DE2441454B2

DE2441454B2 - Antilenkämische proteinhaltige Fraktion und ihre Herstellung

Info

Publication number: DE2441454B2
Application number: DE2441454A
Authority: DE
Inventors: Kazuyoshi Tokio Doi; Morio Kuboyama; Tsutomu Kawasaki Kudo; Taro Nagasawa; Kazuhiro Yokohama Nagata; Joji Chiba Ono; Minoru Komae Tokio Saito; Eiji Narashino Takahashi
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1973-08-30
Filing date: 1974-08-29
Publication date: 1980-12-11
Also published as: DE2441454C3; CH604723A5; FR2242109A1; SE7410972L; JPS5048108A; CA1041010A; DE2441454A1; SE430123B; GB1461335A; US4054648A; JPS5221570B2; FR2242109B1

Description

Die Erfindung betrifft eine antüeukämische proteinhaldgc Fraktion sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus Placenta, die eine Besserung bei Leukämie bewirkt und das Wachstum maligner Blutzelleri inhibiert.

Zur Extraktion physiologisch oder pharmakologisch aktiver Substanzen oder der Reinigung von Placentaextrakten gibt es bereits zahlreiche Veröffentlichungen, darunter solche, bei denen Wirkung gegen Geschwüre oder Krebs angegeben ist. Die Herstellung eines spezifischen Placezitaextrakts mit einem therapeutischen Effekt bei Leukämie ist jedoch bisher nicht bekanntgeworden.

Hieda (»Reizotaiban no Seikagaku to Iryokoka« [»Biochemie und therapeutische Wirkung gefrorener Placenta«], Kinbara Shoten, 1965) berichtete vom Vorliegen einer Substanz in der menschlichen Placenta, die gegen Zirrhose wirksam ist Kimura (Hiroshima Igaku, Bd. 22,1969, S. 1136) und Saito (Clinical Report, Bd. 3, 1969, S. 543) beschrieben ·. ine antiulcerative Wirkung eines Placentapräparats. Ferner berichtete Byong Ho Chin (Abstract of Papers of the 9th International Cancer Congress 1966, S. 476) von einem Mittel gegen Ehrlich-Sarkom und einem Mittel gegen N-F-Sarkom aus menschlicher Placenta.

Das Präparat gegen Zirrhose nach Hieda wurrle folgendermaßen hergestellt:

Eine frische Placenta wurde mit Wasser gewaschen, bei 2 bis 4° C einige Tage lang stehengelassen, danach zerkleinert und 60 min lang gekocht. Die Zubereitung wurde einem Fünftel ihres Volumens mit 1 n-HCI bis zu einem pH von 1,8 versetzt und mit 2 g Pepsin bei 38° C 20 h lang aufgeschlossen. Das aufgeschlossene flüssige Medium wurde bei 3000 U/min 15 min lang zentrifugiert und in eine überstehende Phase und einen Niederschlag aufgetrennt. Die überstehende Phase wurde zur Herabsetzung ihrer Acidität auf einen pH-Wert von 4,4 bis 4,6 durch ein lonenaustauscherharz geleitet; ihr Volumen wurde so eingestellt, daß jeweils 100 g (Feuchtgewicht) Placenta einem Volumen von 100 ml entsprachen. Dieses Präparat wurde als Lösung A bezeichnet. Ferner wurde der Niederschlag mit konzentrierter Salzsäure durch lOstündiges Erhitzen hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde danach mit Aktivkohle entfärbt, wobei die überschüssige flüchtige Säure durch Verdampfen im Wasserbad entfernt wurde, und danach einer zweiten Entfärbung unterwo-fen. Die Acidität der Lösung wurde gleichfalls mit einem lonenaustauscherharz auf einen pH-Weri von 4,4 bis 4,6

herabgesetzt Das Volumen des Eluats wurde so eingestellt, daß jeweils 100 g (Feuchtgewicbt) Placenta einem Volumen von 25 ml entsprachen. Dieses Präparat wurde als Lösung B bezeichnet Die Lösungen A und B wurden gemischt und die Acidität des Gemisches wurde auf einen pH-Wert von 6,1 bis 6,4 eingestellt Nach Kochen und Reinigung durch Filtration wurde das erhaltene Präparat in Ampullen abgefüllt und für Injektionszweckf; sterilisiert Das Präparat stellte eine transparente gelbe Lösung mit einer Dichte von 1,0090 bis 1,0132, einem pH-Wert von 6,1 bis 6,4 und einer Trockendichte von 78,6 bis 823 mg/ml dar und verhielt sich beim Sulfosalicylsäuretest negativ. Der Aschegehalt der Gesamtstickstoffgehalt und der Aminostickstoffgehalt betrugen 8,0 bis 93 mg/ml, 9,13 bis IUl mg/ml bzw. 8,56 bis 10,24 mg/ml. Für den Extrakt wurde eine lipotrope Wirksamkeit eine Erhöhung der Gewebeatmung der Leber, eine Stimulation der Schilddrüse und des Grundumsatzes kastrierter Tiere und eine günstige Beeinflussung der Zirrhose bei Menschen and Versuchstieren geltend gemacht

Von Byong Ho Chin wurde eine Placentfjimulsion hergestellt und zur Gewinnung der überstehenden Phase zentrifugiert Bei der Zugabe von Alkohol kam es zu einer Ausfällung, die dann durch Papierelektrophorese fraktioniert wurde. Die resultierende Fraktion wurde gegen Wasser dialysiert; das Dialysat und die nicht-dialysierbare Fraktion wurden danach mit Aceton ausgefällt Für den Niederschlag wurde eine wachstumsinhibierende Wirkung bei Ehrlich-Sarkom und N-F-Sarkom angegeben.

Eine Heilwirkung gegen Leukämie wurde jedoch bei derartigen Placentaextrakten nicht beschrieben.

Andererseits sind Carbazilchinon (Arakawa, M. et al., Gann, Bd. 61,1970, S. 485), Cytosinarabinosid (Talley, K. et al. Blood, Bd. 21,1963, S. 352), Daunomycin (Tan, C. et al, Caner, Bd. 20,1967, S. 333), Adriamycin (Di Marco, A. et al. Cancer Chemotherapy Reports, Bd. 53,1969, S. 33) und L-Asparaginase (Kidd, G.G. et al. Journal of Experimenta; Medicine, Bd. 98, 1953, S. 565) als to antileukämische Mittel bekannt die aus natürlichen Materialien, bei denen es sich nicht um Placenta handelt, gewonnen oder auf chemischem Wege hergestellt werden. Jedoch zeigen alle diese antileukämischen Mittel keine spezifische Wirkung gegenüber leukämisehen Zelle« und bringen aufgrund klinischer Beobachtungen verschiedene Nebenwirkungen wie z. B. Leukopenie, Thrombocyptopenie, Anämie, Hämorrhagie, Erbrechen, Diarrhöe, Fieber, krankhafte Veränderungen der Niere und der Liber und Gelbsucht mit sich. Daher sollten bei der therapeutischen Verabreichung dieser M it toi einige Hilfsmaßnahmen ergriffen werden, um derartige sonst unvermeidbare Komplikationen zu verhindern. Bmerkenswerte therapeutische Ergebnisse sind damit im allgemeinen nicht erzielt worden, da sich aus den Nebenwirkungen ernste Komplikationen ergaben. So besteht die Chemotherapie der Leukämie gegenwärtig ausschließlich darin, eine vorübergehende Remission mit verlängerter Lebensdauer, aber verbunden mit einer zunehmenden Vergiftung des Patienten, m> herbeizuführen, was nicht als günstiger HYileffekt angesehen werden kann.

Da die bekannten antileukämischen Mittel bezüglich ihrer inhibierenden Wirkung gegenüber leukämischen Zellen nicht spezifisch sind, wurden umfangreiche ' > Untersuchungen mil der Absicht durchgeführt, ein antileukämisches Mittel .».u entwickeln, das nicht nur selektiv das Wachstum leukämischcr Zellen inhibiert.

wobei normale Zellen intakt bleiben, sondern auch die abnorme Funktion maligner Zellen korrigiert.

