DE2448564C3

DE2448564C3 - Verwendung von heterocyclischen Carbonsäuren

Info

Publication number: DE2448564C3
Application number: DE2448564A
Authority: DE
Inventors: Kaoru Nishinomiya Hyogo Kouno; Masanao Toyonaka Osaka Shimizu; Yoshiyuki Amagasaki Takase
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1973-10-13
Filing date: 1974-10-11
Publication date: 1979-11-22
Also published as: JPS5064415A; GB1465993A; IE39940B1; US3981999A; IT1022820B; JPS5647166B2; IE39940L; AU7418774A; NO743673L; DE2448564B2; DE2448564A1; CA1052698A; FR2247245B1; FR2247245A1

Description

(I) 5,8 - Dihydro - 2 - pyrrolidino - 8 - ätby'.- 5 - oxopyrido-[2,3-d]-pyrimidin-6-carbonsäure

20

Die Erfindung betrifft die Verwendung von nachstehend konkret bezeichneten heterocyclischen Carbonsäuren bei der Bekämpfung von infektiösen bakteriellen Krankheiten in Fischen.

Verschiedene chemotherapeutische Mittel wurden bisher zur Behandlung infektiöser Fischkrankheiten aufgrund ihres bestätigten Effektes gegen Krankheiten von Landsäuretieren angewendet. Beispiele derartiger chemotherapeutischer Mittel sind Furazolidon, Chloramphenicol. Tetracyclin und Sulfisoxazol. Die Mikroorganismen, welche Krankheiten in Fischen verursachen, sind jedoch nicht genau die gleichen, wie diejenigen, die in Landsäuregetieren Krankheiten verursachen und das ökologische und physiologische Verhalten von Fischen ist von dem der Landsäugetiere sehr verschieden. Daher ist die sichere Wirksamkeit der chemotherapeutischen Mittel auf verschiedene pathogene Mikroorganismen in Fischen zweifelhaft und kann nicht garantiert werden.

Wenn jedoch sogar diese Arzneimittel verwendet werden, ist die Erreichung der Verhütung oder die Behandlung dieser Fischkrankheiten in vielen Fällen wegen der Entwicklung arzneimittelbeständiger Bacterien und wegen der begrenzten Methode der Anwendung dieser Arzneimittel schwierig.

Es wurde nun gefunden, daß die heterocyclischen Carbonsäure der Formel

R COOH (I)

worin R einen heterocyclischen Rest, bestehend aus

55

5.8-Dihydro-2-pyrrolidino-8-äthyl-5-oxopyrido·

[2.3-d]-pyrimidin-6-yl.
1.4-Dihydro-7-(4-methyl-1 piperazinyl)-4-oxo-

1 -vinylchinolin-3-yl,

1,4-Dihydro-7-(4-äthyl· 1 »piperazinyl)-4-oxo-

l-vinylchinölin»3-yl und/oder 1,4-Dihydro*7-( I -piperazinylj^-oxo^ 1 Vinyl·

l,8-naphthyridin-3-yl

bedeutet,

oder deren nichttoxisches Säureadditionsalz eine ausgezeichnete Wirkung gegen Mikroorganismen, wel-C₂H₅
(abgekürzt PA)

(2) l,4-Dihydro-7-(4-methyl-1 -piperazinyl)-4-oxo-I-vinylchinolin-3-carbonsäure

COOH

CHj-N N

(abgekürzt ΛΤ-1493)

(3) l,4-Dihydro-7-(4-äthyl-1-piperazinyl)-4-oxol-vinylchinolin-S-carbonsäure

COOH

C₂H₅N N

(abgekürzt AT-1557)

(4) l,4-Dihydro-7-(l-piperazinyl)-4-oxo-l-vinyll,8-naphthyridin-3-carbortsäure

COOH

/Ti

. / Kt ΚΓ

HN N
(abgekürzt AT-1475)

Van diesen Verbindungen wird 5,8-Dihydro-2-pyrro· Hdino-S-äthyl-S-oxo-pyrido-l^-dl-pyrimidin-ö-carbonsäure (PA) bei der prophylactischen und therapeutischen Bekämpfung von den genannten Fischkrankheiten besonders bevorzugt

Die obige heterocyclische Carbonsäure der Formel (Ij kann auch in der Form eines nicht toxischen Säureadditionssalzes verwendet werden. Anorganische; Säuren, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure und organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure oder Methansulfonsäure sind als Säuren, die zur Bildung dieser Säureadditionssalze verwendbar sind, geeignet

Sämtliche obigen Verbindungen der Formel (I) sindl als antibakterielle Mittel für Menschen und Säugetiere bekannt (siehe GB-PS 11 29 358 und DE-OS 23 62 553).

So sind in der GB-PS 11 29 358 5,8-Dihydro-5-Oxopyrido-[2^-d]-pyrimidin-Derivate und Verfahren zu deren Herstellung beschrieben, und es wird darin festgestellt, daß diese Verbindungen eine antibakterielle Aktivitäl gegen gramposit've und gramnegative Bakterien besitzen, und daß sie zur Behandlung von bakteriellen Infektionen von Menschen und Tieren verwendet werden können. Die gesamten darin aufgeführten Bakterien sind jedoch nur gegenüber Menschen und warmblütigen Tieren aktiv und besitzen keine pathogene Wirkung gegenüber Fischen. Beispielsweise wird gezeigt, daß 5,8-Dihydro-2-pyroIidinv?-8-äthyl-oxopyrido-[2,3-d]-pyrimidin-6-carbonsäure (nachstehend abgekürzt mit PA bezeichnet) eine antibakterizide Wirkung gegenüber den pahtogenen Bakterien von Menschen und Säugetieren besitzt Es ist jedoch zu beachten, daß PA seine antibakterielle Wirkung nicht gegenüber !amtlichen pathogenen Bakterien ,ntfaltet Es gibt praktisch pathogene Bakterien, die gegenüber PA weniger empfindlich sind. Dies ist z. B. as den Angaben der US-PS 38 87 557 ersichtlich. In dieser US-PS wird anhand der Ergebnisse von Tabelle I und Tabelle IV gezeigt, daß die minimale Hemmkonzentration (MIC) von PA gegenüber Pseudomonas aeruginosa Tsuchijima und Mycobacterium tuberculosis 1(X^g/ml beträgt, so daß sich PA als praktisch unwirksam in vivo erweist

