DE2050714C2 - Polysaccharid mit Antitumoraktivität, Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung als Wirkstoff in Antitumormitteln - Google Patents
Polysaccharid mit Antitumoraktivität, Verfahren zu seiner Gewinnung und seine Verwendung als Wirkstoff in AntitumormittelnInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Polysaccharid mit Antitumoraktivität und das Verfahren zu seiner Gewinnung und
seine Verwendung als Wirkstoff in Antitumormitteln.
Mit dem Begriff »Polysaccharid« wird im folgenden nicht nur das chemisch reine Polysaccharid, sondern auch
das Polysaccharid- Protein (Mucopolysaccharid) bezeichnet.
Die das Polysaccharid gemäß der Erfindung enthaltende Substanz ist aus dem Myzel von Pilzen der Familie
Polyporaceae der Gattung Basidiomycetes oder aus einer Fleischbrühenkultur der zur Familie Polyporaceae
gehörenden Spezies extrahierbar.
Einige Verfahren zum Extrahieren von Wirkstoffen mit Antitumoraktivität aus den Basidiofruchtständen von
zur Gattung der Basidiomyceten gehörenden Spezies sind bereits früher bekanntgeworden, so z. B. aus den
veröffentlichten japanischen Patentanmeldungen 18 196/1962, 16 048/1968 und 25 563/1968. Diese Verfahren
sind jedoch mit einer Reihe von Nachteilen behaftet. So ist beispielsweise die Herstellung des Antitumorwirkstoffes in kommerziellem Maßstab wegen der Benutzung der Basidiofruchtstände als Ausgangsmalerial schwie-
rig. Außerdem konnten bisher die physikochemi-ichen Eigenschaften des in der extrahierten antikanzerösen
Substanz vorliegenden Wirkstoffes nicht angegeben werden. Dementsprechend sind die Verfahren zur Reinigung des Endproduktes noch so ungenügend, daß der Keinheitsgrad dieser Wirkstoffe nur gering ist.
direkt „liter vermindertem Druck getrocknet und als Wirksubstanz verwendet. Daneben ist noch die Extraktion g|
mit Äther, Chloroform, Aceton, Benzol und Methanol geze'gt. In der JA-Patenlpublikation 16 048/1968 erfolgt $
die Reinigung, indem der Extrakt zuerst einer Gelfiltration oder Dialyse unterworfen und dann durch an sich ΐ
bekannte weitere Schritte entproteinisiert und ganz zum Schluß dann der Wirkstoff mit einem mit Wasser |
mischbaren organischen Lösungsmittel ausgefällt wird. In der JA.-Palentpublikation 25 563/1968 wird der Pilz :■
Fisiolins hcpatica Fr. der Familie Fistulinaceae als Ausgangsmaterial verwendet und der wäßrige Extrakt nach
Einengen mit Ammoniumsulfat versetzt, der gebildete Niederschlag wieder in Wasser gelöst und dann dialysiert,
nach Einengen mit Eisessig und dann mit Anionenaustauscher behandelt, erneut dialysiert und dann mit Äthanol
gefällt Man kann aber auch die Verfahrensschritte beliebig vertauschen. Wie die später folgenden Vergleichsversuche zeigen, ergibt Fistolina hepatica nur sehr geringe Ausbeuten, und das Material ist weniger wirksam als
ein Material, das aus Polyporaceae gewonnen ist
Eine Arbeit in Japan. J. Exp. Med, VoL 38,6, Seiten 437—442 (1968), zeigt, daß ein Stamm von Basidomycetes
extrazellulär Polysaccharid während der Submerskultur erzeugt Ein Stamm, der mit B-145 bezeichnet ist und als
Crepidotus sp. identifiziert wurde, wurde mehrere Tage iubmers gezüchtet und die Brühe dann zentrifugiert und
aus dem Überstand durch mehrfaches Fällen mit Aceton ausgefällt und dann durch Dialyse weiter gereinigt Ein
Hinweis auf Pilze der Familie Polyporaceae findet sich auch dort nicht
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung eines hinreichend reinen Antitumorwirkstoffes in
technischem Maßstab sowie diesen Wirkstoff selbst zur Verfügung zu stellen.
Insbesondere wird vorgeschlagen, zur Gewinnung des Polysaccharids von in Fleischbrühe gezogenen Kulturen von Pilzen der Familie Polyporaceae auszugehen.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird der Begriff »kultivierter Nährboden« für eine Brühe, Insbesondere für eine Fleischbrühe, aber auch ganz allgemein für ein beliebiges Kulturmedium, benutzt, die absichtlich
mit der entsprechenden Pilzart zum Zwecke der Inkubation versetzt worden ist
Die im Rahmen der Erfindung eingesetzten Arten von Polyporaceae sind für den Fall, daß ihr Myzel als
Ausgangsmaterial benutzt werden soll, in den Tabellen 1 bis 4 zusammengestellt und sind für den Fall daß die
mit ihnen kultivierten Nährboden als Ausgangsmaterial benutzt werden sollen, in den Tabellen 5 bis 12 zusammengestellt. Wenn das Myzel als Ausgangsmaterial benutzt wird, so kann es sowohl natürlichen Ursprungs sein
als auch künstlich gezüchteten Kulturen entstammen. Zur Anwendung im Rahmen dieser Erfindung kann das
Myzel sowohl unaufgearbeitet als auch durch Waschen mit Wasser und anschließendes Trocknen oder anschließende Gefriertrocknung konserviert vorliegen. Wenn ein mit Arten von Polyporaceae kultivierter Nährboden
als Ausgangsmaterial benutzt wird, kann der Nährboden einer übliche:) Kultur dieser Arten selbst benutzt
werden.
Zur Isolierung der wirksamen Substanz aus diesen Ausgangsmaierialien wird entweder da* Myzel mit warmem Wasser oder einem warmen wäßrigen Lösungsmittel extrahiert oder wird die kultivierte Nährlösung zur
Gewinnung des Myzels filtriert. Beide Ausgangsmaterialien können auch miteinander gemischt benutzt werden.
Die Temperatur des zur Extraktion benutzten Lösungsmittels bleibt unterhalb einer Temperatur von 1200C
unkritisch. Vorzugsweise wird bei Temperaturen zwischen 60 und 1000C gearbeitet. Die Extraktion wird durch
vorheriges Zerpulvern des Myzels begünstigt, jedoch ist eine solche vorherige Pulverisation nicht unerläßlich.
Im allgemeinen wird die Extraktion mit warmem Wasser durchgeführt, jedoch können auch wäßrige Lösungsmittel benutzt werden, die wasserlösliche organische Lösungsmittel, Säuren, Basen oder Salze enthalten. Die für
die Extraktion erforderliche Zeit ist eine Funktion der Extraktionstemperatur. Vorzugsweise wird die Extraktion
bei einer Temperatur vn 60 bis 100"C in einem Zeitraum von 30 Minuten bis zu 10 Stunden durchgeführt. Am
besten wird die Extraktion unter ständigem Rühren in einem Glasgefäß oder in einem Gefäß mit innerer
Glasauskleidung, in emaillierten Gefäßen oder in Gefäßen aus rostfreiem Stahl durchgeführt
Der auf diese Weise hergestellte Myzelextrakt wird zur Entfernung von Feststoffen filtriert oder zentrifugiert
und anschließend wie nachstehend geschildert gereinigt.
Für den Fall, daß von einem kultivierten Nährboden ausgegangen wird, wird der Nährboden vom Myzel
getrennt, konzentriert und anschließend iii gleicher Weise dem unten beschriebenen Reinigungsprozeß unterworfen.
Der auf diese Weise erhaltene wäßrige Extrakt bzw. die filtrierte Nährlösung enthält neben dem Polysaccharid, das der aktive Bestandteil der antikanzerösen Substanz ist noch eine Reihe unerwünschter anderer Substanzen, wie beispielsweise freie Proteine, Nukleinsäuren oder reduzierende Zucker. Zur Entfernung dieser Stoffe ist
ein Reinigungsverfahren erforderlich.
Mit dem Reinigungsverfahren gemäß der Erfindung werden die unerwünschten Substanzen, vor allem die
ausgesprochen schädlichen Komponenten, die freien Proteine, entfernt. Vorteilhaft wird diese Reinigung durch
Kombination einer Reihe von Reinigungsverfahren durchgeführt, beispielsweise durch eine Kombination einer
Entproteinisierung, einer Entionisierung (die eine Neutralisierung und Entsalzung einschließt) und gegebenenfalls Verfahren zur Eliminierung anderer organischer Substanzen. Zur Erreichung dieses Zweckes können
Verfahren wie die Extraktion, das Zentrifugieren, die Filtration, Säurebehandlung, Aussalzen, Dialyse oder
Verfahren unter Benutzung von Ionenaustauschern eingesetzt werden.
Zu allererst wird jedoch, wie die Beispiele zeigen, aus der von Feststoffen befreiten Brühe das Polysaccharid
mit Ammoniumsulfat ausgefällt, gegebenenfalls nach Vorfällen mit Äthanol und Wiederaufnehmen der Fällung
in Wasser. Erst dann schließen sich die weiteren Reinigungsschritte an.
Die Entproteinisierung des in flüssiger Phase vorliegenden, wiederaufgelösten Niederschlags wird durch
Hinzusetzen von Säuren, beispielsweise zur Zusetzen von Schwefelsäure, Salzsäure, Salpetersäure, Essigsäure,
Trichloressigsäure, Picrinsäure, Sulfosalicylsäure, Tanninsäure und andere in einer Menge, die 0,1 bis 3 Gew.-%
entspricht, wobei die freien Proteine gefällt werden, bewirkt, wobei die so gefällten Proteine anschließend von
der flüssigen Phase abgetrennt werden. Die von den gefällten Proteinen befreite Lösung wird anschließend auf
eine Säule mit Anionenaustauscherharz gegeben, die im Zusammenhang mit dem Reinigungsverfahren für den
Fall, daß ein kult;". ierter Nährboden als Ausgangsmaterial benutzt wurde, näher beschrieben wird. Statt auf die
Austauschersäule gegeben zu werden, kann der Extrakt auch einer Dialyse unterworfen werden, wobei zur
Befreiung von der überschüssigen Säure Dialysemembranen, wie beispielsweise Cel'ophanfolien, benutzt werden können. Alternativ kann die Entprotcinisier ung auch direkt durch Ionenaustausch erfolgen.
