftlichen Möglichkeiten zu decken.

In der US-PS 36 74 862 wird die Herstellung eines Tollwutimpfstoffes In Entenembryo-Ze'.lkulturen beschrieben. Die Vermehrungsrate η Zellkulturen ist limitiert.

-Ό Die US-PS 39 73 000 beschreibt eine Methode zur Anreicherung von Tollwutviren durch Dichtegradientenzentrlfugation. M. Rolle und A. Mayr: Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre, Stuttgart 1978, S. 489-493 beschreiben die traditionelle Herstellung von Entenf>mhri;«A_Tr\Il\i/iitimnfctnff

Aufgabe der Erfindung war es, ein ökonomisches Verfahren zu entwickeln und zu realisieren, welches die Nachteile der vorbek.innten Methoden vermeldet und gleichzeitig einen Impfstoff liefert, der ein besseres Ver-5" hältnls von Antigenwert zu Protelngehait aufweist und qualitativ dem Idealimpfstoff nahekommt.

Diese Aufgabe wird wie aus den vorstehenden Ansprüchen ersichtlich Relöst.

Das neue Verfahren zur Herstellung eines Tollwut-Impfstoffes ist somit dadurch gekennzeichnet, daß zum

7Atl/>vtral/tAc nur

rlpr Fmhrvn- __. —. , _

nen verwendet werden und aus dem Zellextrakt das Antigen durch Differential- und anschließende Dlchtegradientenzentrifugation angereichert wird.

Geeignete Geflügelarten für die Vermehrung der Tollwutviren in deren Embryonen schließen ein Enten, Hühner und Wachteln.

Die beiden erfindungsgemäßen Maßnahmen, Verwendung nur der Köpfe der Embryos und die Dichte- und Differentlalgradientenzentrifugatlon dienen demselben Zweck, der Verminderung unerwünschter Fremdsubstanzen und der gleichzeitigen selektiven Anreicherung des gewünschten Immunogenen Wirkstoffes, und passen

organisch ineinander, indem die Abtrennung der unerwünschten Proteine nur möglich ist, wenn der Vlmsanteil in den durch Zerkleinerung gewonnenen Zellextrakten so hoch ist, daß diese durch Verdünnung leicht fließbar- und pumpfähig gemacht werden können, ohne dadurch den Virusgehalt unter das erforderliche Maß zu senken. Diese Konzentration wird erreicht, wenn man nur die Köpfe der Embryos verwendet, weiche die höchste Virenkonzentration aufweisen, während die Embryonenrümpfe nur ca. 10% der Viren des Gesamtkörpers enthalten. Der erfindungsgemäß erhaltene Tollwutimpfsloff ist demnach besonders dadurch gekennzeichnet, daß er nur aus den Köpfen von Geflügelembryos, in denen das Tollwutvirus vermehrt wurde, geerntet worden ist.

Durch Ernte bloß der Embryonenköpfe wird die Viruskonzentration im Verhältnis zum Proteinanteil bereits um mehr als das 3fache gesteigert.

Sterile Enienembryonenkopfpools werden mit einer entsprechenden Menge von Phosphatpufferlösung In einem BlenJer zu einer 5 Ws 33%lgen Suspension homo- 2a genisiert. Zur Verdünnung können außer Phosphatpuffer aus Di-Nalrium-hydroEe/iphosphat 0,75%, Kalium-dlhydrogen-phosphat 0,145%, Natriumchlorid 0,48% in destilliertem Wasser (pH 7,4) auch andere in der Vlruslmpfstoffproduklion gebräuchliche Salzlösungen und sogar entsalztes Wasser verwendet werden, vorausgesetzt, daß man in einem pH-Bereich von 7 bis 8 bleibt.

Die Abtrennung des überwiegenden Teils der restlichen Proteine erfolgt durch Dlfferentialzentrifugatlon (= VorrelnigungszentrifugatlorO der verdünnten Suspension des feinst zerkleinerten Embryonenkopfhomogenisates bei etwa 10 000 xg bis :*> 000 xg. Die anschließende Dichtegradlentenzentrifugation des Überstandes wird In an sich bekannter Welse bei 15 000 bis 90 000xg mit Hilfe vcn verschieden konzentrierten Zuckerlösungen und von J5 Pufferlösungen, d. h. in steigenden Zuck^rkonzentratlonen und in Pufferlösung, in an und für slcli bekannter Welse durchgeführt. Dazu wird die vorgereinigte Suspension bei 55 000 bis 90 000 xg und einer Durchflußrate von 4 Lit./h über eine vorgelegte Stufengradiente zunehmender Konzentrationen von Zucker (gewöhnlich Saccharose von 15 bis 55%) gepumpt. An den Fraktionen, die von den verschiedenen Dichten gesammelt werden, werden Dichte, Protein- und Antigen-Gehalt sowie Sterilität bestimmt. Die antigenhaltigen Fraktionen werden gepooii, nochmals geprüft und dann zur Vakzine /elierverarbeltet. Physiologische Salzlösungen jeder Art, z. B. der weiter oben genannte Phosphatpuffer, können zur Verdünnung eingesetzt werden.