Die Erfindung gibt eine antileukämische proteinhaltige Fraktion sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung an. Die erfindungsgemäße proteinhaltige Fraktion stellt einen proteinhaltigen Placentaextrakt dar und ist erhältlich durch

(a) Zerkleinert: von Placentagewebe von Mensch, Rind oder Schwin in Wasser oder einer verdünnten physiologischen Salzlösung und Herstellung einer Emulsion,

(b) Ansäuern mit einem Gemisch von 10- bis 3U%iger wäßriger Essigsäure und 10- bis 20%iger Salzsäure in einem Verhältnis von 25 :75 bis 75 :25 bis zu einer Acidität von 0,5- bis 2,0-n,

(c) Erhitzen der angesäuerten Emulsion für 30 bis 60 min auf 75 bis 90" C und AbkühEenlassen,

(d) Abzentrifugieren der unlöslichen Proteine,

(e) Neutralisieren der Emulsion mit einer alkalischen Lösung,

(f) Abzentrifugieren von unlöslichem Material,

(g) Einengen bis auf '/io bis '/30 des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck,

(h) Dialysieren des konzentrierten flüssigen Mediums gegen Wasser oder Filtration durch ein geeignetes Membranfilter,

(i) Einengen des Dialysats auf </ioo bis '/200 bzw. des Filtrats auf '/5 bis ¹Ao des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck,

(j) chromatographische Fraktionierung an Sephadex, wobei die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 036 bis 1,82 mit Sephadex G-25®, die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 035 bis 13 mii Sephadex G-15« bzw. die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 035 bis 1,25 mit Sephadex G-10* abgetrennt wird, und

(k) Lyophiiisieren der erhaltenen Fraktion.

Die erfindungsgemüße proteinhaltige Fraktion zeigt eine ausgezeichnete antileukämische Wirkung, wobei bishc bei den angewandten Dosen keine auffälligen Nebenwirkungen beobachtet wurden. Der Wirkstoff wird nachstehend als D-Faktor bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der antileukämischen proteinhaltigen Fraktion ist entsprechend durch die oben angegebenen Verfahrensschritte (a) bis (k) gekennzeichnet

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnung erläutert; es zeigen

F i g. 1 bis 3 Chromatogramme konzentrierter Extrakte von menschlicher Placenta, die erfindungsgemäß unter Verwendung von Sephadex G-25, G-15 bzw. G-IC in Schritt (j) zur gelchromatographischen Trennung hergestellt wurden;

Fig.4 das UV-Soektrum der Fraktion 2, die mit Sephadex G-25 aus dem Placentaextrakt erhalten wurde;

Fig.5 das IR-Spektrum der Fraktion 2, die mit Sephadex G-25 a;s dem Placentaextrakt erhalten wurde;

Fig.6 die wachstumsinhibiefendc Wirkung des D-Faktors bei Mäusen auf die Entwicklung von Zellen bei lymphoider Leukämie sowie von normalen Nierenzellen und

Fig. 7 die wach./'umsirhibierende Wirkung des D-Faktors auf myelogene leukämischc Zellen der Maus.

Im folgenden wird das erfindungsgemäßc Verführen näher erläutert.

Herstellung einer Placentaemulsion

und Ansäuern der Emulsion

[Schritte (a) und (b)]

Die Placenta, die gemäß der Erfindung verwendet wird, stammt vom Menschen, Rind oder Schwein; sie ist frisch oder in gefrorenem Zustand leicht handzuhaben und stellt zugleich ein wirtschaftlich günstiges Ausgangsmaterial dar. Die Placenta wird mit einer ausreichenden Menge mehrfach destilliertem Wasser gewaschen; bei Verwendung von gefrorenem Material soll zuvor aufgetaut werden. Es wird steriles Wasser oder Salzlösung in dem Feuchtgewicht des Materials entsprechender Menge zugegeben. Danach wird die Placenta in Stücke geschnitten und mit einem Gemisch aus wässeriger Essigsäure (20 bis 30%) und Salzsäure (1 bis 20%) in einem Mischungsverhältnis von 25 : 75 bis 75 : 25 zerkleinert, wobei die Acidität der Emulsion im Bereich von 0,5- bis 2,0-n liegen kann. Durch das Ansäuern sollen die Proteine denaturiert und unlöslich gemacht und das Cytoplasma und das Bindegewebe löslich gemacht werden.

Essigsäure und Salzsäure werden verwendet, da z. B.

Salpetersäure und Schwefelsäure zur Zersetzung, Nitrierung, Dehydralation oder Desaminierung der Proteine und Zucker in der Emulsion und zu Schwierigkeiten bei der Extraktion des D-Faktors * führen können. Phosphorsäure ist ebenfalls nicht günstig, da sie nicht nur zu einer langsameren Extraktion des D-Faktors führt, sondern auch die Aktivität des Faktors je Volumeinheit des gereinigten Extrakts herabsetzt.

in Die optimale Acidität liegt aufgrund der experimentellen Untersuchung im Bereich von 0,5- bis 2.0-n. wie aus den folgenden Ergebnissen zum Extraktionsgrad und der Aktivität des resultierenden D-Faktors hervorgeht.

Vergleich der einzelnen Fraktionen
hinsichtlich der antilciikämischen In-vivo-Wirkung

Es wurden insgesamt 13 Proben von Fraktionen mit dem D-haktor hergestellt, wobei wie in obigem iicispici -Ή mit dem Unterschied verfahren wurde, daß die Acidität im Bereich von 0,1 - bis 2,5-n variiert wurde.

Der Extniktionsgrad wird nach folgender Formel berechnet:

r- . . . Trockengewicht der D-Faktor-Fraktion ,__.„.

F.xtraktionsgrad = =- - ^-r-— — I00(%).

Feuchtgewicht der verwendeten Placenta

Die Aktivität der den D-Faktor enthaltenden Fraktion wurde auf biologischem Wege anhand der Zellentwicklung bei lymphoider Leukämie L5178Y der Maus bestimmt (Fischer. G. A., Annals of the New York Academy of Science, Bd. 76, 1958, S. 673). Es wurden 13 verschiedene Testmedien hergestellt, indem jeweils 2 mg von einer der obigen 13 Proben zu 1 ml Nährmedium mit 10% Rinderfetalserum zugegeben wurden: ferner wurde ein Kontrollmedium ohne D-Faktor hergestellt Der Vergleichsversuch wurde in der gleichen Weise mit dem Unterschied durchgeführt, daß kein D-Faktor im Medium enthalten war. Es wurden L5178Y-Zellen zu einer Zellkonzentration von 10⁴ZmI in das Medium eingeimpft. Die Kultur wurde wie üblich inkubiert, worauf die Anzahl der Zellen am sechsten Tag mit einem Hämozytometer gezählt wurde. Die Aktivität des D-Faktors wurde durch die Anzahl der Zellen in 1 ml wiedergegeben. Je kleiner die Anzahl der Zellen ist. umso größer ist die Aktivität des D-Faktors anzunehmen. Es wurde festgestellt, daß eine Acidität von 1.2-n beim Extraktionsvorgang zur höchsten Ausbeute des D-Faktors und zur höchsten Aktivität des D-Faktors pro Gewichtseinheit des Extrakts führte. Wenn der Extraktionsgrad sowie die Aktivität des D-Faktors bei einer Acidität von 1,2-n zu 100 angenommen werden, betrugen der Extraktionsgrad und die Aktivität des Faktors mehr als 70 bzw. 80 bei Aciditäten im Bereich von 0,5- bis 2,0-n. Aciditäten außerhalb des Bereichs führten zu einem kleineren Extraktionsgrad und einer kleineren Aktivität des Faktors. Bei einer Acidität von über 2-n kam es zu einer starken Hydrolyse der Placentaproteine und einer Vermehrung von Produkten mit einem Molekulargewicht unter 5000 Dalton bei einem deutlich größeren Extraktionsgrad, jedoch war die Aktivität des D-Faktors verringert Unter einer Acidität von 0J5-n trat keine ausreichende Hydrolyse ein; dementsprechend fielen Ausbeute und Aktivität pro Gewichtseinheit des Extrakts ab. Daraus folgt, daß die Acidität der Emulsion im Bereich von 0,5- bis 2,0-n und vorzugsweise bei 1,2-n liegen so!L

