DE2440529A1 - Hyaluronidase-proeparat aus menschlicher plazenta und verfahren zu seiner gewinnung - Google Patents
Hyaluronidase-proeparat aus menschlicher plazenta und verfahren zu seiner gewinnungInfo
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Description
" Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta und Verfahren zu seiner Gewinnung "
Priorität: 28. August 1973, Japan, Nr. 97 066/73
Hyaluronidase ist eine Gruppe von Enzymen,die Hyaluronsäure
spaltet. Dieses Enzym kommt in der Natur verbreitet vor, beispielsweise in Testikeln von Säugetieren, Leber und Milz,
Schlangengiften und bestimmten Bakterien. Es ist bekannt, daß dieses Enzym insbesondere in Testes von Säugetieren in verhältnismäßig
großen Mengen vorliegt, und gewöhnlich werden zu
seiner Gewinnung Testes verwendet; vgl. Ullmanns Enzyklopädie
der technischen Chemie, 3. Auflage, Bd. 7 (1956), S. 402-403.
Hyaluronidase wirkt als Ausbreitungsfaktor ("spreading factor") in Haut und Bindegewebe. Hyaluronidase wird in der Human- und
Veterinärmedizin zur Erleichterung und Beschleunigung der subkutanen Infusion auch größerer Fliissigkeitsmengen (Salz- oder
Glucose Lösungen, Plasma) verwendet. Auch andere Injektionen
worden erleichtert und oft in Lhror i/lrksaiakot t gesteigert,
z.U. bei Aruer. Lhet i:-.n , AntibLo t Lca, Antiseren und !Umtgenkon-
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COPY
BAD ORIGINAL
trastmitteln. Auch die Wirkung von Aerosolen zur Inhalation wird oft durch Hyaluronidasezusatz verstärkt.
Hyaluronidase-Präparate aus den vorgenannten Quellen können bei ihrer Verabfolgung durch Injektion erhebliche Nebenwirkungen
infolge ihres Gehalts an heterogenen Proteinen hervorrufen.
Über die Gegenwart von Hyaluronidase in menschlichem Plazentagewebe
sowie die physiologische Bedeutung und die klinische Rolle des Enzyms ist bis jetzt noch wenig veröffentlicht worden;
vgl. F. Scarpa, A. Panazzolo, M. Tanfema und P.F. Pavetto, BoIl. Soc. Ital. Biol. Sper., Bd. 45 ,(1969),
Seiten 217 bis 220, I.P. Homenyuk, Pediatr. Akush. Hinekol.
Bd. 34 (2) (1972), Seiten 44 bis 46,und N.P. Rudyuk,
Nekotorye, Vopr. Patol. Beremennosti i Rodov, Vinnitsk,
Med. Inst. Vinnitsa, i960, Nr. 2, Seiten 251 bis 258.
Bis jetzt sind keine Veröffentlichungen über die Isolierung oder Gewinnung von Hyaluronidase aus menschlicher Plazenta
bekannt geworden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Hyaluronidase-Präparat
zu schaffen, das bei parenteraler Verabfölgung an
Menschen keine störenden Nebenwirkungen infolge eines Gehalbes
von heterogenen Proteinen hervorruft. Eine weitere Aufgabe dor
Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung dieser
Hyaluronidase aus leicht zugänglichen Quellen ?u schaffen. Die
Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Überraschender= Beuui'i,
daß menschliche Plazenta Hyaluronidase in verbal t:a L Im-VAl^
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großen Mengen enthält und leicht aus Plazentagewebe isoliert werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta mit einem Molekulargewicht von etwa
70 000, einem isoelektrischen Punkt von etwa 5,2, einem pH-Optimum von 3,6 bis 4,0 und einer Stabilität von mindestens
24 Stunden in wäßriger Lösung bei Temperaturen unterhalb 30 C
und einem pH-Wert von 6 bis 7. . .
