DE2431719A1 - Verfahren zur gewinnung von proteinkonjugaten - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von proteinkonjugaten

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DE2431719A1 DE2431719A DE2431719A DE2431719A1 DE 2431719 A1 DE2431719 A1 DE 2431719A1 DE 2431719 A DE2431719 A DE 2431719A DE 2431719 A DE2431719 A DE 2431719A DE 2431719 A1 DE2431719 A1 DE 2431719A1
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/561—Immunoelectrophoresis

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Description

2431713
BEHRIHGTOrRKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg (Lahn) ;
Aktenzeichen: Hoe 74/B 011 - Ma I67
Datura: 1. Juli 1974
Verfahren zur Gewinnung von Protein-Konjugaten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von mit organischen Verbindungen kovalent verbundenen Proteinen oder Proteinmischungen, sogenannter Proteinkonjugate. Ea sich das zu gewinnende Proteinkonjugat gegenüber nicht gewünschten Konjugationsprodukten und den zur Konjugation eingesetzten organischen Verbindungen in seinen elektrophor?- tischen Eigenschaften unterscheidet, ber :ht das "erfahren r.:r Gev/innung der gewünschten Fräparate dar.s„:f, dasc nach erfolgter Konjugationsreaktion das vorlie|-enae Ger.:. sch eine !.α präparativ elektrophoretisehen Vei'fshren unterv/orfen v.drd und die Zone, die die gewünschter. Präparate enthältr von denen mit unerwünschten Proteinkonjugaten und den freien organischen Verbindungen abgetrennt wird.
Die Erfindung betrifft im besonderen ein Verfahren zur Reinigung von Protein-Farbstoff-Xon.jugaten, vorzugsweise von antikerperhaltigen Inmunsera bzv/. Proteinfraktioneii nach
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erfolgter Konjugationsreaktion mit Farbstoffen, insbesondere mit Fluoreszenzfarbstoffen, beisjjielsv.-eise mit Flue re se einisotMoeyanat mittels präparativer elektrophoretiseher Verfahren.
Die Erfindung betrifft weiterhin nach dem beschriebenen Verfahren gereinigte Protein-Konjugate und deren Verwendung in der Immunologischen Diagnostik.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht durch die elektrophoretlschen Eigenschaften der Ausgangsmaterialien und der Umsetzungsprodukte die Abtrennung des reinen Proteinkenjugats eines bestimmten Umsetzungsgrades von dem nicht umgesetzten Protein und dein zur Konjugation verwendeten organischen Molekül unter der Voraussetzung, dass diese drei Komponenten eine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit zeigen.
Protein-Farbstoff-Konjugate, insbesondere mit FluorsszenzlarbE-offen konjugierte antikörperhaltige Immunsera haben, ;;ie riHoIisteher.i gezeigt wird, ihre besondere Bedeutung in der ECgenannten Immunfluoreszenztechnik.
Ohne dass daraus eine Einschränkung zu folgern v/äre, soll das Wesen des erfindungsgemässen Verfahrens an diesen repräsentativen Beispielen herausgestellt werden.
Die yon A.H. Coons 19^-2 eingeführte Technik der Immunfluoreszenz gestattet die kombinierte Untersuchung der serologischimmunologischen Spezifität und der morphologischen Charakteristik des zu analysierenden Materials. Grundlage dieser Methode ist die sogenannte Antigen-Antikörper-Reaktion, bei der einer der beiden immunologischen Partner - in der Regel der Antikörper - mit einem fluoreszierenden Farbstoff konjugiert ist. Die Sichtbarmachung der Antigen-Antikörper-
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T. '. — A C *~*
.PiC-J. Ι U /
Reaktionsverbiiidung im ipikroskopisehen Präparat erfolgt durch Anregung der sichtbaren Fluoreszenz mittels Strahlung im ultravioletten Bereich.
Die Immunfluoreszenz hat zur Identifizierung von gebundenen wie freien Antigenen und Antikörpern grosse diagnostische Beachtung gefunden.
Gemäss dem Stand der Technik werden antikörperreiche Fraktionen als sogenannte Immunsera mit Fluoreszenzfarbstoffvorzugsweise mit Fluoresceinisothiocyanat - umgesetzt. Die weitere Reinigung des Umsatzproduktes erfolgt vorwiegend mittels Gelfiltration und mittels Ionenaustauscher-Chromatographie an Diäthyl-Aminoäthyl-Cellulose. Dabei werden die fluoresceinkonjugierten Immunglobuiine isoliert.