Der Bereich des Mischverhältnisses von Essigsäure Jo mit Salzsäure wurde folgendermaßen bestimmt:

Vergleich der Ergebnisse

bei verschiedenen Mischungsverhältnissen von

Essigsäure und Salzsäure

ii Es wurden Extrakte wie in Beispiel I hergestellt, wobei jedoch das Mischungsverhältnis der zum Ansäuern verwendeten Säuren variiert wurde, wie in Tabelle 1 angegeben ist, in der auch die erhaltenen Ergebnisse aufgeführt sind. Ein Mischungsverhältnis

-to von Essigsäure zu Salzsäure von 35 :65 lieferte das beste Ergebnis hinsichtlich des Extraktionsgrads und der Aktivität des D-Faktors. Je größer der Anteil an Salzsäure war, umso größer war der Extraktionsgrad und umso kleiner die Aktivität des D-Faktors. Andere

■45 Werte des Verhältnisses lieferten eine geringere Aktivität als das Verhältnis 35 :65. Wenn der Extraktionsgrad und die Aktivität beim Verhältnis 35 :65 als 100 angesetzt werden, fällt das Mischungsverhältnis, das Werte von 70 für den Extraktionsgrad und 80 für die Aktivität des D-Faktors liefert, in den Bereich von 75 : 25 und 25 : 75.

Daraus ergibt sich, daß das Mischungsverhältnis von Essigsäure und Salzsäure im Bereich von 25 :75 bis 75 :25 liegt und mit 35 :65 optimal ist

Erhitzen
[Schritt (c)]

Die angesäuerte Emulsion wurde zur Denaturierung der Proteine und zum Löslichmachen des Cytoplasmas und des Bindegewebes erhitzt. Mehrstündiges Erhitzen bei höherer Temperatur kann zu einem Abbau des Placentamaterials unter vermehrter Bildung von Produkten mit niedrigem Molekulargewicht führen, wodurch zwar die Menge der extrahierbaren Substanzen erhöht jedoch die Aktivität des D-Faktors pro Gewichtseinheit des Extrakts herabgesetzt wird.

Tabelle

lissie-	Salz	F.xtrnk-	Fxlrak-	Aktivität	Aktivitäts
säure	säure	tions-	tions-	ilcs	index des
		grad	index	D-Faktors	D-Faktors
100	0	0,05	35	1,0X10'	36
95	5	0,05	35	I.OX 10'	36
90	IO	0.05	35	I.OX K)'	36
85	15	0.07	50	7.5 X 10'	48
80	20	0,07	50	6.0X K)'	60
75	25	0.10	71	4.5 X K)'	80
70	30	0.11	78	4.5 X K)'	8(1
65	35	0.13	92	4.3 X 10'	83
60	40	0.! 3	92	4.2 X 10'	85
55	45	0.13	92	4.2 X 10'	85
.ή ι	."H/	u, n		4..' A II/	Λ .1
45	55	0.13	92	3.¹>X 10'	92
40	60	0.14	100	3.8 · 10'	⁽)4
35	65	0.14	'00	3.6 X 10'	100
30	70	0.14	100	4.0X K)'	90
25	75	0.14	100	4.0X 10'	90
20	80	0.15	107	5.5 X K)'	65
15	85	0,15	107	6.('XlO'	60
IO	90	0.15	107	I.OX K)'	36
5	95	0.15	107	1.0 > 10'	36
0	KK)	0.15	107	1.2 X K)'	30
Vergle	iv.sver»	uc h		8.5 x 10'	_
(Medium ohne D-Faktor)

Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um die optimalen Bedingungen für das Erhitzen zu ermitteln. Es wurden insgesamt 9 Placentaextrakte nach Beispiel 1 mit dem Unterschied hergestellt, daß die Erhitzungstemperatur im Bereich von 55 bis 95^CC variiert wurde, indem nach 40minütigem Erhitzen jeweils um 5"C erhöht wurde. Der Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors jeder Zubereitung wurden wie oben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. 40 min Erhitzen auf 80^cC lieferte die besten Ergebnisse für den Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors. Wenn der Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors bei 80°C und 40 min mit 100 angesetzt werden, ergab sich für Temperaturen im Bereich von 75 bis 90⁰C und eine Erhitzungsdauer von 40 min ein Wert von über 70 für den Extraktionsgrad und über 80 für die Aktivität des D-Faktors. Erhitzen bei Temperaturen außerhalb des Bereichs von 75 bis 90⁰C führte zu weniger günstigen Ergebnissen bezüglich beider Parameter.

Tabelle 2	Extrak	Extrak	Aktivität des	Aktivitäts
Erhit-	tionsgrad	tions-	D-Faktors	index des
zungs-	(%)	index		D-Faktors
tempc-
ralurf C)	0,02	15	5,0XlO⁴	70
55	0,02	15	5.0X10⁴	70
60	0,04	30	4,1 X IO⁴	85
65	0,08	60	' 4^2 X 1Ö⁴	83
70	0,12	92	3,8XlO⁴	92
75	0,13	100	3,5 X IO⁴	100
80

l-rhit-	l.xtrak-	ohne D-I	I-xlrak-	Aktivität des	Aktivitätv
/Ulll!S-	tionsürad	tions-	D-Faktors	iiidex des
lempe-	("»)	index		IM-aktors
ratur ( < )
85	0.14	107	3,8X10'	92
90	0,15	115	4.3X10'	81
95	0.18	138	4.7X10'	74
Verpleichsversueh		8.7 X KV	-
(Medium	•akiorl

Ferner wurden 7 Extrakte wie in Beispiel 1 bei einer Erhitzungstemperatur von 80 C mit dem Unterschied hergestellt, daß die Erhitzungsdauer im Bereich von 10 bis 70 min jeweils mit einer Verlängerung um 10 min variiert wurde. Der Extraktionsgrad und die Aktivität Ηρς Π-Falctnr*. wurrlpn w ρ nhpn ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

l-.rhit-	l:\trak-	Ixlrak-	Aktivität des	Aktivitäts
/Linus-	lionsgr.id	tions-	D-IaMors	index de-.
dauer	("■)	index		D-Faktors
(min)
10	0.01	7	I.OX 10^;	35
20	0.05	36	5.0X IO⁴	70
30	0.12	86	3.8 X IO⁴	92
40	0.14	100	3.5 XlO⁴	100
50	0.15	107	3.6 XlO⁴	97
60	0.15	107	3.6 XlO⁴	97
70	0.17	121	4.5 XlO⁴	77
Vergleichsbeispiel		8.6 X K)'	-
(Medium ohne D-f	•aktor)

Wie aus den obigen Ergebn ssen zu ersehen ist. liefert 40 min Erhitzen auf 80⁼C die besten Ergebnisse bezüglich des Extraktionsgrads und der Aktivität des D-Faktors.

Wenn der Extraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors bei den oben angeführten optimalen Bedingungen als 100 gesetzt wird, liefert eine Erhitzungsdauer im Bereich von 30 bis 60 min mit einer Temperatur von 80⁰C Werte von über 70 für den Extraktionsgrad und über 80 für die Aktivität des D-Faktors. Außerhalb des angegebenen Bereichs liegende Werte erwiesen sich als nicht günstig.