Die Verwendung von PA in Verbindung mit Fischen war jedoch bisher nicht bekannt Im allgemeinen sind pathogene Bakterien von Warmblütern völlig verschieden von solchen von Fischen (Kaltblütlern) und besitzen keine pathogene Aktivität gegenüber Fischen. Andererseits sind wiederum pathogene Bakterien von Fischen völlig verschieden von solchen für Warmblütler, und weisen keine pathogene Aktivität gegenüber Warmblütlern auf. Es ist somit völlig unmöglich, eine Voraussage darüber zu treffen, ob ein antibakterielles Mittel für Warmblütler auch eine Wirkung gegenüber Fischen besitzt.

Wie vorstehend bereits ausgeführt, sind die Mikroorganismen, welche Krankheiten in Fischen verursachen, nicht die gleichen wie diejenigen in Landsäugetieren, und das ökologische und physiologische Verhalten von Fischen ist von dem der Landsäugetiere verschieden.

Tatsächlich war es bisher nicht bekannt daß die Verbindungen gemäß der Erfindung eine ausgezeichnete antibakterielie Wirkung gegenüber pathogenen Bakterien von Fischen besitzen. Gemäß der Erfindung wurdß erstmals festgestellt, daß diese Verbindungen eine ausgezeichnete antibakterielle Wirkung gegenüber den pathogenen Bakterien von Fischen aufweisen.

Auch in der Literatur Wurde darüber berichtet, daß in einigen Fällen Verbindungen, die im breiten Umfang als brauchbare antibakterielle Mittel für Säugetiere bekannt sind, wie z. B. Sulfathalidin und Sulfachinoxalin (S η i e s ζ k ο, S. F. et al Trans. Am. Fisheries Soc. 80, 240-250 [1951] oder Clorotetracyclin (Almeida, L J, et al Indian J. Microbiol. 7,51 -56 [1967]) überhaupt keine Wirkung gegenüber einer bakteriellen Infektion von Fischen besitzen.

Anhand von umfangreichen Untersuchungen wurde festgestellt, daß, wie nachstehend gezeigt die Verwendung der Verbindungen gemäß der Erfindung in vitro und in vivo einen unerwarteten ausgezeichneten Effekt hinsichtlich der Verhinderung einer Infektion gegenüber pathogenen Bakterien von Fischen, verglichen mit pathogenen Bakterien von Menschen und Säugetieren liefert wobei diese Verbindungen gegenüber Fischen eins niedrige Toxizität besitzen.

Beispielsweise wurde festgestellt daß der Wert von EDm von PA gegenüber einer bakteriellen Infektion von Fischen etwa 1/20 von dem Wert gegenüber der bakteriellen Infektion von Mäusen ist Außerdem wurde gefunden, daß im Gegensatz zu anderen analogen Verbindungen die gemäß der Erfindung verwendeten Verbindungen einen ausgezeichneten Effekt gegenüber der bakteriellen Infektion von Fischen, bei Ausführung des Badverfahrens, erzielen. Außerdem wurde gefunden, daß die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen eine ausgezeichnete Wirkung, sowohl bei oraler Verabreichung als auch bei Anwendung in einem Bad, aufweisen.
Bei Vergleich der erhaltenen Effekte gegenüber der bakteriellen Infektion von Fischen, unter Verwendung der Verbindungen gemäß der Erfindung mit den Effekten unter Verwendung von als antibakterielles Mittel für Menschen und Säugetiere bekannten Verbindungen mit einer ähnlichen Struktur wie die Verbindungen gemäß der Erfindung, ist überdies klar ersichtlich, daß die erfindungsgemäß erzielten Wirkungen nicht selbstverständlich sind, sondern tatsächlich ein überraschendes Ergebnis darstellen. So ist z. B. die nachstehend angeführte Verbindung E tine Verbindung, die als antibakterielles Mittel für Menschen und Tiere in der GB-PS 11 29 358 angegeben ist Tatsächlich wird jedoch bei Verwendung dieser Verbindung gegen eine bakterielle Infektion von Fischen ein wesentlich schlechterer Effekt erzielt, als mit den erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen.

Es ist ferner bekannt die Verbindung der nachstehenden Formel

CC)C)H

HO

mit einer der Struktur von PA sehr ähnlichen Struktur, überlegenen antibakteriellen Aktivitäten gegenüber pathogenen Bakterien von Menschen und Säugetieren aufweist, verglichen mit dem Effekten von PA. Jedoch zeigt diese Verbindung wesentlich schlechtere Wirkun gen gegenüber einer bakteriellen Infektion von Fischen, verglichen mit der Wirkung von PA und kann somit nicht vorteilhaft auf Fische angewendet werden, (vgl. nachstehende Versuchsergebnisse.)

