CN101918535B - 由粗甘油制备营养性、治疗性或感官性产品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备营养性、治疗性或感官性产品的方法，是通过在包括粗甘油作为一种可能碳源的培养基中，在有氧条件下生长非重组酵母以产生酵母产品来完成的。所述酵母产品经过加工，可获得酵母泥、酵母代谢物、碳水化合物、蛋白质、功能性蛋白质、核苷酸、酵母自溶物、酵母提取物、酵母细胞壁、β葡聚糖、甘露聚糖或来源于矿化酵母产品的产品等营养性、治疗性或感官性产品。

Description

由粗甘油制备营养性、治疗性或感官性产品的方法
技术领域
本发明尤其(但非排他地)涉及一种使用粗甘油作为原料发酵酵母来制造营养性、治疗性和/或感官性产品的方法。
背景技术
粗甘油可作为肥皂和清洁剂生产、酒精饮料生产、脂肪酸制造和生物柴油生产等工艺的副产物而大量获得。生物柴油是一种来源于植物油或动物脂肪的燃料，可用于柴油机和加热***中。这种燃料是可再生而且无毒的，其使用可减少有害排放。因此，全世界涌现了生物柴油的制造，使其成为昂贵而具污染性的石油基燃料的引人注目的替代品。2008年，据美国国家生物柴油委员会(United States National Biodiesel Board)报导，单单在美国，生物柴油制造就达到了每年22.4亿加仑(参看http://www.biodiesel.org/pdf files/fuelfactsheets/ production capacity.pdf)。随着如此大量的生物柴油被制造出来，过量的粗甘油超过了化妆品、个人护理产品和药品等传统应用对于甘油的需求。此外，针对这类用途精制粗甘油的过程昂贵而且耗能大，使得精制不可能是解决过量粗甘油的完善方案。
人们评估了多种方法来处理粗甘油过度供应的问题，包括使用粗甘油作为动物饲料(例如参看Cerrate等人(2006)Int.J.Poult.Sci.5：1001)，以及将粗甘油转化成1，3-丙二醇等产品(例如参看Asad-ur-Rehamn等人(2008)Journal ofChemical Technology & Biotechnology，83(7)：1072)。然而，大规模实施这些方法的可行性被证实是难以实现的，因此，仍然需要能够将过量粗甘油转化成高价值产品的可行方法。
发明内容
本发明提供一种利用粗甘油制造具有高质量和高价值的营养性、治疗性或感官性产品的方法。
根据本发明第一实施例，提供一种制备营养性、治疗性或感官性产品的方法，其包含：
(a)在包含作为至少一种碳源的粗甘油以及一种或多种氮源的培养基存在下，在有氧条件下生长非重组酵母，以产生酵母产品；其中培养基中的碳氮比小于90∶1；和
(b)加工酵母产品，获得营养性、治疗性或感官性产品。
根据本发明第二实施例，提供一种制备营养性、治疗性或感官性产品的方法，其包含：
(a)在包含作为至少一种碳源的粗甘油以及一种或多种氮源的培养基存在下，在有氧条件下生长产朊假丝酵母(Candida utilis)，以产生酵母产品；和
(b)加工酵母产品，获得营养性、治疗性或感官性产品。
根据本发明第三实施例，提供一种制备营养性、治疗性或感官性产品的方法，其包含：
(a)在包含作为至少一种碳源的粗甘油、一种或多种氮源以及一种或多种选自由硒、铬、钼、锗、锌、铁、铜、镁、锰、碘和其组合组成的群组的元素的培养基存在下，在有氧条件下生长非重组酵母，以产生矿化酵母产品；和
(b)加工矿化酵母产品，获得营养性、治疗性或感官性产品。
根据本发明第四实施例，提供一种适用于人类和/或动物的营养性或感官性产品，其是由本发明第一、第二或第三实施例中描述的方法制备而成。
根据本发明第五实施例，提供一种适用于人类和/或动物的治疗性产品，其是由本发明第一、第二或第三实施例中描述的方法制备而成。
具体实施方式
除非文中另有需要，否则本说明书通篇和以下权利要求书中，“包含”一词应理解为暗含包括所述整数或步骤或者一组整数或步骤在内，但不排除任何其它整数或步骤，或者任何其它组整数或步骤。