Entfernung der Prateinsubstanz

und Einstellung des pH-Wertes

[Schritte (d) und (e)]

Ein Teil der Placentaproteine wurde durch Erhitzen im sauren Medium unlöslich gemacht. Die unlöslichen Proteine wurden abzentrifugiert Die überstehende Phase wurde mit einer alkalischen Lösung, vorzugsweise mit wässerigem Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, neutralisiert Eine maximale Abtrennung der Proteine wurde durch Zentrifugieren im sauren pH-Bereich erzielt, da einige F'roteine beim Neutralisieren löslich werden, was ihn: Abtrennung behindert. Beim Neutralisieren der überstehenden Phase können einige unlösliche Produkte ausfallen, die danach entfernt werden sollten.

ϊπι allgemeinen sollen FIxtrskts aus lebenden¹ Material zur Inaktivierung sämtlicher Krankheitserreger einschließlich Viren im Autoklav behandelt werden. Daher wird erfindungsgemäß nach der Neutralisation

autoklavicrt. Der D-Faktor ist derart wärmebeständig, daß der Extrakt bei 1!0⁰C 15 min oder bei 120°C 10 min unter einem Druck von 1.0 bis 1.5 bar mit Dampf sterilisiert werden kann, also unter gleichen Bedingungen wie bei der Sterilisation von Mikrobenkulturmedien.

Konzentrierung und Dialyse bzw. Filtration
[Schritte (f) bis (h)]

Nach der Behandlung im Autoklav wurde der Extrakt zur Abtrennung ausgefallener unlöslicher Substanzen zentrifugiert; der Überstand wurde gesammelt. Ohr.e Behandlung im Autoklav war eine erneute Klärung nicht erforderlich. Die klare Lösung wurde unter vermindertem Druck bis auf '/:< > bis '/in ihres ursprünglichen Volumens eingeengt.

Das Konzentrat wurde zur Entfernung chemischer Spezies mit höherem Molekulargewicht wie üblich gegen dreifach destilliertes Wasser dialysiert oder durch ein Membranfilter filtriert. Die Dialyse des Konzentrats wurde in einem üblichen Cellulose-Dialysierschlauch durchgeführt; die dialysierte Flüssigkeit wurde gesammelt. Die Filtration des Konzentrats wurde mit einem geeigneten Membranfilter vorgenommen, wobei das Filtrat gesammelt wurde.

Erneutes Einengen und Chromatographie mit Hilfe

eines mit Epichlorhydrin vernetzten Dextrans

[Schritte (i) und (j)]

Das dialysierte flüssige Medium wurde auf '/ioo bis '/200 bzw. das Filtrat auf '/s bis '/10 des Volumens der ursprünglichen Lösung unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde anschließend zur Gewinnung einer Fraktion mit einem Gehalt an D-Faktor an Sephadex® G-25, G-15 und GlO chromatographiert. Die jeweilige Säule wurde mit 1 : 100 verdünnter, mit Phosphat gepufferter Salzlösung, die kein Calcium und Magnesium enthielt, mit dreifach destilliertem Wasser äquilibriert. Das Konzentrat wurde dann oben auf die Säule aufgegeben und danach mit dem gleichen Puffer mit einer Geschwindigkeit von 5 bis 10 ml/10 min eluiert. Die Fraktionen mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,96 bis 1,80 bei Sephadex G-25, 0,35 bis 1,24 bei Sephadex G-15 bzw. 0,35 bis 1,25 bei Sephadex G-10 wurden gesammelt.

Die Größe der zu verwendenden Säule hängt vom Volumen des Konzentrats ab, ist jedoch von dessen Konzentration unabhängig. Zur Gewinnung einer Fraktion mit dem D-Faktor soll die Größe der jeweiligen Säule das 10- bis 20fache des Volumens des Konzentrats betragen. Die gelchromatographisch abgetrennte Fraktion wird durch den Verteilungskoeffizienten (Kd) charakterisiert, der nach folgender Formel berechnet wird:

V —V V — V

V;

aG

V_e: Volumen, das bis zur Elution des gelösten Stoffs ausfließt;

V₀: Lösungsmittelvolumen außerhalb der Gelteilchen;

Vp Lösungsmittel volumen in den Gelteilchen;

a: Gewicht der trockenen Gelteilchen:

G\ Gewicht des pro Gewichtseinheit trockener Gelteilchen festgehaltenen Lösungsmittels.

Der Verteilungskoeffizient dient zur !ndizienjng einer gelösten Substanz, um die diese Substanz enthaltende Fraktion unabhängig von der Größe der Säule und der Elutionsgeschwindigkeit zu definieren, die aus der Säule eljlert wird. Da das Molekulargewicht des D-Faktors relativ klein ist, werden Sephadex G-25. G-1 5 oder G-10 zur Abtrennung verwendet. Die Verwendung von Sephadex G-50 oder noch höher vernet/.ter Dextrangele führte nicht zur Gewinnung einer Fraktion mit einem Gehalt an D-Faktor, wie im folgenden erläutert wird:

Nach Beispiel I hergestellter konzentrierter Placentaextrakt(Gesamtfestätoffgehalt 20%), wurde unter den in Tabelle 4 angegebenen Bedingungen an Sephadex G-25. G-15 und GlO chromatographiert. Die optischen Dichten der Fraktionen des Eluats bei 280 bzw. 260 mn wurden spektralphotometrisch bestimmt. Mit Sephade\ G-25 wurden folgende Fraktionen mit folgenden /Cz-Wcrten erhalten:

Fraktion I: 0.03 bis 0,94;

Fraktion 2: 0.95 bis 1.82;

Fraktion 3: !,83 bis 2.55; und

Fraktion 4: 2,56 bis 3,04.

Mit Sephadex G-15 wurden folgende Fraktionen mit folgenden /Cj-Werten erhalten:

Fraktion 1: 0,06 bis 0,34;
Fraktion 2: 0.35 bis 1,25;
Fraktion3: 1,26bis l,85;und
Fraktion 4: 1,86 bis 3,3.

Mit Sephadex G-10 wurden folgende Fraktionen mit folgenden ^-Werten erhalten:

Fraktion 1: 0,06 bis 0,34;

Fraktion 2: 0.35 bis 1,25;

Fraktion 3: 1.26 bis 1,85; und

Fraktion 4: 1.86 bis 3,3.

Der Eixtraktionsgrad und die Aktivität des D-Faktors wurden an den 12 Fraktionen wie oben beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen Chromatogramme des Placentiiextrakts, der mit Sephadex G-25, G-15 bzw. G-10 erhalten wurde. In jeder Figur sind an der Ordinate die optischen Dichten (OD) des Zufließenden Mediums und an der Abszisse die Nr. der Röhrchen und die Kj-Werte angetragen. Die ausgezogenen Kurven geben die OD bei 260 nm, die gestrichelten Kurven die OD bei 280 nm wieder. Die Fraktion 2 jeder Säule zeigte eine kraftige wachstumsinhibierende Wirkung auf die Zellentwicklung bei lymphoider Leukämie der Maus. Keine der anderen Fraktionen zeigte eine derartige Wirkung. Wie den F i g. 1 bis 3 und Tabelle 5 zu entnehmen ist. wurde der D-Faktor ausschließlich aus der jeweiligen Fraktion 2 gewonnen.

Daraus folgt, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren der D-Faktor oder eine Fraktion mit einem Gehalt an D-Faktor in wirksamer Weise erhalten werden können.

Einige physikalisch-chemische Eigenschaften der Fraktion 2 werden nachstehend angegeben: Das Absorptionsmaximum im UV-Bereich lag bei 258 nm. Für das Molekulargewicht ergab sich ein Wert unter 5000 Dalton. Das [R-Spektrum des gefriergetrockneten Präparats der Fraktion 2 (KBr-Preßling) ist in F i g. 5 wiedergegeben, aus der das Vorliegen von Peptidbindungen, Phosphatesterbindungen und Amidogruppen entnommen werden kann. Dementsprechend können Nucleinsäuren, Peptide und Zucker im Extrakt vorliegen. Andere Eigenschaften der gelchromatographisch isolierten Fraktion 2 sind in Tabelle 6 zusammengestellt.