Für die Annahme, daß ein antibakterizides Mittel oder ein Antibiotika, das gegenüber einer bestimmten

24 4S564

Bakterienart wirksam ist, gegenüber beliebigen anderen Bakterien ebenso wirksam sein soll, besteht kein Grund, wie dies auch aus folgenden Veröffentlichungen hervorgeht:

(1) Goodman, L. S. and Gilman, A, »The Pharmacological Basis of Therapeutics«, 4th Ed, Macmillan Co, New York, N. Y, 1970, p. 1157,

(2) Naka^awa.S, »Basic Informations on Antibiotics (japanisch), Nanzando, 1966, pp. 50—51,

(3) H ο 1 ν e y, D. N, »The Merck Manual of Diagnosis and Therapy«, 12th Ed, Merck Spharp & Dohme Res. Lab, 1972, pp. 1553 -54,

(4) S i e g m u η d, O. H, »The Merck Veterinary Manual«, 3rd Ed, Merck & Co, Inc, 1967, pp. 517, 520-31,

(5) A 1 m e d i a, L. J, et al, Indian J. Microbiol. 7,51 — 56 (1967),

(6) Snieszko, S. F, Progressive Fish Culturist 19, 81-84(1957),

(7) S η i e s ζ k ο, S. F, et al, Trans. Am. Fisheries Soc. 80,240-50(1951)

Die Veröffentlichungen 3, 4, 5 und 6 zeigen, daß bestimmte Antibiotika, welche bei der Behandlung von bakteriellen Erkrankungen bei Säugetieren außerordentlich gut wirksam sind, entweder gar keine Wirkung oder bisweilen einen negativen Effekt bei der Behandlung von bakteriellen Erkrankungen von Fischen besitzen. So zeigt die Veröffentlichung 3 verschiedene übliche pathogene Bakterien, die den Menschen befallen, und gibt auch die entsprechenden bekannten antibakteriellen Mittel zur Auswahl an. Die Veröffentlichung 4 beschreibt bestimmte allgemein bekannte antibakterielle Mittel und es ist in diesem Zusammenhang insbesondere auf die Ausführungen auf Seite 517 hinzuweisen, woraus hervorgeht, daß das hier diskutierte antibakterielle Mittel mühelos von dem Verdauungstrakt absorbiert wird, und anhaltende Blutspiegel liefert Insbesondere ist auch auf die Ausführungen auf Seite 528 unter »Tetracyclin« hinzuweisen, wo ebenfalls zum Ausdruck gebracht wird, daß dieses Antibiotikum nach oraler Verabreichung gut absorbiert wird. Eine ähnliche Feststellung findet sich mit Bezug auf »Chlortetracyclin« auf Seite 529.

Die Veröffentlichung 5 beschreibt auf Seite 52 das Chlortetracyclin, obgleich dieses gegenüber pathogenen Fischbakterien in vitro wirksam ist, keinerlei Effekt auf die Krankheit selbst hat, d. h, keine Wirkung bei Behandlung des Fisches in vivo zeigt Die Veröffentlichung 6 vermittelt den interessanten Hinweis, daß Antibiotika, welche der Nahrung von bestimmten Fischen zugesetzt sind, tatsächlich deren Wachstumsausmaß herabvtzen und deren Sterblichkeitsausmaß erhöhen. So erwiesen sich die Antibiotika wie Oxytetracyclin. Chlortetracyclin, Penicillin und Chloramphenicol als schädlich gegenüber andererseits gesunden Fischen. Insbesondere ist in diesem Zusammenhang auch auf die Ausführungen in der ersten Spalte auf Seite 81 der Veröffentlichung 6 hinzuweisen, worin die wesentlichen Unterschiede iri der Physiologie zwischen Säugetieren und Fischen auch insbesondere hinsichtlich der Verwendung von Antibiotika diskutiert ist

Auch die Versuchscrgcbnissc der nachstehenden Tabelle I belt-pen die abweichende Wirksamkeit zwischen den erfindungsgemäß verwendeten Verbiw' düngen und verschitfiencnen anderen antibaklcricllcn Mitteln einschließlich Tetracyclin, bei der Behandlung von verschiedenen pathogenen Bakterien von Fischen in vitro. Wie hieraus klar hervorgeht, ist selbst bei in vitro-Behandlung dieser Organismen ein wesentlicher Unterschied gegenüber einer in vivo-Behandlung

hinsichtlich der Wirksamkeit der verschiedenen antibakteriellen Mittel bei einem gegebenen Organismus vorhanden. In der nachfolgenden Tabelle II wird ein Vergleich bei einer in vivo-Behandlung von Fischen gezeigt, die mit Aeromonas liquefaciens Y-62 einem

üblichen infektiösen Bakterientyp von Fischen infiziert waren. Insbesondere ist dabei der Vergleich der Wirksamkeit zwischen den erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen mit derjenigen von Tetracyclin und der Verbindung E, einem weiteren antibakteriellen Mittel, aufschlußreich. Aus dem Kontrast von Konzentration im Futter und dem Prozentsatz von überlebenden Fischen geht klar hervor, daB Tetracyclin bei der Behandlung dieser pathogenen Fischbakterien vollständig unwirksam ist, wohingegen die erfindungsgemä3 verwendeten Verbindungen bei ο >er wesentlich niedrigeren Konzentration eine außerordentlich hohe Wirksamkeit zeigen.

Daß der Unterschied in der Wirksamkeit von antibakteriellen Mitteln nicht nur auf Antibiotika begr-nzt ist geht aus der Veröffentlichung 7 klar hervor, wenn diese mit der Veröffentlichung 4 verglichen wird. Die Veröffentlichung 4 beschreibt die Wirksamkeit von Sulfachinoxalin bei der Behandlung von Säugetieren. Die Veröffentlichung 7 beschreibt das Sulfachinoxalin und Sulfathalidin sowie andere verschiedene Sulfonamide, die bei der Behandlung von Fischen nicht wirksam waren, hauptsächlich deshalb, weil sie von dem Verdauungstrakt nicht absorbiert wurden.

