SE422081B - Sett att pavisa proteolytiska enzymer - Google Patents

Description

a15 20 25 30 35 40 7907013-2 Det har nu befunnits att uppfinningen gör det möjligt att med hjälp av en adsorptionsprocess isolera proteolytiska enzymer på ett sådant sätt att de förblir immobiliserade ip aktiv form även efter exponering mot naturligt förekommande enzymhämmare i blodet. Förfarandet enligt uppfinningen känne- tecknas därav, att man bringar blodet i kontakt med en adsorbator som består av en bärare på vars yta sulfatgrupper är fastsatta i så hög täthet att ett första.skikt av ur provet adsorberade proteiner eller företrädesvis ett i ett förbehandlingssteg anbringat första skikt av proteiner ad- sorberar de proteolytiska enzymerna ur provet, varigenom en- g zymerna under analysen förblir immobiliserade i aktiv form även efter exponering mot naturligt förekommande enzymhämmare i blodet. De adsorberade enzymerna kan därefter selektivt på-g visas på känt sätt, antingen medan de fortfarande befinner sig .på adsorbatorn, eller efter det att de bringats i lösning genom desorption. Ett speciellt ändamål med uppfinningen är att er-, hålla ett kvantitativt värde på halten av aktiva enzymer i blod; vilket är möjligt med de enzymer som kommer att nämnas i det i följande. I A i Som adsorbator föredrar vi att använda en plast som har behandlats på det sätt som beskrivs i svenska patentansökan nr 77-06746-0. Man behandlar en plastyta av polyeten, polypropen eller polystyren med ett oxidationsmedel som är löst i koncen- I trerad svavelsyra, varefter man lämpligen sköljer ytan med vat- ten och därefter bringar den i kontakt med en vattenlösning av albumin. Oxidationsmedlet kan vara kaliumpermanganat, kalium- dikromat, natriumklorat, natríumperborat, väteperoxid eller natriumperoxid. Svavelsyrans halt av oxídationsmedel är lämpli- = gen från 1 mmol/liter upp till koncentrerad lösning. Behandlín- . gen av plastytan sker lämpligen vid rumstemperatur under en tid : av någon minut upp till någon timme. Vi föredrar att behandla polyeten med kaliumpermanganat, med en halt av 12 mmol/liter i koncentrerad svavelsyra och behandla 2 minuter vid rumstempera- tur. Den sålunda framställda ytan tycks vara något instabil. Vi i föredrar därför att belägga den med ett protein; vilket ökar stabiliteten. Vid ytor avsedda för blodkontakt är proteinet _ lämpligen albumin, företrädesvis humant albumin. Ytan kan beläg-§ gas genom att exponeras mot en vattenlösning av proteinet, lämp-f 10 15 20 25 30 40 7907013-2 ligen med en proteinhalt av minst 102 gram per liter. Expo- neríngen sker lämpligen vid rumstemperatur.

Andra adsorbatorer som är användbara i samband med före- liggande uppfinning är fasta ytor vid vilka bundits heparin el- ler heparinliknande substanser såsom chondroitinsulfat, heparan- sulfat, dermatansulfat, dextransulfat eller andra polysackarider med hög halt av sulfatgrupper i molekylen. I fallet heparin är det väsentligt att substansen binds på sådant sätt att läckage från ytan av heparin under den initiala fasen vid blodkontakt förhindras, ty i annat fall kommer heparin att återfinnas i yt- proteinskiktet varvid det absorberade enzymet snabbt inaktiveras.

En sådan yta är således inte användbar enligt föreliggande upp- finning. En heparinyta med för lågt initialt läckage av heparin kan framställas med hjälp av kovalenta bíndingsmetoder som an- Avisatg av t.ex¿_Hqffman¿mê,S.: Ann¿_§¿Y. Acad.Scí. 283, 372, 1977, eller U.S. patent 3.826.678, samt genom ett förfarande som vi tidigare beskrivit i litteraturen, Larsson et al "Thromb0Sis Research", lä, 157, 1979.

En bärare med ett olöslígt ytskikt innehållande de Ovan nämnda sulfathaltiga polysackariderna kan framställas genom att man belägger ytan med en komplex förening av polysackariden och en katjontensíd i form av en primär amin. En användbar belägg- ningsteknik är den teknik för beläggning av en yta med en kom- plex förening av heparin och en primär amin som beskrivs i pa- rencen 306.597, 315.362, 365.710, 71-04506-6, 75-05240-9, eller i p.ans. 77-08296-4. Vi föredrar den sistnämnda beläggningstek- niken, som innebär att man bringar bärarens yta i kontakt med en ' kolloidal lösning av en komplex förening av polysackariden och en katjontensid i form av en primär amin. Vi föredrar att använda en kolloidal lösning i vilken de kolloidala partiklarna har en' positiv laddning. En sådan kolloidal lösning kan framställas ge- nom att man häller en tämligen utspädd vattenlösning av poly- sackariden ned i en tämligen koncentrerad vattenlösning av en primär amin under kraftig omrörning, varvid man ser till att blandningen hela tiden innehåller ett överskott av primär amin.