Tabede 4

Gewicht der Säulenfüllung 'g)

Säule:

Durchmesser (cm) X Länge (cm)

Eingesetzte Probenmenge (ml)

Elutionsmittel

El utionsgesch windigkeil

(ml/10 min)

Elutionswert (ml/Röhrchen)

Sephadex Ci-25 86 Sephadex (i-15

Sephadex Ci-I 76

2,5X90 2,5X40 2,5X40

20 6 6

verdünnte (1 : 100) mit verdünnte (1 : 100) mit verdünnte (1 : 100) mit

phosphatgcpuffcrtcr phosphatgcpiifTertcr phosphatgepufTcrter

Salzlösung Salzlösung Salzlösung

7 5 4.5

4,5

Tabelle 5

I'rak- Sephadex Ci-25 Sephadex (1-15 Sephadex Ci-10

tion Nr. Verteilung*- Kxtrak- Aktivität des \ ertcilurms- I xtrak- Aktivität des Verteilungs- tixtrak- Ακίίνίιϋι

koefnzient tions- I)-Faktors koelTi/ient tions- D-Iaktors koeffi/ient lions- des

grailC») grau (".>) grad I M D-Faktors

1	0,03-0,94	0.009	1,0X 10"
2	0,95-1,82	0.130	3.4 X ΙΟ⁴
3	1,83-2,25	0,082	8.5 X ΙΟ⁵
4	2,56-3,04	0,009	ι,Ο X 10"

Veraleichsvcrsuch

0,02-0,34 0.005

0.35-1,24 0,110

1.25-1,81 0,090

1.82-2.76 0.004

8,5 X 10" Vergleichsversuch 1,0X10"
3.4X10'
7.2X10'
I₁(Iy μ·)"

8.5 X 10·

0,06-0,34 0,003

0,35-1.25 0,096

1.26-1.85 0,048

1,86-3,3 0,003

1.0 X 10" 3.4 X 10' 7.8 X ΚΓ 1.0/ IO¹'

Vergleichsve.sueh 8.6 X ΚΓ

Tabelle 6

Protein-Pcptide (mg/mll
(Lowry-Folin-Methnde)

Kohlenhydrate (mg/ml)
Phenol-Schwefelsäure (berechnet als Glucose)

Nucleinsäuren Ribonucleinsäuren (mg/ml) (Oreinol-Methode)

Desoxyribonucleinsäuren (mg/ml) (Indol-Methode)

Organische Lösungsmittel
70% Äthanol
Äthyläther
Chloroform
Aceton

Sulfosalicylsäure-Reaktion

Biuret-Reaktion

Ninhydrin-Reaktion

Molisch-Test

Farbe des Pulvers

Sephadex Ci-25

7.20 siiurelöslich

7,19 säureunlöslich

0,01 1.00 3.12

1.92

Sephadex Ci-15	Seplvidex Ci-K)
6.80 sii'irclöslicM	6.30 säurelöslich
6.78 säureunlöslich	6.26 säureunioslich
0,02	0.04
1,38	1.24
3.81	3.56

2.03

1.84

löslich	löslich	löslich
unlöslich	unlöslich	unlöslich
unlöslich	unlöslich	unlöslich
unlöslich	unlöslich	unlöslich

hellgelb

Weiterverarbeitung des Extrakts [Schritt (k)]

Die erhaltene Fraktion mit dem D-Faktor (Fraktion 2) wurde durch ein steriles Membranfilter mit einer Porengröße <0,2μπι filtriert, in sterilisierte Ampullen abgefüllt und gefriergetrocknet.

Vergleichsversuche

Placentaextrakte, die nach den oben erläuterten Arbeitsweisen von Hieda bzw. Byong Ho Chin hergestellt und lyophilisiert worden waren, wurden hinsichtlich ihrer Wirkung mit der erfindungsgemäßen Fraktion wie folgt verglichen:

Es wurden Medien mit einem Gehalt von 10% Rinderfeialserum und 2 mg/m! D-Faktor, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden war, sowie Vergleichsmedien ohne D-Faktor und Placentaextrakte nach Hieda und Byong Ho Chin hergestellt. Diese Medien wurden mit L5t78Y-Ze!len mit einer Zellkonzentration von 1 χ 10⁴ZmI geimpft und in üblicher Weise inkubiert, worauf am 6. Tag die jtweilige Anzahl Zellen mit einem Hämocytometer bestimmt und die Aktivität des D-Faktors durch die Anzahl Zellen pro ml Medium angegeben wurde. Dabei wurde die Anzahl Zellen in einem Medium mit zugegebenem D-Faktor zu 100 festgesetzt; die Anzahl Zellen in einem Medium mit einem Zusatz an anderen Substanzen wurde als Aktivitätsverhältnis des D-Faktors angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt

Tabelle 7	D-Faktor- Aktivität	D-Faktor- Aktivitäts- verhällnis
Zusatz	3,6XlO⁴	100
Erfindungsgemäßer D-Faktor	5,0XlO⁵	7
Nach Hieda erhaltene Substanz	3,0XIO⁵	12
Nach Byong Ho Chin erhaltene Substanz	8,5XlO⁵
Vergleich (Inkubation in einem Medium ohne Extraktzusatz)

Wie aus Tabelle 7 ersichtlich, tritt bei den Placentaextrakt«! nach Hieda und Byong Ho Chin keine Wirkung wie beim D- Faktor auf, daß die normale Zellfunktion bei leukämischen Zellen wiederhergestellt wird.

Danach wurde die den D-Faktor enthaltende Fraktion die gemäß der Erfindung hergestellt worden war, folgendermaßen getestet:

Wirkung des D-Faktors auf die Wiederherstellung

der normalen Funktion erythroblastischer

leukämischer Zellen (T-3-CI-1) in vitro

Normale erythroblastische Zellen können Hämoglobin synthetisieren. Bei der erythroblastischen Leukämie der Maus (T-3-CI-1) können die Zellen infolge zellulärer Veränderungen kein Hämoglobin synthetisieren. Wenn demgemäß der D-Faktor wieder zur Hämoglobonsyn these bei T-3-C1-1 führt, ist anzunehmen, daß er die normale Funktion leukämischer Zellen wiederherstellt.

Der Stamm T-3-CI-1 wurde von Ikawa (Gann, Bd. 57, 1966, S. 641; ibid, Bd. 58,1967, S. 155; Proceedings of the Japan Academy, Bd. 47, 1971, S. 220) wie folgt hergestellt:

Friend-Virus (von Q Friend gefundener Leukämie-Virus der Maus) wurde Mäusen intraperrtoneal injiziert, um einen Fokus in der Milz hervorzurufen. Die Milz der

ίο getöteten Tiere wurde entfernt und die Zellen des Gewebes in einer Salzlösung dispergiert Die Milzzellensuspension wurde dann Mäusen subcutan injiziert um ein Neoplasma zu erzeugen. Die auf diese Weise gebildeten neoplasmatischen Zellen wurden wiederum Mäusen zur Ausbildung einer aszitischen Form intraperitoneai injiziert, aus der ein Klon (T-3-CI-1) in vitro gewonnen wurde. Zu einem Nährmedium mit 20% Kälberserum wurden 2 mg D-Faktor pro ml zugegeben, der nach Beispiel 1 hergestellt worden war. Als KontroürnedrüiTi diente ein Nähnnedhnn ohne D-Faktor. Die Impfung erfolgte in üblicher Weise mit T-3-CI-1 -Zellen, worauf die Kulturen 4 Tage inkubiert wurden. Die Aktivität der Aminolävulinsäuresynthetase der Zellen wurde in dieser Zeit bestimmt Die enzymatische Aktivität wird als Index für die Differentiation angesehen; bei der Reaktion des Enzyms Aminolävulinsäuresynthetase handelt es sich um den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der nachfolgenden Hämoglobinsynthese.