Vergleiche dazu: Entenembryo Tollwutvakzine: J. M. 5<> Hosklns, Laboratory Techniques in Rabies by M. M. Kaplan et al, WHO Geneva 1973, Chapter 27, pp. 243-55. Dichtegradlentenzentrifugation: J. Hilfenhaus et al. Journal of Biological Standardization 1976, 4, 263-271;
M. Majer et al. Develop, blol. Standard, Vol. 37, pp. 267-271 (1977);

F. Äiaiiosiu ei a\, Develop. b!o!. Standard, Vg!. 40, pp. 35-44.

Durch diese selektiven Zentrlfugationen werden etwa 85% des restlichen Proteingehaltes eliminiert. Damit kann der erfindungsgemäß erhaltene Impfstoff gegenüber üblichem Entenembryo-Todwutlmpfsloff bis zu SOfach verbessert werden.

Diese gewaltige Verbesserung ist auf die Verminderung des Proteingehaltes um etwa das 20fache Und die gleichzeitige Freisetzung von sehr viel mehr Viren je Embryo zurückzuführen. Bei der Aufarbeitung gehen weniger Viren durch Bindung an Zelloberflächen sowie durch volumetrische und mechanische Verluste verloren. Die volumetrfschen Verluste entstehen beim Abzentrifugieren von viel Zelltrümmern im Sediment, die mechanischen Verluste beim Zentrifugieren von viskoseren Suspensionen, bei der mehr Viren und Virusaggregate mitniedergeschlagen werden.

Die getroffenen Maßnahmen zur Verbesserung des Tollwutimpfstoffes lagen nicht auf der Hand.

Bei Infektion des Gehirns von jungen Säugern (Kaninchen, Ratten, Mäusen) durch cerebrale Inokulation von Tollwutviren 1st es naheliegend, daß die Vermehrung dei Viren zunächst im Gehirn erfolgt Dasselbe Ist nicht als selbstverständlich vorauszusetzen, wenn im angebrüteten Geflügelei die Inokulation in den Dottersack erfolgt. Es hat Fich nun gezeigt (siehe Beispiel 2A), daß die Vermehrung 'uch in diesem Fall weit überwiegend, zu ca. 90% im Gehirn erfolgt, wobei das Virus aus dem Dottersack In das Embryo wandert und dort das in Bildung begriffene Nervengewebe bevorzugt befällt. Dies war auch im Hinblick auf die bekannte Möglichkeit, Tollwutviren in Zellkulturen zu vermehren, die keine Verwandtschaft zu Nervengewebe aufweisen, nicht sicher vorauszusehen.

Vergl. dazu: CA-PS 8 27637 und 8 Il 119: Vermehrung von Tollwutviren in vitro auf Hamsternleren-Zellkulturen.

T. J. Wiktor, Develop, biol. Standard, VoI. 37, pp. 265-266 (S. Karger. Basel 1977);

T. J. Wiktor et al. Develop, biol. Standard, VoI 40, pp. 3-9 (1978): Development and production of rabies vaccine on human dlploid cells (Lungenfibroblasten);
P. Atanasiu et al, ibid. 40, pp. 35-44 (1978): Human rabies vaccine on bovine fetal kidney cells;
A. L. van Wezcl et al, ibid 40, p. 69-75 (1978): Production of rabies vaccine In dog kidney cells;
J. F. Lavender et al. Applied Microbiology, Sept. 1971, Vol. 22, No. 3, pp. 358-365: Duck Embryo cell culture for rabies vaccine.

Es war auch nicht a priori zu erwarten, daß das erst in Bildung begriffene Embryo-Gewebe schon so ausgeprägt organspezifische und damit für Viren selektiv anfällige Zellen aufweist. Vergl. dazu: J. F. Lavender f-l al, Ioc. clt. Jedenfalls Ist bis heute für die Herstellung von Tollwutimpfstoff durch Vermehrung der Viren in angebrüteten Enteneiern stets der ganze Embryokörper geerntet und zur Herstellung des Virus- und Zellen-Homogenlsates verwendet worden. Vsrg¹,. dazu: J. M. Hosklns, Laboratory Techniques in Rabies by M. N. Kaplan et al, WHO. 1973, Chapter 27, pp. 243-55: Duck-Embryo Vaccine.