DJ.ese Verfahren haben den Nachteil, dass man beim Versuch der Entfernung des nicht kovalent gebundenen Farbstoffes aus der fluoresceinkonjugierten Proteinpräparation mittels Gelfiltration oder Dialyse eine unvollständige Abtrennung des Farbstoffes beobachtet, insbesondere wird der adsorptiv an das Protein gebundene oder der hydrolytisch relativ leicht abspaltbaref schwach kovalent gebundene Farbstoff nicht entfernt. Ausserdem wird Farbstoff, der infolge Eigenpolymerisation bzw. Eigenkondensation höhere Molekulargwichte erreicht, ebenfalls nur unvollständig eliminiert.
Die Anwendung solcher freien Farbstoff enthaltender Präparate führt zu unspezifischen Fluoreszenzfärbungen am mikroskopischen Präparat und damit zu falschen Aussagen.
Bei dem gemäss dem Stand der Technik vorwiegend angev/andten Verfahren zur Gewinnung der antikörperhaltigen konjugierten
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Proteinfraktion mittels Ionenaustauscher-Chromatographie an DEAE-Cellulose wird im wesentlichen nur der Antikörperanteil, der zur IgG-Klasse gehört, gewonnen. Unter den dabei angewandten Elutions- und Trennbedingungen werden Antikörper der IgM- und IgA-Klassen nur unvollständig bzw. überhaupt nicht abgelöst, so dass das gewonnene Präparat zum Teil einen erheblichen Verlust an gewünschten spezifischen Antikörpern aufweist. Bei Änderung der Elutionsbedinguiig zur Gewinnung fluresceinkonjugierter IgM- und IgA-Antikörper werden sogenannte "übermarkierte"^f-Globuline wie auch basophile Proteine miteluiert. Aufgrund ihres stark samten Charakters führen diese sogenannten "übermarkierten" Proteinanteile bei immunologischen Reaktionen zur unspezifischen Bindung mit einer Reihe basischer Proteine im Untersuchungsmaterial und damit ebenfalls zu Fehlinterpretationen der erhaltenen Fluoreszenz.
Das erfindungsgemässe Verfahren weist die angegebenen Nachteil e nicht auf. Die vorzugsweise in einem inerten Träger durchgeführte elektrophoretische Reinigung farbstoffkonjugierter Proteinpräparationen, vorzugsweise fluoresceinkonjugierter Proteinpräparationen, nach der Konjugationsreaktion bietet folgende Vorteile:
1. Das Verfahren ermöglicht eine optimale "maßgerechte" antikörperhaltige Zonengewinnung. Unerwünschte, beispielsweise antikörperfreie Ballast-Protein-Fraktionen können bei der Eliminierung der gewünschten Fraktion ohne Schwierigkeiten verworfen werden. Die Ausbeute der antikörperhaltigen farbstoffkonjugierten Proteinpräparationen ist optimal. Im herangezogenen Beispiel der fluoresceinmarkiertenTT-Globulin-Fraktion werden 70-90% der eingesetzten Menge wiedergewonnen.
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2. Infolge der Konjugation von Proteinen mit sauren organischen Molekülen ändert sich der isoelektrische Funkt bei allen mit den organischen Molekülen in Reaktion getretenen Proteinen zu niedrigen Werten mit der Folge, dass sie unter den Bedingungen der Elektrophorese stärker anodisch wandern als nicht konjugierte Proteine. Die Entfernung zu sauer gewordener Proteine infolge starker Reaktion mit dem zur Konjugation eingesetzten Molekül bereitet keine Schwierigkeiten, da diese stärker anodenwärts wandern. Besonderes Gewicht hat dieses Ergebnis- bei den mit dem sauren Fluoreszenzfarbstoff Fluoresceinisothiocyanat (chinoides System mit freier Carboxylgruppe) konjugierten Proteinen.
3· Die optimale Entfernung des nicht (oder adsorptiv) gebundenen sauren organischen Moleküls, dessen Präsenz in fluoresceinkonjugierten Präparationen zu unerwünschten, unspezifischen Fluoreszenzfärbungen führt, ist bei dem erfindungsgemässen Verfahren gewährleistet. Der Grund für die leichte Entfernung dieses Farbstoffanteils liegt darin, dass das saure Molekül selbst stark anodenwärts wandert. Die Belastung durch die elektrische Spannung bei den Bedingungen der präparativen Zonenelektrophorese führt zu einer Abspaltung von relativ schwach an Protein gebundenen Molekülen und verursacht eine gute Qualität der elektrophoretisch gewonnenen Protein-Konjugate. Im Falle der mit Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Proteine wird eine Stabilitätsssteigerung solcher Präparate bei Aufbewahrung in wässriger Lösung gegenüber denen, die nach dem Stand der Technik gewonnen wurden, beobachtet.