本说明书内提到的文献都是按引用全部并入本文中。
本说明书中提到的任何现有技术不是而且不应视为承认或以任何形式暗示，所述现有技术形成澳大利亚普通常识的一部分。
如上文所提到的，在一个宽泛实施例中，本发明涉及通过在包括粗甘油的培养基上生长酵母，来制备来源于酵母的营养性、治疗性或感官性产品的方法。可根据本发明的方法生长的酵母是能够使用粗甘油作为可同化碳源的非重组酵母生物体。术语“非重组酵母”用于指尚未通过引入来自另一生物体的遗传物质或去除遗传物质而有意地改变基因组的酵母生物体。因此，适于本发明的酵母生物体可以包括基因组随机改变，但未通过例如(但不限于)选择育种和/或在选择压力下突变等基因工程改造技术来***外来遗传物质的生物体。
此类非重组酵母生物体包括(但不限于)产朊假丝酵母(Candida utilis)、弯假丝酵母(Candida curvata)、西班牙假丝酵母(Candida hispaniensis)、Candidabentonensis、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、椭圆酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或其组合。优选所述酵母是产朊假丝酵母。根据本发明，也可能需要生长两种或两种以上酵母生物体，以产生复合的酵母生物质。
酵母生物体的其它实施例可包括(但不限于)属于以下各属的酵母种类或其菌株：球拟酵母属(Torulopsis)、红酵母属(Rhodotorula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、德巴里酵母属(Debaromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、地丝菌属(Geotrichum)、汉逊酵母属(Hansenulae)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、毛孢子菌属(Trichosporon)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、芽孢酵母属(Aciculoconidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Apiotrichum、被孢霉属(Mortierella)、小克银汉霉属(Cunninghamellae)、毛霉目(Mucorales)、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)或担子菌纲(Basidiomycetes)，而且其是非重组的，并能够使用粗甘油作为碳源。如所属领域技术人员所了解的，上文所列的各酵母生物体可具有其它分类。例如，产朊假丝酵母也称为杰丁毕赤酵母(Pichia jadinii)。
术语“粗甘油”用于指由一种或多种工艺产生并且未经蒸馏的甘油，所述一种或多种工艺包括(但不限于)植物油或动物脂肪制造生物柴油的酯基转移；脂肪或油制造脂肪酸的水解；和脂肪或油制造肥皂和清洁剂的皂化。由所述工艺获得的粗甘油可具有多种杂质含量。
例如，作为生物柴油工艺的副产物，以重量比(wt/wt)计，粗甘油可含有约15％至约95％甘油，以及不同量的杂质，包括(但不限于)脂肪酸和/或其盐；短链烷基醇，例如甲醇或乙醇；无机盐；水，以及非甘油有机物质(Matter OrganicNon-Glycerol，MONG)，包括单酸甘油酯和二酸甘油酯、二甘油、聚甘油醚、丙烯醛(例如高温食用油是生物柴油原料的情形)和生物柴油本身。由生物柴油制造获得的粗甘油的pH值可在约2到12的范围内，更通常为约4到10。粗甘油中pH值的变化、杂质性质和各杂质的量受多种因素影响，包括生物柴油原料(三酸甘油酯)的质量与纯度、酯基转移工艺中使用的催化剂的量，和所使用的加工技术。例如，以重量比计(wt/wt)，由生物柴油制造获得的粗甘油可含有60％到85％甘油，余量为脂肪酸或其盐(5％到35％)、无机盐(5％到20％)和MONG(＜10％)。