Auch bei der analogen Herstellung von Tollwut-Lebend-Impfstoff, wobei die Vermehrung auf Genügeleiern erfolgt, wird das gesamte Embryo geerntet.

Vergl. dazu: H. Koprowski, Laboratory techniques in Rabies, Chapter 26, pp. 235-42: Chicken '_mbryo Vaccine.

Durch die Verwendung der Embryonenköpfe allein wird nach dem Homogenisieren derselben eine Suspension crhslicn, die c£"e sehr hchs Viruskonzsntr2"^nti 21*^- weist. Sie läßt sich verdünnen und damit wie oben beschrieben in eine für die Abtrennung der Proteine durch Differential- und Dichtegradientenzentrlfugatlon erforderliche Form bringen. Bei Verwendung der ganzen Embryos, wie das in den bisher beschriebenen Verfahren stets geschieht, vergl. Hosklns Ioc. clt., entsteht nach der Homogenisierung des 33%lgen Extraktes und Abzentrifugatlon der groben Teile mit etwa 2600 Touren pro Minute eine Suspension, die verhältnismäßig dickflüssig und daher nicht zur Dlchtegradienten-Zentrlfugatlon verwendbar Ist.

Das nach dem erfindungsgemaßen Verfahren erhaltene Impfstoffkonzentrat zeichnet sich nicht nur durch seinen hohen Gehalt von weit über 100 Antigenwerteinheiten (gemessen am NIH Standard mittels des Standard NJH Tests in Mäusen und des RFFIT Tests) pro mg Stickstoff aus. er ist auch unter Verwendung von noch ungeborenen noch nicht schmerzempfindenden Embryos erhalten worden, die zudem in ihrem erst in Entwicklung begriffenen Gehirngewebe frei von Myelin zu sein scheinen.

Vergl. dazu: M. Abdussalem et al. The problem of antirabies vaccination. International conference on the application of vaccine against assay viral rickettsial and bacterial diseases of man Pan. Am. Health Org. (PAHO), Sc. pub. No. 226 (1970) pp. 54-59;
P. Fenje, The status of existing rabies ν Ines, ibid pp. 60-65.

Es hat sich gezeigt, daß 50%'ges Ci-:' ^:T.r>.jrnogenat von Entenembryonen kein Myeün „nthäh. -is mittels PoIyacrylamidgel-EIektrophorese r~—'veisbar ist, während unter -dentischen BediPgü^r _Q,_fi Myelin im Gehirn erwachsener Enten und ''Inder nachgewiesen werden konnte.

Nach dem vorliegenden neuen Verfahren fassen sich praktisch unbegrenzte Mengen öder jedenfalls reichlich genügende Mengen des gesuchten, wertvollen und unschädlichen Impfstoffes mit verhältnismäßig geringem Aufwand ökonomisch herstellen. Dies ist bei Herstellung jvon Tollwutimpfstoff durch Vermehrung der Viren in menschlichen Diploidzellkulturen infolge deren geringer Leistungsfähigkeit nicht möglich. Vergl. dazu: Anweisung des »Centre for diseases control« CDC vom Febiuar 1979:

Das CDC hat die Verwendung von humanem Diploidzelltollwutimpfstoff auf Personen reduziert, weiche durch Entenembryo-Vakzine lebensgefährliche Reaktionen erlitten oder keinen ausreichenden Antikörperliter erreichen konnten. Als Grund wird die ungenügende ProduR tivität von humanen Diploidzellkuituren genannt. Siehe auch: Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR) 27.333,413(1978).

Da aus Uerschützerischen Gründen und wegen ungenügender Verträglichkeit und Sicherheit die Tollwutimpfstoffhcrstellung am geborenen und mit Sicherheit leidenden Säugetier nicht mehr verantwortbar ist, besteht ein großes Bedürfnis nach einem neuen, einfach herzustellenden, nicht zu teuren, wirksamen und sicheren Tollwutimpfstoff, der für die Bekämpfung der praktisch weitweit verbreiteten mit Sicherheit tödlich verlaufenden schrecklichen Infektionskrankheit das einzig wirksame Ξ Mittel ist. - _."

^r In der folgenden Tabelle sind ..Marakteristische und -~ maßgebende Kennzahlen von TolIwuEimpfstoffen, die nach bekannten, üblichen Verfahren hergestellt wurden ■- (Impfstoff A-F), sowie die entsprechenden KenrizaKleri eines nach der vorliegenden Erfindung hergestellten Impfeoffes G aufgeführt.