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Ma - 6 -
4; Werden für die Konjugation als Proteine Antikörper eingesetzt, so gestattet das erfindungsgemäße Verfahren die Gewinnung aller farbstoffkonjugierter Antikörperklassen, Z-B. IgG, IgA, IgM. Dies hat. insbesondere bei der Verwendung von Antikörpern aus Seren von beispielsweise Mensch, Ziege, Schaf, Pferd Bedeutung, bei denen außer den Antikörpern der IgG-Klasse auch die Antikörper anderer Immunglobulinklassen einen relativ hohen Anteil an der gesamten . Antikörpermenge ausmachen. Dieser Faktor hat auch ein erhebliches wirtschaftliches Interesse, da antikörperhaltige Seren nicht in unbeschränkter Menge zur Verfügung stehen.
Auf die Reinigung von mit Fluoresceinfarbstoffen konjugierten Antikörpern übertragen, führt das erfindungsgemäße
Verfahren zu einer Erhöhung der Relation von spezifischen Antikörpern (Ab) zu Gesamteiweiß (P), des soganannten Ab/P-Quotienten, was eine Steigerung der gewünschten spezifischen Fluoreszenz bewirkt.
5. Das Verfahren, das auf den Einsatz teurer chromatographischer Hilfsmittel verzichtet, beinhaltet eine wesentliche Verbilligung bei der Herstellung reiner Proteinkonjugate. " Das verwendete inerte Trägermaterial kann wiederholt eingesetzt werden«
Als'elektrophoretisches Verfahren wird die Träger-Elektrophorese bevorzugt, insbesondere die Elektrophorese, die den inerten Träger in einer horizontalen Wanne enthält. Bei Verwendung von beispielsweise Polyvinylchloridgranulat als Trägermaterial läßt sich hierbei nach der Auftrennung der antikörperhaltigen fluoresceinkonjugierten Protein-Fraktionen die gewünschte Präparation entsprechend den sichtbaren Banden herausschneiden und danach aus dem Träger mit einfachen Lösungsmitteln eluieren. .
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~ 7 - , Ka
Ist das Konjugat ungefärbt/ kann die Position von Protein, Reaktionspartner und Protein-Konjugat indirekt, beispielsweise über einen Papierabklatsch, der anschließend nach den bekannten Maßnahmen eingefärbt wird, nachgewiesen werden.
Häufig verwendete elektrophoretische Trägermaterialien sind neben Polyvinylchlorid Polyacrylamid, Cellulose, Stärke, Glasperlen, Sand, um einige Beispiele zu nennen, ohne jedoch daß man sich erfindungsgemäß darauf beschränken müßte.
Erfindungsgemäß lassen sich jedoch auch Elektrophorese-Anordnungen in vertikaler Bauart mit und ohne Trägermaterial verwenden. Sehr gute Reinigungseffekte werden auch mit kontinuierlich arbeitenden Elektrophoresegeräten erhalten.
Nach dem vorliegenden Verfahren werden Äntikörper-Präparationen jeden Ursprungs aufgetrennt, die mit Farbstoffen sauren Charakters kovalent gebunden worden sind. Ein besonders geeigneter Farbstoff ist dabei Fluoresceinisothiocyanat.
Es können jedoch auch nicht fluoreszierende Farbstoffe mit Proteinen umgesetzt werden und die infolge der Konjugationsreaktion gefärbten Proteine nach dem vorliegenden Verfahren abgetrennt werden, sofern die benutzten Farbstoffe ein unterschiedliches elektrophoretisch^^ Wanderungsverhalten aufweisen.
Statt Antikörpern können auch andere Proteine tierischen, pflanzlichen und mikrobiellen Ursprungs eingesetzt werden, wenn sie als Konjugate eine vom Ausgangsprotein und dem zur . Konjugation verwendeten organischen Molekül abweichende elektrophoretische Eigenschcift aufweisen. Vorzugsweise werden als organische Moleküle für. die Konjugation solche Verbindungen •eingesetzt, deren isoelektrische Punkte im sauren pH-Bereich 3.j.egen. ·
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_ $ _ Ka
Die Erfindung soll nachfolgend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Beispiel ι · '
Eine 3%ige antikörperhaltige Serumeiweißlösung von der Ziege wird mit Fluoresceinisothiocyanat auf bekannte Weise im alkalischen Milieu umgesetzt. Das konjugierte Antiserum wird in einer mit 3,6 1 PVC-Pulver (Geon X 427 der Firma Serva, Heidelberg) fassenden horizontalen Elektrophoresc-7\pparatur (Maße: 1 = 65,0 ch, b = 76,0 cm, h = 1,2 cm) bei pH-Wert 8,1, einer Feldstärke von 6 V pro cm, bei einer Stromstärke von O,6 A während einer Laufzeit von 15 Stunden aufgetrennt. Die antikörperhaD.tige
'^-Globulin-Fraktion, die ohne Konjugation an Fluoresceinisothiocyanat in der;Regel in der Auftragsrille liegenbleibt bzw. sogar kathodisch wandert, ist deutlich in Richtung Anode gewandert. Die hellgelbe bis grünliche Färbung der antikörper haltigen -^-Globulin-Fraktion zeichnet sich deutlich ab von den übrigen Protein-Fraktionen und von den freien Farbstoffariteilen, die dunkelgelb bis rötlich-braun gefärbt sind. Die gewünschte Antikörperhaltige ^"-Globulin-Fraktion m-'-t optimalem F/P-Quotienten, der übrigens unmittelbar nach der Auftrennung bandenweise bestimmt werden kann, wird als PVC-Zone herausgeschnitten und mittels 0,9%iger Kochsalzlösungaus dem Träger ausgewaschen. Das Eluät wird durch Ultrafiltration auf etwa 1 g % Eiweiß eingeengt,»
Danach kann die Endeinstellung und Qualitätskontrolle erfolgen.