优选以重量比计，根据本发明使用的粗甘油含有约20％到约95％甘油。更优选以重量比计，粗甘油含有约40％到约90％甘油。最优选以重量比计，粗甘油含有约80％到约90％甘油。
粗甘油中存在的杂质，例如脂肪酸、甲醇、无机盐和丙烯醛，可抑制某些微生物的生长。这些杂质甚至还可能有毒，或仅仅限制可达到的细胞密度和/或工艺生产率。杂质还可能改***甘油的颜色、香味和味道，而这又会影响由本发明方法制备的酵母产品的颜色、香味和味道。例如，由生物柴油制造获得的粗甘油的颜色会呈深褐色，而取决于产品，这种颜色可能是不被接受的。本发明的关键方面在于，所得来源于酵母的产品的颜色、香味和味道具有市场上可接受的质量，而且多种粗甘油的质量始终如一。因此，在添加到培养基中前，可能需要对粗甘油进行处理，以便至少部分纯化粗甘油，去除一种或多种杂质。或者，可以选择不受杂质抑制，而仍能够提供例如用于营养或药用目的的高价值产品或提取物的非重组微生物。
为了实现粗甘油的部分纯化，取决于粗甘油的纯度和欲实现的所需纯化，粗物质可经历一种或多种处理，包括(但不限于)酸化、吸收和过滤。例如，添加一种或多种无机酸(例如磷酸、硫酸、盐酸或硝酸)和/或一种或多种有机酸(例如乙酸、氯乙酸、甲烷磺酸和其类似物)降低pH值，可以将脂肪酸与粗甘油分离，从而通过倾析、离心或其它方式将其去除。如果粗甘油经历酸化处理，则优选使用磷酸。必要时，可以通过蒸馏或其它方法，去除粗甘油内的挥发性物质，例如甲醇。单酸甘油酯和二酸甘油酯可以例如通过皂化形成其它甘油和脂肪酸盐去除。其它可能的粗甘油处理方法包括(但不限于)通过离子交换法、反渗透法、纳滤法(nanofiltration)、超滤法和/或滤过吸附剂的方法去除无机或有机盐。例如，可通过使粗甘油经历活性炭和/或膨润土等吸附剂处理，来去除不利的颜色、味道和香味。
在使用一种以上纯化方法的情况下，可以选择任何次序，优选能最有效实现所需纯化的次序。如果粗甘油确实经历了一个或多个部分纯化步骤，则预期经过处理的粗甘油中甘油的含量(以重量百分比计)将保持在20重量％到95重量％的近似范围内。有关粗甘油的来源、质量范围和处理选择的其它细节，可见于多个文献中，包括Glycerine：A Key Cosmetic Ingredient，Eric Jungermannn &Norman O.V.Sonntag编辑，Marcel Dekker Incorporated，1991，ISBN978-0824784652，其按引用并入本文中。但是取决于所得粗甘油的质量，可以省略部分纯化的步骤。
本发明的方法可包括以下步骤：任选部分纯化粗甘油，以去除或减少一种或多种杂质；将处理过的粗甘油供应给有氧酵母发酵***；在实质上无菌的条件下，以分批、补料分批、半连续、连续模式或其组合培养酵母；收集培养物和分离酵母；以及回收和进一步加工酵母发酵产物。本发明优选提供利用处理过的粗甘油，通过在实质上无菌的连续有氧发酵***中生长非重组酵母，来产生酵母和来源于酵母的产品的方法。
根据本发明，在合成培养基内处理过的或未经过处理的粗甘油是可在所述合成培养基上生长的酵母的一种可能的可同化碳源。可与未经过处理或经过处理的粗甘油一起包括在培养基内的其它可同化碳源包括(但不限于)葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖、纤维二糖、***糖和/或半乳糖等糖，以及可发酵糖源，包括(但不限于)啤酒厂糖残余物、糖蜜、玉米浆、木材加工废水和/或乳清。优选使非重组酵母在包括经过处理或未经过处理的粗甘油作为唯一可同化碳源的合成培养基上生长。此类酵母包括产朊假丝酵母、椭圆酿酒酵母、贝酵母和/或马克斯克鲁维酵母的选定菌株。所述酵母可进一步加工来提供人类食品级产品。