Tabelle

AGW-E/ Prot-gehalt/ AGW-E/ Dosis Dosis (mg) mgProt.

Gehirnsubstanz im Ausgangsmaterial einer Dosis ') (mg)

A:

Kaninchengehirnimpfstoff
5% Gehirn,
Dosis 2 ml

B:

Babymäusegehirnimpfstoff
1% Gehirn,
Dosis 2 ml

C:

Rattengehirnimpfstoff
10% Gehirn,
Dosis 1,5 ml

D:

SchafsgehirnimnfRinft"
5% Gehirn,
Dosis 5 ml

3,4 100

4,8

8,5 150

250

E: 0,6

EntenembryoimpfstoflF
nach Hoskins
33% Suspension

F: 2,5 20-50

HunianzellkulturimpfstofT

nach Krprowski

0,05

0,05 0,125

100
(20)

Tabelle (Fortsetzung)

AGW-E/ Prot.-gehalt/ AGW-E/
Dosis Dosis (mg) mgProt.

Gehirnsubstanz im A usgangsmaleriaE einer Dosis ')

G:

Gereinigter Entenkopfembryoimpfstoff gemäß
vorliegender Erfindung

2,5

0,6-1,2 3-5

') Schatzwerte

') !00 mg Kopfextralct. etwa ein Fünftel davon ist Gehirn - 20 mg

Antigenwerteinheiten (AGW-E): Faktor, um den ein Impfstoff besser oder weniger gut gegen Tollwut schützt als ein NIH-Referenz Impfstoff

PfOL » Protein

20

Kommentar:

Die Überlegenheit des erflndungsgcmäß erhaltenen Impfstoffes G gegenüber den Impfstoffen A-F Ist aus den Vergleichszahlen klar zu erkennen.

Bei allen In Betracht fallenden Parametern erreicht oder übertrifft dieser neue Impfstoff die Qualität der besten bisher bekannten Impfstoffe.

Einzig bei dem Babymausegehlrnlmpfstoff Ist der Proteingehalt niedriger. Dafür Ist bei diesem Impfstoff B mit einem Myelin-Gehalt zu rechnen, der Encephalitis erzeugen kann. Der Humanzeilkulturimpfstoff F. der kein Gehfmgewebe enthält, weist an deren Stelle hohe Proteingehalte auf. Die spezifische Aktivität (d. h. das Verhältnis zwischen Wirkstoffgehalt zu kontaminierenden Proteinen) Ist bei dem erfindungsgemäßen Impfstoff um Potenzen höher als bei den Vergleichspräparaten.

Beispiel 1
Herstellung von fcnlenembryo-Impfstoff

I. Herstellung der Virensuspension

JO

40

Der »Wistar Rabies, PM (Pltman-Moore)-HDCS«- Vlrusstamm vom Wistar Institute. Philadelphia, oder ein anderer zur Impfstoffherstellung geeigneter Tollwutvlrus-Stamm wird vor der eigentlichen Verwendung durch Intracerebrale Passage in der Maus und wiederholte Passagen in angebrüteten Enteneiern an Entenembryozellen adaptiert. Für die Vakzineproduktion werden die Viren aus einer Passage mit besonders hohem Titer verwendet, welche sich bereits bei der Herstellung von Tollwutvakzine nach J. M. Hoskins (Laboratory Techniques in Rabies by Kaplan et al, WHO, 1973. 27, pp. 243-55: Druck-Embryo-Vacclne; oewährt haben.

Befruchtete Enteneier aus gesunden Herden werden bei 36⁰Ch-I⁰C bei 65 bis 70% Feuchtigkeit bebrütet. Nach 6 Tagen werden sie durchfeuchtet, ungeeignete Eier werden entfernt.

Den Eiern mit sich entwickelnden Embryos wird am 7. Tag der Bebrütung das Tollwutvirus direkt In den Dottersack Inokuliert. Die Bebrütung wird fortgesetzt.

10 bis 13 Tage später werden die Eier erneut durchleuchtet. Die Eier mit gut fortentwickelten Embryos werden unter sterilen Bedingungen geöffnet, die Embryos entnommen und dekapiert. Die Köpfe werden einzeln unter sterilen Bedingungen In der Dampfphase über flüssigem Stickstoff aufbewahrt, bis deren Sterilitätsprüfung abgeschlossen 1st. Die sterilen Köpfe werden vereinigt in Pools von 40 bis 60 Köpfen; jeder Pool wird erneut auf Sterilität geprüft. Für die Verarbeitung zum Impfstoff werden mehrere Pools bei 4 bis 37' C aufgetaut und in einem Homogenisator (Blender) In phosphathaltlgem Puffer (pH 7.4) zerkleinert, derart, daß ein 5%lger w/v Kopfextrakl entsteht.