Insbesondere ist auch die »Discussion and Recommendation for Treatment« auf Seite 246 und 248 der Veröffentlichung 7 von Interesse, worin die Unterschiede zwischen in vitro- und in vivo-Wirksamkeit von antibakteriellen Mitteln und die KritikaJiät des Ausmaßes von Absorption und Ausscheidung einer Droge und ihre Durchdringungsstärke gegenüber Geweben diskutiert wird.

Der in der vorliegenden Anmeldung verwendete Ausdruck »Fisch« wird in sehr weitem Smn verwendet und umfaßt eine Vielzahl von Fischen, die gezüchtet oder kultiviert als Nahrungsmittel. Haustiere oder andere nützliche Materialien im Zusammenhang mit dem menschlichen Leben gehalten werden und umfaßt insbesondere Fisch im gewöhnlichen Sinn und auch Krustentiere und Schalenfisch.

Zu den Fischen, auf die das Mittel der Erfindung angewendet werden kann, gehören solche, die in frischem Wasser. Brackwasser und Salzwasser leben. Spezifische Beispiele für derartige Fische sind Gelbschwanz. Stöckerfisch. Thunfisch. Forelle. Plattfisch.

Sillago. Meerbr usen. Kabeljau. Roßmakrele. Blaufisch. Meeräsche. Lachs. Regenbogenforelle, Krabben. Garnele. Seeaal. Aal. Schlammfisch. Karpfen. Silberkarpfen. Häsling. Ayu. Engelhai. Guppy. Plattenfisch. Goldfisch. Seeohr. Kreiseischnecke, Austern und Perlaustern.

Es ist bkannt, daß bei der Aufzucht oder Kultivierung von Fischen der beschriebenen Art sich häufig Verschiedene infektiöse Krankheiten entwickeln und ausbreiten und zum Tod des Fischs führen können. Diese durch Bakterien verursachte infektiöse Krankheiten treten häufig in den gesamten Jahreszeiten auf und die Fischzüchter sind sehr eingehend mit diesen Krankheiten befaßt Die Ursachen dieser Krankheiten sind verschiedene Bakterien, wie beispielsweise Genus

Aeromonas, Chondrococcus columnaris und Genus Vibrio.

Die antimikrobiell Wirksamkeit der erfindungsgemäßen heterocyclischen Carbonsäure der Formel (I) ist an zählreichen gegenüber Fisch palhogenen Bakterien ersichtlich, für die Beispiele Vibrio, Aeromonas, Chondrococcus, Pasteurella und Pseudomonas anguillisepticasind.

Die ausgezeichnete Bekämpfungswirkung der Verbindungen der Formel (I) auf infektiöse Krankheiten von Fischen ergibt sich aus den folgenden Versuchen.

(I) Wirkungen verschiedenen pathogenen
Mikroorganismen auf Fisch in vitro

Testmethode:

15

{g)

Testverbindung wurde nach der Reihenverdünnungsmethode an verschiedenenen pathogenen Mikroorganismen, die unter den folgenden experimentellen

Bedingungen iiikubiefl wurden, bestimmt. Die niedrigste Konzentration, bei der das sichtbare Wachstum des Organismus inhibiert wurde, wurde als MIC bezeichnet.

Versuchsbedingungen

Methode:

Diel Brühen-Verdünnungsmethode

Medium:

Bouillon, pH 7,2 mit Ausnahme für Vibrio (3%ige NaCNBouillon, pH 7,2), Pasteurella (2%ige NaCl-Gehirn-Herz-Infusion, pH 7,3) und Chondrococcus (TV-Medium, pH 7,3)

Impfstoff:

I Tropfen einer bakteriellen Suspension je Reagenzglas (100 bis 1000 Mindesiwächstümseihheiten in dem Medium)

inkubationstemperatur:

25°C mit Ausnahme für Pseud. anguilliseptica

Inkubationszeit:

48 Std. mit Ausnahme für Pseudo, anguilliseptica (7 Std).

Tabelle I

Organismen

Aeromonas liquefaciens Y-62
Aeromonas salmonicida Hara-1
Aeromonas salmonicida Hara-2
Aeromonas salmonicida Kawazu
Aeromonas salmonicida Kusuda
Vibrio anguillarum A-8
Vibrio anguillarum K-3
Vibrio anguillarum Km-30

Pasteurella piscicida AI-3
Pasteureila Piscicida K-I
Pseudomonas anguilliseptica S-I
Pseudomonas anguilliseptica T-2
Chondrococcus sp K-I
Chondrococcus sp K-2

MIC : μι	g/ml	ΑΤ-1493	ΑΤ-1557	AT-1475	Tetracyclin
PA	0,1	0,3	0,3	1
1	ο,ι	0,3	0,3	0,3
ο,ι	ο,ι	0,3	1	ο,ι
1	ο,ι	0,1	0,3	1
0,1	0,1	0,3	0,3	0,3
ο,ι	3	3	10	1
3	3	10	3	1
1	3	10	10	0,3
3	1	1	1	0,3
0,3	0,3	1	1	0,3
1	ο,ι	0,1	0,1	0,3
ο,ι	0,1	0,1	0,1	0,3
ο,ι	3	1	1	1
0,3	3	1	1	1
0,3

Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, daß Mikroorganismen zum gleichen Ausmaß wie Tetracy-

sämtliche Verbindungen der Formel (I) gemäß der 55 elin besitzen, daß ein bekanntes antibakterielles Mittel