jo In der Vergleichskultur betrug die Enzymaktivität nur 10,5 pmol/30 min ■ mg Protein. In der erfindungsgemäßen Kultur betrug sie 67,8 pmol/30 min ■ mg Protein. Dieses Ergebnis zeigt klar, daß der D-Faktor die Enzymaktivität erhöht und auf der anderen Seite zur

r> Differentiation der leukämischen Zellen beiträgt

Tierversuch zur Ermittlung der Wirkung des D-Faktors auf leukämische Zellen in vivo

In gleicher Weise wie oben wurden T-3-C1-1-Zellen in zwei verschiedenen Medien mit einer Zellkonzentration von 5 · 10⁵ZmI suspendiert Gruppen von Mäusen (Versuchsgruppen und Vergleichsgruppen) mit jeweils 10 Tieren wurde intraperitoneal I ml Suspension injiziert Den Tieren wurde reichlich Trockenfutter verabreicht; sie wurden in Käfigen bei konstanter Feuchtigkeit und Temperatur gehalten. Das überleben der Versuchstiere wurde in beiden Gruppen jeden Tag zur Ermittlung der Wirkung des D-Faktors überwacht. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die Tiere der Versuchsgruppe bis zu durchschnittlich 60 Tage überlebten, wahrend der Durchschnitt in der Vergleichsgruppe 34 Tage betrug. Daraus geht klar hervor, daß der

5* D-Faktor der Malignität leukämische Zellen in vivo entgegenwirkt Die Oberlebenszeit in Tagen einer Gruppe von Mäusen, denen T-3-CI-1-Zellen injiziert worden waren, die in einem Medium mit D-Faktor inkubiert waren, ist gegenüber der Vergleichsgruppe

Mt stark verfange«. Damit ist gezeigt, daß Mäuse, die mit leukämischen Zellen geimpft wurden, die vorher mit D-Faktor behandelt wurden, länger überleben als einfach mit leukämischen Zellen geimpfte Mäuse. Aufgrund dessen ist anzunehmen, daß der D-Faktor der

* > Malignität leukämischer Zellen in vivo entgegenwirkt.

Zur Bestimmung der wirksamen und geeigneten Dosis wurden die nachstehenden Tierversuche in vivo durchgeführt:

Bestimmung der wirksamen und geeigneten Dosis

Jeweils 1 ml (5 χ je 10) einer T-3-C1-1-Zellsuspension, die wie oben hergestellt war, wurde 25 Mäusen unter den gleichen Bedingungen intraperitoneal injiziert wobei die Mäuse in djei Gruppen aufgeteilt wurden. D-Faktor, der auf gleiche Weise wie oben hergestellt war, wurde in sterilem Wasser zu einer Konzentration von 280 mg/ml aufgelöst und 9 Mäusen der Gruppe B in einer Menge von 0,1 ml und 7 Mäusen der Gruppe C in einer Menge von 0,2 ml kontinuierlich 3 d lang, ausgehend vom 4. Tag nach der Injektion von T-3-CI-1-Zellen, verabreicht Daneben wurde je 0,2 ml sterilisierte physiologische Salzlösung 9 Mäusen der Gruppe A als Vergleichsgruppe 3d lang verabreicht. Die Oberlebenszeit der Mäuse jeder Gruppe wurde zur Ermittlung der wirksamen Dosis festgestellt Nach der Bestimmung der durchschnittlichen Überlebenszeit in Tagen jeder Gruppe wurden die Indices der durchschnittlichen Oberiebenszeit in Tagen der Gruppen B und C berechnet, woraus das Verhältnis der Lebenszeitverlängerung errechnet wurde; die durchschnittliche Überlebenszeit in Tagen der Gruppe A ist dabei zu 100 angenommen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 8 aufgeführt

Tabelle 8

Gruppe Verabreichte	Anzahl	Durch	Verhältnis
Substanz	der	schnittliche	der Lebens
	Mäuse	Ubcr-	verlängerung
		lebenszeit
		(Ii)

A Salzlösung 9 25.3 100

B D-Faktor 9 33.3 132

(durchschnittlich
1400 mg/kg)

C D-Faktor 7 36.4 149

(durchschnittlich
2800 mg/kg)

Wie aus der Tabelle 8 ersichtlich beträgt die Lebensverlärtgerung der Gruppen B und C, denen der D-Faktor verabreicht wurde, etwa das 1,3- bzw. l.5fache gegenüber der Vergleichsgruppe A.

Durch diesen Test wurde nachgewiesen, daß die durchschnittliche Überlebenszeit bei Mäusen gegenüber der Vergleichsgruppe (Gruppe A) durch 3 Tage lange Verabreichung von D-Faktor in einer Dosis von 1400 mg/kg Körpergewicht um etwa 30% verlängert werden kann.

Akute Toswitäl

D-Faktor wurde /u einer Konzentration von 170 mg/ml in destilliertem Wasser gelöst und stciilfiltriert. 80 5 Wochen alten männlichen Mäusen in 8 Gruppen zu je 10 Mäusen wurde diese Lösung des D-Faktors in der in der Tabelle 9 angegebenen Menge einmal intraperitoneal verabreicht. Zur Auswertung wurde die Mortalität bestimmt.

Die Ergebnisse gehen aus Tabelle 9 hervor.

Tabelle 9

Menge der verab	Menge des verab	Morta
reichten D-Faktor-	reichten D-Faktors in	lität
Lösung	ml/kg Körpergewicht
(ml/g Körpergewicht)

0,0100
ίο 0,0150
0,0200
0,0230
0,0234
0,0235
0,0240
0,0250

1700
2550
3400
3910
3980
3995
4080
4250

0 0 0 2 5 7 Q

¹O

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Fraktion einen LDso-Wert von 3980 mg/kg hatte.

wobei alle Mortalitätsfällc vom Schock innerhalb von 1 bis 15 min nach der Verabreichung herrührten. Bei der Autopsie dieser durch Schock gestorbenen Mäuse wurde eine Entfärbung und Atrophie der Milz und eine Teilentfärbung der Leber festgestellt. Demgemäß sind die Mäusen therapeutisch verabreichten Mengen D-Faktor von durchschnittlich 1400 mg/kg bzw. 2800 mg/kg sicher ohne Risiko, wie sich aus den Versuchsergebnissen zur akuten Toxizität ergibt Die erfindungsgemäße proteinhakige Fraktion stellt

in somit ein wirksames Heilmittel gegen Leukämie in der Human- und Veterinärmedizin dar, dessen Wirksamkeit und Sicherheit im Tierversuch in vivo bestätigt wurden.

Wirkung des D-Faktors auf die Wiederherstellung

der normalen Funktion Iymphoider leukämischer Zellen bei der Maus in vitro

Lymphoide leukämische Zellen der Maus (L5178Y) bilden in einem Medium aus Nährmedium mit 10% Rinderfetalserum und Agar eine charakteristische

4» Kolonie, wie dies auch bei anderen Tumorzellen im allgemeinen der Fall ist. Wenn daher die leukämischen Zellen im Medium mit dem D-Faktor keine charakteristische Kolonie bilden, kann daraus geschlossen werden, daß der D-Faktor eine Wiederherstellung der normalen 5 Funktion derartiger leukämischer Zellen bewirkt hat.