Zur Verdünnung kann man außer NaCI-Phosphatpuffer (= Dl-Natrlumhydrogenphosphat 0.75%, Kaliumdlhydrogenphosphal 0.145%, Natriumchlorid 0,48% In destilliertem Wasser) auch andere In der Viruslmpfstoffprodukliop gebräuchliche unschädliche Salzlösungen bis zum entsalzten Wasser verwenden, solange man in einem pH-Be. Jen von 7 bis 8 bleibt.

2 Inakia.erung der Viren

Für die Inaktivierung wird gewöhnlich //-Proplolaclon (BPL) verwendet. Vergl. dazu: G. A. LoGrlppo, Annales New York Academy of Sciences. Vol. 83 (1960), ρρ 578-94. Es wurden jedoch auch andere Agentlen empfohlen und geprüft. In den USA wird beispielsweise TrI-(n-butyl)-phosphat benutzt.

Vergl. dazu: H. Tint et al. Symposia series In lmmunobiologicalstandardlzation (Karger, Basel) 21. 132-144: A new tissue culture rabies vaccine. Inactivated and disaggregated with Trl-(n-butyl)-phosphate;
T. J. Wiktor et al. Develop, blol. Standard., Vo!. 40, pp. 3-9 (1978).

Für die Inaktivierung mit /i-Proplolacton wird die vlrushaltlge Gewebssuspension unter ständigem Rühren auf 37° C gebracht und mit soviel einer frisch bereiteten eisgekühlten wäßrigen Lösung von /»-Propiolacton versetzt bis eine Konzentration von /f-PropioIacton von I : 2500 erreicht ist. Nach 5mlnütlgem Rühren bei 37° C wird die Suspension in ein zweites Gefäß gebracht und weitere 120 Minuten gerührt. pH und Temperatur werden ständig kontrolliert. Absinken des pH 1st ein Maß der BPL-Hydrolyse und wird auch als solches registriert. Das pH sinkt von ca. 8 auf ca. 7,4 ab. Nun wird auf 5° C ± 3° C abgekühlt und über Nacht weiter gerührt. Am nächsten Tag wird Thiomersal [o-iÄthylmercurlthlo)-benzoesäure] zugefügt bis eine Konzentration dieses Antlseptikums von 1 :10 000 erreicht Ist. Die Suspension wird bis zur Reinigung und Konzentrierung durch die Differential- und Dlchtegradlentenzentrlfugatlon bei 5° C gehalten.

3. Differential- und Dichtegradlentenzentrlfugation

Die 5%lge Kopfsuspension hat z.B. eine spezifische Aktivität von 0,78 AGW-E/mg Protein. In einem folgenden Produktionsansatz wurde eine Aktivität von 0,55 AGW-E/mg Protein gemessen.

Die Inaktivierten Viren, die In dieser Suspension enthalten sind, werden durch zwei Zentrlfugatlonen gereinigt und konzentriert.

3.1. Zunächst werden durch eine Vorrelnlgungszenlrifugatlon bei 10 000 bis 15 000 xg die größeren Zelltrümmer -, entfernt. Nach der Vorreinigung steigt die spezifische Aktivität leicht an: auf 1,0 Im Ansatz 1 und fm 2. Ansatz auf 0,73 AGW-E/mg Protein.

3.2. Oas vorgereinigte Material wird anschließend welter gereinigt und konzentriert mittels Zentrifugalion über einen linearen Saccharose-Gradienten (15 bis 55%,) bei 75 000 bis 90 000 xg.

Die Gradienten-Fraktionen werden auf Sterilität und Antlgen-Gehalt geprüft. In olesen Fraktionen variiert die spezifische Aktivität mit den verschiedenen Dichten der kontaminierenden Proteine. So findet man z. B. bei einer Dichte von 19% Saccharose eine spezifische Aktivität von 2, bei 37% Ist die spezifische Aktivität 24. und bei 43% liegt sie um 6 herum. In einem zweiten Ansatz liegt die spezifische Aktivität bei 20% Saccharose um 0.3. bei 37% über 20, und bei 45% um 2.

Sterile Fraktionen mit einer Wirksamkeit von über 20 AGW-E/mg Protein (d. s. mehr als 100 AGW-E/mg N) und einem Saccharose-Gehalt von etwa 30 bis 40% werden vereinigt, anschließend werden Sterilität und Antigenkonzentratlon erneut geprüft und für den weiteren Prozeß vorgemerkt.