Erfindung ausgezeichnete antimikrobielle Wirkungen in ist vitro gegenüber Fischkrankheiten verursachenden

(2) Orale Wirkung gegen Aeromonas-Infektion in Goldfischen
Testmethode

Goldfischen mit einem Gewicht von jeweils etwa 6 bis 7 g wurde ein Fischfutter mit einem Gehalt der der folgenden fünf Tage nach der Infektion beobachtet, wobei die Wassertemperatur bei 24 bis 25° C gehalten

jeweiligen Testverbindungen verabreicht Nach 30 min 65 wurde. In der gleichen Weise wurde der Kontrollgruppe

wurden die Fische intramuskulär mit Aeromonas das gleiche Fischfutter ohne die Testverbindung

liquefaciens Y-62 (etwa 10⁷ Keime je Fisch) unter gegeben. Äther-Anästhesie infiziert Die Fische wurden während

	9	Dosierung	24	48	564	(Tag;e)	2	Fische nach	10	5	Prozentgehalt
							10			10	an überleben
Tabelle Ii	Konzen					1	9			6	den Fischen
Arzneimittel	tration der	(mg/kg)	Anzahl der überlebenden	10	5	3		5
	Nahrung	6,1	Zeitraum	10	5	10		5	100
	(%)	2,5		5	5	7	dem angegebenen	5	60
	0,1	7,5	0	5	4	5		4	100
PA	0,03	2,5	10	5	5	5		5	100
	0,1	7,6	10	5	4	5	4	3	ioo
AT-1493	0,03	2,2	5	5	ί	4	10	-	80
	0,1	22,3	5	5	0	5	6	-	100
AT-1557	0,03	7,5	5	5	1	4	5	-	60
	0,3	253,1	5	3	1	ö	5	—	Ü
AT-1475	0,1	80,4	5	3		0	5		0
	3	6,3	5	3		1	4		0
Tetracyclin	1	—	5			0	5		0
	0,1	5		3
Verbindung E*)	—	5	-
Vergleich		10	-
		0
	—

*) Verbindung E: l-Chlor-l,4-dihydro-H2-hydroxyäthyI)-4-oxochinolin-3-carbonsäure (sh. japanische PatentveröfTentlichung 7524/1961)

Die Verbindungen der Formel (I) zeigten sämtlich einen Prozentgehalt an Überlebenden von wenigstens 60% in einer Nahrungskonzentration von 0,03 bis 0,1% (etwa 2,2 bis 7,6 mg/kg)

Im Gegensatz dazu zeigten Tetracyclin und die Verbindung E einen Prozentgehalt an Überlebenden

von 0% bei einer Nahrungskonzentration von mehr als 0,1% sowie bei einer Konzentration von nur 0,1%. Spmit ist es klar, daß die Verbindungen der Formel (1) der Erfindung weit besserere Effekte in geringer oraler Dosierung als die bekannten antimikrobiellen Mittel liefern.

(3) Vergleich der Wirkung gegenüber pathogenen Bakterien für Fische mit der Wirkung gegenüber

pathogenen Bakterien für Säugetiere

Versuchsverfahren

Zehn männliche Mäuse (ddY-S Stamm, etwa 20 g) wurde. Die Sterblichkeit wurde während der nachfol-

von jeder Gruppe wurden intraperitoneal mit einer 40 genden zwei Wochen beobachtet und dann wurde die

Bakteriensuspension in einer Nährbrühe mit einem Wirksamkeit (ED50) in Übereinstimmung mit dem

Gehalt von 50 bis 100LDm S. typhimurium (etwa Überlebensausmaß berechnet.

iö'Zeiien/rviaus) infiziert. Die zu prüfende Verbindung Das Verfahren fur den in vitro lest unter

wurde oral in Form einer Suspension in 0,2%iger Verwendung von S. typhimurium und für den in vitro

Carboxymethylcellulose 2 mal je Tag während einer 45 und in vivo Test unter Verwendung von A. liquefaciens,

Dauer von 4 Tagen verabreicht, wobei die erste wurde entsprechend der vorstehend angegebenen

Behandlung unmittelbar nach der Infektion ausgeführt Arbeitsweisen durchgeführt.

Tabelle III

Versuchsverbindung

Salmonella	typhimurium	Aeromonas	liquclacicns
S-9		Y-62
in vitro	in vivo	in vitro	in vivo (p. o.)
	(P-O.)
MIC·	ED₅₁,	MIC	Dosis Überlebens
			ausmuß
(mcg/ml)	(mg/kg)	inicg/ml)	(mg/kg) (%)

COOH

O ^N T

QH₅

*MIC = Mindestmhibierungskonzentration.

46,7

6,1
2,5

100
60

Ii

12

Fortsetzung

Versuchsverbindung

Salmonella typhtinurium
S-¹)

Acromonas liquelariens
Y-62

in vilro

MIC* (mcg/ml) in vivo
(po.)

ED₅₁₁
(mg/kg)

in vitro
MIC

in vivo (p. o.i Dosis

Uberlebensausmaß (mcg/ml) (mg/kg) (%)

COOH

AT-1493

CH₃N

O₁I

2,5

100

AT-1557

G₂H₅N N

COOH 11,5

0,3

7,6
2,2

100 80

CH=CH,

AT-1475

HN

COOH

CH=CH, 35,6

0,3

22,3
7,5

100 60

AT-6I6**)

COOH 17,7

0,3

23,2
7,1

40 0

HO

C₂H₅

*) MIC = Mindeslinhibicrungskonzcnlration.