Es wurden zwei Versuchsmedien hergestellt, die 03 bzw. 2,0 mg D-Faktor pro ml des obigen Mediums enthielten; das Vergleichsmedium enthielt keinen D-Faktor. Jedes Medium wurde auf t> Petrischalen verteilt; in jede Schale wurden L5178Y-Zellen in einer Zellkonzentration von 10^J eingeimpft. Die insgesamt 15 Schalen wurden in üblicher Weise inkubiert. Am 12. Tag wurde die Gesamtzahl der Kolonien jeder Schale ermittelt. Zur Untersuchung der Wirkung des D-Faktors auf die Wiederherstellung der normalen Funktion der L5178Y-Zellen wurden die Kolonien unter einem Mikroskop mit schwacher Vergrößerung durch Analyse des Kolonietyps in kompakte und aufgelockerte Kolonien eingeteilt.

hi Unter kompakten Kolonien wurden solche verstanden, bei denen alle Zellen dicht ancinanderklebten; unter aufgelockerten Kolonien wurden solche verstände, bei denen die Zellen im phcriphercn Bereich der Kolonie im Agar dispergiert waren. Die Ergebnisse sind

h> in Tabelle 10 wiedergegeben. Die gesamte Anzahl der Kolonien im D-Fakior-haliigen Medium \wir deutlich kleiner als beim Vciglcichsmedium. Die Häufigkeit aufgelockerter Kolonien war ferner bei jedem behan-

delten Medium größer als beim Vergleichsmedium. Daraus ergibt sich klar, daß der D-Faktor zu einer normalen Funktion der Lymphozyten führt, und zwar zu

einer lokomotorischen Aktivität der L5178Y-Zel|en, und die Wiederherstellung der normalen Funktion lymphoiderieukBinischer Zellen der Maus bewirkt

Tabelle 10

Klassifikation

Konzentration des D-Faktcrs (mg/ml)

Anzahl der Kolonien insgesamt Anzahl kompakter
Kolonien

Anzahl aufgelockerter Kolonien

Vergleichsversuch 0

Versuch 0,5

(P-Faktor-haltiges

Medium)

Versuch 2,0

(D-Faktor-haltiges

Medium)

52	52
57	37
48	47
44	43
45	45
Mittel 49,2	Mittel 44,8
25	23
43	27
36	28
30	24
37	33
Mitte! 34,2	Mittel 27,0
1	0
3	0
2	2
3	1
1	1

Mittel 2,0 Mittel 0,8

0 0 1 1 0_

Mittel 0,4

2 16 8 6 4

Mittel 7,2

1 3 0 2 0

Mittel 1,2

Inhibierende Wirkung des D-Faktors in vitro

auf das Wachstum lymphoider leukämischer Zellen der Maus (L5178Y) und normaler Zellen

In diesem Versuch wurde gezeigt, daß der D-Faktor der erfindungsgemäßen proteinhaltigen Fraktion eine 4n wachstumsinhibierende Wirkung auf leukämische Zellen, jedoch nicht auf normale Zellen ausübt.

L5178Y-Zellen wurden in einer Zellkonzentrat on von IWmI in zwei Nährmedien mit 10% Rinderfetalserum geimpft, von denen das eine 2 mg/ml D-Faktor 4"> (hergestellt nach Beispiel 2) und das andere keinen D-Faktor enthielt. Die Medien wurden wie üblich inkubiert. Die Zählung der Zellen wurde am 2. bis 8. Tag mit einem Hämocytometer unter einem Mikroskop durchgeführt, um festzustellen, ob irgendeine wachs- >o tumsinhibierende Wirkung des D-Faktors zu beobachten war.

Als Vergleichssystem wurden normale Zellen, die in vitro aus normalen Mäusenieren erzeugt waren, in einer Konzentration von 7 · 10⁴ZmI in zwei Eagle-Medien mit ή 10% Kälberserum geimpft, von denen das eine D-Faktor in einer Menge von 2 mg/ml und das andere keinen D-Faktor enthielt. Die Kulturen wurden wie üblich inkubiert. Nachdem die Zellen durch Trypsinisation vom Boden abgelöst worden waren, wurde die Zellzahl vom I. bis zum 7. Tag nach der Inkubation mit einem Hämocytometer wie vorstehend beschrieben ermittelt, um die wachstumsinhibierende Wirkung des D-Faktors auf normale Zellen zu untersuchen.

Das Ergebnis ist in F i g. b dargestellt, wobei die μ Ordinate die Zellzahlen pro ml Medium und d'e Abszisse die Kulturdauer in Tagen wiedergeben: die Kreise gelten für die Vergleichsiriippe. die ausgefüllten Kreise für die Versuchsgruppe; die ausgezogenen Kurven gelten für die Zählung der L5178Y-Zellen und die gestrichelten Kurven für die Zählung der normalen Zellen.

Wie Fig.6 zu entnehmen ist, übt der D-Faktor eine spezifische wachstumsinhibierende Wirkung auf leukämische Zellen aus.

Inhibierende Wirkung des D-Faktors in vitro

auf das Wachstum myelogener leukämischer Zellen

der Maus (M-l-Cl-34)

M-l-CI-34-Zellen wurden von Ischikawa (Journal of Cell Physiology, Bd. 74, 1969, S. 223) \v^:e folgt hergestellt: Myelogene Zellen einer leukämischen Mau'j, die spontan Lejkämie entwickelte, wurden einer normalen Maus des gleichen Stamms intravenös injiziert. Nach 2 Wochen wurden myelogene leukämische Zellen aus hypertrophen Lymphknoten des Tieres gewonnen. Das Kulturmedium wurde hergestellt, indem 1,3 g Aminosäure/Vitaminmediumpulver in I I Nährmedium gelöst und dem Gemisch 15% Pferdeserum zugesetzt wurden. Die myelogenen Zellen wurden in einer Zellkonzentration von 2 - lOVml in das Medium in einer Petrischale eingeimpft (Durchmesser 60 mm). Es wurde wie üblich 5 Tage inkubiert, wobei zwischendurch geschüttelt wurde. Es wurden nur Zellen, die im Medium suspendiert waren, gesammelt (nachstehend mit IvI-I bezeichnet).

Ausgehend von M-1-Zellen wurden M-l-CI-34-Zellen als K!on nach der Weichagarniethoclc erhalten, bei der ein doppelschichtiges Agarmedium mit einem Gehalt von 20% Pferdcsemm und 0,33% Agar in der Deckschicht und 0.5% in der Bodenschicht verwendet wurde.

Das Testmedium für M-1-CI-34-Zellen wurde durch Lösen von 0,85 g Arninosäure/Vitaminmediumpulver in 11 MEM-Medium und Zusatz von 10% Kälberserum hergestellt Die M-l-CI-34-Zellen wurden in einer Zellkonzentration von 2 · 10VmI in 2 Teilmengen des obigen Mediums geimpft, von denen das eine D-Faktor in einer Menge von 2 mg/ml (hergestellt nach Beispiel 3) und das andere keintti D-Faktor enthielt und als Vergleich bei der Feststellung dieme, ob eine wachstumsinhibierende Wirkung auf myelogene leukämische Zellen der Maus vorlag. Die Teilmengen wurden in üblicher Weise inkubiert, wobei die Zellzählung vom 1. bis 10. Tage unter Verwendung eines Hämocytometers unter einem Mikroskop durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in F i g. 7 dargestellt, wobei die Ordinate die Zellzahl/ml und die Abszisse die Kulturdauer in Tagen wiedergibt; die Kreise bezeichnen die Vergleichsgruppe, die ausgefüllten Kreise die Versuchsgruppe.

Wie Fi g. 7 zu entnehmen ist, war zu beobachten, daß die .Zellzahl vom Beginn der Inkubation abfiel, was anzeigte, daß die M-l-Cl-34-ZelIen im D-Faktor haltigen Medium nicht wachsen konnten. Auf der anderen Seite zeigten die M-l-C!-34-Zellen ein aktives Wachstum im Medium ohne D-Faktor. Daraus ist ersichtlich, daß der D-Faktor das Wachstum myelogener leukämischer Zellen inhibiert.