4. Einstellung der Antlgenkonzentrate

Vorgetestetc Antlgenkonzentrate werden vereinigt, mit einem geeigneten Stabilisator, z. B. Natrlumphosphatpuffer IpH 7,4) - siehe oben - oder anderen physiologischen Salzlösungen, einschließlich dem bereits beschriebenen Stabilisator (siehe Hoskins, Ice. clt.) auf sine Konzentration von mindestens 2,5 AGW-E/ml verdünnt. Sterilität und Antlgenwert werden erneut geprüft.

Typische Werte für diesen »Final Bulk« (zur Abfüllung bereiter Ansatz) liegen Im Bereich von 3 bis 5 AGW-E/ml und einer spezifischen Aktivität von 3 bis 6. In 5 typischen Produktionen waren die spezifischen Aktivitäten 2.9, 3,5, 5,1, 5,3 und 5,4.

40

Antigenltät:

Prüfung nach Standardvorschrift des National Institute of Health (USA).
Sterilität:

Alle erhaltenen Endprodukte, die zur Anwendung gelangen, sind steril.

InaktlvltUt:

Diese erfolgt jeweils an 3 jungen Kaninchen und 10 Milusen, welche nach Intracerebraler Inokulation von 0,3 ml rehydrailslertem Impfstoff während 14 Tagen beobachtet wurden. Die Tiere dürfen keine Krankheitssymptome aufweisen.

Unschädlichkeit:

5 ml rekonstituierte Impfstofflösung wird 3 Meerschweinchen und 0,5 ml an 3 Mäuse intraperltoneal verabreicht.

Die Tiere dürfen keine von der Norm abweichende Reaktionen zeigen.

Stabilität des beispielsgemäß erhaltenen Impfstoffes
In lyophlllslerter Form

Aktivitäten (AGW-E/ml) In % des Ausgangswertes (0-Wert) nach 3 Monaten bei der angegebenen Temperatur.

Tabelle

Lot Nr.

0-Wert
(AGW-E/ml)

-20⁰C +4°

ZT ° +37⁰C

30

35 78 LyII T3 3,3
78 LyII T4 3,7
78 LyII T5 3,6

124% 97% 94% 70% 103% 76% 100% 86% 122% 75% 69% 114%

5. Lyophlllslerung

Der nach 4. erhaltene »Final Bulk« wird In Portionen von 1 ml In 3 ml Fläschchen abgefüllt. Lyophllisatlonsstopfen werden lose aufgesetzt und die Vakzine wird unter Vakuum In gefrorenem Zustand getrocknet. Nach vollendeter Trocknung werden die Stopfen eingedrückt, die Fläschchen werden mit Metallkappen zum Festhalten der Gummistöpfchen definitiv verschlossen und bei -20° C aufbewahrt.

Stabilität des beispielsgemäß erhaltenen neuen
Tollwutimpfstoffes nach Rekonstllutlon

Aktivitäten (AGW-E/ml) In % des Ausgangswertes nach 4 Wochen Lagerung bei der angegebenen Temperatur.

Tabelle

Lot Nr.

0-Wert
(AGW-E/ml)

+4⁰C ZT^c

+37⁰C

78 LyIi T3	3,3	136%	82%	61%
78 LyII T4	3,7	135%	86%	51%
78 LyII T5	3,6	125%	89%	61%

55

60

6. Rekonsiltutlon zum gebrauchsfertigen fmpfstofT
und dessen Anwendung

Für den Gebrauch wird ein Milliliter steriles, destilliertes Wasser durch den Gummistopfen eingespritzt, das Fläschchen wird leicht geschwenkt - ohne Schaum zu produzieren - bis der Impfstoff ganz gelöst Ist. Der gesamte Inhalt eines Fiäschchens wird dann subkutan am Oberarm Injiziert.

7. Qualitätskontrolle des Endproduktes

Diese umfaßt: Bestimmung der Antlgenität, Sterilität, Inaktlvltät, Unschädlichkeit und des Gehaltes an Stickstoff, NaCI, /f-PropIonlacton-Rücksländen und ThIomersal.

Beispiel 2
1. Verteilung des Tollwutantigen Im Entenembryo

Um die Verteilung des Tollwufäntigens im Entenembryo zu bestimmen, wurden Infizierte Entenembryonen In Kopf, Rückenmark und Rumpf ohne ZNS aufgeteilt. Virus- und Antlgengehalt wurden gemessen:

Köpfe Rücken- Rumpf

mark ohne ZNS

Mittelwerte (g) 3,44 0,95 9,68

Virusgehalt der 33% Susp. 5,95 4,7 4,55

(Titer X logio)

Fortsetzung

Köpfe Rücken- Rumpf

mark ohne ZNS

Virusgehalt total

(logio)

AGW-E/ml 33% Tusp.