**) AT-616 = S.S-Dihydro-S-älhyl-S-P-hydroxypyrrolidinoJ-S-o.xopyrido-iZJ-dJ-pyrimülin-o-carbonsäure wird als besonders wertvolle Verbindung in der DE-OS 21 43 369 beschrieben.

S. typhimurium ist ein pathogenes Bakterium für Landsäugetiere und A. liquefaciens ist ein pathogenes Bakterium für Fische.

Aus den Ergebnissen der vorstehenden Tabelle III ist klar ersichtlich, daß die Verbindung PA einen wesentlich überlegenenen in vivo Effekt auf pathogene Fischbakterien ausübt, als auch auf pathogene Säugetierbakterien. Andererseits besitzt die Verbindung AT-616 eine Molekularstruktur, die derjenigen von PA äußerst ähnlich ist, übt jedoch einen besseren in vivo Effekt auf pathogene Säugetierbakterien auf als die Verbindung PA, wohingegen AT-616 iedigiich einen wesentlich schlechteren in vivo Effekt auf pathogene Fischbasterien, verglichen mit dem Effekt von PA, ausübt

(4) Badewirkung gegen Aeromonas-Infektion

bei Goldfischen

Testmethode

Goldfische mit einem Gewicht von jeweils etwa 8 g wurden intramuskulär mit Aeromonas liquefaciens Y-62 (10⁷ Keime/Fisch) unter Äther-Anästhesie infiziert. Die Fische wurden in Gruppen eingeordnet und jede Gruppe wurde in 6 I frisches Wasser (23 bis 27° C), das PA in der in Tabelle IH angegebenen Menge enthielt, gebracht

Dann wurde während der folgenden 5 Tage beobachtet in der gleichen Weise wurde die Vergieichsgruppe in 6 I frisches Wasser ohne irgendeine darin eingearbeitete Testverbindung gebracht

Tabelle IV

Arzneimittel

Bad konzen tration	Anzahl überlebender Fische nach dem Zeitraum (Tage)	1	2	3	angegebenen	5	Prozsntgehalt der Über- Ifebenden
(μ^πιΐ)	0	6 6 1	6 6 0	6 6	4	6 6
1 0,5	6 6 6	6 6	100 100 0

Unbehandelter Vergleich

(5) Toxizität
Orale Toxizität bei Goldfischen

Eine Nahrung, die 10% der jeweiligen Testverbindung enthielt, wurde oral an Gruppen mit je fünf

Tabelle iv

Goldfischen, die jeweils 6 bis 10 g wogen, verabreicht und es wurden Beobachtungen während der folgenden 7 Tage durchgeführt. Die Temperatur des Wassers wurde bei 28°C gehalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV wiedergegeben.

Arzneimittel	Dosis	Anzahl der überlebenden Fische	1	nach	3	4	dem	angegebenen	7	Morta
		Zeitraum (Tage)	5	seit Verabreichung	5	5			5	lität
	(mg/kg)	0	5	2	5	5	5	6	5	(%)
ΨΑ	800	5	5	5	5	5	5	5	5	0
AT-1493	955	5	5	5	5	5	5	5	5	0
AT-1557	935	5	5	5	5	5	5	5	5	0
AT-1475	923	5	5	5	5	0
llnbehandelter Vergleich	—	5	5	5	5	0

Wie oben gezeigt, ergaben sämtliche Verbindungen 35 Sämtliche Aale überlebten ohne Anormalität ihrer der Formel (I) gemäß der Erfindung keinerlei Toxizität äußeren Erscheinung bei einer Dosis von 2000 mg/kg.

bei einer Dosis von 800 bis 935 kg/kg. „ , . . ,._,,,„,

Badetoxizitat bei Goldfischen

Gruppen von Golsfisohen mit einem Gewicht von jeweils 7 bis 8 g (jede Gruppe bestand aus 6 Goldfischen) wurden in 6 1 frisches Wasser (27 bis 30⁰C), Hoc pa in y^e>isch'^odersns" !Ccnzsntr*iiic"cn v/ enthielt gebracht, wobei während 5 Tagen belüfte wurde. Während dieses Zeitraums wurden Beobachtungen durchgeführt. Wie in Tabelle V wiedergegeben, betrug der LC₅₀-Wert (50% lethale Konzentration) von PA für den Goldfisch 10,13 μg/ml.

Orale Toxizität in Aalen

Eine Suspension von PA in Q,2^o/oiger Carboxymethylcellulose wurde oral an Gruppen mit jeweils 10 Aalen jAnguilla Japonica, etwa 160 g) verabreicht und es Wurden Beobachtungen während der folgenden 7 Tage durchgeführt Die Temperatur des Wassers wurde bei ti bis 27,5° C gehalten.

Tabelle VI

Arzneimittel Badekon- Anzahl der überlebenden Fische nach dem angegebenen Mor- LC50

zentration Zeitraum (Tage) talität

^g/ml) 0 12 3 4 5 fcg/ral)

Unbehandelter
Vergleich

16	6	6	6	1	0	—	100
8	6	6	6	5	5	5	20
4	6	6	6	6	6	6	0
_	6	6	6	6	6	6	0

10,13

Gemäß der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) auf Fische angewendet, deren mikrobielle Infektionen verhindert oder geheilt werden sollen. Dies kann auf verschiedene Weise erfolgen. Eine typische Art besteht darin, die Verbindung der Forme! (I) als solche oder eine die Verbindung der Formel (I) enthaltende Zubereitung oral an die Fische zu verabreichen. Eine andere typische Art besteht darin, dem Fisch ein Futter oder eine Nahrung zu geben, mit der die Verbindung der Formel (I) vermischt ist Eine andere Art besteht darin.

den Fisch zeitweise oder kontinuierlich mit einer wäßrigen Lösung (Bad) der Verbindung Qer Formel (I) durch Eintauchen oder Waschen zu behandeln. Eine weitere Art besteht darin, den Fisch in einem entsprechenden Medium (beispielsweise frisches Was ser, Brackwasser ί der Seewasser, welches die Verbindung enthält) zu züchten.