Nach Beendigung der Dialyse bzw. des Ionenaustausches wird die in der Membran bzw. im Auslauf gesammelte Flüssigkeit konzentriert und mit dem 3- bis lOfachen Volumen eines Alkohols zur Erzeugung eines
Niederschlags versetzt, der dann der Gefriertrocknung unterworfen wird oder erst mit Alkohol und dann mit
Aceton gewaschen und anschließend getrocknet wird. Das auf diese Weise erhaltene Produkt ist ein nicht
hygroskopisches, hellgraues bis weißes Pulver, das antikanzerös wirksam ist
Auch bei Verwendung der konzentrierten Kulturbrühe wird zuerst das Polysaccharid ausgefällt, wie oben
angegeben. Um weitere unerwünschte Stoffe, wie beispielsweise freie Proteine, freie Nukleinsäuren, reduzieren
de Zucker, verschiedene Ionen oder Vitamine, zu entfernen, stehen verschiedene Methoden zur Verfugung. So
kann beispielsweise konzentriert werden, mit Säure behandelt werden, extrahiert werden, es kann dialysiert oder
mit einem Ionenaustauscher behandelt werden. Auch Kombinationen dieser Verfahrensweisen sind möglich. Zur
Entfernung der freien Proteine sind anorganische und organische Säuren geeignet, beispielsweise Trichloressigsäure. Schwefelsäure, Salzsäure, Eisessig, Sulfosalicylsäure, Picrinsäure oder Tanninsäure. Bezogen auf die
gesamte flüssige Phase sollte die Konzentration dieser Säuren etwa 0,1 bis 3% betragen.
Die Dialyse, die zur Entfernung niedrigerer Zucker, freier Aminosäuren, verschiedener Salze oder auch zur
Entfernung verschiedener Nukleinsäuren dienen kann, kann mit Hilfe einer semipermeablen Membran, beispielsweise mit einer CeHophanfolie, einer Kollodiummembran oder auch mit einer Darmmembran durchgeführt werden. Der Ionenaustausch wird mit Anionen- und Kationen-Austauscherharzen durchgeführt Als
Kationen-Austauscherharze kommen beispielsweise Amberlite IR-120 B, Amberlite 200, Amberlite IR-122, Amberlite IR-
123, Amberlite XE-100, Amberlite IRC-50 und Amberiite IRC-84 (® alle Rohm & Haas); Dowex 50W (® von
Dow Chemical); Duolite C-3, Duolite C-10, Duolite C-20, Duclite C-25, Duolite C 27, Duolite ES-63, Duolite ES-80 und DuoliteCS-101 (* alle von Diamond Alkali) sowie Diaion SK-IA, Diaion SK-IB, Diaion SK-102, Dk-
ion SK-103, Diaion SK-104, Diaion S K-106, Diaion SK-110, Diaion SK-112, Diaion SK-116, Diaion SKI, Diaion PK-204, Diaion PK-208, Diaion PK-212, Diaion PK-216 und Diaion PK-228 (® alle von Mitsubishi Chemical
Industry Co, Ltd.) in Frage. Als Anionenaustauscher können beispielsweise eingesetzt werden: Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-401, Amberlite IRA-402, Amberlite IRA-405, Amberlite IRA-425, Amberlite IRA-900, Amberlite IRA-904, Amberlite IRA-410, Amberlite IRA-411, Amberlite IRA-911, Amberlite IRA-910, Amberli-
te 1R-45, Amberlite lRA-93, Amberlite IRA-68 und Amberlite IR-4B (Rohm & Haas); Dowex 1, Dowex 2, Dowex 44, Dowex 21K und Dowex 11 (Dow Chemical) sowie Duolite A-2, Duolite A-4, Duolite A-6, Duolite A-7,
Duolite ES-15, Duolite A-30T, Duolite A-30B, Duolite A-41, Duolite A-43, Duolite ES-57, Duolite A-40, Duolite A-40LC, Duolite A-42, Duolite A-42LC, Duolite A-40, Duolite A-101D, Duolite A-102, Duolite A-102D und
Duolite ES-111 (Diamond Alkali). Die freien Proteine werden durch die oben bereits genannten Verfahren
entfernt, wobei die Säurebehandlung besonders geeignet ist. Die Entfernung der überflüssigen Säure und die
Entfärbung wird durch Ionenaustausch erreicht. Die Austauscher Duolite S-30 oder Duolite ES-33 (Diamond
Alkali) und die diesen verwandten Austauscher zeigen vor allem einen besonders günstigen Entfärbungseffekt.
Die Austauscher Dowex 5OWX2 (Η-Typ) und Dowex 44 (OH-Typ) sind zur Entfernung der Nukleinsäuren aus
der flüssigen Phase besonders geeignet.
Das Endprodukt kann auch durch Hinzufügen stark polarer organischer Lösungsmittel, beispielsweise wasserlöslicher Alkohole und Ketone, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol oder Aceton, ausgefällt werden.
Unter einer Behandlung mit Bleiacetat wird das Hinzufügen von Bleiacetat zur flüssigen Phase verstanden,
wodurch das Endprodukt als Bleisalz ausgefällt wird. Aus diesem Bleisalz kann das reine Endprodukt durch
Entfernen des Bleis erhalten werden, was beispielsweise durch Einleiten von Schwefelwasserstoff in eine Auf
schlämmung des Niederschlags bewirkt werden kann, wodurch das Blei als Bleisulfid gefällt wird.
Wie vorstehend beschrieben, ist der Zweck des Reinigungsverfahrens die Entfernung unerwünschter Substanzen aus dem Extrakt oder aus der Nährlösung, wobei diese unerwünschten Substanzen im wesentlichen aus
Proteinen bestehen, und die Isolierung des wirksamen Polysaccharids aus der so erhaltenen gereinigten Lösung.
Das erfinöungsgemäße Polysaccharid, das durch die im vorstehenden beschriebene Behandlung erhalten wird,
so kann folgendermaßen charakterisiert werden: Es ist ein hellgraues bis weißes Pulver, nicht dialysierbar, hat
keinen scharfen Schmelzpunkt, verkohlt bei stärkerem Erhitzen, ist unlöslich in gebräuchlichen organischen
Lösungsmitteln und in organischen Säuren, jedoch löslich in Wasser. Eine 10%ige wäßrige Lösung dieser
Substanz reagiert neutral. Eine 0,1%ige wäßrige Lösung zeigt keine charakteristischen Absorptionen im UV-Bereich.
Unterwirft man das erfindungsgemäß erhaltene Polysaccharid in einer 0,Q5molaren Natriumboratlösung der
Elektrophorese (Celluloseacetatmembran, 20 bis 25 V/cm, 90 min), so wird auf der Anodenscite nur ein einziger
Fleck erhalten.
Wird jedoch eine 0,l%ige wäßrige Lösung des Polysaccharids dadurch hydrolisiert, daß zur Lösung so lange
Schwefelsäure hinzugefügt wird, bis die Gesamtlösung 1 normal ist und daß diese Lösung anschließend 5 Stunden
auf 1000C erwärmt wird, dann durch Hinzufügen von Bariumcarbonat neutralisiert und papierchromatographiert wird, kann stets Glukose nachgewiesen werden.
Das Polysaccharid selbst zeigte auch unter den verschiedensten Bedingungen im Papierchromatogramm
keine Wanderung. Unterwirft man die 1%ige wäßrige Lösung der Substanz jedoch der oben beschriebenen
schwefelsauren Hydrolyse und neutralisiert sie anschließend mit Bariumcarbonat, so zeigt das Papierchromato
gramm deutlich die Glukose.
Das Hydrolyseprodukt des Polysaccharids reagiert positiv auf die folgenden Reaktionen: Anisaldehydreaktion, Molisch-Reaktion, Anthronreaktion, Tryptophanschwefelsäurereaktion, Chromotropsäureschwefelsäurereaktion, Carbazol-Cystein-Schwefelsäsure-Reaktion, Anilinsalzsäurereaktion. Resorcinsalzsäurereaktion, ToI-
lens-Reaktion und Thioglykolschwefelsäurereaktion. Das Hydrolysat reagiert nicht auf Eisen(III)-chlorid und
Fehlingsche Lösung.
Das erfindungsgemäße Polysaccharid zeigt keine antimikrobische Wirkung gegenüber Bakterien, Pilzen und
Hefen, wie beispielsweise Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Aspergillus nigel oder Candida
albicans und unterscheidet sich damit ganz wesentlich von den antibakteriellen und antikarzinogenen Wirkstoffen,
die aus den zur Gattung Actinomycetes gehörenden Spezies erhalten werden.
Darüber hinaus zeigt das Polysaccharid keinerlei Cytotoxizität oder andere unerwünschte Nebeneffekte, die
bei den bekannten antikarzinogenen Wirkstoffen auftreten, so z. B. die Abnahme der Leukocyten, Anämie der
Leber und anderer Organe, Atrophie der Milz, Verlust an Körpergewicht und Appetitlosigkeit. Die akute
Toxizität (LD50) der Substanz liegt bei oraler Applikation über 20 g/kg und bei subkutaner, intramuskulärer oder
intravenöser Injektion über 100 mg/kg.