可如所属领域技术人员所知，以一种操作模式(分批、补料分批、半连续、连续或其组合)制备接种物或种子培养物，随后用于装入发酵罐中以便在相同或不同模式或其组合下操作。所属领域技术人员已知各模式的细节，例如，可见于以下课本中：Fermentation and Biochemical Engineering Handbook：Principles，Process Design and Equipment，第2版，H C Vogel & C L Todaro编辑，NoyesPublications(New Jersey)1997，ISBN 0-8155-1407-7，其按引用并入本文中。为了获得高生产率，优选补料分批、半连续或连续操作模式。最优选在实质上无菌的条件下，以连续模式操作发酵罐。
在连续操作期间，稀释率(D)是一个重要参数，因为它是发酵罐体积中每小时的发酵罐体积通过量，即，如果D是0.1/小时，则2000升发酵罐中每小时更换200升。工业发酵罐的最佳稀释率是根据所需生产率、下游加工设备的能力和所需产品质量的精确细节确定。生物体的最大生长速率代表着稀释率的上限，以避免出现发酵罐中的细胞密度迅速降低到零的“洗出(wash out)”效应。稀释率优选为约0.05到约0.25/小时。如所属领域技术人员所了解的，稀释率较高，可增加所产生的生物质的核糖核酸含量，取决于应用，这可能是或可能不是所想要的。
除稀释率外，还优选使用常规方式控制其它发酵条件，例如溶解氧浓度(通风)、营养物组成、pH值和温度等，来提供最佳酵母产量。很明显，为了达到并保持高发酵生产率，所有营养物都应以足量或以足够比率提供。
具体地说，需要将通风或溶解氧(Dissolved Oxygen，DO)保持在大于零的水平。如所属领域技术人员所知，这可以通过向发酵罐中供应大量空气并同时利用高剪切混合机实现。或者，可以将富含氧的空气供应到发酵罐中。穿过发酵罐的典型气体通量在每分钟约0.1到10个发酵罐体积(vvm)的范围内。保持DO大于零所需的精确气体通量将取决于培养细胞密度、其具体的氧摄取需求、稀释率(适用时)、操作压力和发酵容器的物理参数等因素。溶解氧的浓度优选超过2％的空气饱和度，更优选超过5％的空气饱和度。
发酵培养基中甘油的浓度(无论是由未经过处理还是经过处理的粗甘油提供)应足以支持酵母进一步生长和生产率，同时又低于可能因渗透压影响而抑制酵母生长的限度。培养基中甘油的浓度优选为约0.1克/升到约500.0克/升。培养基中甘油的浓度更优选为约50.0克/升到约200.0克/升。培养基中甘油的浓度最优选为约70.0克/升到约150.0克/升。培养基中约70.0克/升到约150.0克/升的甘油浓度，会产生以干重计在25.0到90.0克/升的近似范围内的细胞密度。如果培养基除甘油外，还含有其它可同化碳源，则所有碳源的总浓度优选为约0.1克/升到约500.0克/升。如所属领域技术人员所了解，发酵罐中碳源的浓度可能不同于供应到发酵罐中的碳源的浓度。
培养基中还包括氮，而且一种或多种氮源可包括(但不限于)氨、其一种或多种无机盐、一种或多种有机铵盐、酵母提取物、尿素、硝酸、一种或多种无机亚硝酸盐和/或一种或多种无机硝酸盐。发酵培养基中的氮源优选为氨水溶液或氨气，或者一种或多种无机铵盐。发酵期间，也可以使用氨控制pH值。
发酵培养基中碳与氮(C/N)的比率小于90∶1。优选C/N比小于或等于80∶1。更优选C/N比小于或等于40∶1，甚至更优选小于或等于20∶1。最优选C/N比小于或等于10∶1。C/N比为10∶1，会由甘油产生50％干生物质的产率(以纯的计)。根据本发明可以达到较高的生物质产率，即使预计C/N比小于90∶1可能会使更多的酵母暴露于未经过处理或经过处理的粗甘油中可能具抑制作用的杂质。
在酵母生长不受氧等其它生长限制因素限制的情况下，碳氮比越低，则生长受可用碳量限制的可能性越大。根据本发明，酵母生长可受一个以上因素限制，或受除可用碳外的因素限制。在无其它生长限制因素存在的情况下，C/N比为90∶1或大于90∶1，会使酵母生长受到可用氮量限制，而C/N比低于3∶1，则会导致氮利用率低下。