Die Verbindung der Formel (J) kann als solche angewendet werden, im allgemeinen ist es jedoch zweckmäßig, sie oral in Form einer oral verabreichten Zubereitung, welche wenigstens eine heterocyclische Carbonsäure der Formel (I) oder deren nichttoxisches Säureadditionssalz und ein geeignetes Verdünnungsmittel enthält, zu verabreichen. Die Zubereitung kann aus einem Feststoff bestehen, wie beispielsweise Pulver. Tabletten oder Granulat oder aus einer Flüssigkeit, wie beispielsweise einer Suspension oder Lösung. Das für diesen Zweck verwendete Verdünnungsmittel kann beispielsweise Wasser. Ätlianof. Stärke. Dextrin. Talk. Gelatine. Lactose. Bentonit Fischpulver oder Saccharose sein. Diese Verdünnungsmittel können allein oder in Kombini .ion von zwei oder mehreren verwendet vv erden.

Die obige Zusammensetzung kann die aktive Verbindung der Formel (I) in einer Menge von 0.1 bis 99 Gew.-%, bevorzugt 0.5 bis 50 Gew.-%. bezogen auf das Gewicht der Masse enthalten. Der Rest kann ein Verdünnungsmittel der oben beschriebenen Art sein.

Hie wirksame Verbindung der Formel (I) kann in Futter oder Nahrung für Fische eingearbeitet werden. Die Menge der zuzusetzenden wirksamen Verbindung der Formel (I) kann je nach der Art des Fischs und der Art des Futters oder der Nahrung u.dgl. variiert werden. Im allgemeinen beträgt sie 0.001 bis 10 Gew.-°/o. bevorzugt 0.01 bis 1 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Futters oder der Nahrung.

Die wirksame Verbindung der Formel (I) kann auch in ein Fischbehandlungs- und Eintauchbad eingearbeitet werden.

Somit können erfindungsgemäß auch durch Eintauchbäder, die infektiösen bakteriellen Fischkrankheiten, verhindert werden. Dabei enthält das Wasser 0.05 bis 500 ppm wenigstens zu einer Verbindung der Formel (I) oder deren nichttoxisches Säureadditionsalz. Die Konzentration des wirksamen Bestandteils kann 0.1 bis 500 ppm. bevorzugt 0.5 bis 100 ppm für zeitweiliges Baden und 0.05 bis 5 ppm. bevorzugt 0.1 bis I ppm für das Baden während eines längeren Zeitraums (d. h. Züchtung in einer wäßrigen Lösung des wirksamen Bestandteils) betragen.

lim die Löslichkeit in Wasser /u erhöhen, kann die heterocyclische Carbonsäure der Formel (I) in der Anwendungsform ihres Alkalisalzes, speziell ihres Natriumsal/cs angewendet werden. Oder sie kann in Wasser als ein Gemisch mit einer kleinen Menge eines Wasserdispergiermittels, wie beispielsweise Carboxy methylcellulosc (CMC), llydroxypropylcellulose oder Gelatine eingearbeitet werden.

Die Menge der anzuwendenden Verbindung der Formel (I) ist mit zahlreichen Faktoren verbunden, wie beispielsweise der Art, Größe und dem Alter des Fischs, der Art der Infektion, den Umständen, die den Fisch umgeben oder der Anwendungsmethode. Daher sollte sie in jedem Fall entsprechend bestimmt werden. Beispielsweise beträgt die Dosis des wirksamen Bestandteils bei oraler Verabreichung normalerweise 0,5 bis 500 mg je kg Körpergewicht.

Wie oben beschrieben, ergeben die Verbindungen der Formel (I) eine hohe antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber verschiedenen für Fische pathogenen Mikroorganismen, ohne daß sie irgendwelche wesentliche Toxrzität bei Fischen zeigen. Ihre prophylactische Wirkung ist ganz hervorragend und kann in sehr kleinen Dosierungen erhalten werden. Obgleich die genannten Verbindungen wenn sie zum Baden verwendet werden, gute Wirksamkeil zeigen, liefern sie ganz besonders überlegene Effekte bei oraler Verabreichung. Das es nur sehr wenige ausgezeichnete oral verabreichbare Mittel gibt, liefert die orale erfindungsgemäße Verwendung einen erheblichen industriellen Beitrag und ist daher sehr wertvoll.

Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der erfindungsgemäßen Verwendung.

Beispiel 1
Heslungsefiekt bei oraler Verabreichung

Unter Verwendung von Gruppen von Goldfischen mit jeweils 20 Goldfischen von 10 g. die mit Chondrococcus columnaris natürlich infiziert waren, wurde der Heilungseffekt von PA bei oraler Verabreichung untersucht.

PA wurde einer pulverförmigen Fischnahrung zugesetzt und die Nahrung wurde den Fischen während 3 Tagen (2% des Körpergewichts/Tag) zweimal täglich, einmal am Morgen und das andere Mal am Abend gegeben. Das Ausmaß an überlebenden Fischen wurde während 7 Tagen beobachtet. Es wurde festgestellt, daß das Ausmaß der Oberlebenden 70 bis 80% betrug, wenn die Menge an PA in der Nahrung 0.1% und 0.01% betrug.