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung des
Hyaluronidase-Präparats, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man menschliches Plazentagewebe mit einer wäßrig-alkalischen
Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 10,5 extrahiert, aus dem erhaltenen Extrakt die Globulinfraktioh isoliert, die Globulinfraktion
an einem Anionenaustauscher adsorbiert, der mit einer 0,005 bis 0,01 molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert
von 6,0 bis 8,5 äquilibriert worden ist, die adsorbierte Hyaluronidase mit einer Pufferlösung erhöhter Molarität und/
oder erniedrigtem pH-Wert eluiert und die erhaltene Hyaluronidase-Fraktion der Gelfiltration unterwirft.
In der Praxis wird das erfindungsgemäße Verfahren folgendermaßen durchgeführt:
Frische oder gefrorene menschliche Plazenta wird gegegebenenfalls
nach dem Waschen zur Entfernung von Blut im Fleischwolf zerkleinert und mit einer wäßrig-alkalischen Lösung mit einem
pH-Wert von 7,5 bis 10,5 homogenisiert. Alle Arbeitsgänge werden
vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb 50C durchge-
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COPV
führt. Unlösliche Stoffe werden abfiltriert oder abgeschleudert. Man erhält einen klaren Extrakt. Durch die Extraktion
mit der wäßrig-alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 10,5 wird die Hyaluronidase in maximaler Ausbeute gewonnen
und in diesem pH-Bereich ist das Enzym während der Extraktion stabiler als in saurem Medium.
Als Base für die wäßrig*-alkalische Lösung können Ammoniumhydroxid,
Natriumhydroxid, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, verschiedene Salze der Borsäure und vorzugsweise alkalische
Puffersubstanzen verwendet werden, die die vorgenannten basisch reagierenden Verbindungen enthalten.
Aus dem erhaltenen klaren Extrakt wird in an sich bekannter Weise durch Fraktionierung eine Globulinfraktion gewonnen. Beispielsweise
kann die Fraktionierung durch fraktionierendes Aussalzen mit Ammoniumsulfat, fraktionierende Fällung mit einem
wasserlöslichen Alkohol, durch Zinkacetat oder durch Elektrophorese erreicht werden. Auf diese Weise wird eine Trennung
von Hemoprotein, wie Hemoglobin, und gefärbten Proteinen erreicht.
Das günstigste Fraktionierungsverfahren ist die fraktionierende Fällung mit Ammoniumsulfat oder mit einem wasserlöslichen
Alkohol. Besonders gute Ergebnisse werden mit der fraktionierenden Fällung mit Ammoniumsulfat erhalten. Bei der
fraktionierenden Fällung mit Ammoniumsulfat wird der erhaltene Extrakt auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 eingestellt und mit
kristallinem Ammoniumsulfat oder einer konzentrierten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung unter kräftigem Rühren bis zu 40 bis
50prozentiger Sättigung versetzt. Die entstandene Fällung wird
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durch Zentrifugieren isoliert. Diese Fällung bzw. Globulinfraktion
enthält nahezu die Gesamtmenge an Hyaluronidase, die in
der eingesetzten Plazenta vorhanden war. Gleichzeitig sind große Mengen an Verunreinigungen, wie Heraoprotein im ursprünglichen
Plazentagewebe, wirksam abgetrennt worden. Ferner gelingt es auf diese Weise, das große Volumen des ursprünglichen
Extraktes auf ein kleines Volumen in Form einer Ausfällung zu reduzieren. Die fraktionierende Ausfällung mit Ammoniumsulfat
kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, da das Ammoniumsulfat auf das Enzym eine stabilisierende Wirkung und gleichzeitig
eine bakteriostatische Wirkung entfaltet.
Zur fraktionierenden Ausfällung mit einem wasserlöslichen Alkohol wird vorzugsweise Äthanol oder Isopropanol verwendet. Bei
Verwendung von Äthanol beträgt die Endkonzentration etwa 20 . bis 25 Prozent und der pH-Wert 6,5 bis 8,5. Obwohl die Fraktionierung
mit Äthanol gewöhnlich ziemlich genaue Bedingungen hinsichtlich der Temperatur, des pH-Werts und der Ionenstärke
erfordert, unterscheidet sich das Verfahren hinsichtlich Ausbeute und Reinheit nicht wesentlich von der Fraktionierung mit
Ammoniumsulfat.