取决于酵母种类或其菌株，培养基还可以含有一种或多种大量营养物(macro-nutrient)，例如矿物盐或其元素；或微量营养物(micro-nutrient)，例如维生素。例如，产朊假丝酵母需要硫(S)、氮(N)、磷(P)、钾(K)、镁(Mg)、钠(Na)、钙(Ca)、锌(Zn)、铁(Fe)、锰(Mn)、钴(Co)、铜(Cu)、钼(Mo)和硼(B)等元素来支持生长，但不需要维生素。然而，如果酵母种类或其菌株需要一种或多种维生素，例如硫胺素、烟酸、吡哆醇、生物素、肌醇、泛酸等，则所属领域技术人员将认识到，维生素的供应优选独立于其它进料，而且还应根据特定酵母生物体提供必要的维生素量。
培养基中元素的浓度由多种因素决定。浓度下限是由特定酵母菌株在特定生长条件下的需要决定。浓度上限是由特定元素开始变得对特定酵母种类的生长有抑制作用或甚至有毒的浓度决定。抑制作用/毒性可能专门针对某些元素(例如，低含量的重金属是必不可少的，但含量较高则有毒)，或所述影响可能是由高浓度引起的离子强度或渗透压产生。
如所属领域技术人员所了解的，可以将培养基中的各种组分(例如经过处理或未经过处理的甘油、矿物盐或其元素、氮源、水和任选使用的微量营养物)分别引入发酵罐中；以单一混合物形式引入，或者以两种或两种以上各含有两种或两种以上组分的个别混合物形式引入。送入发酵罐中的组分混合物优选以至少减少(如果不能消除的话)沉淀作用的方式制备。
发酵罐的pH值应保持在满足酵母生长的水平范围内，通常为pH 3.0到pH8.0。pH值优选应保持在几乎没有其它微生物能良好生长的水平，例如小于4.5，以使污染的风险减到最小。pH值最优选小于4.0。本发明人已经发现，根据本发明，例如产朊假丝酵母生长的pH值最优选为3.6。
也可以控制工艺温度，而且其应高到足以达到较快的生长速率，但在酵母种类或菌株的耐受性所确定的上限内。可能时，优选较高的温度。对于酵母生长，温度为约20.0℃到约40.0℃。更优选温度为约25.0℃到约36.0℃。本发明人已经发现，根据本发明，例如产朊假丝酵母生长的温度最优选为35.0℃。
由甘油(无论是由未经过处理还是经过处理的粗甘油提供)得到的酵母生物质的产率将取决于酵母种类或其菌株，以及其它可能的限制因素的存在与否。产率定义为每克碳源(以干重计)细胞的克数(以干重计)。在无其它限制存在的情况下，在含有未经过处理或经过处理的粗甘油的培养基存在下生长的酵母的产率可为约25.0％到约80.0％。以干重计，相应细胞密度为约5.0克/升到大于或等于150.0克/升。以干重计，细胞密度优选为约20.0克/升到大于或等于100.0克/升。以干重计，细胞密度更优选为约30.0克/升到大于或等于80.0克/升。以干重计，细胞密度最优选大于50.0克/升。为了使水的使用减到最少以及帮助通过脱水回收产物，优选较高的细胞密度。
较高的细胞密度在理论上是可行的，但在连续操作模式中，DO的供应会成为限速因素，除非稀释率极低。本发明人已经发现，取决于所用粗甘油的纯度，根据本发明在粗甘油上以连续模式生长的产朊假丝酵母的产率和细胞密度类似于或者甚至高于利用纯甘油达到的产率和细胞密度。还发现，本发明方法可以使酵母生长展现大于或等于0.85克/升·小时的工艺生产率。优选工艺生产率大于或等于1.00克/升·小时，更优选生产率大于或等于2.00克/升·小时，最优选生产率大于或等于3.00克/升·小时。
通常，本发明产品是无毒的，因为其被认为对预定的营养性、治疗性或感官性使用是安全的。由本发明方法制造的酵母产品可以是生物体本身、分泌的代谢物，或通过进一步加工所培养的酵母得到的产品。在酵母产品是酵母生物体本身的情况下，所述酵母可用于人类、动物或二者，以达到营养、治疗或感官目的。进一步加工可得到酵母自溶物和提取物等产品，其例如可用作调味成分和增味剂。通过本发明方法可以获得的其它产品包括核苷酸，例如GMP和IMP，其可单独或组合用作增味剂，而且还可以包括一种或多种酵母提取物。由酵母得到的具有乳化、增稠、结合脂肪和蛋清代用等所需功能特性的蛋白质部分也是本发明的产品。