Der antikarzinogene Effekt des Polysaccharide gemäß der Erfindung wurde durch die folgenden Versuche
sichergestellt: f
Eine Maus der ICR-JCL-Reihe mit einem Körpergewicht von 20 g wurde intraperitoneal mit festen Zellen des |;
Ehrlich-Karzinoms oder des Sarcoma-180 infiziert. Eine Woche, nachdem eine hinreichende Zunahme der 15 ,"4
Bauchwasserflüssigkeit in dieser Maus beobachtet werden konnte, wurden die darin enthaltenen Krebszellen
subkutan in einer Konzentration von 6 Mill, pro Maus auf andere Mäuse übertragen. Diese Mäuse wurden zu \
Gruppen von je 10 Tieren aufgeteilt, von denen die erste Gruppe nur mit Salzlösungen behandelt wurde, \
während die anderen Gruppen mit antikanzerösen Wirkstoffen und mit der Substanz gemäß der Erfindung
behandelt wurden. Die erste Anwendung geschah intraperitoneal eine Woche nach der Transplantation, während
die folgende Behandlung neunmal jeden zweiten Tag wiederholt wurde. Die mit den festen Krebszellen
infizierten Mäuse wurden fünf Tage nach der letzten, der zehnten Behandlung auf die Zunahme des Körpergewichtes
untersucht und anschließend zur Aufspürung von Nebeneffekten anatomisch untersucht.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den Tabellen 1 bis 12 zusammengestellt.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen im einzelnen näher erläutert.
Zu 301 destilliertem Wasser wurden 2 kg getrocknetes und kleingehacktes Myzel von Coriolus pubescens (Fr.)
Quel. gegeben. In einem mit Rückflußkühler versehenen Glasgefäß wurde die Mischung auf 95 bis 1000C unter
Rühren drei Stunden lang erhitzt, um so eine Extraktion zu bewirken. Anschließend wurde die Mischung auf
Zimmertemperatur abgekühlt, durch ein Tuch filtriert und das Filtrat auf einen Liter eingeengt Nach Hinzufügen
von 700 g Ammoniumsulfat wurde das Filtrat über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Der Niederschlag,
der sich über Nacht gebildet hatte, wurde am nächsten Morgen durch eine Papierfiltration abgetrennt Der ι
Rückstand wurde sechsmal mit je 4 1 einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung, d. h. also mit 24 1 insgesamt, 35 '
gewaschen. Anschließend wurde der Niederschlag in etwa 1 I Wasser gelöst und in ein Visking-Cellulosegefäß
gegeben, wo er einer 40stündigen Dialyse in strömendem Wasser unterworfen wurde. Nach der Konzentration
der flüssigen Phase in der Membran auf 1 I wurden 100 ml 10%igerTrichloressigsäure hinzugefügt, um die freien
Proteine zu entfernen. Nach der Entfärbung mit 10 g Aktivkohle wurde das Gemisch entfärbt. Das Filtrat wurde
noch einmal für 40 Stunden einer Dialyse in fließendem Wasser unterworfen, wonach die flüssige Phase in der
Membran auf 100 ml konzentriert wurde. Der Niederschlag, der sich nach Hinzufügen von 400 ml Äthanol
gebildet hatte, wurde der Reihe nach mil S0%igem Äthanol, 99%igem Äthanol und mit Aceton gewaschen und r
anschließend getrocknet. Auf diese Weise wurden 60 g eines hellgrauen bis weißen Pulvers erhalten. ,.t
Die auf diese Weise erhaltene Substanz ist ein Polysaccharid, was durch die im vorstehenden genannten Tests
nachgewiesen wurde. Sowohl diese Substanz als auch andere Polysaccharide, die aus dem Myzel anderer Spezies
der Familie Polyporaceae nach dem gleichen Verfahren erhalten wurden, wurden auf ihre antikarzinogene
Wirkung hin untersucht Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt
Das für diese Versuche benutzte Myzel wurde auf die folgende Weise erhalten:
Eintausend 11-Erlenmayer-KoIben wurden mit je 150 ml der im nachstehenden angegebenen Nährlösung ^1
gefüllt: 50 ;
Die Kolben wurden mit einem Wattebausch verschlossen und 30 Minuten bei 120°C sterilisiert Die Nährflüssigkeiten
wurden anschließend in üblicher Weise mit Coriolus pubescens (Fr.) Quel. geimpft, der auf einem
schrägstehenden Kulturboden kultiviert worden war. Nach einer stationären Inkubationszeit der Kulturen in
den Erlenmayer-Kolben von 20 Tagen bei 23 bis 25°C wurde der Inhalt der Kolben filtriert Das auf den Filtern
zurückgebliebene Myzel wurde mit 501 Wasser gewaschen und anschließend getrocknet
| 1 <~pi\suv. | 5g |
| Hefeextrakte | 3g |
| Primäres Kaliumphosphat | 03 g |
| Sekundäres Kaliumphosphat | 03 g |
| Magnesiumsulfatheptahydrat | 0,3 g |
| Glukose | 30 g |
| Wasser | 1 Liter |
| pH = 6.0 |
Familie
Wirkungsgrad gegen festen Krebs Sarcoma-180
Polyporaceae —► Corbolus pubescens (Fr.) Quel.
Polyporaceae —► Tyromyces lacteus (Fr.) Murr. Polyporaceae Polyporus confluens (A. et S.) Fr.
Polyporaceae —► Microporus affinis (Blume et NeesJKuntze.
Polyporaceae Trametes gibbosa Fr. Polyporaceae Cryptoporus volvatus (PK.) Hubb.
Polyporaceae Trametes albida (Fr.) Bourdot et Garzin Polyporaceae —► Ganoderma lucidum (Fr.) Karst.
Polyporaceae —► Hirschioporusabietinus(Fr.)Donk
Polyporaceae —► Tyromyces incarnatus Imazeki
80 100 80 70 60 60 70 70 70 90
Zu 3 kg von getrocknetem und pulverisiertem Myzel von Grifola gigantea (Fr.) Pilat wurden 451 destilliertes
Wasser gegeben. In einem mit RückflußkUhler versehenen, glasausgekleideten Gefäß wurde das Gemisch unter
Rühren zum Zwecke der Extraktion fünf Stunden lang auf 9O0C erhitzt. Nach Abkühlen wurde durch ein Tuch
filtriert und das Filtrat anschließend auf 51 konzentriert. Das Konzentrat wurde anschließend 30 Minuten lang
zentrifugiert (1500 g), die überstehende Lösung dekantiert und unter Rühren mit 4250 g Ammoniumsulfat
versetzt und über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten Morgen wurde filtriert, der Rückstand
gesammelt und in Wasser aufgelöst und die so erhaltene Lösung anschließend auf eine mit 1 η Salzsäure
aktivierte Säule gegeben, die Amberlite IR-120B enthielt Zur Entfernung des überschüssigen Ammoniumsulfats
wurde der Durchlauf anschließend auf eine mit einer 1 η NaOH-Lösung aktivierte Säule gegeben, die Duolite A-7 enthielt Der Auslauf wurde auf einen Liter konzentriert durch Hinzugabe von 41 Äthanol homogenisiert
und anschließend filtriert Der Rückstand wurde mit Äthanol und anschließend mit Aceton gewaschen, getrocknet und lieferte eine Ausbeute von 55 g einer hellgrauen bis weißen, pulverigen Substanz.
Diese Substanz ist ein Polysaccharid, wie durch die im vorstehenden beschriebenen Tests nachgewiesen
wurde. Die so erhaltene Substanz wurde mit den an deren Polysacchariden, die aus dem Myzel anderer
Polyporaceae nach dem gleichen Verfahren erhalten wurden, auf ihre Antitumorwirkung untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengefaßt
Familie
Wirkungsgrad gegen festen Krebs Sarcoma-180
Polyporaceae Trametes cinnabarina Fr. Polyporaceae — Deadaleopsis confragosa (Fr.) Schroet
Polyporaceae -* Favolus arcularius (Fr.) Arnes. Polyporaceae Gloeoporus amorphus (Fr.) Clem, et Shear.
Polyporaceae Fomitopsis castanea imaz. Polyporaceae Ischnoderma resinosum (Fr.) Karst.
Polyporpceae —► Grifola frondosa (Fr.) S. F. Gray
Polyporaceae Amauroderma scopulosum (Berk.) Imaz.
Polyporaceae Grifola gigantea (Fr.) Pilat Polyporaceae Tyromyces caesius (Fr.) Karst
Polyporaceae Trametes sanguinea (Fr.) Lloyd Polyporaceae Elfvingia applanata (Pers.) Karst
90 90 90 60 80 70 80 90 90 70 90 80
Zu 1 kg von getrocknetem und pulverisiertem Myzel von Microporus flabelliformis (Fr.) Kuntze wurden 35 I
destilliertes Wasser gegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren zum Zwecke der Extraktion 5 Stunden lang in
einem Gefäß aus rostfreiem Stahl, das mit einem RückflußkUhler und einer Rührvorrichtung ausgerüstet war, auf
95 bis 98DC erhitzt Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde durch ein Tuch filtriert Der Rückstand wurde
zum Zwecke der weiteren Extraktion mit weiteren 301 destilliertem Wasser drei Stunden lang unter Rühren auf
98 bis 100" C erhitzt anschließend auf Zimmertemperatur abgekühlt und erneut durch ein Tuch filtriert Beide
Filtrate wurden vereinigt und unter verringertem Druck auf 51 eingeengt In das Konzentrat wurden unter
gutem Rühren 4 kg Ammoniumsulfat eingetragen. Nach Stehenlassen über Nacht bei 5 bis 8° C wurde das
Reaktionsgemisch am nächsten Tag 20 Minuten bei 1300 G zentrifugiert Der Rückstand wurde in 11 destilliertem Wasser aufgelöst und 200 Stunden lang der Ultrafiltration unterworfen, wobei mit einem Ultrafilter Modell
2000 (Amicon Corporation) unter Benutzung einer Diaflo-Membran UM-2(Amicon Corporation) bei 5 bis 10°C
ein Druck von 4,9 bar (5 kg/cm2) erreicht wurde. Die Flüssickeit in der Membran wurde in einen Erlenrnayer-Kolben
gegeben und, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, mit 3 Gew.-% Tanninsäure versetzt. Die
Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt und anschließend 20 Minuten lang bei 300G zentrifugiert. Die
überstehende Flüssigkeit wurde erneut ultrafiltriert, wobei wiederum ein Ultrafilter Modell 2000 mit einer
Diaflo-Membran benutzt wurde. Die Ultrafiltration wurde 200 Stunden bei 5 bis 8°C und 4,9 bar (5 kg/cm2)
durchgeführt. Die Flüssigkeit in der Membran wurde mit der dreifachen Volumenmerge Äthanol versetzt. Das
Gemisch wurde gut gerührt und der so gebildete Niederschlag anschließend auf einem Papierfilter gesammelt.