Die als Fällung erhaltene Globulinfraktion ist durch blutdrucksenkende
Faktoren, blutähnliche Substanzen, Hemoproteine und andere Substanzen noch erheblich verunreinigt. Sie muß daher
weiter gereinigt werden. Zur Abtrennung dieser Verunreinigungen
wird die Globulinfraktion mit einem Anionenaustauscher be·=·
handelt, an dem die Hyaluronidase selektiv adsorbiert wird.
Zu diesem Zweck wird die erhaltene Fällung in einer geringen
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Menge Wasser gelöst und das in der Lösung vorhandene Ammoniumsulfat
wird durch Dialyse gegen Wasser abgetrennt. Sodann wird das. Dialysat mit einem Anionenaustauscher zusammengebracht.
Die selektive Adsorption der Hyaluronidase wird so durchgeführt, daß man das Dialysat mit dem Anionenaustauscher bei
einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 in einer Pufferlösung verminderter Molarität von etwa 0,005 bis 0,01 molar zusammenbringt.
Das Dialysat wird also mit einem etwa 0,005 bis
0,01 molarem Puffer, wie Phosphatpuffer oder Tris-(hydroxyraethyl) ·
aminomethan-Puffer, bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 äquilibriert und auf eine mit einem Anionenaustauscher gefüllte
Säule gegeben, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Die Hyaluronidase im Dialysat wird auf diese
Weise selektiv am Anionenaustauscher adsorbiert.
Als Anionenaustauscher kann in dieser Stufe beispielsweise ein
Polysaccharidgel mit basischen Gruppen, wie Diäthylaminoäthyldextran (DEAE-Sephadex) und Diäthylaminoäthylcellulose
(DEAE-Cellulose), ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit
basischen Gruppen, wie Dowex 1, d.h. ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat
mit quartären Ammoniumgruppen, oder ein Phenol-Formaldehyd-Kondensat mit basischen Gruppen, wie Amberlite XE,
verwendet werden.
Danach wird der Anionenaustauscher mit der gleichen Pufferlösung
gewaschen, die zum Äquilibrieren verwendet wurde, um die nicht adsorbierten Verunreinigungen abzutrennen. Hierauf wird
die Hyärulonidase mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die jedoch,
eine erhöhte Molarität besitzt, beispielsweise 0,02 bis
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0,10 molar, bei gleichem oder niedrigerem pH-Wert, oder mit
einer Pufferlösung mit niedrigerem pH-Wert, beispielsweise 6,5 bis 5,0.
Die eluierte Hyaluronidase-Fraktion wird sodann der Gelfiltration
durch ein stark vernetztes Polysaccharidgel-Molekularsieb, wie Sephadex G-150 oder G-2oO (ein vernetztes Dextran), oder
Sepharose 6-B (Agarosegel) oder einem Polyacrylamidgel-Molekularsieb,
wie Biogel P-100 oder P-150, einem Acrylamid-Methylenbisacrylamid-Copolymerisat,
unterworfen. Das Filtrat kann lyophilisiert werden. Man erhält ein Hyaluronidase-Präparat
in Form eines weißen Pulvers.
Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wird ein Hyaluronidase-Präparat
mit befriedigenden Eigenschaften erhalten. Ein : Präparat mit höherer Aktivität kann dadurch hergestellt werden,
man ' .
daß/die aus dem Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst entweder mit einem Kationenaustauscher, der mit einer etwa
0,01 bis 0,05 molaren Pufferlösung bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 7 äquilibriert worden ist, oder mit einem Anionenaustauscher,
der der gleiche sein kann, wie er in dem vorstehend geschilderten Verfahren verwendet wurde und der mit einer etwa
0,1 bis 0,2 molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 7,0 äquilibriert worden ist, behandelt, um zunächst
unerwünschte Verunreinigungen selektiv zu adsorbieren und dadurch abzutrennen. · .