可以根据本发明方法制备的其它产品包括来源于酵母细胞壁的β-葡聚糖。β-葡聚糖可具有有益的感官特性。根据本发明，感官性产品是一种经过加工的酵母产品，其可为终产品提供所需味道、颜色、气味和/或感觉(包括口感)。例如，在食品制备的情况下，适合的感官特性可包括白色或灰白色、可口的味道(例如肉味或咸味)和/或令人愉快的气味(例如非酵母样香味)。
根据本发明，具有免疫刺激性的β-葡聚糖也可例如用作治疗性产品。治疗性产品定义为可改善、改良或治疗有需要个体的疾病或病症(例如，缓解疾病的一种或多种症状，或者停滞、逆转或另外减缓疾病一种或多种症状的进展或其严重程度)的经过加工的酵母产品，或对有需要个体具有预防作用(例如，在疾病或病状的症状显现之前，预防或延缓疾病或其症状的发作，或另外减轻症状的范围或严重程度)的经过加工的酵母产品。
治疗性产品可投予植物(例如农作物、观赏植物)，或动物(例如水生动物个体，例如鱼、虾)，或哺乳动物个体等个体。哺乳动物个体可包括(但不限于)人类、灵长类动物、家畜(包括(但不限于)奶牛、马、绵羊、猪和山羊)、伴侣动物(包括(但不限于)狗、猫、兔、豚鼠)和圈养野生动物。也涵盖实验室动物，例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。个体优选是哺乳动物个体。
实现治疗作用的合适剂量和给药方案可由主治医师或兽医决定，而且可以取决于所治疗的特定病状、病状的严重程度以及个体的一般年龄、健康和体重。对于某些应用(例如动物饲料或水产养殖)，治疗性产品的剂量也可由成本效益分析确定。治疗性产品可以单剂或一系列剂量投予。尽管可能单独投予治疗性产品，但其也可以呈与一种或多种与组合物中其它成分相容而且对个体无害的载剂、稀释剂、赋形剂或佐剂的组合物形式，优选是药物组合物(例如参看Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing，1990，按引用并入本文中)。所述载剂、稀释剂、赋形剂或佐剂包括所有常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载剂、包衣、抗真菌剂和抗细菌剂、透皮剂、表面活性剂、等渗剂和吸收剂等。应了解，组合物还可以包括其它辅助性生理活性物质。
治疗性产品或其组合物适宜经口、直肠、鼻、局部(包括皮肤、口腔和舌下)、***或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)投予。组合物适宜以单位剂型(包括胶囊、药袋、片剂、散剂、颗粒剂、锭剂、口嚼锭、软锭、漱口液；于水性或非水性液体中的溶液、悬浮液或糊浆；或水包油乳液或油包水乳液、洗液、凝胶、乳膏、油膏或泡沫剂)提供，并且可以利用药剂学领域众所周知的任何方法制备。
除治疗性产品外，营养性产品也可以由本发明方法获得。根据本发明，营养性产品是一种经过加工的酵母产品，其可提供、补充或新补给活个体(例如哺乳动物个体，包括人类和上述动物；以及植物，包括农作物和观赏性植物；细菌和真菌)生长、繁殖、改善或维持健康和其它异养需求以及延迟、逆转或防止过早老化或其症状所需的营养物。营养性产品还可用于完全或部分强化任何活个体的食品、饮料、水或营养物补充源(例如盐砖)。例如，本发明的经过加工的酵母产品的营养价值可以是蛋白质和氨基酸含量、碳水化合物含量(例如膳食纤维源)和/或维生素含量。
根据本发明，营养性产品可来源于矿化酵母。例如，矿化酵母可以是无法从传统膳食组合物中获得足量的必需痕量矿物质时，人类食品或动物饲料应用中的重要补充。本发明的矿化酵母产品是在有氧和实质上无菌的条件下于水性培养中生长。所述培养基包括作为一种可能碳源的经过处理或未经过处理的粗甘油，以及一种或多种能被酵母吸收的元素，由此以分批、补料分批、半连续或连续模式或其组合产生矿化酵母。优选以连续模式产生矿化酵母产品。