Der Rückstand auf dem Filterpapier wurde der Reihe nach mit 5 I 75%igem Äthanol, mit 3 I 95%igem Äthanol
und schließlich mit einem Liter 99%igem Äthanol und abschließend mit einem Liter Aceton gewaschen und
unter verringertem Druck getrocknet. Es wurden auf diese Weise 23 g einer hellgrauen bis weißen, pulverigen
Substanz erhalten.
Die auf diese Weise erhaltene Substanz konnte mit den im vorstehenden beschriebenen Tests als Polysaccharid
identifiziert werden. Diese Substanz wurde zusammen mit anderen Polysaccharide die aus dem Myzel
anderer Polyporaceae nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurden, auf ihre antikarzinogene
Wirksamkeit hin untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengefaßt.
Das für diese Versuche benutzte Myzel wurde nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt
_ _—
Familie Organismus Wirkungsgrad gegen
festen Krebs Sarcoma-180
Polyporaceae Daedaleopsis styracina (P. Henn.etShir)lmazeki 80 2s
Polyporaceae Gloeophyllum saepiarium (Fr.) Karst. 80
Polyporaceae Fomitopsis officinalis (Fr.) Bond, et Sing. 80
Polyporaceae—» Coriolus consors (Berk) Imaz. 60
Polyporaceae Tyromyces sambuceus (Lloyd.) Imaz. 80
Polyporaceae Polyoporus pes-caprae Fr. 90
Polyporaceae Microporusflabelliformis(Fr.)Kuntze 100
Polyporaceae —» Coriolus flabelliformis (Fr.) Kuntze 70
Polyporaceae—» Fomesfomentarius(Fr.)Kickx 80
Polyporaceae Ganoderma neo-japonicum Imaz. 80
Polyporaceae Trametes dickinsii Berk. 70
Polyporaceae Oxyporus ravidus (Fr.) Bond, et Sing. 60
Polyporaceae—* Hirschioporusfusco-violaceus(Fr.)Donk 60
Polyporaceae Coltrioiaperennis(Fr.)Murrill 80
Polyporaceae Favolusalveolarius(Fr.)Quel. 80
Zu 2,5 kg von getrocknetem und pulverisiertem Myzel von Coriolus hirsuius (Fr.) Quel wurden 751 destilliertes
Wasser gegeben. Das Gemisch wurde zum Zwecke der Extraktion unter Rühren in einem Glasgefäß 3
Kunden lang auf 95 bis 100° C erh itzt, wobei gelegentlich etwas destilliertes Wasser in der Weise ergänzt wurde,
daß das Gemisch nach dem Erlvizen auf eine Menge von 251 eingeengt war. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur
wurde zunächst durch c-ir Tuch, dann durch ein Filterpapier filtriert und das Filtrat anschließend unter
verringertem Druck auf 2,5 1 «.ingeengt. Nach Zufügen von 2 kg Ammoniumsulfat wurde das Gemisch kräftig
gerührt, über Nacht stehengelassen und am nächsten Morgen durch ein Filterpapier filtriert Der Rückstand auf
dem Filterpapier wurde mit einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (101) gewaschen und anschließend in 24 1 so
destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde dann auf eine Säule mit Duolite C-25-D und anschließend auf
eine Säule mit Amberlite IRA-400 gegeben, um das überschüssige Ammoniumsulfat zu entfernen. Der Auslauf
wurde unter vermindertem Druck auf 500 ml eingeengt und auf eine Säule mit Scphadex G-75 gegeben. Diese
Säule wurde zusätzlich mit 101 Waschwasser beaufschlagt, wobei die Fraktion mit dem höchsten Molekulargewicht
gesammelt und der Gefriertrocknung unterworfen wurde. Nach der Trocknung wurden 3,26 g einer
hellgrauen bis weißen, pulverigen Substanz erhalten.
Die auf diese Weise erhaltene Substanz wurde mit Hilfe der im vorstehenden beschriebenen Tests als
Polysaccharid identifiziert Diese Substanz wurde gemeinsam mit anderen Polysacchariden, die aus dem Myzel
anderer Polyporaceae nach dem im vorstehenden beschriebenen Verfahren erhalten wurden, auf ihre antikarzinogene
Wirksamkeit hin untersucht Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben.
Das für diese Versuche benutzte Myzel wurde nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise erhalten.
Familie
Organismus
Wirkungsgrad gegen festen Krebs Sarcoma-180
Polyporaceae Porodiscuius penduius (Schw.) Murr:!!
Polyporaceae Fomitopsis cytisina (Berk.) Bond, et Sing.
Polyporaceae Polyporus caeruleoprus Peck
Polyporaceae Fomitopsis pinicola (Fr.) Karst.
Polyporaceae Polyporellus brumalis (Fr.) Karst.
Polyporaceae —► CoriolushirsutusiFr.JQuel.
Polyporaceae Coriolellus heteromorphus (Fr.) Bond, et Sing.
Polyporaceae —* Coriolus conchifer (Schw.) Pat.
Polyporaceae Fomitopsis latissima (Bres.) Imazeki, comb. nov.
Polyporaceae Polyporellus elegans (Fr.) Karst.
Polyporaceae Pclyporus dispansus Lloyd
Polyporaceae Trachyderma tsunodae (Yasuda) Imazeki
Polyporaceae Lenzites betulina Fr.
60 60 90 80 90 90 70 70 80 90 60 60 90
Nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde eine Kultur von Fomitopsis rhodophaea (Lev.) Imaz.
gezogen, und die Nährflüssigkeit wurde zur Entfernung des Myzels durch ein Tuch filtriert Das erhaltene Filtrat
(i001) wurde unter vermindertem Druck auf 151 konzentriert und mit 12,75 kg Ammoniumsulfat versetzt. Das
zugefügte Salz wurde anschließend unter Rühren gelöst. Die so erhaltene Lösung wurde über Nacht im
Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen eine Stunde lang bei 6000 G zentrifugiert. Die überstehende
Flüssigkeit wurde dekantiert und der Rückstand in 3 I destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung
wurden 2550 g Ammoniumsulfat gegeben und die Mischung erneut über Nacht im Kühlschrank stehengelassen.
Am nächsten Morgen wurde eine Stunde lang bei 6000G zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde fünfmal
wiederholt. Der schließlich erhaltene Niederschlag wurde in 31 destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde
durch ein Papier mit der Porenweite Nr. 2 filtriert und das in eine Cellophanzelle gegebene Filtrat anschließend
50 Stunden lang in strömendem Wasser dialysiert. Die in der Zelle gesammelte Flüssigkeit wurde bei Zimmertemperatur
unter vermindertem Druck auf 11 eingeengt und in der Weise mit Trichloressigsäure versetzt, daß,
bezogen auf die Gesamtlösung, eine Konzentration der Trichloressigsäure von 4 Gew.-% erhalten wurde. Die
Lösung wurde über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und anschließend eine Stunde lang bei 10 000 G
zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wurde wiederum in eine Cellophanzelle gegeben und weitere 150
Stunden lang bei 10° C dialysiert Die in der Zelle gesammelte Flüssigkeit wurde bei Zimmertemperatur unter
vermindertem Druck auf 11 eingeengt und anschließend mit 31 Äthanol versetzt. Die erhaltene Mischung wurde
über Nacht stehengelassen und am nächsten Morgen durch Zentrifugieren (15 Minuten bei 1500 G) der Niederschlag,
der sich gebildet hatte, abgetrennt, mit absolutem Äthanol, Aceton und Äther gewaschen und getrocknet.
Es wurden 19,2 g einer hellgrauen bis weißen, pulverigen Substanz erhalten.
In Tabelle 5 sind die Ergebnisse der Tests auf die antikarzinogene Wirksamkeit des auf diese Weise erhaltenen
Mucoplysaccharids zusammen mit den Ergebnissen für andere Mucopolysaccharide dargestellt, die in der
gleichen Weise aus anderen Polyporaceae erhalten wurden.
| Familie | Organismus | Elementar | Ausb. | Dosis | Wirkungs | Wirkungs |
| analyse | auf | mg/kg | grad gegen | grad gegen | ||
| C H | Zucker | festen Krebs | festen Krebs | |||
| basis | Sarcoma-180 | vom Ehrlich- | ||||
| (%) | (%) | Typ(%) |
55 Polyporaceae Polyporaceae
Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
65 Polyporaceae
Fomitopsis rhodophaea (Lev.) Imaz.
Coltricia pusilla Imazeki etYsk-Kobayashi
Polyporellus picipes (Fr.) Karst
Daedaleopsis styracina (P. Henn et Shir.) Imazeki Gloeophyllum saepiarium
(Fr.) Karst Fomitopsis officinalis (Fr.) Bond, et Sing.