Als Kationenaustauscher kann beispielsweise ein Polysaccharidgel,
wie Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose), Carboxymethyl-
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dextran (CM-Sephadex), oder ein Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolymerisat,
wie Amberlite IRC-5O, verwendet werden. Die selektive Adsorption wird in an sich bekannter Weise durchgeführt.
In beiden Fällen wird die Pufferlösung, die durch den jeweiligen Ionenaustauscher geleitet wird, und die weiter gereinigte
Hyaluronidase enthält, mit dem Anionenaustauscher unter den vorgenannten Bedingungen zusammengebracht. Es wird eine besser
gereinigte Hyaluronidase-Fraktion erhalten, die anschließend der Gelfiltration unterworfen wird.
Die in der Globulinfraktion enthaltenen Verunreinigungen können auch mittels weniger vernetzter Molekularsiebe und unspezifischer
Adsorptionsmittel abgetrennt werden, um die wesentlichen Stufen zu erleichtern, d.h. das Zusammenbringen mit dem
Anionenaustauscher und die Gelfiltration. Zu .diesem Zweck wird die Globulinfraktion durch ein Molekularsieb, wie Sephadex
G-1OO oder G-150, geleitet, und in drei Fraktionen fraktioniert,
d.h. eine Fraktion, die Substanzen mit höherem Molekulargewicht enthält, die Produktfraktion, die Substanzen mit einem
Molekulargewicht von 50 000 bis 100 000 enthält, sowie eine Substanzen mit niedrigerem Molekulargewicht enthaltende Fraktion.
Die Produktfraktion kann mit einem unspezifischen Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle, Kaolin oder Hydroxylapatit,
zusammengebracht' werden. Die auf diese Weise erhaltene partiell gereinigte Fraktion kann sodann mit dem Kationenaustauscher
oder Anionenaustauscher nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren und anschließend nach dem eingangs beschriebenen Ver-
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fahren mit dem Anionenaustauscher behandelt und der Gelfiltration
unterworfen werden.
Überraschenderweise zeigt das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellte Hyaluronidase-Präparat keine Nebenwirkungen, wenn es dem Menschen injiziert wird.
Die Eigenschaften des Hyaluronidase-Präparats der Erfindung sind folgende:
Das Molekulargewicht beträgt etwa 70 000, der isoelektrische Punkt liegt bei 5,2 und das pH-Optimum bei 3,6 bis 4,0, bestimmt
mit Hyaluronsäure aus menschlicher Nabelschnur als Substrat. Das Enzym ist sehr stabil, wenn es unterhalb 300C in
wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 6 bis 7 aufbewahrt wird.
Hyaluronidase aus Stiertestikel hat ein Molekulargewicht von 110 000, einen isoelektrischen Punkt von 5,7 und ein pH-Optimum
von 4,0 bis 5,5. . .
Aus den vorstehend angegebenen Werten ist ersichtlich, daß sich das Hyaluronidase-Präparat der Erfindung aus menschlicher
Plazenta von Hyaluronidase aus Stiertestikel unterscheidet.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die Bestimmung der
Hyaluronidase-Aktivität wird nach einer modifizierten Methode
von N.N. Aronson", Jr. und E. A. Padidson, J. Bial. Chem.
Bd. 242 (3) (1967), Seiten 437 bis 440, und V. Patel,
A.L. Tappel und J0S. O'Brien, Biochem. Med., Bd. 3 (1972),.