矿化酵母生长的条件和参数的范围，包括通风、温度、pH值、C/N比、营养物组成和甘油浓度，都与上述条件和参数类似，只是培养基中一种或多种元素的量和/或存在可变化。为了制造矿化酵母产物，可将一种或多种预期会被酵母吸收的元素足量添加到培养基中。如果培养基中一种或多种其它元素与所需元素的吸收竞争，则所需元素的添加还需要减少这些元素。某些元素还可能抑制酵母生长，而且进行发酵工艺的方式应使矿物质对发酵性能的不利影响减到最小，同时又使酵母中所需元素的并入产率和由粗甘油制造酵母生物质的产率最大化。适于此目的的方法包括(但不限于)提供缺乏可与所需元素(例如硒)的吸收竞争的元素(例如硫)的培养基，以及控制所需元素的供应。制备缺乏硫的培养基的一种可能方法是将硝酸添加到矿物盐中以平衡酸度，同时降低矿物盐中硫酸的量。以此方式，硝酸也充当氮源。
并入酵母中的优选元素是对例如人类或动物提供健康或营养益处并且无机形式不易被生物利用的元素，包括(但不限于)硒、铬、钼、锗、锌、铁、铜、镁、锰、碘和其组合。因此，矿化酵母产品中含有的硒、铬、钼、锗、锌、铁、铜、镁、锰、碘和其组合等一种或多种元素的含量增高。这些元素在自然界仅以痕量水平存在，而来源于矿化酵母的本发明产品含有显著增高的含量。取决于元素、酵母种类或菌株以及酵母生长的条件，以干重计，所述增高的含量可在约百万分之一百到约百万分之五万(parts per million，ppm)各元素的范围内。以干重计，优选矿化酵母产品中所需元素应实质上呈有机形式(例如硒代甲硫氨酸)，以使生物利用率最大。尽管矿化酵母产品可经过处理而产生营养性产品，但预期矿化酵母产品经过加工，也可以产生治疗性产品或感官性产品。
适于产生矿化酵母产品的酵母生物体是能够使用未经过处理或经过处理的粗甘油作为碳源并且吸收所需元素的任何非重组生物体。此类酵母包括(但不限于)产朊假丝酵母、弯假丝酵母、西班牙假丝酵母、Candida bentonensis、马克斯克鲁维酵母、贝酵母、椭圆酿酒酵母或其组合。优选酵母是产朊假丝酵母(杰丁毕赤酵母)。根据本发明，也可能需要生长两种或两种以上酵母生物体，以产生复合的矿化酵母生物质。酵母生物体的其它实施例可包括(但不限于)属于以下各属的酵母种类或其菌株：球拟酵母属、红酵母属、克鲁维酵母菌属、德巴里酵母属、毕赤酵母属、地丝菌属、汉逊酵母属、纤维单胞菌属、毛孢子菌属、黄单胞菌属、耶罗威亚酵母属、芽孢酵母属、隐球菌属、Apiotrichum、被孢霉属、小克银汉霉属、毛霉目、毛霉属、根霉属或担子菌纲，而且其是非重组的，并能够使用粗甘油作为碳源并吸收所供应的所需矿物质。
本发明的营养性、治疗性或感官性产品是通过加工矿化或非矿化酵母产品获得。可利用所属领域中已知的任何方法，例如离心、过滤等，收集由发酵得到的酵母产品。例如，可能有必要通过离心和/或过滤从上清液中分离出矿化或非矿化酵母产品。随后，可利用以下一种或多种工艺，包括(但不限于)洗涤、萃取、干燥(例如，使用转鼓式干燥机或喷雾干燥机)、自溶、分级分离或浓缩，进一步加工所得酵母泥，由此产生营养性、治疗性或感官性产品。还可以加工所得上清液，以从用过的培养基中分离出酵母代谢物，由此产生营养性、治疗性或感官性产品。或者，可以有氧或无氧方式消化上清液，并将由此产生的水从所得泥浆中分离出来，并且再循环到有氧发酵工艺中。
酵母泥可经历均质化，包括高压均质化、超声波处理和/或其它溶解法(例如使用清洁剂)，获得蛋白质/氨基酸和碳水化合物作为营养性、治疗性或感官性产品。由酵母泥获得的蛋白质可任选进一步衍生化，提供能用作营养性、治疗性或感官性产品的功能性蛋白质。任选衍生化的功能性蛋白质可例如用作乳化剂、增稠剂、脂肪结合剂、蛋清代用品和冰淇淋稳定剂。功能性蛋白质以及如核苷酸等其它产品的制备中酵母生物质的使用例如描述于：Use of Yeast Biomassin Food Production，CRC Press，A.Halasz & R Lasztity，1991，第5章，第8章和附录第291到第300页，以及其中的参考文献中，其按引用并入本文中。