4235 531 0,93
40,02 41,41
5,1! 0,60 634 0,61
4230 631 037
3835 6,88 0,22 42,94 5,16 0,61
300
300
300
300
300
300
80 100 70 80 60 80
70 90 60 90 60 80
Eine Kühlflüssigkeit von Ganoderma tsugae Murrill, die in der gleichen Weise wie in Seispiel 5 beschrieben
erhalten worden war. wurde zur Entfernung des Myzels durch ein Tuch filtriert Je 451 des Filtrats wurden bei
Zimmertemperatur unter verringertem Druck auf 4,51 eingeengt. Die unlöslichen Rückstände wurden durch
Zentrifugieren (20 Minuten bei 1300 G) entfernt 3285 g Ammoniumsulfat wurden zu der überstehenden Flüssigkeit hinzugefügt das Gemisch wurde gut gerührt und über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten
Morgen wurde erneut 20 Minuten bei 1500 G zentrifugiert. Der Rückstand wurde gesammelt mit 31 gesättigter
Ammoniumsulfatlösung homogenisiert und erneut 20 Minuten lang bei 1500G zentrifugiert Der so erhaltene
Rückstand wurde in einem Liter destilliertem Wasser aufgelöst und auf eine mit Salzsäure aktivierte Amberlite lR-120-Säule gegeben, um einen Teil der Proteine und einen Teil des Ammoniumsulfats zu entfernen. Anschließend wurde die Säule mit 51 destilliertem Wasser gewaschen und das Waschwasser mit dem Auslauf
vereinigt und anschließend bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf 1,51 eingeengt Der eingeengten Flüssigkeit wurde bis zu einer Gesamtkonzentration von 3,5 Gew.-% Trichloressigsäure zugesetzt Der
Ansatz wurde über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und zur Abtrennung der Proteine am nächsten
Morgen 40 Minuten lang mit 10 000 G zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule mit
Duolite A-7 gegeben, die mit 4%iger Sodalösung aktiviert worden war. Dadurch wurde das restliche Ammoniumsulfat und die farbigen Nebenprodukte abgetrennt Die Säule wurde anschließend mit 51 destilliertem
Wasser gewaschen und das Waschwasser dem vorher erhaltenen Durchlauf hinzugefügt Die vereinigten Durchläufe wurden bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf 1,51 eingeengt. Zu der eingeengten Flüssigkeit wurden 4,5 I Äthanol hinzugefügt das Gemisch wurde über Nacht stehengelassen und am nächsten Morgen
20 Minuten lang mit 1400 G zentrifugiert. Der Niederschlag wurde gesammelt und in zwei Litern 75°/oigem
Äthanol aufgenommen und homogenisiert und erneut 20 Minuten lang mit 1400 G zentrifugiert Diese Behandlung wurde fünfmal wiederholt und der schließlich erhaltene Rückstand nacheinander mit absolutem Äthanol,
Aceton und Äther gewaschen und anschließend getrocknet Die Ausbeute a.. hellgrauem bis weißem Pulver
betrug 2,5 g.
In Tabelle 6 sind die Ergebnisse der Versuche zum Nachweis der antikarzinogenen Wirksamkeit des so
erhaltenen Mucopolysaccharids mit den Ergebnissen zusammengefaßt, die für andere Mucopolysaccharide
erhalten wurden, die in der gleichen Weise aus anderen Polyporaceae erhalten worden waren.
| Familie | Organismus | Elementar | H | Ausb. | Dosis | Wirkungs | Wirkungs | Typ(%) |
| analyse | auf | mg/kg | grad gegen | grad gegen | 90 | |||
| C | Zucker | festen Krebs | festen Krebs | |||||
| 5,70 | basis | Sarcoma-180 vom Ehrlich- | 90 | |||||
| (%) | (%) | |||||||
| Polyporaceae | Coriolus consors | 41,54 | 6,25 | 0,77 | 300 | 80 | 100 | |
| (Berk.) Imaz. | ||||||||
| Polyporao?!>e | Tyromyces sambuceus | 38,06 | 5,63 | 0,47 | 300 | 90 | 100 | |
| (Lloyd) Imaz. | 100 | |||||||
| Polyporaceae | Coltricia dependens | 38,67 | 6,68 | 0,25 | 300 | 100 | ||
| (Berk, et Curt) Imaz. | 6,87 | 60 | ||||||
| Polyporaceae | Polyporus ovinus Fr. | 39,07 | 0,76 | 300 | 100 | |||
| Polyporaceae | Fomitopsis insularis | 40,96 | 6,49 | 0,16 | 300 | 100 | ||
| (Murr.) Imaz. | ||||||||
| Polyporaceae | Ganoderma tsugae Murrill | 39,58 | 0,19 | 300 | 60 | |||
Durch Inkubation in 300 ml einer Nährflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung:
Zusammensetzung (I):
| Peptone | 10g |
| Hefeextrakte | 2g |
| Malzextrakte | 2g |
| Primäres Kaliumphosphat | 0,1g |
| Sekundäres Kaliumphosphat | 0,1g |
| Magnesiumsulfatheptahydrat | 0,1g |
| Glukose | 50 g |
| Calziumcarbonat | 1.5g |
| Wasser | 1 Liter |
| pH = 6.5 |
60
wurde nach dem stationären Verfahren nach 14 Tagen bei 23 bis 25°C ein Myzel von Tramets gibbosa Fr.
erhalten. Das Myzel wurde mit 100 ml einer aphysiologischen Salzlösung homogenisiert und zur Impfung in 23 1
eines Nihrbodens in einen 361 fassenden Fermentierbottich aus rostfreiem Stahl gegeben.
Der Nährboden, der die im folgenden angegebene Zusammensetzung hatte, war 30 Minuten lang bei 1200C
sterilisiert worden:
| Peptone | 10 g |
| Hefeextrakt | 2g |
| Malzextrakt | 2g |
| Primäres Kaliumphosphat | 0.1g |
| Sekundäres Kaliumphosphat | 0.1g |
| Magnesiumsulfatheptahydrat | 0.1g |
| Glukose | 50g |
| Siliconharz | 0.05 g |
| Calziumcarbonat | 13 g |
| Wasser | 1 Liter |
| pH -6,5 |
Der Nährboden wurde der aeroben Inkubation unterworfen, und zwar 10 Tage lang bei einer Rührgeschwindigkeit von 110 bis 120 U/min und 23 bis 25° C und einer Belüftungsrate von 0,15 Liter/Liter/min.
Der Nährboden (151) wurde durch ein Tuch filtriert und das Filtrat bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf einen Liter eingeengt Dem Konzentrat wurden 850 g Ammoniumsulfat zugesetzt, das Gemisch
anschließend gut gerührt und Ober Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten Morgen wurde 20
Minuten lang mit 1600G zentrifugiert. Der so erhaltene Rückstand wurde in einem Liter destilliertem Wasser
gelöst und die erhaltene Lösung ultrafiltriert, wobei ein Ultrafilter Modell 2000 mit einer Diaflo-Membran UM-2
(Amicon Corporation, USA) verwendet wurde. Es wurde 150 Stunden lang unter einem Druck von 6,87 bar
(7 kg/cm2) filtriert Die im Filter gesammelte Flüssigkeit wurde in ein 3-Liter-Becherglas gegeben und bis zu
einer Gesamtkonzentration von 3 Gew.-% mit Trichloressigsäure versetzt. Das Gemisch wurde gut durchgerührt, über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen eine Stunde lang bei 10 000 G
zsntrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine Duolite A-7-Säule gegeben, die mit 4%iger NaOH-Lösung behandelt worden war. Die Säule wurde anschließend mit 31 destilliertem Wasser gewaschen, wobei das
Waschwasser mit dem vorher erhaltenen Durchlauf vereinigt wurde. Die vereinigten Durchläufe wurden unter
vermindertem Druck auf einen Liter eingeengt. Dem Konzentrat wurden 31 Aceton zugesetzt und der so
erhaltene Niederschlag wurde mit reinem Aceton und mit Äther gewaschen und anschließend getrocknet. Es
wurden 3,0 g eines hellgrauen bis weißen Pulvers erhalten.
In Tabelle 7 sind die Ergebnisse der Prüfungen auf die antikarzinogene Wirksamkeit des so erhaltenen
Mucopolysaccharids zusammen mit den Ergebnissen für die anderen Mucopolysaccharide wiedergegeben, die
nach dem im vorstehenden genannten Verfahren aus anderen Polyporaceae erhalten wurden.
| 40 | Tabelle 7 | Organismus |
Elementar
analyse C H |
6,34 |
Ausb.