För att uppnå en effektiv utfällníng av de positivt laddade kol- loidala partiklarna på bärarens yta föredrar vi att i förväg be- handla bärarens yta så att den blir negativt laddad. Detta kan man uppnå genom att väljaWen_bärare av plast och sulfatera den- 10 15 20 25 30 35 40 7997013-2 nas yta med den metod som.beskrivits ovan under hänvisning till den svenska patentansökan 77-06746-0.

I applikationer då helblod används är det viktigt att ad-D sorbatorn är av sådan beskaffenhet att trombocyterna förhindras att aktiveras och fastna vid ytkontakten. Ytan enligt uppfinnin- gen med hög halt av ytbundna sulfatgrupper har förmågan att ad- sorbera ett proteinskikt av sådan selektiv sammansättning att trombocyterna inte fastnar eller aktiveras, vilket torde bero på att fibrinogen ej fastnar på ytorna- Det resulterande prote- inskiktet har samtidigt kvar förmågan att binda proteolytiska enzymer utan att dessa kan hämmas med undantag för en heparinyta av viss beskaffenhet enligt ovan. Mängden trombocyter kan enkelt bestämmas genom bíoluminiscensmätning enligt den metod som be- skrivs av Larsson et al, Thrombosis Research, Vol.ll, sid. s17, 1977. D D de D Enligt uppfinningen skall på ytan finnas fastsittando sulfatgrupper i hög täthet. Att detta villkor är uppfyllt kan fastställas experimentellt på följande sätt.

Ytan som skall testas exponeras i form av lämpligt antal _ provbitar mot en lösning av albumin under några minuter. Därefter exponeras ytorna ytterligare några minuter, lämpligen 15, mot en lösning av albumin innehållande sådan mängd trombin att lösningen får en trombinaktivitet av ungefär 20 E/ml. Med E avses en enhet enligt NIH, dvs National Institute of Health. Provbitarna delas l därefter upp i 2 grupper. Den första gruppen inkuberas med fysiof logisk koksaltlösning och den andra med defibrinogenerad, dVS i_šiäIi§9ss§h§ftiaë_plasma-.bämvliglinkubationstidlärrlfilmin- Båda gruppernas ytkoncentration av trombinaktivitet mäts därefter genom inkuberíng med trombinspecifikt substrat, S-2238 från Kabi Diagnostica. Testytan uppfyller kraven enligt uppfinningen ,_ om trombinet ej inaktiveras av den defibrinogenerade plasman.

Det uppmätta värdet i gruppen inkuberad med defibrinogenerad plasma får ej understiga värdet erhållet i gruppen inkuberad med koksalt med mer än 50 %. Värdet i den senare gruppen bör bli minst 5-lÖ4 absorbansenheter per cmz och sekund vid den testmetod som beskrivs i exempel 1.

Adsorbatorn kan utformas på godtyckligt sätt. Den kan t.ex. ha formen av ett provrör vars innervägg har försetts med en sulfatyta enligt uppfinningen. Man fyller provröret med det 10 15 20 'u 30 40 7907015-2 blod som skall undersökas. Efter en viss tid tömmer man prov- röret, sköljer med fysiologisk koksaltlösning, och fyller prov- röret med ett specifikt reagens på det enzym man vill påvisa, lämpligen ett syntetiskt substrat. Enligt en annan utföringsform består adsorbatorn av ett i båda ändar öppet rör vars innervägg har försetts med en sulfatyta enligt uppfinningen. Röret inkopplas i en artär-ven-förbindelse på en patient t.ex. vid en operation, på ett sådant sätt att det när som helst snabbt kan lossas, varefter förekomsten av adsorberade enzymer kan under- sökas. Alternativt kan blodexponeringen ske i samband med en venpunktion. Om man önskar en stor yta hos adsorbatorn, kan denna ges formen av små korn eller kulor, vilkas yta har belagts med albumin enligt uppfinningen.