Seiten 447 bis 457} durchgeführt. In einem Reagenzglas werden
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0,04 molare Acetatpuffer (pH 3,6), 0,15 molare Kochsalzlösung, 15Oy Natriumhyaluronat als Substrat und die Enzymlösung miteinander
vermischt. Das Gesamtvolumen beträgt 0,40 ml. Das Reaktionsgemisch wird 60 Minuten bei 370C inkubiert. Nach der
Inkubation wird das Reaktionsgemisch zum Abstoppen der enzymatischen Reaktion mit 50 ül 50prozentiger Trichloressigsäurelösung
versetzt. Ein anderes Reagenzglas wird zur Kontrolle ohne Zusatz von Enzym inkubiert und nach der Inkubierung unter den
gleichen Bedingungen mit Trichloressigsäure und dem Enzymextrakt versetzt. In Abwesenheit des Enzyms wird kein Abbau der
Hyaluronsäure beobachtet. Das mit Trichloressigsäure angesäuerte Reaktionsgemisch wird mit 50 ul einer Alkalilösung entsprechender
Konzentration neutralisiert. Gewöhnlich wird 3,4 η Natronlauge verwendet. Die Menge von N-Acetylhexosamin-Endgruppen,
die aus dem Substrat durch die enzymatische Reaktion abgespalten wurde, wird nach der Methode von Reissig,
Strominger und Leloir, J. Biol. Chem., Bd. 217 (1955), Seiten 959 bis 966, unter Verwendung von N-Acetylglucosamin als
Standard bestimmt. Eine Aktivitätseinheit von Hyaluronidase ist diejenige^Enzymmenge, die 1 uMol N-Acetylglucosamin aus
Hyaluronsäure bei 37°C/min freisetzt.
Gefrorene menschliche Plazenta, die in feuchtem Zustand 2676 g wiegt, wird in einem Fleischwolf zerkleinert und dreimal
in jeweils 10 Liter kalter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und filtriert, um anhaftendes'Blut sorgfältig abzutrennen.
Es werden 2071 g gewaschenes Plazentagewebe erhalten, das mit einem"Virtis 45 Homogenisator mit dem 2,5-fachen VoIu-.·■'■·
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men gekühlten 0,02 molaren Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) bei der
Höchstgeschwindigkeit des Schneidmessers 30 Sekunden homogenisiert wird. Es werden 5450 ml Homogenat erhalten. Das Homogenat
wird 2 Stunden stehengelassen und sodann 15 Minuten bei 9600 g zentrifugiert. Es werden 3950 ml eines klaren Uberstands
erhalten. Der Überstand wird mit 5 η Salzsäure unter kräftigem
Rühren auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Sodann werden 1290 g kristallines Natriumsulfat bei einer Temperatur von 0
bis 50C eingetragen. Man erhält eine etwa 50prozentige gesättigte
Lösung. Der pH-Wert der Lösung wird erneut überprüft und mit 1 η Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Hierauf wird die
Lösung 15 bis 18 .Stunden bei 0 bis 50C stehengelassen. Die
entstandene Fällung wird 15 Minuten bei 9600 g zentrifugiert
und in 200 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird gegen.Wasser in einem Hollow Fiber Dialyzer Concentrator Modell DC-2 dialysiert,
bis die Lösung frei von Sulfationen ist. Das Dialysat wird mit einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung (pH 8,2) äquilibriert
und auf eine mit DEAE-Cellulose gefüllte Säule mit den Abmessungen
4,5 χ 50 cm gegeben. Die DEAE-Cellulose wurde vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert. Sodann wird die Säule
mit dem gleichen Puffer gewaschen, um nicht absorbierbare Verunreinigungen
abzutrennen. Hierauf wird das Enzym mit 0,05 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,5) eluiert. Es werden 725 ml
Eluat erhalten, das durch Dialyse gegen Wasser entsalzt wird.
Die spezifische Aktivität des Enzyms beträgt 4,5 Millieinheiten
pro mg Proteine Der Reinigungsgrad auf der Stufe der Ammoniumsulfat-Fraktionierung
beträgt 1,8 und nach der Chromatographie an DEAE-Cellulose 10.
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Die vom Puffersalz befreite Hyaluronidase-Fraktion wird gefriergetrocknet
und in 0,01 molarem Tris-Puffer (pH 7,0) gelöst.