auf Zucker basis (%) |
Dosis
mg/kg |
Wirkungs
grad gegen festen Krebs Sarcoma-180 (%) |
Wirkungs
grad gegen festen Krebs vom Ehrlich- Typ(%) |
| 45 | Familie |
Polyporellus brumalis
(Fr.) Karst Coriolus pubescens (Fr.)Qu6l. Tyromyces lacteus /Cr \ Murr |
42,65 | 5,53 | 0,79 | 300 | 80 | 70 |
| Polyporaceae |
\r I.f IVlUI I ·
Polyporus confluens (A. et S.) Fr. Microporus af finis (Blume et Nees) Kuntze Trametes gibbosa Fr. |
40.55 | 6,15 | 0,20 | 300 | 70 | 80 | |
| 50 | Polyporaceae | 38,26 |
6,10
5,59 5,86 |
0,71 | 300 | 90 | 80 | |
| Polyporaceae |
39,23
38,20 39,25 |
Beispiel 8 |
0,53
0.20 0,25 |
300
300 300 |
80
70 80 |
90
80 90 |
||
| 55 |
Polyporaceae
Polyporaceae Polyporaceae |
|||||||
| 60 | ||||||||
220 1-Liter-Inkubationsflaschen wurden mit je 200 ml einer Malzextrakt-Nährflüssigkeit der folgenden ZusamiTK Setzung gefüllt:
Malzextrakte (Difco)
Wasser
50 g
1 Liter
Die Flaschen wurden mit Wattestopfen verschlossen, 30 Minuten lang bei 1200C sterilisiert, zum Abkühlen
stehengelassen und anschließend mit einem Myzel von Fomhopsis castanea Imaz. geimpft, das auf einer Schrägfläche gezogen worden war. Die stationäre Inkubation wurde über 20 Tage bei 25 bis 28° C durchgeführt Zur
Entfernung des Myzels wurde der fermentierte Nährboden anschließend durch ein Filtertuch filtriert Das Filirat
wurde ultrafiltriert, wobei eine Diaflo-Membran UM-2 bei einem Druck von 637 bar {7,0 kg/cm2) benutzt
wurde. Die durch die Ultrafiltration auf 31 eingeengte Flüssigkeit wurde aus dem Filter ausgetragen und zur
Entfernung der Rückstände 15 Minuten lang bei 1500G zentrifugiert Der überstehenden Flüssigkeit wurden
2550 g Ammoniumsulfat zugesetzt Das Gemisch wurde über Nacht stehengelassen und am nächsten Morgen 15
Minuten lang mit 1500 G zentrifugiert Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde in 31 einer gesättigten
Ammoniumsulfatlösung aufgenommen und homogenisiert und erneut 15 Minuten lang bei 1500 G zentrifugiert
Diese Behandlung wurde fünfmal wiederholt, worauf die Flüssigkeit auf eine Amberlitc IR-200-Säule gegeben
wurde, die mit 1 η Salzsäure aktiviert worden war. Die Säule wurde anschließend mit einem Liter destilliertem
Wasser gewaschen, das dem vorher erhaltenen Durchlauf zugefügt wurde. Die vereinigten Durchläufe wurden
über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen 30 Minuten lang mit 10 000 G zentrifugiert. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wurde abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit auf eine
aktivierte Dowex 1-Säule gegeben. Der Durchlauf wurde bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf
einen Liter eingeengt, mit 31 Äthanol versetzt und der nach der Filtration erhaltene Rückstand der Reihe nach
mit absolutem Alkohol, Aceton und Äther gewaschen und anschließend getrocknet Es wurden 103 g eines
hellgrauen bis weißen Pulvers erhalten.
In Tabelle 8 sind die Ergebnisse der Versuche zum Nachweis der antikarzinogenen Wirksamkeit des so
erhaltenen Mucopolysaccharids zusammen mit den Ergebnissen anderer Mucopolysaccharide wiedergegeben,
die aus verschiedenen anderen Polyporaceae nach dem im vorstehenden beschriebenen Verfahren erhalten
worden waren.
| Familie | Organismus | Elementar | Ausb. | Dosis | Wirkungs- Wirkungs |
| analyse | auf | mg/kg | grad gegen grad gegen | ||
| C H | Zucker | festen Krebs festen Krebs | |||
| basis | Sarcoma-180 vom Ehrlich- | ||||
| (%) | (%) Typ(%) |
Polyporaceae Polyporaceae
Polyporaceae Polyporaceae
Favolus arcularius (Fr.) Arnes
Gloeoporus amorphus (Fr.) Clem et Shear Fomitopsis castanea Imaz.
Ischnoderma resinosum (Fr.) Karst.
39.48 6,21 0,50
38,31 5,81 0,%
39,69
41,99
5,15
5,76
5,76
0,72
0,79
300
300
300
300
300
300
90
90
90
70
100
90
100
80
80
Unter ständigem Hinzufügen von Wasser wurden 40 g Maismehl drei Stunden lang bei 100° in einem Liter
Wasser gekocht. Nach Abkühlen wurde der Brei filtriert und wurden dem Filtrat 10 g Rohrzucker zugesetzt. 813
1-l-lnkubationsflaschen wurden mit je 180 ml dieses Kornextrakt-Nährbodens gefüllt. Die Flaschen wurden mit
Wattebäuschen verschlossen und 30 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wurden sie mit zuvor kultiviertem Myzel von Rigidoporus ulmarius (Fr.) Imaz. geimpft. Die stationäre
Inkubation wurde 20 Tage lang bei 23 bis 27°C durchgeführt. Anschließend wurde das Myzel von dem fermentierten Nährboden abgetrennt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei Zimmertemperatur auf 101
eingeengt und mit 8,5 kg Ammoniumsulfat versetzt. Nach kräftigem Durchrühren wurde die Flüssigkeit über
Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen filtriert. Der auf dem Filterpapier verbliebene
Rückstand wurde mit 51 einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung gewaschen, in 2 I destilliertem Wasser gelöst
und anschließend 60 Stunden lang in strömendem Wasser dialysiert, wobei eine Cellophanzell<» benutzt wurde.
Die Lösung in der Cellophanzelle wurde anschließend auf einen Liter eingeengt und bis zu einer Konzentration
von 3,5 Gew.-% mit Trichloressigsäure versetzt. Nach erneutem Stehenlassen über Nacht im Kühlschrank
wurde am nächsten Morgen 30 Minuten lang mit 10 000 G zentrifugiert. Der Rückstand wurde abgetrennt und
die überstehende Flüssigkeit der Ultrafiltration unterworfen, wobei eine Diaflo-Membran UM-2 mit einem
Durchmesser von 150 mm bei einem Druck von 6,87 bar (7 kg/cm2) benutzt wurde. Die Filtration und das
Waschen wurden mit 160 I destilliertem Wasser durchgeführt. Durch die Ultrafiltration wurde ein Einengen auf
600 ml erreicht. Zu der eingeengten Flüssigkeit wurden 1,8 I Äthanol gegeben und die Mischung anschließend
über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Am nächsten Morgen wurde 20 Minuten lang mit 1600 G zentrifugiert. Der Rückstand wurde in 3 I destilliertem Wasser aufgenommen und das überschüssige Äthanol unter
ständiger Ergänzung des Wassers bei vermindertem Druck entfernt. Durch Gefriertrocknung dieser Flüssigkeit
wurden 29,1 g eines hellgrauen bis weißen Pulvers erhalten.
In Tabelle 9 sind die Ergebnisse der Prüfungen auf die antikarzinogene Wirksamkeit des so erhaltenen
Mucopolysaccharids zusammen mit den Ergebnissen für andere Mucopolysaccharide wiedergegeben, die aus
verschiedenen anderen Polyporaceae nach dem gleichen Verfahren erhalten worden waren.
25 30 35 40
50
55
60
65
| Tabelle 9 | Organismus | Elementtr- | Ausb. | Dosis | Wirkungs | Wirkungs |
| Familie | analyse | auf | mg/kg | grad gegen | grad gegen | |
| C H | Zucker | festen Krebs | festen Krebs | |||
| basis | Sarcoma-180 | vom Ehrlich- | ||||
| (%) | (%) | Typ(%) | ||||
Polyporaceae
PolypoFjjCeae
Polyporaceae
Polyporaceae
Polyporaceae
Polyporaceae
Grifola frondosa (Fr.) S. F. Gray
Hirschioporus versetiiis (Berk.) Imaz.
Laetiporus versisporus (Lloyd) Imazeki Rigidoporus durus
(Jungh.) Imaz. Polyporellus aquamosus (Fr.) Karst Rigidoporus ulmarius
(Fr.) Imaz.
39,06 6,77 032 300 100 90
42.65 537 0,25 300 70 70
39.01 5,47 0,43 300 90 100
42,71 6.74 0.62 300 100 100
40.48 5,25 0,17 300 80 90
42,01 5,21 0.97 300 70 80
Das vorstehende Beispiel wurde mit den in der folgenden Tabelle 9a angegebenen Stämmen der Polyporaceaefamilie nachgearbeitet, wobei sich innerhalb der Fehlergrenzen die gleichen Ergebnisse ergaben wie in
Beispiel 9. Für den Stamm Coriolus versicolor (Fr.) wurde der Wirkungsgrad gegen festen Krebs Sarcoma 180
untersucht und zeigte gemäß der hier angegebenen Methode einen Wirkungsgrad von 100.
Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
Trametes trogii Berkeley Fomitopsis rhodophaea(Lev.) Imaz.
Coltricia pusilla Imazeki et Ysk. Kobayashi Polyporeilus pioipes(Fr.) Karst.
Coriolus pargamenus (Fr.) Pat Tyromyces guttulatus (Pk.) Murr. Polyporus tuberaster Fr.
Daedaleopsis nippenica Imazeki Coltrica dependens (Berk, et Curt.) Imaz.
Polyporus ovinus Fr. Fomitopsis insularis (Murr.) imaz. Ganoderma tsugae Murrill
Grifola albicans Imazeki Coriolus versicolor (Fr.) Qu6l.
Grifola umbellata (Fr.) Pilät Piptoporus betulinus (Fr.) Karst.
Daedaleopsis tricolor (Fr.) Bond, et Sing. Ganoderma boninense Pat.
Trametes orientalis (Yas.) Irnaz. Favolus emerici (Cooke) Imazeki
Fomitopsis pubertatis (Lloyd) Imaz. Fomitopsis vinosa (Berk.) Imaz.
Porodisculus pendulus (Schw.) Murrill Fomitopsis cytisina (Berk.) Bond, et Sing.
Polyporus caeruleoprus Peck Fomitopsis pinicola (Fr.) Karst. Polyporus dispansus Lloyd
Trachyderma tsunodae (Yasuda) Imaz. Lenzites betulina Fr.
Fomitopsis rosea (Fr.) Karst. Oxyporus ravidus (Fr.) Bond, et Sing.
Hirschioporus fuscoviolaces (Fr.) Donk Coltricia perennis (Fr.) Murr. Favolus aiveolarius (Fr.) Quel.
Grifola gigantea (Fr.) Pilät Tyromyces caesius (Fr.) Karst. Trametes sanguinea (Fr.) Lloyd
Elfvingia applanata (Pers.) Karst.