Som redan antytts, föredrar vi att påvisa adsorberade enzymer med hjälp av syntetiska substrat vilka är kommersiellt tillgängliga. Sålunda kan trombin specifikt påvisas med hjälp av S-2258, faktor Xa med S~2222, kallikrein med S-2302 och plasmin med S-2251, från Kabi Diagnostíca. Det är också möjligt att påvisa adsorption av aktiva enzymer på annat sätt än med hjälp av syntetiska substrat. Sålunda kan den s.k. kontaktpro- dukten, vilken huvudsakligen utgörs av faktor Xlla, Xla och IXa, påvisas på följande sätt. g V"__ g ' Bakgrunden till testmetoden är följande. Då citratplasma rekalcifieras sätts hela enzymkaskaden igång och förlöper olika snabbt, beroende på aktiveringsgraden av faktorerna XII, XI och IX, som aktiveras oberoende av kalcium. Tiden från kalciumtillsats fram till detekterbar fíbrinbildning kallas rekalcifieringstid. Ett känt sätt att åstadkomma en kontaktaktivering är att inkubera plasma i glasrör varvid rekalcifieringstiden kraftigt förkortas.

Om nu provbitar av en yta med hög sulfattäthet, lämpligen försköljd med albumin, inkuberas dels med normal plasma och dels med glasaktiverad plasma under 10 min och därefter sköljs med kok- saltlösning så kan man påvisa att vid förnyad inkubering med normal plasma förkortas rekalcifieringstiden i det fall då glas- aktiverad plasma tidigare använts jämfört med det fall då normal plasma också använts i den tidigare inkuberingen. Detta visar att de enzymer som ingår i kontaktprodukten adsorberats på sul- fatytan. *_ ____________ M ____ __M” .-_..........~._...-.-...f.....- -- - _... ...q-pau» 7907013-2 Exempel 1 _ Polyetylenslangar av en längd om 1 m och med en innerdia- meter av 1,8 mm behandlades invändigt med koncentrerad svavel- syra innehållande 2 gr/1 kaliumpermanganat vid rumstemperatur 5 under två minuter. Efter noggrann sköljning med vatten behand- lades slangarna med en 4% albuminlösning under 5 minuter varefter de sköljdes noga med fysiologisk koksaltlösning.

De sålunda preparerade slangarna testades därefter på följande sätt: 10 4 slangar roterades under 15 minuter på en lutande skiva I med l ml av en fysiologisk koksaltlösning innehållande 4 % albumin och 20 E/ml trombin. Efter roteríng sköljdes alla slan- garna noga med koksultlösning, varefter 2 st rotorados 5 min med defibrinogenerad plasma och sköljdes med koksaltlösníng. 15 Förekomst av ytbunden tromhinaktivitet påvisades därefter genoms att i längder om 45 cm av slangarna inkubera O;7 ml av en lös- ning av trombinspecifikt substrat S-2238, löst i en tris-buffert med pH 8,4 enligt tillverkarens anvisningar. Inkubationen gick till så att substratlösningen sögs upp i testslangen med hjälp 20 av en reversibel slangpump med en hastighet av 2,5 cm/sek var- efter lösningsvolymen reverserades fram och åter till lösningen pumpades direkt ned i 0,3 ml ísättika. Den totala inkuhations- tiden valdes till 80 sekunder. , Under inverkan v trombin avspjdlkas_paranitroanilin frångp 25 psubstratet och_halten av denna, som enkelt kan mätas foto- metriskt, är således proportionell mot trombinaktiviteten. Reaktio- nen avslutas genom att förskjuta pH med hjälp av isättíka.

Absorbansen hos lösningen uppmättes vid 405 nm och l cmÄ optisk gångväg och blev: i 30 I iürupp 1 (koksaltsköljníngj 1,100 Grupp 2 (koksaltsköljning + defini- brinogenerad plasma) 1,100 Genom att jämföra de erhållna värdena med en standardkurva erhållen genom att ínkubera substratlösning med olika kända halter av trombin kan de erhållna värdena uppskattas att mot- svara en ytkonçentration av trombin av O,§“§/cm. ,._-,-.ñ,__--,_._ m.. .._....._ . - ___.. -_..._,-~.-_~_-_-.

Vid motsvarande försök med obehandlad polyetylenslang noterades absorbansen 0 i båda grupperna. 40 10 15 20 25 30 35 40 7907013-2 Försöket visar att trombinet binds till albumínskiktet och undandras plasmans trombinhämmarsystem.

Exempel 2 Polyetylenslangar av längd om 1 m och med en innerdiameter av 1,8 mm behandlades invändigt med koncentrerad svavelsyra innehållande 2 g/l kaliumpermanganat vid rumstemperatur under två minuter. Efter noggrann sköljning roterades slangarna med l ml av trombocytfri citratplasma under 60 minuter varefter slangarna sköljdes noggrant med fysiologisk koksaltlösning.

De sålunda preparerade slangarna testades därefter på samma sätt som beskrivits i Exempel l, varvid följande värden på absorbansen uppmättes: Grupp l (koksalt) 1,090 Grupp 2 (defibrinogenerad plasma) 1,120 Försöket visar att sulfatytan efter kontakt med blodplasma har förmåga att binda trombin.