Diese Lösung wird der aufsteigenden Gelfiltration mit Sephadex G-200 unterworfen. Das Eluat wird in 2 ml Fraktionen
aufgefangen, die Hyaluronidase-Fraktionen werden vereinigt und durch Dialyse gegen Wasser entsalzt. Danach wird das Dialysat
gefriergetrocknet. Es werden 20,8 mg stark gereinigte Hyaluronidase mit einer spezifischen Aktivität von 17,2 Millieinheiten
pro mg Protein erhalten. Der Reinigungsgrad bei Verwendung von Sephadex G-200 beträgt 3,8.
Das erhaltene Hyaluronidase-Präparat hat ein Molekulargewicht von etwa 69 000, bestimmt durch Gelfiltration, und einen isoelektrischen
Punkt von 5,19. Das Präparat ist bei 300C in
für mindestens 24 Stunden wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 6,5/stabil. Bei 30 minütiger
Inkubation bei 600C und beim gleichen pH-Wert gehen
90 Prozent der ursprünglichen Aktivität verloren. Andererseits zeigt das Präparat keinen Aktivitätsverlust bei mindestens
5-maligem wiederholtem Gefrieren und Auftauen. Ferner ist das
Präparat stabil bei 00C in wäßriger Lösung vom pH-Wert 4 bis
7,6.
1,5 kg gemäß Beispiel 1 hergestelltes gewaschenes Plazentagewebe wird zusammen mit dem 2,5-fachen Volumen Wasser in einem
hochtourigen Schneidmischer homogenisiert. Das erhaltene Homogenisat
wird mit 2 η Natronlauge unter kräftigem Rühren auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt und 1 Stunde stehengelassen.
Sodann wird das Gemisch unter vermindertem Druck durch ein
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Filtertuch filtriert und der pH-Wert des Filtrats mit 2 η Natronlauge
auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Lösung wird mit kristallinem Ammoniumsulfat bis zur 45prozentigen
Sättigung versetzt und die entstandene Fällung nach mehrstündigem Stehen 20 Minuten bei 6800 g abzentrifugiert. Die Fällung
wird in wenig Wasser gelöst und die Lösung zur Abtrennung von Ammoniumsulfat gegen V/asser dialysiert. Das Dialysat wird
mit 0,01 molarer Phosphatpufferlösung (pH 6,0) äquilibriert und anschließend auf eine mit CM-Sephadex (C-5Q) gefüllte
Säule mit den Abmessungen 3 χ 80 cm gegeben, der vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert wurde. Sodann wird mit
dieser Pufferlösung eluiert. Das Eluat wird aufgefangen. Ein großer Teil der nicht-aktiven Globulinähnlichen Proteine
bleibt an der CM-Sephadex-Kolonne adsorbiert. Im Eluat liegt
partiell gereinigte Hyaluronidase vor. Die nicht-adsorbierte. Fraktion wird mit 0,01 molarem Tris-Puffer (pH 8,0) äquilibriert
und auf einem mit DEAE-Sephadex (A-50) gefüllte Säule
mit den Abmessungen 2 χ 15 cm gegeben, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Es wird mit 0,05 molarer
Tris-Pufferlösung (pH 7,0)eluiert und das Eluat gefriergetrocknet.
Es werden 30 mg partiell gereinigte Hyaluronidase mit einer spezifischen Aktivität von 11,2 Millieinheiten pro
mg Protein erhalten. Der Reinigungsgrad bei Verwendung von CM-Sephadex beträgt 3,5 und von DEAE-Sephadex 8,5.
30 mg des Enzympräparats werden in 2 ml einer O;15 molaren
Phosphatpufferlösung (pH 6,5) gelöst und der ansteigenden Gelfiltration
an Sephadex G-200 unterworfen. Die abfließende Lösung wird in 2 ml Portionen aufgefangen. Die -Hyaluronidase-
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Fraktionen (enzymatisch festgestellt) werden vereinigt und durch Dialyse gegen Wasser entsalzt. Danach wird das Dialysat
gefriergetrocknet. Es werden 15,7 g hochgereinigte Hyaluronidase mit.einer spezifischen Aktivität von 19,8 Millieinheiten
pro mg Protein erhalten. Die Hyaluronidase hat ein Molekulargewicht von 72 000 und einen isoelektrischen Punkt
von 5,21.Das Präparat hat die gleiche Stabilität wie das gemäß
Beispiel 1 hergestellte Präparat.
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Claims (13)
1. Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta mit
einem Molekulargewicht von etwa 70 000, einem isoelektrischen Punkt von etwa 5,2, einem pH-Optimum von 3,6 Ms 4,0 und einer
Stabilität von mindestens 24 Stunden in wäßriger Lösung bei Temperaturen unterhalb 300C und einem pH-Wert von 6 bis 7.
2. Hyaluronidase-Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß es in Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegt.
3. Verfahren zur Gewinnung des Hyaluronidase-Präparats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliches
Plazentagewebe mit einer wäßrig-alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 10,5 extrahiert, aus dem erhaltenen Extrakt
die Globulinfraktion isoliert, die Glo-bulinfraktion an einem
Anionenaustauscher adsorbiert, der mit 0,005 bis 0,01 molarer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5 äquilibriert
worden ist, die adsorbierte Hyaluronidase mit einer Pufferlösung erhöhter Molarität und/oder erniedrigtem pH-Wert eluiert
und die erhaltene Hyaluronidase-Fraktion der Gelfiltration unterwirft und gegebenenfalls die erhaltene Hyaluronidase-Lö- *
sung gefriertrocknet.
4„ Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man
die aus dem Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst mit einem Kationenaustauscher behandelt, der mit einer 0,01 bis
0,05 molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 bis 7
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äquilibriert worden ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus dem Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst
mit einem Anionenaustauscher behandelt, der mit einer 0,1 bis Ο;2 molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 7,0
äquilibriert worden ist.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Globulinfraktion aus dem Extrakt mit Ammoniumsulfat
bis zu 40 bis 45 Prozent Sättigung bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 fraktioniert aussalzt und die entstandene Fällung
isoliert.
7. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die Globulinfraktion aus dem Extrakt mit einem wasserlöslichen
Alkohol bis zu 20 bis 25prozentiger Sättigung bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 ausfällt und die entstandene
Fällung isoliert.
8. Verfahren nach Anspruch 3t dadurch gekennzeichnet, daß
man sämtliche Verfahrensschritte in feuchtem Zustand bei Temperaturen unterhalb 5°C durchführt.
9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Anionenaustauscher ein Polysaccharidgel mit basischen
Gruppen, ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisatgel mit basischen Gruppen oder ein Phenol-Formaldehyd-Kondensat mit basischen
Gruppen verwendet.
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10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Anionenaustauscher ein Piathylaminoathyldextrangel
(DEAE-Sephadex), eine Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose),
ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit quartären Ammoniumgruppen (Dowex 1) oder ein Phenol-Formaldehyd-Polyamin-Kondensat
(Amberlite XE) verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gelfiltration ein stark vernetztes Polysaccharidgel-Molekularsieb,
wie Sephadex G-150 oder Sephadex G-200, ein Polyacrylamidgel-Molekularsieb, wie Biogel P-30, oder ein
Agarosegel-Molekularsieb, wie Sepharose 6-B, verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Kationenaustauscher Carboxymethylcellulose
(CM-Cellulose), Carboxymethyldextran (CM-Sephadex) oder
ein Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolymerisat (Amberlite
IRC-50) verwendet.
(CM-Cellulose), Carboxymethyldextran (CM-Sephadex) oder
ein Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolymerisat (Amberlite
IRC-50) verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
man die aus dem Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst mit einem Anionenaustauscher der gleichen Art behandelt, wie .·
er anschließend bei der Adsorption der Globulinfraktion verwendet
wird.
5098U/1124
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