8,50 6,7 7,55
1,9 <0,3 <0,3

Nahezu lOmal mehr Virus wurde im Kopf, der etwa '/< des Gesamtkörpers ausmacht* gefunden als im Rest des Entenembryonenkörpers. Daraus folgt, daß durch Entfernung des Rumpfes 75% unnötiges und schildllches Entenembr>onenproteln entfernt werden kann, ohne den Virusgehall merklich zu reduzieren.

2. Ermittlung der optimalen Erntezeit

In einem dreiteiligen Versuch wurden Embryonen verschiedenen Alters geimpft und zu verschiedenen Zelten nach der Impfung geerntet. Köpfe und Rümpfe wurden separat verarbeitet. Der Virusgehalt der Köpfe wurde bestimmt.

a) Neuntägige Entenembryonen wurden nach Standard Prozedur (Hoskins loc. cit.) geimpft und 11, 12, 13, 14 und 15 Tage später geerntet.

Erntetag (Tage nach Impfung)
11 12 13 14 15

Ernte- 76 88 100 131 135 Köpfe
gewicht _{145 179 2}21 278 290 Körper

^³I²⁰ λ 221 267 321 409 425 Gesamtembryo Embryos)

34 33 31 32 32 Anteil ΚορΓ

5,8 5,7 5,3 5,1 5,2 Virustiter
(X logio)

b) Wie a), wobei jedoch achtTage alte Entenembryonen verwendet wurden.

Gewicht
von jeweils 20
Embryos

60 67 89 113 115 Köpfe
102 137 195 247 260 Körper
162 204 284 359 375 Gesamtembryo

36 33 37 29 30 Anteil Kopf

in.%

5,9 5,7 5,1 Virustiter

(X log.o)

c) Wie a), wobei sieben Tage alte Entenembryonen verwendet wurden.

Gewicht
von jeweils 20
Embryos

62 65 83 91 99 Köpfe
108 130 176 226 235 Körper
170 195 259 317 334 Gesamtembryo

36 33 37 29 30 Anteil Kopf

5,6 5,8 5,5 5,2 4,9 Virustiter
(logio)

Aus diesen Daten Ist zu entnehmen, daß (1) der Kopf etwa ¹A des gesamten Embryos darstellt und (2) am II. Tag nach der Inokulation (Impfung) der höchste Vlrustlter bereits erreicht Ist. Da man In erster Linie am Tollwutantigen Interessiert ist und dieses sehr viel stabiler ist als das funktionell Virus, liegt die beste Erntezeit offenbar am oder nach dem Tag des höchsten Virustiters. Die hohe Wachstumsrate des Kopfes veranlaßt andererseits die Ernte so früh wie möglich anzusetzen und weniger schädliches Kopfgewebe verarbeiten zu müssen, jedenfalls vor Eintritt des rasanten Wachstums, das ab dem 19. Tag beobachtet wird:

Embryoalter (Tage) 17 18 19 20 21 22 23

Kopfgewicht (je 20) 62 60 76 88 100 131 135

ing 65 67 89 112 115

83 91 99

Einzelkopf (g) 3,1 3,1 3,8 4,5 5,2 6,2 6,8

3. Wirksamkeit des nach Beispiel 1 erhaltenen

Tollwutimpfstoffes in Katzen nach der subkutanen

Impfung

Anzahl Impflinge mit
mehr als

Männliche

Katzen

Weibliche

Katzen

100%	100%
57	29
43	14

0.5 IE
5,0
20,0

(Internationale Einheiten an Antikörpcrgehalt)

4. Wirksamkeit in Affen (macacus rhesus)

Impfstoff

n. Beispiel 1

Impfstoff des Handels »Merieux« (HDCS)

Impfschema 0, 3, 7 0, 3 0, 3, 7 0, 3

Anzahl Affen 5

Antikörper
(S 0,5 IE)

3 Wochen nach 5 (100%) 4 (80%) 1 (20%) 1 (20%) der letzten
Impfung

7 Wochen nach 4 ( 80%) 3 (60%) 3 (60%) 0 ( 0%) der letzten

Impfung

5. Wirksamkeit des erfindungsgemäß erhaltenen Tollwutimpfstoffes Im Menschen

Der fertige, lyophillslerte und durchgeprüfte Impfstoff wurde Im Vergleich mit einem HDCS (human dlplold cell strain) Impfstoff über 70mal im Menschen verimpft.