Exempel 3 Polyetylenslangar av en längd om 90 cm och med en inner- diameter av 3,7 mm behandlades invändigt med koncentrerad sva- velsyra innehållande 2 g/l kaliumpermanganat vid rumstemperatur under två minuter. Efter noggrann sköljning behandlades med en 4% albuminlösning, varefter slangarna sköljdes med fy- siologisk koksaltlösning.

De sålunda preparerade slangarna testades sedan under in vivo förhållanden enligt följande. Slangarna anbringades som* arterio-venös shunt mellan arteria och vena femoralis på hundar under olika tider. Slangarna komprimerades så att blodflödet blev ca 40 ml/min. Efter avslutad exponeringstid (20 min) av- lägsnades testslangen och sköljdes omedelbart med koksaltlös- ning. 30 cm av varje slang testades därefter konsekutivt med 4 olika enzymsubstrat enligt Exempel 1, under beaktande av de rekommendationer om val av buffertlösningar som lämnats av till- verkare av substraten. De olika substraten framgår av nedanstå- ende tabell.

Följande absorbansvärden uppmättes: Substrat Absorbansvärde S-2302 (kallekrein) 0,342 S-2251 (plasmin) 0,325 S-2222 (faktor Xa) 0,239 S-2238 (trombin) 0,388 - - V ...-~...,....-... ~ .- ...,._...»..~......,.-. _ _. ...__ _... 10 15 20 30 35' 40 _ Följande resultat erhölls: 7907013-2 Försöket visar att de nämnda enzymerna adsorberas utan att inaktiveras på en yta enligt uppfinningen vid kontakt med cir- kulerande blod in vivo.

Exempel 4 7 Polyetylenslangar av en längd om l m och med en innerdia- meter av 1,8 mm behandlades invändigt med koncentrerad svavel- syra innehållande 2 g/l av kaliumpermanganat vid rumstemperatur under två minuter. Efter noggrann sköljning behandlades med eng 3 albuminlösning under 5 minuter, varefter slangarna sköljdes noga med fysiologisk koksaltlösning. 7 7De sålunda preparerade slangarna roterades i en grupp med normal citratplasma och í en annan med citratplasma som aktive- rats genom rotering i glasrör under 10 minuter vid 3796. Slan- garna sköljdes därefter noga med fysiologisk koksaltlösning och samtliga roterades därefter med normal citratplasma under 10 minuter. Plasmaproverna från sista roteringen samt tillhöran- de kontrollprover testades slutligen i ett rekalcifieríngstest; Plasmaprov normalplasma, ej roterad 517 normalplasma, aktiverad i glasrör 148 normalplasma, roterad i slangar försköljda med.normal cítratplasma- S48 normalplasma, roterad i slangar försköljda med glasaktiverad plasma 340 Försöket visar att en yta med ett albumínskikt enligt upp- finningen förmår adsorbera de aktiva enzym'XIIa, Xla, IXa (kon- taktprodukt) som bildas då citratplasma aktiveras genom glas- kontakt. ' * * * Rekalcifieringstid (sek)

Claims (6)

' e 7907013-2 PATENTKRAV

1. Förfarande för påvisande av proteolytiska enzymer i blod genom att man bringar blodet i kontakt med en adsorbator, varvid enzymerna adsorberas på adsorbatorn, varefter man på i och för sig känt sätt undersöker förekomsten av adsorberade en- zymer, k ä n n e t e c k n a t därav, att man bringar blodet i kontakt med en adsorbator som består av en bärare på vars yta sulfatgrupper är fastsatta i så hög täthet att ett första skikt av ur provet adsorberade proteiner eller företrädesvis ett i ett förbehandlingssteg anbringat första skikt av proteiner adsorbe- rar de proteolytiska enzymerna ur provet, varigenom enzymerna under analysen förblir immobiliserade i aktiv form även efter exponering mot naturligt förekommande enzymhämmare i blodet.

2. '2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att man undersöker förekomsten av adsorberade blodkoagu- lationsenzymer.

3. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att ytan med fastsittande sulfatgrupper i hög täthet har framställts genom behandling av en plastyta av polyeten, poly- propen eller polystyren med ett oxidationsmedel som är löst i koncentreradzsvavelsyra.

4. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att proteinskiktet anbringas på bärarens yta genom att ytan med fastsittande sulfatgrupper i hög täthet behandlas med en vattenlösning av proteinet.

5. Förfarande enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t därav, att albumin anbringas på bärarens yta som protein.

6. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att proteinskiktet anbringas på bärarens yta genom att ytan med fastsittande sulfatgrupper i hög täthet bringas i kon- takt med det blod i vílket proteolytiska enzymer skall påvisas, varvid de ytbundna sulfatgrupperna ur blodet selektivt adsorbe- rar proteiner som har förmågan att binda proteolytiska enzymer i aktiv form.