Beim Einsatz von 3,6g einer fluoresceinkonjugierten antikörperhaltigen Eiweißlösung (120 ml Antiserum) werden 0,5 g einer fluoresceinkonjugierten antikörperhaltigen ^-Globulin-Fraktion gewonnen.
/9
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- _ 9 —
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Werden antikörperhaltige Serumproteine vom Kaninchen eingesetzt, so erhält man beim Einsatz von 8 g eines fluoresceinkonjugierten antikörperhaltigen Antise'rums (120 ml) 1,0 g einer fluoreseeinkonjugierten antikörperhaltigen ■T-GlobuD.in-Fraktion.
Ähnliche Ausbeuten erhält man auch bei der Gewinnung von Antikörpern aus Huraanseren. Unter Berücksichtigung, daß der Anteil der ;p-Globulin-Fraktion in einem Antiserum ca. 15 bis 18% ausmacht, sind die Ausbeuten, bezogen auf diese ^"-Globulin-Fraktion, als optimal zu bezeichnen.
/10
t: ρ η ι\ ρ ' / 1 1 1 ')
- 10 Beispiel-2
Ka 167
Eine 3%ige Human-Transferrin-Lösung wird mit Fluoresceinisothiocyanat auf bekannte Weise im alkalischen Milieu umgesetzt- Das konjugierte Protein wird in einer mit 3,6 1 PVC-Pulver (Geon X der Firma Serva, Heidelberg) fassenden horizontalen Elektrophorese-Apparatur (Maße: 1 = 65,0 ch, b = 7 6,,O cm, h = 1,2 cm) bei pH-Wert 8,1, einer Feldstärke von 6 V pro cm, bei einer Stromstärke voii O, 6 A während einer Laufzeit von 15 Stunden aufgetrennt. Das Transferrin-Konjugat ist deutlich in Richtung Anode gewandert. Die gelb-braune Färbung der Transferrin-haltigen Zone zeichnet sich deutlich ab von den freien Farbstoffanteilen, die unterschiedlich gefärbt und noch weiter anodenwärts gewandert sind. Das Transferrin-Konjugat mit optimalem F/P-Quotienten, der übrigens unmittelbar nach der Auftrennung bandenweise bestimmt werden kann, wird als PVC-Zone herausgeschnitten und mittels O,9?6iger Kochsalzlösung aus dem Träger ausgewaschen. Das Eiuat wird durch Ultrafiltration auf etwa 1 g % Eiweiß eingeengt.
Danach kann die Endeinstellung und Qualitätskontrolle erfolgen.
Beim Einsatz von 3,6 g IIuman-Transferrin werden ca. 3,0 g des entsprechenden fluoresceinkonjugxerten Proteins gewonnen.
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Claims (8)

Ka IG7 Pat entansprueh
1. Verfahren zur Reinigung von Protein-Konjugaten, ciie sich gegenüber den zur Konjugation eingesetzten organischen Verbindungen in ihren elektrophoretischen Eigenschaften unterscheiden, dadurch gekennzeichnet, dass das Kohkonjugat zur Abtrennung von unerwünschten Nebenprodukten und nicht umgesetzten Konjugationspartnern einer präparativen Elektrophorese unterworfen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mit Farbstoffen konjugierte antikörper haitigp Cammaglobulin-Fraktionen gereinigt v/erden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mit Fluoreszenzfarbstoffen konjugierte antikörperhaltige Gammaglobulin-Fraktionen gereinigt werden.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass elektrophoretische Verfahren mit inerten Trägern angewandt werden.
5 · Nach \erfabren der· Ansprüche 1-4 gereinigte Protein-Kon jugate .
6. Nach Verfahrm dar· Ansprüche 1 - A gereinigte Protein-Farbstoff-Kon jugate.
·7· Verwendung der Protein-Konjugate nach Anspruch 5 in der immunologischen Diagnostik.
8. Verwendung der Protein-Farbstoff-Konjugate nach Anspruch in der immunologischen Diagnostik.
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