12
Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
Polyporaceae Polyporaceae Polyporaceae
Hirschiopcrus abietinus (Fr.) Donk Tyromyces incarnatus Imazcki
Amauroderma scopulosum(Berk.) lmaz.
Polyporus pes-caprae Fr. Microporusflabelliforrnis(Fr.) Kuntze
Coriolus biformis (Klotz.) Pat. Fomes fomentarius (Fr.) Kickx Ganoderma neo-japonicum lmaz.
Beispiel 10
1324 1-1-lnkubationsflaschen wurden mit je 200 ml einer Nährflüssigkeit gefüllt, die die folgende Zusammensetzung hatte:
| Glukose | 40 g |
| Getreidequellflüssigkeit | 20 g |
| Natriumnitrit | 3g |
| Primäres Kaliumphosphat | 0,5 g |
| Calciumcarbonat | 3g |
| Wasser | 1 Liter |
Die eingefüllte Nährflüssigkeit wurde durch 30 Minuten langes Erwärmen auf 120° C sterilisiert und anschließend auf Zimmertemperatur abgekühlt. Die Flüssigkeit wurde mit einem Myzel von Ganoderma boninense Pat
geimpft, das zuvor nach der stationären Inkubation (21 Tage bei 20 bis 23°C) erhalten worden war. Zur
Entfernung des Myzels wurde die Nährflüssigkeit nach der Inkubation filtriert und das Filtrat bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf 101 eingeengt. Dem Konzentrat wurden 301 Äthanol zugesetzt, und nach
Stehen über Nacht im Kühlschrank wurde am nächsten Morgen durch Filterpapier filtriert Der Rückstand auf
dem Filterpapier wurde mit absolutem Äthanol und anschließend mit reinem Aceton und Äther gewaschen und
anschließend getrocknet Der getrocknete Rückstand wurde in einem Liter destilliertem Wasser gelöst und zur
Entfernung unlöslicher Rückstände durch ein Filterpapier Nr. 5C filtriert. Das Filtrat wurde mit 850 g Ammoniumsulfat versetzt und gut durchrührt, über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen
mit 1500G zentrifugiert. Der Rückstand wurde gesammelt, in einem Liter gesättigter Ammoniumsulfatlösung
aufgenommen und homogenisiert und erneut 15 Minuten lang mit 1500G zentrifugiert Diese Behandlung
wurde sechsmal wiederholt und der schließlich erhaltene Rückstand in einem Liter destilliertem Wasser aufgelöst und durch ein Filterpapier Nr. 2 filtriert. Das Filtrat wurde nacheinander auf eine aktivierte Duolite C-27-
und auf eine Amberlite IR-401-Säule gegeben, mit 2 I destilliertem Wasser gewaschen, wobei das Waschwasser
wiederum den Durchläufen zugesetzt wurde, wobei die so vereinigten Durchliufe anschließend bei vermindertem Druck und Zimmertemperatur auf 830 ml eingeengt wurden. Dem Konzentrat wurden 2490 ml reines
Aceton zugefügt, worauf das Gemisch über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen 15
Minuten lang mit 1500G zentrifugiert wurde. Der Rückstand wurde aufgenommen, mit 31 75%igem Aceton
gewaschen und anschließend in 31 destilliertem Wasser gelöst Unter ständigem Wasserzulauf wurde das Aceton
unter vermindertem Druck abgezogen und die so erhaltene Lösung der Gefriertrocknung unterworfen. Es
wurden 36,7 g einer hellgrauen bis weißen, pulverigen Substanz erhalten.
In Tabelle 10 sind die Ergebnisse der Versuche zum Nachweis der antikarzinogenen Wirksamkeit des so
erhaltenen Mucopolysaccharids wiedergegeben, wobei auch die Ergebnisse für andere Mucopolysaccharide
aufgenommen sind, die aus anderen Spezies der Polyporaceae nach dem gleichen Verfahren erhalten worden
waren.
| Tabelle 10 | Organismus |
Elementar-
analyse C H |
Ausb.
auf Zucker basis (%) |
Dosis
mg/kg |
Wirkungs- Wirkungs
grad gegen grad gegen festen Krebs festen Krebs Sarcoma-180 vom Ehrlich- (%) Typ(%) |
90
100 80 |
| Familie |
Daedaleopsis tricolor
(Fr.) Bond, et Sing. Ganoderma boninense Pat Coriolus hirsutus (Fr.)Quel. |
39^9 6,16
4137 6,13 42,48 5,68 Beispiel U |
030
0,51 0,17 |
300
300 300 |
90
100 90 |
|
|
Polyporaceae
Polyporaceae Polyporaceae —► |
||||||
to
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
220 1-1-Inkubationsflaschen wurden mit je 220 ml einer Nährflüssigkeit gefällt, die die folgende Zusammensetzung hatte:
13
Peptone Glukose Wasser
10g 40 g 1 Liter
Nach dem Einfüllen dieses Nährbodens, dem sogenannten Sabouraud-Medium, wurden die Flaschen mit
Wattestopfen verschlossen und zur Sterilisation 30 Minuten lang auf 12O0C erwärmt. Nach Abkühlen auf
Raumtemperatur wurde die Nährflüssigkeit mit Myzel von Ganodenna iucidum (Fr.) Karst geimpft. Das Impfmyzel wurde zuvor durch stationäre Inkubation (18 Tage bei 24 bis 26°C) hergestellt. Zur Entfernung des My/cls
wurden die inkubierten Nährflüssigkeiten durch ein Tuch filtriert, bei Zimmertemperatur unter vermindertem
to Druck auf 3,31 eingeengt und zur Entfernung verbliebener Rückstände mit 1300G zentrifugiert. Nach dem
Zufügen von 2460 g Ammoniumsulfat zur überstehenden Flüssigkeit und nach anschließendem guten Rühren
wurde die Flüssigkeit über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen 20 Minuten lang bei
1500 G zentrifugiert. Der verbleibende Rückstand wurde aufgenommen, in 3,3 I gesättigter Ammoniumsulfatlösung homogen verteilt und 20 Minuten mit 1500 G zentrifugiert. Nach achtmaligem Wiederholen dieses Vor-
gangs wurde der schließlich erhaltene Rückstand in 31 destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf eine
Dowex 50W- und auf eine Amberlite IR-401-lonenaustauschersäule gegeben, die anschließend mit 3 I destilliertem Wasser gewaschen wurden. Das Waschwasser wurde den zuvor erhaltenen Durchlaufen zugefügt. Die
vereinigten Durchläufe wurden anschließend ultrafiltriert. Nach Waschen mit 301 destilliertem Wasser wurde
die Ultrafiltration so lange durchgeführt, bis das Gesamtvolumen der Flüssigkeit nur noch 1,1 1 betrug. Die so
erhaltene Flüssigkeit wurde auf eine Duolite S-30-Säule gegeben, die mit 4%iger Salzsäure und mit 4%iger
Sodalösung aktiviert worden war. Die Säule wurde mit 31 destilliertem Wasser gewaschen, wobei das Waschwasser wieder dem Durchlauf hinzugefügt wurde. Anschließend wurde unter vermindertem Druck bei Zimmertemperatur auf 1,11 eingeengt. Nach Zusetzen von 3,31 Äthanol wurde das Konzentrat über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und am nächsten Morgen 15 Minuten lang mit 1500G zentrifugiert. Der erhaltene
Niederschlag wurde in 31 destilliertem Wasser gelöst und zur Entfernung des Äthanols unter ständigem Ausgleich des Wasserverlustes bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck behandelt. Nach der Gefriertrocknung der verbliebenen Flüssigkeit wurden 2,1 g eines hellgrauen bis weißen Pulvers erhalten.
In Tabelle 11 sind die Ergebnisse der Versuche zum Nachweis der antikarzinogenen Wirksamkeit des so
erhaltenen Mucopolysaccharids zusammengestellt, wobei auch die Ergebnisse für die Mucopolysaccharide
angeführt sind, die nach dem gleichen Verfahren aus anderen Spezies der Polyporaceae erhalten worden waren.
| Familie | Organismus | Elementar | H | Ausb. | Dosis | Wirkungs | Wirkungs | |
| analyse | auf | mg/kg | grad gegen | grad gegen | ||||
| C | Zucker | festen Krebs | festen Krebs | |||||
| 6,11 | basis | Sarcoma-180 | vom Ehrlich- | |||||
| (%) | (%) | Typ(%) | ||||||
| 40 | Polyporaceae | Coriolellus heteromorphus | 41,85 | 5,42 | 0,26 | 300 | 80 | 70 |
| (Fr.) Bond, et Sing. | ||||||||
| Polyporaceae — | Coriolus conchifer | 39.48 | 6,43 | 0,55 | 300 | 80 | 90 | |
| (Schw.) PaL | ||||||||
| Polyporaceae | Fomiiopsis latissima | 38,53 | 5,73 | 0.59 | 300 | 70 | 70 | |
| 45 | (Bros.) Imazeki, comb,nov. | 6,45 | ||||||
| Poiypöraceae |
Polyporeilus oiegans
(Fr.) KarsL Cryptoporus volvatus |
4033 | 0.56 | 300 | 60 | 60 | ||
| Polyporaceae | (PK.)Hubb. | 38,14 | 6,16 | 0.35 | 300 | 80 | 90 | |
| Trametes albida | ||||||||
| 50 | Polyporaceae | (Fr.)BourdotetGalzin | 39.94 | 5,21 | 0.64 | 300 | 60 | 70 |
| Ganoderrna !ueidum | ||||||||
| Poiyporaceac | (Fr.) Karst. | 42:85 | Beispiel 12 | 0.16 | 300 | 80 | 70 | |
| 55 |
205 1-1-Inkubationsflaschen wurden mit je 180 ml des sogenannten Mayerschen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung gefüllt:
Wasser
50g 10g 5g
1 Liter
Nach dem Sterilisieren unter Druck (30 Minuten lang bei 1200C) und Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde
das Medium mit Myzel von Coriolus pargamenus (Fr.) PaL geimpft, das zuvor durch eine stationäre Inkubation
14
(20 Tage lang bei 25 bis 27"C) erhalten worden war.