Die Unschädlichkeit des neuen Impfstoffes war mindestens ebensogut wie die des Standardlmpfstoffcs:

Impfstoff	Impfstoff nach	Impfstoff	5
	Beispiel I	des Handeis
		><Werieux«
		(HDCS)
Dosen verimpft	74	70	10
lokale Reaktion	2 (2,7%)	8(11,4%)
(Hitze, Schwellung, Rötung)
allgemeine Reaktion)	-(O %)	2 ( 2,8%)
(Fieber, Ausschlag,			15
Bettlägngkeit)

Die Wirksamkeit des neuen Impfstoffes wurde ebenfalls verglichen mit dem Slandardlmpfstoff. In der folgenden Tabelle Ist die Prozentzahl der Personen gezeigt, die nach Impfung mit dem einen oder anderen Impfstoff mit Antikörperentwicklung reagierten, wobei allgemein 0,5 IE (internationale Einheit) als protektiv angesehen werden.

20

25 entwickelnden Embryos wird am 7. Tag der Bebrütung Tollwutvirus direkt In den Dottersack inokuliert. Die Bebrütung wird fortgesetzt. 10 Tage später werden die Eier geöffnet und die Embryos entnommen. Die Embryos werden zerlegt; Köpfe, Rückenmarke und Rümpfe werden getrennt behandelt, d.h. zu jeweils lOSbigen Homogenisaten zerkleinert. In den Homogenlsaten wird die Virus-Konzentration mit HIJfe des »Rapid fluorescent focus Inhibition tests« (RFFIT) lUrlert.

Es wurden 3 Versuchsserien durchgeführt. Die
nlsse sind in der Tabelle aufgeführt.

Viruskonzenlration in ID 50/ml

Kopf 4,25 / 4,4 & 4,8

Rückenmark 3,55 / & 4,8

Rumpf 3,0 / 3,6 & 3,8

Anzahl Impflinge mit mchr'als	Impfstoff nach Beispiel 1 (36 Impflinge)	HDCS-lmpfstoff »Merieux« (33 Impflinge)
0,5 IE-Antikörper	100%	100%
5,0	89	85
10,0	64	58
15,0	56	39
20,0	47	39
30,0	39	24
40,0	25	12

35

Beispiel 3 Herstellung von Hühnerembryo-Impfstoff

Hühnereier wurden während 7 Tagen bei 36° C ± 1° C bei 60 bis 75% Feuchtigkeit bebrütet. Den Eiern mi* sich Es wurde nun gefunden, daß das Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS) etwa lOmal mehr Virus enthält als der ZNS-freie Rumpf.

Auf diesem Ergebnis basierend erfolgt die Herstellung von Hühnerembryo-Impfstoff In gariz analoger Welse wie im Beispiel 1 beschrieben. Indem das an Hühnerembryozellen adaptierte Tollwutvirus von hohem Tlter etwa nach der Methode von H. Koprowsky, Laboratory Techniques In Rabbles by M. M. Kaplan et al, WHO Geneva, Chapter 26, pp. 235-242 in angebrüteten Hühnereiern vermehrt wird. Die Eier werden am 7. Tag der Bebrütung beimpft und anschließend welter bebrütet. 9 bis 10 Tage nach der Inokulation des Virus in den Dottersack werden die Hühnerembryonenköpfe geerntet. Die Aufarbeitung der Hühnerembryonenköpfe erfolgt nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren.

Der erhaltene Impfstoff wird der Im Beispiel 1.7 beschriebenen Qualitätskontrolle unterworfen. Der erhaltene Impfstoff erwies sich auch am Menschen als voll wirksam.

Beispiel 4

Ähnlich wie im Beispiel 1 beschrieben, können auch in angebrüteten Wachteteiern Tollwutviren vermehrt und danach aus deren Köpfen geerntet werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen eines Tollwutlmpfstoffes durch Vermehren von Tollwutviren In Geflügelembryonen, Ernten der Embryonen, Inaktivleren der Viren, Abtrennen des Antigens aus dem resultierenden Zeliextrakt and Konfektionieren zum Impfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß zum Herstellen des Zellextraktes nur die Köpfe der Embryonen verwendet werden und aus dem Zeliextrakt das Antigen durch Differential- und anschließender Dichtegradientenzentrlfugatlon angereichert wird.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dazu Enten-, Hühner- oder Wachtel-Embryonen verwendet.

3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Differentialzentrifugation mit etwa iO 000 bis 15 000 xg und die Dichtegradlentenzentrlfugation mit 75 000 bis 90 000 xg In steigenden Zuckerkonzentrationen und in Pufferlösung in an und für sich bekannter Weise durchführt.