Beispiel 1

400 g menschliche Placenta wurden mit einer ausreichenden Menge mehrmals destilliertem Wasser gewaschen, in Stücke zerschnitten und mit 500 ri| Wasser zu einer Emulsion zerkleinert Zur Emulsion wurde ein Gemisch aus 20%iger Essigsäure und 10%iger Salzsäure im Verhältnis 35:65 bis zu einer Acidität von 1,2-n zugegeben. Die angesäuerte F-nulsion wurde dann 40 min auf 80⁰C erhitzt und nach dem Abkühlen mit 3000 U/min 20 min zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde bei 110°C 20 min autoklaviert, narhdem der pH-Wert mit 1 n-NaOH auf 7 eingestellt worden war; nach dem Abkühlen wurde 30 min mit 10 000 U/min zur Abtrennung von unlöslichem Material zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde im Vakuum auf '/» des Volumens eingeengt in einem Celluloseschlauch gegen das zehnfache Volumen dreifachdesrlliertes Wasser dialysiert. Die Dialyse wurde zweimal wiederholt: das dialysierte flüssige Medium wurde gesammelt Das Dialysat wurde dann im Vakuum auf '/200 des Volumens konzentriert und in einer Säule (2,5 x 90 cm) an Sepbadex G-25 Chromatographien, wobei die Säule mit einer 1 · 100 verdünnten Phosphatpuffer-Salzlösung, die kein Calcium und Magnesium enthielt, mit einer Geschwindigkeit von 7ml/f2min eluiert wurde. Die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,96 bis 1,80 wurde gesammelt Die Fraktion wurde lyophilisiert und lieferte etwa 450 mg D-Faktor in Form eines hellgelben Pulvers,

. Beispiel 2

300 g menschliche Placenta wurden mit einer reichlichen Menge mehrfach destilliertem Wasser gewaschen, in Stücke geschnitten, mit 400 mi einer 1 ; 100 verdünnten Salzlösung versetzt und zu einer Emulsion zerkleinert. Zu der Emulsion wurde ein Gemisch aus 20%iger Essigsäure und 15%iger Salzsäure im Verhältnis 50:50 bis zu einer Acidität von 1-n zugegeben. Die angesäuerte Emulsion wurde 60 min auf 75°C erhitzt und nach dem Abkühlen 20 min mit 3000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde 10 min bei 120⁰C autoklaviert und nach dem Abkühlen zur Abtrennung von unlöslichem Material bei 5000 U/min 30 min zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde im Vakuum auf '/io des Volumens eingeengt und unter reduziertem Druck mit einem geeigneten Membranfilter filtrier. Das Filtrat wurde · nach Einengen auf '/10 des Volumen; im Vakuum an einer Säule (2,5 χ 40 cm) mit Sephadex G-15 chromatographiert, wobei die Säule mit dem gleichen Puffer wie in Beispiel 1 mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/10 min eluiert wurde. Die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von Ο35 bis 1,24 wurde gesammelt. Sie wurde Iyophilisiert und lieferte etwa 300 mg D-Faktor in Form eines hellgelben Pulvers.

Beispiel 3

500 g gefrorene Rinderplacenta wurden aufgetaut, mit einer ausreichenden Menge mehrfach destilliertem Wasser gewaschen, zu Stücken zerschnitten und mit 500 ml mehrfach destilliertem Wasser zu einer Emulsion zerkleinert. Zu der Emulsion wurde ein Gemisch aus 25%iger Essigsäure und 15%iger Salzsäure im Verhältnis 70 :30 bis zu einer Acidität von 1,2-n zugegeben. Die angesäuerte Emulsion wurde 40 min aui" 8O⁰C erhitzt und nach dem Abkühlen 30 min mit 3000 U/min 30 min zentrifugiert. Die überstehende Phase wurde nach Neutralisation mit 2 n-NaOH bis auf pH 6,5 15 min bei 110⁰C zur Abtrennung von unlöslichem Material autoklaviert. Die überstehende Phase wurde nach Einengen auf '/20 des Volumens im Vakuum durch ein geeignetes Membranfilter filtriert. Das Filtrai wurde nach Einengen auf Vio des Volumens im Vakuum an einer Säule (2,5 χ 40 cm) mit Sephadex G-I0chromatographiert, wobei die Säule mit dem gleichen Puffer wie in Beispiel 1 mit einer Geschwindigkeit von 4,5 ml/ 10 min eluiert wnrde. Die Fraktion mit einem Verieilungskoeffizienten von 0,35 bis 1,25 wurde gesammelt und Iyophilisiert, wobei etwa 500 mg D-Faktor in Form ein..s hellgelben Pulvers erhalten wurden.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

1, Antüeukämische proteinhaltige Fraktion, erhältlich durch

(a) Zerkleinern von Placentagewebe von Mensch, Rind oder Schwein in Wasser oder einer verdünnten physiologischen Salzlösung und Herstellung einer Emulsion,

(b) Ansäuern mit einem Gemisch von 10- bis ι ο 30%iger wäßriger Essigsäure und 10- bis 20%iger Salzsäure in einem Verhältnis von 25 :75 bis 75 :25 bis zu einer Acidität von 0,5-bis 2,0-n,

(c) Erhitzen der angesäuerten Emulsion für 30 bis 60 min auf 75 bis 90° C und Abkühlenlassen,

(d) Abzentrifugieren der unlöslichen Proteine,

(e) Neutralisieren der Emulsion mit einer alkalischen Lösung,

(f) Abzentnfugieren von unlöslichem Material,

(g) Einengen bis auf Vio bis V» des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck,

(h) Dialysieren des konzentrierten flüssigen Mediums gegen Wasser oder Filtration durch ein geeignetes Membranfilter,

(i) Einengen des Dialysats %J V100 bis '/200 bzw. des Filtrats auf '/5 bis '/io des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck,

(j) chroiiiatographische Fraktionierung an Sphadex, wobei die Fraktion mit einem Verteilungskoeffiziec.'en von 0,96 bis 1,82 mit Sephadex G-25®, die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 035 bis 1,24 mit Sephadex G-15® bzw. die Fraktion mit dnem Verteilungskoeffizienten von 0,35 bis 1,25 nut Sephadex G-10® J5 abgetrennt wird, und

(k) Lyophilisieren der erhaltenen Fraktion.
2. Verfahren zur Herstellung der antileukämischen proteinhaltigen Fraktion nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

(a) Zerkleinern von Placentagewebe von Mensch, Rind oder Schwein in Wasser oder einer verdünnten physiologischen Salzlösung und Herstellung einer Emulsion,

(b) Ansäuern mit einem Gemisch von 10- bis 30%iger wäßriger Essigsäure und 10- bis 20%iger Salzsäure in einem Verhältnis von 25 :75 bis 75 :25 bis zu einer Acidität von 0,5-bis 2,0-n,

(c) Erhitzen der angesäuerten Emulsion für 30 bis 60 min auf 75 bis 90⁰C und Abkühlenlassen,

(d) Abzentrifugieren der unlöslichen Proteine,

(e) Neutralisieren der Emulsion mit einer alkalischen Lösung,

(f) Abzentrifugieren von unlöslichem Material, Ig) Einengen bis auf '/10 bis '/30 des ursprünglichen

Volumens unter vermindertem Druck,
(h) Dialysieren des konzentrierten flüssigen Medi· ums gegen Wasser oder Filtration durch ein geeignetes Membranfilter,

(i) Einengen des Dialysats auf V100 bis '/200 bzw. des Filtrats auf Vs bis V10 des ursprünglichen Volumens unter vermindertem Druck,
(j) chromaiographische Fraktionierung an Sephadex, wobei die Fraktion mit einem Verteilungs- h¹, koeffizienten von 0,96 bis 1,82 mit Sephadex G-25¹*. die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von O.'i5 bis 1.24 mt Seohadex G-15® bzw, die Fraktion mit einem Verteilungskoeffizienten von 0,35 bis 1,25 mit Sephadex G-10® abgetrennt wird, und
(k) Lyophilisieren der erhaltenen Fraktion.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zum Ansäuern der Emulsion in Schritt (b) ein 35:65-Gemisch aus 10- bis 30%iger Essigsäure und 10- bis 20%iger Salzsäure verwendet und bis zu einer Acidität von 1,2-n angesäuert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) 40 min auf 8O⁰C erhitzt wird.
5. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend die antileukämisehe Proteinfraktion nach Anspruch 1.