Nach der Filtration der Nährflüssigkeit durch ein Tuch wurde bei Zimmertemperatur unter vermindertem
Druck auf 2,5 I eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 2 kg Ammoniumsulfat versetzt und anschließend gut
gerührt. Nach Stehenlassen über Nacht wurde am nächsten Morgen 15 Minuten lang mit 1500G zentrifugiert.
Der Rückstand wurde gesammelt und in 3 I destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf eine aktivierte
Amberlite IR-200-Säule gegeben. Die Säule wurde mit einem Liter destilliertem Wasser gewaschen, das Waschwasser dem Durchlauf zugesetzt, und die vereinigten Durchläufe wurden nach Stehenlassen über Nacht im
Kühlschrank durch ein Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde auf eine Duolite A-6-Säule gegeben, wobei die
Säule mit 31 destilliertem Wasser gewaschen wurde und das Waschwasser wiederum dem Durchlauf zugesetzt
wurde. Die vereinigten Durchläufe wurden bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf einen Liter
eingeengt. Zu der eingeengten Flüssigkeit wurden unter Rühren 20 g Bleiacetat gegeben. Nach der Zugabe
wurde noch eine Stunde gerührt. Nach Stehen über Nacht im Kühlschrank wurde am nächsten Morgen 30
Minuten lang mit 3000 G zentrifugiert. Der Rückstand wurde aufgenommen und in einem Liter destilliertem
Wasser homogenisiert. Anschließend wurde erneut 30 Minuten lang mit 3000 G zeinrifiJ«i": i. Diese Behandlung
wurde fünfmal wiederholt und der schließlich erhaltene Rückstand in einem Liter Wasser suspendiert Der
Niederschlag, der nach 30 Minuten langem Einleiten von Schwefelwasserstoff in die Suspension erhalten wurde,
wurde abfiltriert. Dus Filtrat wurde in einer Abdampfschale auf ein Sandbad gesetzt und unter ständiger
Ergänzung des abgedampften Wassers dann nach 10 Stunden zur Trockne eingedampft. Der trockene Rückstand wurde in einem Liter destilliertes Wasser aufgenommen und durch ein Filterpapier Nr. 5C filtriert. Das
Filtrat wurde nacheinander durch eine filtrierte Duolite C-25D-, eine Amberlite IRA-410- und auf eine Duolite S-30-Säule gegeben. Die Säulen wurden mit einem Liter destilliertem Wasser gewaschen und das Waschwasser den Durchläufen zugesetzt. Nach Einengen bei Zimmertemperatur unter vermindertem Druck auf einen
Liter wurden 3 1 Methanol zugesetzt und das Gemisch über Nacht im Kühlschrank stehengelassen. Der Rückstand, der durch Zentrifugieren (15 Minuten mit 1500 G) abgetrennt wurde, wurde anschließend in einem Liter
destilliertem Wasser gelöst. Das Methanol wurde unter vermindertem Druck bei Zimmertemperatur und
stetiger Wasserzufuhr zur Lösung abgezogen. Die verbliebene Flüssigkeit wurde der Gefriertrocknung unterworfen. Die Ausbeute betrug 8,0 g einer hellgrauen bis weißen, pulverigen Substanz.
In Tabelle 12 sind die Ergebnisse dieser Versuche zum Nachweis der antikarzinogenen Wirksamkeit des so
erhaltenen Mucopolysaccharids wiedergegeben, wobei auch die Ergebnisse für andere Mucopolysaccharide in
die Tabelle aufgenommen wurden, die nach demselben wie im vorstehenden beschriebenen Verfahren aus
anderen Arten der Polyporaceae erhalten worden waren.
| Tabelle 12 | Organismus | Elementar | H | Ausb. | Dosis | Wirkungs | Wirkungs | Typ(%) |
| Familie | analyse | auf | mg/kg | grad gegen | grad gegen | 90 | ||
| C | Zucker | festen Krebi | s festen Krebs | |||||
| 5,99 | basis | Sarcoma-180 vom Ehrlich- | 100 | |||||
| (%) | (%) | 60 | ||||||
| Daedaleopsis nipponica | 40,80 | 6,76 | 0,73 | 300 | 100 | |||
| Polyporaceae | Imazcki | 5,04 | 90 | |||||
| Trametes dickinsii Berk | 42,00 | 0,90 | 300 | 100 | 60 | |||
| Polyporaceae | - Coriolus pargamenus | 39,46 | 6,79 | 0,18 | 300 | 60 | ||
| Polyporaceae - | (Fr.) Pat. | 6,05 | 90 | |||||
|
Tyromyces guttulatus
(Pk.) Murr. Cantharellus floccosus |
38,60 | 0,20 | 300 | 100 | ||||
| Polyporaceae | Schw. | 40,% | 5,59 | 0,46 | 300 | 60 | ||
| Polyporaceae | Polyporus tuberaster Fr. | |||||||
| 39,19 | 0,78 | 300 | 80 | |||||
| Polyporaceae | ||||||||
Claims (5)
1. Polysaccharid mit Antitumoraktivität, das unter normalen Bedingungen fest, amorph, wasserlöslich,
nicht hygroskopisch und nicht dialysierbar ist und nur einen Flecken auf der Anodenseile bei der Durchiuh-
rung einer Elektrophorese mit einer Zelluloseacetatmembran bei 20—25 V/cm während 90 min in Natriumboratlösung zeigt, immer eine positive Glukosereaktion nach einer Hydrolyse mit 1 η Schwefelsäure zeigt,
wobei das Hydrolysat des Polysaccharide weder die Phenolreaktion mit Eisen(lll)chlorid noch die Fehlingsche Reaktion auf reduzierende Zucker gibt jedoch positiv auf die Anisaldehyd-Reaktion, dk Molisch-Reaktion, die Anthron-Reaktion, die Tryptophan-Schwefelsaure-Reaktion, die Anilia-Chlorwasserstoffsiure-Re-
aktion, die Resorcin-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion. die Carbazol-Cystein-Schwefeisäare-Reaktion, die
Tollens-Reaktion und die Thioglycolschwefelsäure-Reaktion reagiert, und das aus einem flüssigen Myzel-Extrakt eines Pilzes der Klasse Basiodiomycetes oder aus einer Kultcrbrühe dieses Pilzes dadurch erhältlich ist,
daß man als Basidiomycetespilz einen solchen aus der Familie Polyporaceae einsetzt, das Polysaccharid rois
den flüssigen Extrakt, der durch Extraktion des Myzels durch Wasser oder sir^ij wäßrigen Lösungsmittel
unterhalb 1200C erhalten worden ist, oder aus der konzentrierten Kulturbrühe ausfällt, indem man mit
Ammoniumsulfat versetzt den erhaltenen Niederschlag wieder in Wasser auflöst die wäßrige Lösung in an
sich bekannter Weise weiter reinigt, wobei man sie einer Kombination von zumindest einer Dialyse und
wenigstens einer Säurebehandlung oder Ultrafiltration oder wenigstens einer Ultrafiltration und/oder wenigstens einem Ionenaustausch unterwirft die so erhaltene Lösung zur Isolierung des Polysaccharids kon-
zentriert und den Rückstand trocknet oder das Polysaccharid aus der wäßrigen Lösung mit einem hochgradig polaren organischen Lösungsmittel ausfällt und den gebildeten Niederschlag trocknet
2. Polysaccharid nach Anspruch 1 aus einem flüssigen Extrakt der durch Extraktion des Myzels des Pilzes
mit heißem Wasser oder einem heißen wäßrigen Lösungsmittel bei einer Temperatur zwischen 60 und 100° C
erhalten worden ist
3. Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharids mit Antitumoraktivität gemäß Anspruch 1 aus einem
flüssigen Myzelextrakt eines Pilzes der Klasse Basidiomycetes oder aus einer Kulturbrühe dieses Pilzes
durch Ausfällung und Reinigung, dadurch gekennzeichnet daß man als Basidiomycetespilz einen solchen aus
der Familie Polyporaceae einsetzt, das Polysaccharid aus dem flüssigen Extrakt, der durch Extraktion des
Myzels mit Wasser oder einem wäßrigen Lösungsmittel unterhalb 1200C erhalten worden ist, oder aus der
konzentrierten Kulturbrühe mit Ammoniumsulfat ausfällt, den erhaltenen Niederschlag wieder in Wasser
auflöst, die wäßrige Lösung in an sich bekannter Weise weiterreinigt wobei man sie einer Kombination von
zumindest einer Dialyse und wenigstens ein*;r Saurebe^ialung oder Ultrafiltration oder wenigstens einer
Ultrafiltration und/oder wenigstens einem lonenau1· <u«<.ch unterwirft,die so erhaltene Lösung zur Isolierung
des Polysaccharids konzentriert und den Rücksiaru trocknet oder das Polysaccharid aus der wäßrigen
Lösung mit einem stark polaren organischen i^ösungsmittel ausfällt und den gebildeten Niederschlag trock
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen flüssigen Extrakt verwendet der
durch Extraktion der Myzelien des Pilzes mit heißem Wasser oder einem heißen wäßrigen Lösungsmittel bei
einer Temperatur zwischen 60 und 1000C erhalten worden ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Fällung mit Ammoniumsulfat eine Vorfällung mit Äthanol durchführt und den Niederschlag in Wasser auflöst und dann mit Ammoniumsulfat fällt.
6. Verwendung des Polysaccharids nach Anspruch i als Wirkstoff in Ar'.itumormitteln.
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