In einer Vergleichsgruppe, die mit der gleichen Nahrung, jedoch ohne das Arzneimittel gefüttert wurde, starben 80% der Fische während des Versuchszeitraums.

Beispiel 2

Gruppen von Aalen (Anguilla Japonica. mittleres Gewicht 100 g). wobei jede Gruppe aus 50 Fischen bestand, wurden intramuskulär mit Aeromonas liquefa· ciens Y-62 (!0° Keime/Fisch) infiziert. Während 2 Tagen beginnend am Tag vor der Infektion, wurde den Aalen eine aus PA haltiger Nahrung bestehende Suspension unter Verwendung eines Katheters bei einer Dosierung von 1.56 mg/kg/Tag oral verabreicht. Am siebten Tag nach der Infektion wurden die Aale beobachtet. Fs wurde festgestellt, daß 80% der Aale überlebten.

In einer Vergleichsgruppe von 50 Aalen, denen das so Arzneimittel nicht verabreicht worden war. sterben sämtliche Fische vor Ablauf von 3 Tagen nach der Infektion.

Während des Versuchszeilraums wurde die Temperatur ^es Wasser bei 25 bis 2b~ C gehalten.

Beispiel 3

Gruppen von Aalen (Aguilla Japonica. mittleres Gewicht 100 g). wobei jede Gruppe aus 50 Aalen

μ bestand, wurden intramuskulär mit Aeromonas liquefa· ciens Y-62 (10- Keime Fisch) infiziert. Eine aus* einer PA haltigen Nahrung bestehende Suspension wurde den Aalen 4 Std. nach der Infektion und am nächsten Tag unter Verwendung eines Katheters bei einer Dosierung von 3,1 mg/kg/Tag oral verabreicht. Am siebten Tag nach der Infektion wurden die Aale beobachlet und es wurde festgestellt, daß das Ausmaß an Überlebenden 100% betrug.

909 647/241

In einer Gruppe von 50 Fischen, denen kein Arzneimittel verabreicht worden war, starben sämtliche Fische innerhalb von 3 Tagen nach der Infektion.

Die Temperatur des Wassers wurde bei 25 bis 26°C während des gesamten Versuchszeitraums gehalten.

Erfindungsgemäß könnrn die heterocyclischen Carbonsäuren in folgenden Formen verabreicht werden:

Beispiel A

PA
Polyvinylpyrrolidon

Lactose
Stärke

300 g

10 g (5%ige Lösung) 40 g 50 g

Die obigen Bestandteile wurden geknetet, hinsichtlich der Größe eingestellt, und in üblicher Weise unter Bildung einer körnigen Masse getrocknet.

Beispiel B

AT-1493
Gelatine

Dextrin
Stärke

300 g

6 g (!0°/oige Lösung) 40 g 54 g

Beispiel C

PA

Lactose
ι Stärke

300 g
1350 g
1350 g

Die obigen Bestandteile wurden unter Bildung eines 10%igen Pulvers gemischt

In der gleichen Weise wie in den Beispielen A, B und C konnten körnige Massen oder pulverförmige Massen, die AT-1475 bzw. AT-1557 als Hauptbestandteil enthielten, hergestellt werden.

Beispiel	D	850 g
Rezept einer Goldfischnahrung:		90 g
Mehl + Maispulver	40 g
Fischpulver	geringe Menge
Mineralien	etwa 20 g
Vitamine	1000 g
Andere Substanzen
insgesamt

Die obigen Bestandteile wurden geknetet, hinsichtlich der Größe eingestellt und in üblicher Weise unter Bildung einer körnigen Masse getrocknet.

Die obige Goldfischnahrung wurde mit 30 mg PA vermischt und Wasser wurde zugesetzt, um das Gemisch gründlich zu verkneten. Das Gemisch wurde dann in Granulate mit einem jeweiligen Durchmesser von etwa 1 mm überführt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verwendung von heterocyclischen Carbonsäuren der folgenden Formel

R-COOH worin R einen heterocyclischen Rest, bestehend aus .yp

pyrido-[2,3-d]-pyrimidin-6-yl, 1,4-Dihydro-7-(4-methyl-1 -piperazinyl)-

4-oxo-1 -vinylchinolin-3-yl, 1,4-Dihydro-7-(4-äthyl-l -piperazinyl)-4-oxo-1 -vinylchinoIin-3-yl und/oder l,4-Dihydro-7-(l-piperazinyl)-4-oxo-l-vinyl-

1,8-naphthyridin-3-yl
bedeutet,

oder deren nichttoxischen Säureadditionssalzen bei der Bekämpfung von durch Bakterien verursachten infektiösen Fischkrankheiten.

Z Verwendung von S-S-Dihydro^-pyrrolidino-S-äthyl-5-oxopyrido-[2_r3-d]-pyrimidin-6-carbonsäure nach Anspruch 1.

ehe Fischkrankheiten verursachen (beispielsweise Chondrococcus eolumnaris oder Vibrio anguillarum), bei herabgesetzter Toxizität auf Fische besitzen und daher in günstiger Weise sowohl prophylaktisch als

auch therapeutisch Mittel bei bakteriellen infektiösen Krankheiten von Fischen eingesetzt werden können.

Nachfolgend sei die erfindungsgemäße Verwendung näher erläutert Die obengenannten Stoffe werden dem Fisch in einer wirksamen Menge bei der Bekämpfung

ίο der infektiösen Krankheiten verabreicht; auch in Form einer Masse oder Badelösung, welche die heterocyclische Carbonsäure oder deren nichttoxisches Säureadditionssalz enthält
Für die heterocyclischen Carbonsäuren gelten die nachfolgenden Formeln: