DE2429191A1

DE2429191A1 - Isolierung von koagulationsfaktoren aus biologischem material

Info

Publication number: DE2429191A1
Application number: DE2429191A
Authority: DE
Inventors: Lars-Olov Andersson; Hakan Gunnar Borg; Elisabeth Charlotte Ehrenberg; Nanna Forsman; Gunnat Hanshoff; Goeran Dipl Ing Lindroos; Maggie Miller-Andersson
Original assignee: Kabi AB
Current assignee: Phadia AB
Priority date: 1973-06-19
Filing date: 1974-06-18
Publication date: 1975-01-16
Also published as: DK141274C; GB1460607A; ES427365A1; NO742216L; AU7020674A; FR2234312B1; US3920625A; IL44828A0; DK141274B; ZA743896B; FR2234312A1; FI183974A; DK324374A; SE7407445L; JPS5035307A

Description

Isolierung von Koagulationsfaktoren aus biologischem Material

Die Blut-Koagulationsfaktoren I (Fibrinogen), VIII (antihämophjler Paktor ( abgekürzt AHP) und Paktor IX (auch als B-Faktor bezeichnet) werden in hohen Ausbeuten aus tierischem Material wie Blut oder Blutprodukten (z.B.Plasma) oder Plasmafraktionen isoliert oder der B-Paktor wird in reiner Form aus einem B-Faktor-Konzentrat erhalten durch ein Verfahren, das die wesentlichen Stufen der Adsorption {z.B. bei der Affinitätschromatographie) mindestens eines dieser Faktoren in einem flüssigen System an einer wasserunlöslichen Gelmatrix umfaßt, die hauptsächlich aus einem vernetzten sulfoniertem gelbildenden Kohlenhydrat wie vernetzten! Dextransulfat-Agarose, vernetzten Dextransulfat-Dextran, vernetztem Heparin-Agarose und anderen derartigen^ eine Gelmatrix bildendeüSubatanzen, zum Beispiel Benzidln-2,2-disulfonsäure-Agarose besteht.

x) aπIfatierem oder

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In den letzten Jahren wurden große Forschungganstrengungen unternommen, um den Mechanismus der Blut-Koagulation aufzuklären und die daran beteiligten Bestandteile zu isolieren. Das große Interesse an der Blut-Koagulation beruht zum Teil auf dem wissenschaftlichen Interesse an dem System als solchem. In erster Linie ist die Kenntnis darüber, wie die Blut-Koagulation voi/sichgeht und wie sie beeinflußt werden kann, vom klinischen Standpunkt aus von außerordentlichem Interesse. Es bestehen noch eine Anzahl von Unklarheiten bezüglich des Mechanismus der Blut-Koagulation. Es ist jedoch unbestritten, daß die Blut-Koagulation als ein Prozeß beschrieben werden kann, bei dem die Aktivierung einer Spuren vorhandenen Komponente gefolgt wird von einer aufeinanderfolgenden Aktivierung einer Anzahl von Komponenten, die gegebenenfalls zur Bildung eines Klumpens bzw. Pfropfens führt. Dadurch führt eine verhältnismäßig kleine Anfangswirkung zu einem deutlichen Endeffekt in Abhängigkeit von einer Multiplizierungswirkung, die in dem System auftritt.

Bisher konnten jedoch nur einige wenige der verschiedenen Komponenten_fdie an dem Blut—Koagulationssystem beteiligt Bind, in reinem Zustand isoliert werden. Diese Komponenten werden im allgemeinen als Koagulationsfaktoren bezeichnet

und es wird angenommen, daß es 12 davon gibt, von denen jeder durch eine römische Ziffer bezeichnet wird, das heißt

von der Paktor I, Paktor II usw. entsprechend der International Commission on Haemostasia and Thrombosis (Thromb. Diathes, Haemorrhag. Suppl. 13, 196+)angegebenen Nomenklatur.

In Zusammenhang mit den Koagulationefaktoren müosen noch ewei weitere Systeme erwähnt werden. Einesvon ihnen ist das System der Hemmstoffe, das die Neigung des Blutes zu koagulieren steuert und die Bildung von Thromben verhindert. Dieses System enthält u.a. Antithrombin III, einen Hemmstoff für den Paktor Xa und einen Hemmstoff für den Paktor XI

fit

Das andere ist das System, das eine Lösung eines möglicher« weise entstandenen Thrombus ermöglicht und üblicherweise

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als fibrinolytiecheo System bezeichnet wird. Es umfaßt Plasmin und Plasminogen als wichtige Bestandteile.

Der Koagulationsfaktor I, das heißt Fibrinogen, ist (1.) das Strukturelement, das das Gel bildet, das bei der Koagulation von Blut oder Plasma entsteht und (2.) ein Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 340000. Seine Konzentration in dem Plasma beträgt ungefähr 2 mg/ml Plasma. Während des Blut-Koagulationsprozesses wird ein Enzym gebildet, nämlich Thrombin, das die Peptide von dem Fibrinogen hydrolytisch abspaltet. Die Abspaltung dieser Peptide von dem Fibrinogen führt dazu, daß das Zuletztgenannte seine Struktur ändert und beginnt ein Aggregat zu bilden. Diese Aggregatbildung führt zur Bildung eines Gels, d.h. eines Klumpens oder Pfropfens.

Fibrinogen wird klinisch angewandt, um bestimmte Arten von Blutungen zu stillen. Es ist verhältnismäßig schwierig, Fibrinogen für klinische Zwecke herzustellen bzw. zu gewinnen. Da Fibrinogen ein verhältnismäßig empfindliches Molekül ist, müssen die bei seiner Bildung angewandten Fraktionierungsverfahren sehr mild sein. Die größte Schwierigkeit besteht darin, ein Fibrinogen mit einer hohen Koagulationsfähigkeit zu erhalten, das gleichzeitig eine gute Stabilität in wässriger Lösung besitzt. '

Der KoagulationsfaktorTHI_/der antihämophile Faktor (kurz als AHF bezeichnet) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 1 Million. Er ist in sehr kleinen Mengen im Blutplasma vorhanden. Seine normale Konsentration beträgt ungefähr 10vug/ml Plasma. Einer der bekanntesten erblichen Koagulationsdefekte ist gekennzeichnet durch die Abwesenheit des biologisch wirksamen Faktors VIII (AHF)· Dieser Defekt ist die klassische Hämophilie oder Hämophilie A (Bluterkrankheit Schwere Hämophilie zeigt sich in einer starken Blutungsneigung, wobei die geringste Verletzung zu einer tödlichen Blutung führen kann·

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Diese Krankheit tritt schon in sehr jungen Jahren auf und es können verschiedene Komplikationen auftreten.Häufig tritt bei den Patienten eine Blutung der Gelenke auf, die zu einer Entzündung (an den Gelenken) und auf lange Dauer zur Invalidität führt. Das führt dazu, daß die meisten der schweren Bluter schon in einem Alter von 20 Jahren todkrank sind, wenn sie nicht mit AHF-haltigen Mittel behandelt werden.

Die Therapie, die zur Behandlung von Hämophilie angewandt werden kann, ist die Transfusion von ganzem (menschlichen) Blut oder Plasma oder sogar von verschiedenen Konzentraten, die AHF enthalten. Die medizinischen Vorteile bei der Anwendung solcher Konzentrate sind offensichtlich. Die zur Zeit verfügbaren AHF-Konzentrate können in zwei unterschiedliche Gruppen eingeteilt werden und zwar teilweise hochkonzentrierte und teilweise wenig konzentrierte Zubereitungen. Die zur Zeit am häufigsten angewandten Mittel sind niedrig-konzentriert. Beispiele hierfür sind Kryopräzipitate nach Pool (Pool J., Hershogold, E.K.,Pappenhagen,A., Nature 203 (1964) S. 312), und Cohn-Praktion 1-0 (Blombäck, M.Arkiv Kemi 12(1958) S.387).

Diese beiden wenig konzentrierten AHP-Zubereitungen enthalten beaahtliche Mengen an Fibrinogen. Der Nachteil derartiger Zubereitung besteht darin, daß die Patienten verhältnismäßig große Mengen einer wässrigen Lösung durch Infusion verabreicht bekommen müssen. Später wurden bestimmte sogenannte hoch-konzentrierte AHF-Zubereitungen entwickelt. Mit diesen kann eine angemessene Dosis AHF in einer wässrigen Lösung ait einem Volumen von 10 bis 15 ml verabreicht werden. Ein derartiges AHF-Koηζentrat ist wesentlich leichter anzuwenden als die früheren Arten.

Klinisch scheinen die hoch-konzentrierten Zubereitungen gut zu wirken, sie besitzen jedoch auch bestimmte Nachteile. Vom Standpunkt der Isolierung ausgesehen, besteht ein Nachteil

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darin, daß die Ausbeute an AHF-Aktivität, bezogen auf das Ausgangsplasma, verhältnismäßig gering ist. Außerdem werden die anderen Proteine, die in den Franktionen vorhanden sind, aus denen AHP gewonnen wird, im allgemeinen nicht ausgenutzt. Schließlich erfordern diese Verfahren ein sehr gutes Ausgangsmaterial, das heißt das Blutplasma sollte frisch oder unmittelbar nach der Entnahme des Blutes und anschlies-3endeni Zentrifugieren gefroren worden sein.

Der Koagulationsfaktor IX ist auch als B-Faktor bekannt, da eine Art der Hämophilie, nämlich die Hämophilie 3 durch einen erblichen Mangel an dem Koagulationsfaktor IX hervorgerufen wird. Die Hämophilie B zeigt sich in einer stark erhöhten Blutungsneigung bei Verletzungen und chirurgischen Eingriffen. In schweren Fällen können große subkutane und intramuskuläre Hämatome auftreten. Gelenkblutungen mit sekundären GelBnkdeformationen und daraus entstehende Invalidität treten bei Hämophilie B ebenfalls häufig auf. Die Behandlung, die angewandt werden kann, besteht in verschiedenen Formen einer Substitutionstherapie, nämlich, der Transfusion von Blut, Plasma oder einigen der jetzt verfügbaren Faktor-IX-Konzentrat'e.

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Die Behandlung kann entweder prophylaktisch sein und unter anderem eine lange Zeit hindurch angewandt werden, um die Entwicklung der oben erwähnten Gelenkzerstörungen zu vermeiden oder sie kann im Zusammenhang mit Operationen,Zahnextraktionen und anderen Gelegenheiten durchgeführt werden, bei denen die Gefahr von Blutungen groß ist. Die zur Zeit möglichen Behandlungen besitzen zahlreiche Nachteile. Die Transfusion von Blut und Plasma umfaßt die Gefahr der Übertragung von Hepatitis und kann in gewissem Ausmaß zu einer Immunisierung führen. Bei den zur Zeit zur Verfügung stehenden Faktor-IX-Konzentraten besteht offensichtlich die Gefahr der Übertragung von Hepatitis.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es möglich,die oben genannten Nachteile zu überwinden. Die verschiedenen Verfahren, die erfindungsgemäß zur Isolierung der Koagulationsfaktoren I, VIII und IX angewandt werden können, umfassen alle die neue Stufe nach der einer oder mehrere dieser Faktoren aus einem wässrigen flüssigen System auf ein Adsorptionsmedium adsorbiert werden, das ein sulfatisiertes oder sulfoniertes vernetztes gelbildendes Kohlenhydrat ist. So werden die Faktoren an das Gel gebunden und auf diese Weise gereinigt. Bei der Reinigung oder Isolierung des Koagulationsfaktors VIII wird die sulfatierte Gelmatrix angewandt um* die überwiegende Fraktion, das heißt das Fibrinogen aus dem Ausgangsmaterial zu adsorbieren.

Ansätze, bei denen von Blutplasma ausgegangen wurde, zeigten, daß es unter geeigneten Bedingungen möglich war, Faktor I und Faktor IX nahezu quantitativ an das heparinhaltige Agarosegel zu binden, das heißt jeden dieser Faktoren getrennt.

Jeder dieser Faktoren I und IX wird dann eluiert, indem man das adsorbathaltige Gel mit einem Puffer eluiert, der sich in der Zusammensetzung von demjenigen unterscheidet, indem das Protein gelöst war. Variationen treten in der Reinheit der Ausgangsproteinfraktionen auf. Es werden jedoch wesentlich

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bessere Ergebnisse erhalten, wenn man als Ausgangsmaterial eine Cohn-Fraktion-I-Paste (Journal of the American Chemical Society, 1946, Band 48, Seite 459) anwendet und auch wenn man ein ein B-Faktor-Konzentrat anwendet.

Erfindungsgemäß können sowohl Koagulationsfaktor I als auch Koagulationsfaktor VIII isoliert werden, das heißt nacheinander aus dem gleichen Ausgangsmaterial, zum Beispiel aus Cohn-Fraktion-1-0 oder einem Kryopräzipitat (Pool et al, s.o.)· Zum Beispiel zeigten Ansätze, die in dieser Phase des erfindungsgemäßen Verfahrens Dextransulfat-Agarose

(als Agarose besonders Sepharose 4B_fein perlenförmiges Agarosegel, das erhalten worden ist, indem man eine 4 %±ge Agaroselösung zur Gelbildung in Perlenform bringt (Pharmacia Fine Chemicals of Piscataway, N.J., U.S.A. und Uppsala, Schweden) ) verwendeten, daß es möglich war, den Hauptteil des Fibrinogens an dem Gel zu adsorbieren, wobei die AHF-Aktivität in der(nicht adsorbierten) Lösung nahezu quantitativ zurückbleibt.

Anschließend wird das Gel abgetrennt und das in der Lösung vorhandene AHF nach bekannten Verfahren ausgefällt (z.B. a.a.O., Seite 4, Zeilen 13-14, in Pool, Hershgold und Pappenhagen). Anschließend kann eine hoch konzentrierte Lösung von AHF erhalten werden, indem man diesen Niederschlag in einer kleinen Menge eines gepufferten Proteinlösungsmittels löst. Das Fibrinogen kann von dem Dextransulfat-Sepharosegel durch einen Puffer mit zunehmender Ionenstärke eluiert werden (z.B. durch Zugabe von Natriumchlorid zu einer Lösung, die der nicht-adsorbierten Lösung entspricht). Dieses Fibrinogen kann anschließend ausgefällt werden und daraus eine hoch konzentrierte Lösung hergestellt werden.

Ein derartiges Verfahren besitzt zahlreiche Vorteile verglichen mit den früher angewandten Verfahren zur Gewinnung hoch konzentrierter AHF-Zubereitungen. Zum Beispiele ist

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vor allem die Ausbeute an AHF wesentlicher größer.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß neben der hohen Ausbeute an AHF das von der Gelmatrix bei dem gesamten Isolierungsverfahren eluierte Fibrinogen ebenfalls verwendet werden kann. Ein weiterer deutlicher Vorteil besteht darin, daß selbst älteres Blut oder Blutplasma für das Verfahren als Ausgangsmaterial sowohl zur Gewinnung von AHF als auch von Fibrinogen angewandt werden kann.

Bei der Herstellung von Faktor-IX-Zubereitungen wurde ein Faktor-IX-Konzentrat als Ausgangsmaterial angewandt, daß dem Zentrifugat der Cohn-Fraktion-I (Methode 6) hergestellt worden war durch Adsorption des Faktors IX zusammen mit verschiedenen anderen Proteinen an DEAE-Sephadex (einem mit Epichlorhydrin vernetzten Diäthylaminoäthyldextran in Perlenform der Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J., U.S.A. und Uppsala, Schweden). Die Herstellung dieses Konzentrates ist im einzelnen beschrieben von Tullis u.a. (New England Journal of Medicine, Band 273, Seite 667, 1965). Der Koagulationsfaktor IX wurde aus diesem Konzentrat _an . Heparin-Sepharose-4B-Gel oder ein ähnlich wirkendes Gel(wie später kurz erklärt) adsorbiert und von dem Gel durch Änderung des gepufferten Proteinlösungsmittels zum Beispiel durch Erhöhung seiner Ionenstärke von ungefähr 0,06 m auf ungefähr 2 m Natriumchlorid eluiert. Der so erhaltene Faktor IX zeigt die Spuren einer weiteren Komponente, wie aus der Immunoelektrophorese hervorgeht. Eine weitere Fraktionierung durch Gelfiltration mit Hilfe von Sephadex G-150 (einem mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran in Perlenform zur Gelfiltrationschromatographie mit einem Vassergehalt von 15 ml/g, das heißt mg/g trockener Perlen_fder Pharmacia Fine Chemicals) ergab jedoch vom immunologischen Standpunkt aus ein reines Produkt.

Ee wurde jedoch noch dne gewisse Heterogenität bezüglich des Molekulargewichts beobachtet. Weitere Untersuchungen zeigten, daß das auf der Tatsache beruhte, daß das Pr parat sowohl

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den aktivierten Faktor K, als auch die nicht aktivierte Form enthielt. Der nicht aktivierte Faktor IX besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 80 000 und der aktivierte Faktor von ungefähr 50 000. Bei Zugabe von 0,002 rn p-Aminobenzamidin (einem Proteasehemmstoff) zu dem zur Lösung des Proteinausgangsmaterial angewandten Puffer vor dem Vermischen der Lösung mit dem Adsorbtionsgel wurde ein Faktor-IX-Präparat erhalten, das vollständig frei war von aktiviertem Faktor IX

. und nur den reinen Faktor IX in nicht aktivierter Form enthielt.

Beispiele für wasserunlösliche Gelmatrices, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, sind solche die Sulfatgruppen an einem gelbildenden Polysaccharid enthalten, das mit einer anderen Polysaccharidgruppe wie vernetztet DextransulfatAgarose, vernetzten Dextransulfat-Dextran, vernetztea Heparin-Agarose, vemetzter Chondroitinsulfat-Agarose und vernetzte Dextransulfat^pichlorhydrin-Agarosesverbunden und solche, die hauptsächlich aus Benzidindisulfonsäure bestehen, die mit einer Polysaccharidgruppe verbunden ist, wie Benzidin-2,2-disulfonsäure-Agarose und Benzidin-2,2-disulfonsäure-Dextran. Das üblichste Verfahren zur Herstellung dieser Gelmatrices besteht darin, daß man die Vernetzung durch Anwendung von Cyanogenbromid bei einem alkalischen pH-Wert durchführt. '

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

AHF und Fibrinogen isoliert von Cohn-Fraktion-1-0 durch Adsorption des Fibrinogens an vernetzten» Dextransulfat-Agarose-Gel

Herstellung von vernetzten^ Dextransulfat-Agarose-Gel unter An wendung von Sepharose-4B-Agarose:

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35 g Cyanogenbromid wurden in 500 ml Wasser gelöst und 30 g Dextransulfat zugegeben. Ungefähr 1000 ml Sepharose-4B-GeI und 300 ml Wasser wurden zugegeben und alles gut vermischt. Das Gemisch wurde unter Rühren stehengelassen und der pH-Wert 7 min durch Zugabe von Lauge auf 11 gehalten. Dann wurde die Zugabe von Lauge abgebrochen und der pH-Wert fiel langsam. Es wurde weitere 48 h bei Raumtemperatur gerührt und das Gel anschließend gewaschen. Das vernetzte Dextransulfat-Sepharose-4B-GeI war dann fertig.

Fraktionierung von Fibrinogen und AHF aus Cohn-Fraktion 1-0:

Ungefähr 10 g gefriergetrocknete (d.h. lyophilisierte) Cohn-Fraktion 1-0 aus frisch gefrorenem Plasma,enthaltend ungefähr 1500 Einheiten AHF wurden in 1500 ml 0,02 m Citratpuffer (pH 6,8) gelöst. JTOOO ml trocken filtriertes Dextransulfat-Sepharose-4B-GeI wurde zu der Lösung gegeben und das Gemisch 30 min gerührt. Das Gel wurde dann abgetrennt und mit 200 ml Citratpufferlösung gewaschen. Die nicht adsorbierte Lösung und die Waschflüssigkeit wurden zusammengegeben. Die Analyse zeigte, daß die gemischte Lösung 6 % der ursprünglichen Proteinmenge und 65 % des AHF-aktiven Materials aus der Ausgangs-Cohn-Fraktion 1-0 enthielt. Das AHF wurde durch Zugabe von Natriuracltrat bei pH 7,1 zu der gemischten Lösung ausgefällt. Beim Lösen von 0,4 g dieses AHF-Niederschlags in ungefähr 35 ml Glycin-NaCl-Phosphat-Puffer (pH 6,9) erhielt man eine Lösung mit einer spezifischen Aktivität von 21 AHF-Einheiten/ml. Die gesamte Ausbeute an AHF aus der Cohn-Fraktion 1-0 betrug 55 %· Die Desorption des an das Gel gebundenen Fibrinogens wurde durchgeführt durch Eluieren mit 2 m NaCl-Lösung. Der größte Teil des Fibrinogengehalts der Ausgang3-Cohn-Fraktion wurde zurückgewonnen.

Die AHF-Analyse wurde durchgeführt nach J.J. Veitkampf et al,, Thromb, Diath. Haemorrhag. 19-20 (1968), Seite 279.

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Die Proteinkonzentration wurde bestimmt durch Messung der UV-Absorbtion bei 200 nm.

Beispiel 2

AHF und Fibrinogen aus Cohn-Fraktion-I-Paste aus altem (outdated) Plasma durch Adsorption des Fibrlnogens an Dextransulfat-ECD-Sepharose-Gel (ECD-Sepharose bedeutet mit Epichlorhydrin behandelte Agaroseperlen)

Ungefähr 1 1 Sepharose 4B wurde mit 1 1 1m Natriumhydroxid und 20 ml Epichlorhydrin und 5 g Natriumborhydrid (NaBH^) behandelt. Das Gemisch vairde 1 h unter Rühren auf 60⁰C gehalten. Das Gel wurde dann mit warmem Wasser gewaschen und mit 500 ml 2m Natriumhydroxidlösung, enthaltend 2,5 g Natriumborhydrid vermischt. Das Gemisch wurde 1 h im Autoklaven auf 120⁰C erhitzt. Das Gel wurde dann mit 500 ml 0,2 m Natriumhydroxidlösung, enthaltend 2,5 g Natriumborhydrid gewaschen. Es wurde langsam Eisessig zugegeben bis der pH-Wert des Gemisches auf ungefähr 4 gefallen war. Das Gel wurde mit Wasser gewaschen und unter Verwendung von Cyanogenbromid auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise mit Dextransulfat gekuppelt.

Fraktionierung von Fibrinogen und AHF aus Cohn-Fraktion-I-Paste:

Zu 1 1 einer Lösung von Cohn-Fraktion-I-Paste (aus altem Plasma) in 0,02 m Natriumeitratpuffer (pH 6,8) wurde 1 1 des wie oben hergestellten vernetzten Dextransulfat-ECD-Sepharose-GeIs gegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren 15 min stehengelassen und anschließend das Gel (mit dem gebundenen Adsorbat) auf ein Filter dekantiert. Die gepufferte Ausgangslösung, die vor der Adsorption ungefähr 10 mg Protein/ml Lösung und 0,5 Einheiten AHF/ml enthielt, ergab nach der Adsorption eine Lösung, die 1,4 mg Protein/ml und 0,36 AHF-Einheiten/ml enthielt. Aus dieser Lösung wurde das aktive AHF-Material durch

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Zugabe von Natriumeitrat bei einem pH-Wert von 7,1 ausgefällt. Beim Lösen von 1 g des wie oben abgetrennten Niederschlags in ungefähr 20 ml des Glycin-NaCl-Phosphat-Puffers erhielt man eine Lösung mit einer spezifischen Aktivität von 16 AHF-Einheiten/ml. Die Gesamtausbeute an AHF betrug 62 %.

Das en das Gel gebundene Fibrinogen wurde durch Eluieren mit 2 m Natriunchlorid^ösung desorbiert. Mehr als 90 % des Fibrinogen wurden gewonnen.

Beispiel 3

AHF und Fibrinogen aus einem Kryoprä zlpitat durch Adsorbtion des Fibrinogens an vernetztes Dextransulfat-Sepharose-Gel

Vernetztes Dextrr.nsulfat-Sepharose-4B-Gel wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Zu 1 1 einer Lösung von 10 g Kryopräzipitat in 0,02 m Natriumeitratpuffer (pH 6,8) wurde 1 1 des Dextransulfat-Sepharose-Gels gegeben. Das Gemisch wurde 15 min gerührt und anschließend das Gel auf ein Filter dekantiert und die nicht adsorbierte Lösung gesammelt. Die ursprüngliche Lösung enthielt ungefähr 14 mg Protein/ml der nicht adsorbierten Lösung und 0,97 AHF Einheiten/1 Lösung. Das AHF aktive Material wurde dann mit Natriumeitrat wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, ausgefällt. Das Fibrinogen wurde von dem Gel mit 2 m NaCl wie in Beispiel 1 oder 2 desorbiert. Man erhielt 65 % AHF und 82 % Fibrinogen aus der ursprünglichen Lösung·

Beispiel 4

AHF und Fibrinogen aus Cohn-Fraktion 1-0 durch Adsorption von Fibrinogen an vernetztes Dextransulfat-Dextran-Gel

15 g Dextran ^M500" (mittleres Molekulargewicht 500 000) wurden in 200 ml Wasser gelöst. 10 g Cyanogenbromid wurden in 100 ml

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Wasser gelöst und anschließend wurden 5 g Dextransulfat zugegeben. Die Lösung wurde gemischt und der pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 11 eingestellt und 7 min unter ^gleichzeitigem Ruhren des Gemisches auf diesem Wert gehalten. Das entstehende Gel wurde 24 h unter Rühren stehengelassen und dann mit 0,1 m Natriumbicarbonatpuffer und mit Wasser gewaschen.

Fraktionierung von Fibrinogen und AHF aus Cohn-Fraktion 1-0:

Es wurde entsprechend Beispiel 1 gearbeitet, wobei Cohn-Fraktion 1-0 aus frisch gefrorenem Plasma als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Das oben beschriebene Gel adsorbierte 62 % des Proteinmaterials. Die Ausbeute an AHF betrug 90 %, Das Fibrinogen wurde quantitativ mit 2 ra NaCl eluiert.

Beispiel 5

AHF und Fibrinogen aus Cohn-Fraktion 1-0 durch Adsorption des Fibrinogens an vernetztes Heparin-Sepharose-Gel.

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Herstellung von Heparin-Sepharose 4B-GeI

5 g Cyanogenbromid wurden in 100 ml Wasser gelöst und anschließend 1,5 S Heparin zu der Lösung gegeben und das Gemisch unter Rühren stehengelassen, während der pH-Wert durch Zugabe von Natriumhydroxid 7 min konstant auf 11 gehalten wurde. Anschließend wurde die Zugabe der Lauge abgebrochen und der pH-Wert sank langsam. Es wurde weitere 48 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend das Gel entsprechend Beispiel 4 gewaschen.

Fraktionierung von Fibrinogen und AKB¹ aus Cohn-Fraktion 1-0

Zu 30 ml einer Lösung gefriergetrockneter Cohn-Fraktion 1-0 au3 frisch gefrorenen Plasma in 0,02 m Natriumeitrat (pH 6,8) wurden 10 g des unmittelbar vorher dekantierten Heparin-Sepharose-Gel3 zugegeben.

Das Gemisch wurde unter Rühren 15 min stehengelassen und anschließend das das Adsorbat enthaltende Gel auf ein Filter dekantiert. 63 56 der ursprünglichen AHF-Aktivität verblieben in der nicht-adsorbierten Lösung sowie 4 $ der Fibrinogenmenge, die zu Beginn vorhanden war. Das AHF-aktive Material wurde dann durch Natriumeitrat mit einem pH-Wert von 7,1, wie in Beispiel 1, ausgefällt. Das Fibrinogen wurde aus dem Gel mit 2 m NaCl eluiert. Die Ausbeute an Fibrinogen betrug 85 #·

Beispiel 6

AHF und Fibrinogen auTS Cohn-Fraktion 1-0 durch Adsorption des Fibrinogens an Chondroitin-sulfat-Sepharose-Gel

Herstellung des vernetzten Chondroitin-sulfat-Sepharose-GeIs.

1 g Cyanogenbromid wurde zu einer wässrigen Lösung, enthaltend 250 rag Chondroitin-sulfat-C gegeben und anschließend

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40 ml Sepharose-4B-Gel zugegeben. Das Gemisch wurde 7 min unter Rühren bei einem pH-Wert von 11 gehalten und anschliesaend sank der pH-Wert und das entstehende Gel wurde 48 h unter Rühren stehengelassen. Das Gel wurde dann gewaschen und war fertig zur Verwendung.

Fraktionierung von Fibrinogen und AHF aus Cohn-Fraktion 1-0

Ungefähr 0,2 g gefriergetrocknete Cohn-Fraktion 1—0 aus frischem gefrorenem Plasma wurden in 20 ml Gitratpuffer (pH 6,8) gelöst. Anschließend wurden 20 ml des eben erhaltenen Gels zugegeben und dae Gemisch 15 min unter Rühren stehengelassen, woraufhin das Gel mit dem Adsorbat abfiltriert wurde. Die Analyse der nicht-adsorbierten Lösung zeigte, daß 44 % des Fibrinogens an dem Gel adsorbiert worden waren. Die AHF-Ausbeute betrug 80 $. Das Fibrinogen wurde von dem Gel mit 2 m NaCl desorbiert, wie in den Beispielen 1,2,4 oder 5.

Beispiel 7

AHF und Fibrinogen aus Cohn-Fraktion 1-0 durch Adsorption des Fibrinogens an Dextransulfat-Sepharose-Gel, das hergestellt worden war durch Vernetzung mit Epichlorhydrin.

Herstellung des vernetzten Dextransulfat-^Sepharose-Gels nach dem ECD-Verfahren.

1 1 Sepharose—4B-GeI wurde vermischt mit 500 ml einer wässrigen Lösung enthaltend 30 g Dextransulfat. Zu diesem Gemisch wurden! 11m Natriumhydroxidlösung, 40 ml Epichlorhydrin und 10 g Natriumborhydrid zugegeben. Das Gemisch wurde 1 h unter Rühren bei 60⁰C gehalten. Das entstehende Gel wur de mit warmen Wasser gewaschen und mit 500 ml 2 m Natrium hydroxidlösung und 5 g Natriumborhydrid gewaschen.

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Das Gemisch wurde 1 h im Autoklaven bei 120⁰C behandelt und anschließend das Gel mit einer Lösung von Lauge,enthaltend ITatriumborhydrid gewaschen. Anschließend wurde langsam Eisessig zugegeben, bis der pH-Wert 4 betrug. Das Gel wurde mit Wasser gewaschen und war dann fertig zur Verwendung.

Fraktionierung von Fibrinogen und AHP aus Cohn-Praktion I-U

Gefriergetrocknete Cohn-Praktion 1-0 aus frisch gefrorenem Plasma wurde in dem Citratpuffer dispergiert und mit dem vernetzten Dextransulfat-Sepharose-4B-Gel wie in Beispiel 1 vermischt und das Gel mit dem Adsorbat und die gemischte nichtadsorbierte Lösung zusammen mit der Waschflüssigkeit des Gels, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Die nichtadsorbierte Lösung, die nach Adsorption des Pibrinogens an das Gel erhalten worden war, erhielt 5 i° des ursprünglichen Proteingehaltes und 57 # der AHP-Aktivität. Das AHF-aktive Material wurde dann,* tfie in Beispiel 2, mit Natrium— citrat ausgefällt. Beim Eluieren des Pibrinogens aus dem Gel mit 2 m NaCl erhielt man 90 #.

Beispiel 8

AHP und Fibrinogen aus Üohn-Praktion 1-0 durch Adsorbtion des Pibrinogens an Benzidindisulfonsäure-substituiertes Sepharose-Gel.

Herstellung von mit Benzidindisulfonsäure substituiertem Sepharose-Gel

250 ml Sepharose-4B-Gel wurden mit 100 ml Wasser vermischt und 10 g Cyanogenbromid in 100 ml Wasser zugegeben. Durch Zugabe einer Lösung von Natriumhydroxid wurde der pH-Wert auf 11,0 erhöht und 7 min unter Rühren auf diesem Wert gehalten. Anschließend wurde das so behandelte Gel auf eine¹¹. Glasfilter dekantiert und mit kaltem Wasser gewaschen. 14g

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Benzidin-2,2~disulfonsäure wurden in 60 ml Wasser unter gleichzeitiger Zugabe von Lauge zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von 7 gelöst. Die Benzidindisulfonsäurelösung wurde zu dem Gel zugegeben und das Gemisch unter Rühren bei 5⁰C über Nacht stehengelassen. Anschließend wurde das Gel mit Pufferlösung gewaschen.

Fraktionierung von Fibrinogen und AHF aus Colin-Fraktion 1—0

Ungefähr 1/2 g gefriergetrocknete Cohn-Fraktion 1-0 aus frisch gefrorenem Plasma wurde in 40 ml Wasser gelöst und 10 ml trockengesaugtes Gel zugegeben und anschließend das Gemisch 30 min gerührt» Das Gel wurde abfiltriert und das Fibrinogen aus dem Gel mit 2 m NaCl-Losung.wie in den vorigen Beispielen eluiert. Bei Anwendung von Natriumeitrat wurde das AHF-alctive Material ausgefällt und auf die in den früheren Beispielen beschriebene Weise gewonnen. 85 $> de3 ursprünglichen Fibrinogens waren an der Matrix adsorbiert. Die AHF-Ausbeute betrug 80 $>.

Beispiel 9

Gewinnung von Faktor IX durch Plasma-Adsorption an Heparin-Sepharose«-Gel.

Heparin-Sepharose—Gel wurde hergestellt durch Vermischen von 100 ml einer Heparin-Lösung (5000 Einheiten/ml) in Wasser mit 200 ml Sepharoae-4B-Gel und anschließende Zugabe von 4 g Cyanogenbromid. Der pH-Wert wurde auf 11 eingestellt und 7 min auf diesem Wert gehalten. Anschließend sank der pH-Wert. Das Gel wurde über Nacht unter Rühren stehengelassen, am nächsten Tag gewaschen und war dann zur Verwendung fertig.

Auf eine Säule (200 ml), die mit vernetztem Heparin-Sepharo3e-Gel beschickt und mit 0,02 m Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 0,01 m Citrat, 0,15 m NaCl Puffer (pH 8,4) äquinllhriert _MaTt wurden 40 ml menschliches Blutplasma gegeben. Beim Eluieren dieses vernetzten Gels mit dem gleichen Puffer lief der Hauptteil des Plasmaa direkt durch die Säule.

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Das Adsorbat auf der Säule wurde dann durch Gradienteneluierung mit 0,05 m Citratpuffer (pH 5,0) unter kontinuierlicher Erhöhung der Ionenstärke durch Zugabe von 2 m ITaCl eluiert. Durch Dialyse dieses Eluats gegen destilliertes Wasser und anschließendes Lyophilisieren des Dialyserück— Standes erhielt man eine Fraktion mit Paktor IX-Aktivität, deren spezifische Aktivität 60 mal größer war als diejenige des Ausgangsmaterials, berechnet pro mg Protein.Ausbeute 35 #·

Die Paktor IX Aktivität wurde bestimmt durch Koagulationsanalyse nach dem Verfahren J.J.Veitkampf et al.(Thromb. Diath.Haemorrhag., 19-20 (1968) S.279).

Beispiel 10

Paktor IX aus einen B-Faktor-Konsentrat durch Adsorption an Heparin-Sepharose-Gel .

Das B-Faktor-Konzentrat (mit 8 Faktor-IX-Einheiten/nl), das als Ausgangsmaterial verwendet wurde, wurde hergestellt durch Adsorption der überstehenden Flüssigkeit von Cohn-Fraktion I (Verfahren 6) (Jour. Am. Chem. Soc, supra S. 6 Zeilen 18-19) an DEAE-Sephadex-Gel und anschließendes Eluieren von dem G-el mit einem üblicherweise angewandten Protein-Lösungsmittelpuffer in ,bekannter V/eise.

Ungefähr 0,5 g Protein (in Form eines Konzentrats von B-Faktor) enthaltend ungefähr 400 Einheiten Faktor IX wurden in 35 ml 0,03 m Natriumeitrat, 0,06 m NaCl-(pH 7,6)-Puffer gelöst. Die Lösung wurde auf . eine Säul'e (210 ml) von vernetztem Heparin-Sepharoae-4B-Gel gegeben, das entsprechend Beispiel 5 hergestellt worden war, das mit diesem Citrat-NaCl-Puffer äqullibriert worden war. Beim Eluieren dieses vernetzten Gels mit dem gleichen Puffer wurde der nichtadsorbierte Hauptteil des Ausgangskonzentrats direkt durch die Säule gewaschen. Die Desorption des adsorbierten Faktors IX wurde erreicht durch Gradienteneluierung des Gels in der Säule mit 0,1 Ht Essigsäure, Natriumacetatpuffer (pH 5,0)

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mit kontinuierlicher Erhöhung der Ionenstärke durch Zugabe de3 entsprechenden Puffers, enthaltend 2 m NaCl. Beim Lyophilisieren des Eluats erhielt man eine Proteinfraktion mit einer starken Praktor IX Aktivität. Die Berechnung der Aktivitätsausbeute zeigte, daß 86 fo der Aktivität gewonnen wurden. Die Immunoelektrophorese zeigte, daß dieses Produkt Spuren anderer Komponenten enthielt. Die v/eitere Gelfiltration mit Hilfe von Sephadex G-150 ergab eine Aktivität in zwei Bereichen und zwar ein Elutionsvolumen entsprechend einem Molekulargewicht von ungefähr 80000 und ein Elutionsvolumen entsprechend einem Molekulargewicht von 50000. Die Substanz mit dem niedrigeren Molekulargewicht scheint der aktivierte Paktor IX zu sein. Der Grad der Reinheit der höher-molekularen Substanz, verglichen mit derjenigen des Ausgangskonzentrats, zeigte eine ungefähr 40-fache Reinigung.

Beispiel 11

Paktor IX aus einem B-Paktor-Konzentrat durch Adsorption

an vernetzteßHeparin-Sepharose-Gel in Gegenwart eine3 Protease-Hemmstoffes.

Ungefähr p,5 g B-Paktor-Konzentrat (wie in Beispiel 10), enthaltend ungefähr 400 Einheiten Paktor IX, wurde in 35 ml 0,03 m Citrat, 0,06 m NaCl, 0,002 m p-Aminobenzamidinpuffer (pH 7,6) gelöst (p-Aminobenzamidin ist ein Protease-Hemmstof f, der unter anderem Trypsin und Thrombin hemmt). Die Lösung wurde auf eine Säule gegeben, enthaltend ein vernetzt es Heparin-Sepharose^B-Gel, das anschließend, wie in Beispiel 10 beschrieben ist, eluiert und desorbiert wurde. Eine Fraktion mit hoher Paktor IX Aktivität wurde nach EIuieren mit 0,01 m Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer erhalten. Bei weitererTrennung mit Hilfe von Sephadex g-150 Gel erhielt man ein aktives homogenes Protein mit einem Molekulargewicht von 82000. Die Gesamtauebeute an Paktor—IX-Aktivität betrug 370 Einheiten (92,5 #), das 52 mal reiner war als das Ausgangsmaterial·

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Beispiel 12

Aktivierter Faktor IX aus Cohn-Praktion III (Verfahren 6) durch Adsorption an vernetztes Heparin-Sepharose-Gel.

Ungefähr 10 3:g Cohn-Praktion III (Verfahren 6) Jour. Am. Chen. Soc, a.a.0,S.6 Zeile V3-19 wurden in 40 1 0,01 m Dinatriiimmonohydrogen-und Mononatriumdihydrogenphosphat, 0,15 m NaCl (pH 7) Puffer gelöst. Das ungelöste Material wurde abzentrifugiert. 18 1 DEAE-Sephadex-Gel wurden 2U der Lösung gegeben. Das Gemisch wurde unter Rühren 1 h stehengelassen und anschließend das DEAE-Sephadex-Gel abgetrennt (dekantiert) und mit den oben angegebenen Puffer gewaschen. Eine Säule wurde mit dem Gel beschickt, das anschließend rait 0,05 m Phosphat, 1 m ITaCl (pH7)Puffer desorbiert wurde. 180 g des Proteineluats mit Paktor-IX-Aktivität wurden erhalten. Dieses Eluat wurde nach der Dialyse (gegen destilliertes Wasser) und Änderung des Puffers in 0,03 m Citrat, 0,06 m NaCl (pH 7,6) an 6 1 vernetztes Heparin-Sepharose—4B-GeI adsorbiert. Dieses, das Adsorbat enthaltende Gel wurde in eine Säule gegeben und dann wie in Beispiel 9 eluiert. Man erhielt eine Fraktion mit Paktor-IX-Aktivität. Untersuchungen durch Gelfiltration zeigten,'daß diese Substanz hauptsächlich aktivierter Paktor IX war, das heißt, die Komponente mit einem Molekulargewicht von ungefähr 50000.

Beispiel 13

Paktor IX aus einem B-Paktor-Konzentrat durch Adsorption an vernetztes Heparin-Gel.

Vernetztes Heparin-Gel wurde hergestellt durch. Zugabe von 6 g Cyanogenbromid zu 100 ml einer lösung von Heparin (5000 Einheiten/ml). Der pH-Wert wurde auf 11 eingestellt und 8 min auf diesem Wert gehalten und anschließend sank er ab. Das entstehende Gel, das einige Stunden stehengelassen wurde, wurde dann mit Bicarbonatpuffer und mit Wasser

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gewaschen und anschließend war das vernetzte Heparin-Gel zur Verwendung .fertig.

Eine Säule wurde mit diesem Gel "beschickt und eine Pufferlösung von B-Paktor-Konzentrat (wie in Beispiel 10) auf die Säule gegeben. Die Adsorption und Eluierung wurde entsprechend Beispiel 9 durchgeführt und man erhielt eine Faktor-IX-Fraktion mit einem verhältnismäßig hoheii·. Reinheitsgrad (27 fadh reiner als das Ausgangsmaterial des B-Faktor-Konzentrats). Ausbeute 62 ^c/o.

Beispiel 14

Faktor IX aus einem B-Faktor-Konzentrat durch Adsorption an vernetztes Dextransulfat-Sepharose-Gel.

Vernetztes Dextransulfat-Sepharose-Gel wurde hergestellt durch Zugabe von 100 ml Sepharose-4B-Gel zu 50 ml Dextransulfat und anschließend wurden 2 g Cyanogenbromid zugegeben. Der pH-Wert wurde auf 11 gebracht und 7 min auf diesem V/ert gehalten und durfte anschließend absinken. Das vernetzte Dextransulfat-Gel wurde über Nacht stehengelassen und dann gewaschen. Dieses vernetzte Gel wurde in eine Säule gegeben und eine Lösung von B-Faktor-Konzentrat (wie in Beispiel 10) daraufgegeben. Die Desorption und Eluierung wurde entsprechend Beispiel 9 durchgeführt. Man erhielt ein Produkt, das ungefähr 13 mal reiner war als das Ausgangsmaterial und die Ausbeute betrug 17 $>* *

Beispiel 15

Paktor IX aus einem B-Faktor-Konzentrat durch Adsorption an vernetztes Chondroitinsulfat-Sepharose-Gel.

Vernetztes Chondroitinsulfat-C-Sepharose-Gel wurde hergestellt durch Anwendung von Chondroitinsulfat C bei dem Verfahren, wie es zur Herstellung von vernetztem Dextransulfat-Sepharose-Gel in Beispiel 6 angegeben ist. Das entstehende vernetzte Gel wurde in eine Säule gegeben und eine Lösung von B-Faktor-Konzentrat (wie in Beispiel 10) daraufgegeben und die Eluierung und Desorption ent-

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sprechend Beispiel 9 duruugüführ i. Ler erhaltet*ϊ^ΐσ-^ · heitsgrad war ungefähr 30 mal höher als "bei dem Ausgangsinaterial und die Ausbeute betrug 37 $·

Beispiel 16

Reinigung von Faktor I, VIII und IX aus dem gleichen Ausgangsui.it erial.

Dextranüulfat-Sepharose-ffel wurde hergestellt entsprechend Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß 10 1 Gel erhalten wurden. Heparin-Sepharose-Gel wurde entsprechend Beispiel 9 hergestellt, aber in einer Menge von 11. . - . 30 kg gefrorenes Plasmawurden aufgetaut und anschließend Cohn-Fraktion I (Verfahren 6) durch 8 # Äthanol ausgefällt und in einer Sharpies—Zentrifuge zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt und zur Gewinnung des Faktors IX, wie später beschrieben, angewandt. Dor Niederschlag der Fraktion I wurde in Stücke geschnitten und in 9,6 1 0,02 m Citratpuffer mit einem pH-Wert von 6,8 gelöst. Zu der Lösung wurden 180 ml 2 <fi Al(0H)_ Gel gegeben und das Gemisch 30 min gerührt und dann abzentrifugiert. Zu der Lösung wurden dann 10 1 Dextransulfat-Sepharose-Gel gegeben und das Gemisch 30 min gerührt.Das Gel wurde abfiltriert und das vorhandene AHP-akti^o Material in der Lösung durch Zugabe von Hatriumcitrat, wie früher beschrieben, ausgefällt. Das ausgefällteMaterial enthielt 0,7 AHF-Einheiten/mg Protein und konnte gelöst werden, wobei man eine Lösung erhielt, enthaltend 30 AHP-Einheiten/ml. Die Ausbeute aus dem AHF-Gehalt des Plasma berechnet, betrug 34 $. Das Fibrinogen (Faktor i) konnte erhalten werden durch Eluieren des Dextransulfat-Sopharose-Gels mit 2 m NaCl. Das erhaltene Fibrinogen war 89 °/> rein und die Ausbeute betrug 84 $.

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CRiGiNAL INSPECTED

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Faktor IX wurde erhalten aus der überstehenden Flüssigkeit nach der Ausfällung der Cohn-Fraktion I. Zu dieser Lösung (32 1) wurden 5 1 gequollenes DEAE-Sephadex-Gel gegeben. Das Gemisch wurde 1 h gerührt und anschließend da3 Gel durch Demontieren abgetrennt. Nach dem Waschen wurde das DEAE-Sephadex-Gel mit 0,05 m Phosphat 1 m NaCl, pH 7,0 eluiert. Die erhaltene Proteinfraktion wurde gegen 0,03 m Citrat, 0,06 m NaCl, pH 7,6, dialysiert. Zu der Lösung wurde dann 1 1 Heparin-Sepharose-Gel unter Rühren gegeben. Das Gel wurde in eine Säule gegeben und nach Beispiel 9 desorbiert. Eine Fraktion mit Faktor-IX-Aktivität wurde erhalten, die nach der Dialyse und Lyophilisierung der Gelfiltration mit Hilfe von Sephadex G-200 unterworfen wurde. Man erhielt ein Faktor IXPräparat, das 52 Einheiten/mg Protetin enthielt. Die Gesamtausbeute aus dem Plasma betrug 47 $.

Die Beispiele 9 bis 15 zeigen die Isolierung eines einzelnen Blut-Koagulationsfaktors, zum Beispiel Faktor IX, aus den jeweils getrennten Ausgangsmaterialien. Beispiele 1 bis 8 zeigen die getrennte Isolierung von zwei Blut-Koagulationsfaktoren, Fibrinogen und AHF aus einem einzigen

Das

Ausgangsmaterial. Beispiel 16 zeigt die getrennte Isolierung von jedem der drei Blut-Koagulationsfaktoren aus einem einzigen Ausgangsmaterial.

Die verschiedenen Beispiele zeigen die Anwendung der.jeweiligen spezifischen Ausgangsmaterialien für jeweils 1, 2 oder 3 der Blut-Koagulationsfaktoren I, VIII und IX. Es kann jedoch irgendein Blut oder Blutanteil (blood tissue Produkt) das irgendeinen dieser Blut-Koagulationsfaktoren enthält, angewandt werden. Ein solches Blutprodukt kann von irgendeinem bluthaltigen Lebewesen, entweder von Menschen oder Rinct oder sonstigem Säugetier oder anderem Tier stammen, das einen dieser Koagulationsfaktoren enthält.

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Der Ausdruck "tierisches Blutprodukt" umfaßt in erster Linie Blutserum, Blutplasma (frisch oder alt) sowie irgendeine der Blut-Koagulationsfaktor enthaltenden Fraktionen oder Konzentrate, die von menschlichen oder Rinderblut oder Blut eines .sonstigen bluthaltigen Tieres stammen, Blutserum oder Blutplasma, wie das Kryopräcipitat sowie auch die bisher zur Verfügung stehenden verschiedenen Arten von AHF-Konsentraten, wie die sogenannten teilweise gering oder teilweise hoch-konzentrierten Präparate oder die sogenannten konzentrierten AHF-Präparate oder das B-Faktor-Konzentrat.

Bas in verschiedenen Beispielen angewandte Dextransulfat ist,wie⁶^Om Hersteller (Pharmacia Pine Chemicals) geliefert wird, üblicherweise Natriumdextransulfat. Es wird häufig nur als Dextransulfat bezeichnet, nicht nur vom Hersteller und in dessen Literatur sondern auch in anderer Literatur. Es wird als Natriumsalz in den Handel gebracht aufgrund der größeren Stabilität über längere Zeit. Es kann erfindungsgemäß in beiden Formen verwendet werden, so daß der Ausdruck "SuIfatdextran", wie er hier verwendet wird, auch das Hatriumsalz umfaßt.

Die Sepharose 4B wird nicht in Form trockner Perlen in den Handel gebracht. So wurde es in den Beispielen, bei denen die Verwendung eines bestimmten Volumens dieses Adsorptionsmittels angegeben ist, nicht in seiner ursprünglichen Form, sondern in viskoser fließfähiger aber nicht flüssigkeitsari-ig freifeließfähiger Form angewandt.

Der Ausdruck "vernetzte Dextransulfat-Epichlorhydrin-Agarose" in dem Ausdruck "Epichlorhydrin-Agarose" bedeutet, daß die Agarose getrennt mit Epichlorhydrin umgesetzt worden ist. So bedeutet der Ausdruck" vernetzt" in dem längeren dieser beiden Ausdrücke, die Beispiel 2. zeigt, daß auch eine Vernetzung durch eine getrennte Vernetzungsreaktion zwischen dem Dextransulfat und der mit Epichlorhydrin behandelten Agarose stattgefunden hat.

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Außerdem zeigt. Beispiel 7, öaii T^ichiorhydrin als Vernetzungsmittel in dem Reaktionsmedium, enthaltend Dextran, sulfat und Agarose (zum Beispiel Sepharose 4B) angewandt werden kann, um die Vernetzung zwischen den beiden PoIysaccharidsubstanzen herbeizuführen, die zur Herstellung der vernetzten wasserunlöslichen Gelmatrix für die erfindungsgemäisen Zwecke angewandt werden. So wird zum Beispiel in Beispiel 11 eine solche Gelmatrix als ECD-vernetztes Dextransulfat-Agarosegel bezeichnet.

Die vernetzte Benzidin-2,2-disulfonsäure~Agarose des Beispiels 8 kann bei diesen Verfahren ersetzt werden durch die entsprechende Menge an vernetztem Benzidin-2,2-disulfonsäure-Dextran, indem man die bei der Herstellung der vernetzten Benzidin-Agarose verwendete Sepharose 4B durch die entsprechende Menge Dextran ersetzt.

Allgemein kann der spezielle Puifer, der in irgendeinem der Beispiele als Lösungsmittel für das als Ausgangsmaterial verwendete tierische Blutprodukt oder fur das Adsorbat oder irgendeinen Niederschlag verwendet wird, ersetzt werden durch irgendeine andere wässrige Pufferlösung, die mit dem Ausgangsblutprodukt, dem Adsorbat oder Niederschlag verträglich ist und den gewünschten pH-Wert ergibt, um das gewünschte Produkt Adsorbat oder den Niederschlag zu lösen.

Der nichtadsorbierte Anteil der Lösung des Ausgangsmaterials kann übiicherweise von dem Adsorptionsgemisch oder der Säule mit einem einzigen Volumen der Pufferlösung ausgewaschen werden, das dem Volumen des in dem Gemisch oder der Säule angewandten Geis enxspricht.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es möglich, daß man (±) ein Fibrinogenprodukt mit ungefähr 80 bis 90 % Fibrinogen (ii) ein Koagulationsfaktor-VIII(AHF)-Produkt mit einer größeren Reinheit als irgendein anderes im Handel erhältliches AHP-Produkt und(iii) das reinste Antikoagulationsfaktor B(Faktor IX)produkt erhält.

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Das bedeutet einen deutlichen Vorteil, indem die iTlüssigkeitsmenge, die irgendeinen dieser drei Koagulationsfaktoren enthält, die einem Patienten verabreicht werden muß, wesentlich herabgesetzt werden kann, wobei nicht nur Kosten eingespart werden, sondern auch die Unannehmlichkeit für den Patienten erheblich verringert wird. Zum Beispiel ist das aus frischem Plasma nach dem Verfahren der Beispiele 2 und 16 hergestellte AHF-Konzentrat in einer Konzentration von 30 AHF-Einheiten/ml erhältlich. Dadurch wird es möglich eine hochwirksame Dos isLn Form einer üblichen Injektion mit einer Handspritze zu verabreichen una macht die lange kontinuierliche Infusion aus einer hängenden Infusionsflasche überschüssig.

Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Isolierung der Blutkoagulationsfaktoren Fibrinogen, antihämophilem Faktor VIII und/oder B-Faktor, aus tierischem Blut oder Blutanteil, enthaltend mindestens Fibrinogen und/oder B-Faktor, dadurch gekennzeichnet , daß man eine wasserunlösliche adsorbierende Gelmatrix mit dem Blut oder Blutprodukt, das in einem wässrigen Medium gelöst und gegenüber den Inhaltsstoffen des Bluts inert ist, zusammenbringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorptionsmittel vernetztes Dextransulfat-Dextran, vernetztes Dextransulfat-Agarose, vernetztes Dextransulfat-Epichlorhydrin-Agarose, Dextransulf at-Epichlbrhydrin-vernetzte Agarose, vernetztes Chontroitinsulfat-vernetzte Heparin-Agarose, vernetztes Heparin, vernetztes Benzidin-2,2-disulfonsäüre-Agarose und/oder vernetztes Benzidin-2,2-disulfonsöure-Dextran verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Blutprodukt ganzes Blut verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3_t dadurch gekennzeichnet, daß man als Blut menschliches Blut verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man als Blutprodukt frisches oder veraltetes· Plasma oder eine Plasmafraktion verwendet«

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6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den B-Faktor an vernetzte Heparin-Agarose adsorbiert.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Blutprodukt die Cohn-Fraktion 1-0, eine Cohn-Fraktion-1-Paste oder Cohn-Fraktion ΠΙ (Verfahren 6) verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Blutprodukt verwendet, das Fibrinogen und den antlhämophilen Faktor enthält^und das Fibrinogen an das Adsorptionsmittel adsorbiert, die das Fibrinogenadsorbat enthaltende Gelmatrix von dem nicht adsorbierten Rest der Lösung des Blutproduktes abtrennt und den hämophilen Faktor aus der Lösung isoliert.

9. Verfahren nach Anspruch 8$ dadurch gekennzeichnet, daß man als Blutprodukt eine Cohn-Fraktion I-Paste verwendet, diese in einer wässrigen Pufferlösung eines anorganischen Salzes mit einem pH-Wert von 6,8 löst, als Adsorptionsmatrix vernetztes Dextransulfat-mit Epichlorhydrin behandelte Agarose verwendet und den antihämophilen Faktor aus dem nicht adsorbierten Rest der Lösung durch Zugabe von Natriumeitrat auf einen pH-Wert von ungefähr 7»1* ausfällt, den ausgefallenen antihämophilen Faktor von der wässrigen Lösung abtrennt und das Fibrinogen von der Gelmatrix .mit einer wässrigen Lösung von ungefähr 1 m bis ungefähr 2 m Natriumchlorid eluiert.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet , daß man ein Blutprodukt verwendet, das den Koagulations-B-Faktor enthält, dieses in einem wässrige!

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Puffer bei einem pH-Wert von 7 bis ungefähr 8,4 löst, die den B-Faktor adsorbiert enthaltende Matrix abtrennt und den B-Faktor von den Adsorptionsmittel durch Gradienteneluieiuig mit einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert von ungefähr 5 unter kontinuierlicher Erhöhung der Ionenstärke eluiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß man den Koagulations-B-Faktor von dem Eluat durch Dialyse und Lyophy.lisieren des Dialyserückstandes gewinnt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als adsorbierende Gelmatrix vernetzte Heparin-Agarose verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet,' daß man als Blutprodukt eine Plasmafraktion und als wässrigen Puffer einen solchen verwendet, der einen wasserlöslichen Protease-Hemmstoff enthält, der gegenüber der Plasmafraktion inert ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß man als Protease-Hemmstoff p-Aminobenzamidin verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 10 bis 1^, dadurch gekennzeichnet, daß man als wässrigen Puffer eine Lösung von 0,02 m Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 0,01 m Citrat, 0,15 m NaCl mit einem pH-Wert von 8,4 verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß man als Blutprodukt Plasma verwendet, das Fibrinogen, antihämophilen Faktor und Koagulationsfaktor B enthält, dieses in einem wässrigen Puffer, der einen pH-Wert von 7 bis 8,4 ergibt, löst, die Gelmatrix von dem nicht ad-

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sorbierten Hauptteil des Plasmas trennt, den Koagulations-B-. Faktor von dem Adsorptionsmittel durch Gradienteneluierung mit einem verträglichen Puffer mit einem pH-¥ert von 5 unter kontinuierlicher Erhöhung der Ionenstärke von ungefähr 0,01 m bis 2 m an einem wasserlöslichen anorganischen Salz eluiert, die ^ialysierbaren Salze von dem Eluat durch Dialyse entfernt und den Dialyserückstand des B-Faktors lyophylisiert, den alkalischen Puffer in dem nicht adsorbierten größeren Teil des Plasmas gegen einen Puffer mit einem pH-Wert von ungefähr 6,8 austauscht und die entstehende Lösung, enthaltend das Fibrinogen und den antihämophilen Faktor mit einer adsorbierenden wasserunlöslichen Gelinatrix so lange zusammenbringt, daß das Fibrinogen aus der Lösung adsorbiert wird, das- das Fibrinogenadsorbat enthaltende Adsorptionsmittel von dem nicht adsorbierten Rückstand der Lösung abtrennt, das Fibrinogen von dem Adsorptionsmittel durch Eluieren mit einer wässrigen Lösung enthaltend ungefähr 0,001 m bis ungefähr 2 m Natriumchlorid eluiert und zu der verbleibenden nicht adsorbierten Lösung Natriumeitrat bis zu einem pH-Wert von 7,1 zumischt, um den antihämophilen Faktor auszufällen.

17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet', daß man das Blutprodukt mit der wasserunlöslichen Adsorbierenden Gelmatrix so lange zusammenbringt, bis das Fibrinogen oder das B-Faktor adsorbiert ist und eine solche Menge verwendet, daß mindestens ungefähr 15 % des Fibrinogens oder B-Faktors adsorbiert werden.

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