还可以用蛋白酶等酶，酶促消化酵母泥，通过离心和/或过滤分离得到酵母提取物和酵母细胞壁。酵母细胞壁部分可例如通过转鼓式干燥或喷雾干燥进行干燥，而且可以通过研磨和筛分等方法减小所得干物质的粒度。干燥的酵母细胞壁以及酵母提取物都可用作营养性、治疗性或感官性产品。例如，酵母细胞壁的干粉可用作复合多糖的来源，或用于其它营养或药妆目的。例如，其还可以是具有免疫刺激特性的β-葡聚糖的来源。
来自椭圆酿酒酵母的作为酵母提取过程的副产物产生并且随后经过干燥的酵母细胞壁，可含有约30％β-葡聚糖、约30％甘露聚糖、约15％蛋白质和约5％到10％脂质，以及其它组分，例如甘露糖蛋白和壳多糖。但是，各酵母细胞壁组分的含量可取决于酵母的种类或其菌株而变化。例如，由产朊假丝酵母，根据本发明制备和干燥的酵母细胞壁可含有约10％β-葡聚糖和约40％蛋白质。
可以根据所属领域中已知的方法，例如涉及水解和/或酶促降解椭圆酿酒酵母细胞壁的方法，通过选择性去除其它组分，来增大酵母细胞壁部分中β-葡聚糖的含量。可以通过化学和/或酶方法，包括(但不限于)用于去除脂质的脂酶、用于去除蛋白质和甘露糖蛋白的蛋白酶和用于去除壳多糖的壳多糖酶，去除特定的非β-葡聚糖组分。β-葡聚糖(去除或不去除酵母细胞壁中的其它非β-葡聚糖组分)可用作营养性、治疗性或感官性产品。酵母细胞壁中的其它组分也可以是本发明的营养性、治疗性或感官性产品。例如，甘露聚糖可通过用热水萃取，从酵母细胞部分中去除，随后用作营养性、治疗性或感官性产品。
现将参考以下非限制性实施例进一步描述本发明，而且所述实施例只用于例示说明。
实施例
实施例1：处理粗甘油
将由生物柴油制造得到的副产物粗甘油加温到约25℃，以使所述物质液化。粗甘油的pH值为约10.0，并且甲醇含量小于1％(重量比)。将粗甘油(1000升)转移到1300升装有顶置搅拌和加热/冷却夹套的不锈钢罐中。加温到60℃后，将85％(重量比)磷酸溶液缓慢泵入经过搅拌的混合物中，直到通过滴定确定达到终点pH 4.0。再添加水(250升)，以保持形成的盐在溶解状态。随后，使混合物静置2小时，此后，分离出下层甘油水溶液相(TCG)，并储存供用于发酵阶段。或者，可对混合物进行离心，以获得上层和下层相，随后分离。TCG相中甘油含量为约700克/升。进一步使用前，将TCG稀释到含500克/升甘油的标准浓度。取出主要由游离脂肪酸组成的上层相，以供储存、分析和处置。
任选可通过用膨润土和/或活性炭处理，去除TCG的浅琥珀色到深褐色。将膨润土和/或活性炭添加到TCG(25克/升)中，在环境温度下搅拌，随后通过离心去除。所得TCG可以是无色的。
通过HPLC，利用RI检测来分析加工之前和之后各相的甘油含量，以确定产率。
进料量：1000升，约50％到60％(重量比)甘油，即约含500到600公斤甘油
产量：约1000升，约50％(重量比)甘油，即约含500公斤甘油
产率＝TCG中得到的甘油占约95％到100％
上层相中甘油的含量约小于1％(重量比)。
实施例2：在实施例1经过处理的粗甘油存在下，连续发酵产朊假丝酵母
以连续方式建立一个2L的实验室有氧发酵罐，带有控制pH值及温度和泡沫，以及测量溶解氧(DO)、供应发酵培养基和收集培养物的设施。根据需要，向发酵罐中供应氧，以便在必要时防止连续培养的氧缺乏。
供应到发酵罐中的培养基包括以下三种组分：
(1)甘油浓度为约500克/升并且pH值为4.0的实施例1的经过处理的粗甘油(作为唯一碳源)，其是以50毫升/小时的流量提供；
(2)(i)矿物盐浓缩物(含有S、K、P、Mg、Na、Ca、Zn、Fe、Mn、Co、Cu、Mo和B)、(ii)硫酸与(iii)磷酸的混合物，所述混合物的pH值为0.8，并且以110毫升/小时的流量提供；和
(3)水，以105毫升/小时的流量提供，其量足以稀释甘油、矿物盐浓缩物、硫酸和磷酸达到下表1中所示的浓度。在供应到发酵罐中之前，这三种组分各自分别经由高压釜灭菌。
独立地调整三种组分供应的组成和相对速率，以便控制发酵的稀释率(生长速率)和发酵罐中的组成。优选发酵罐中营养物的浓度如表1中所示：
表1-发酵罐净进料中营养物的浓度
  组分   浓度(克/升)
  甘油   约80克/升
  S   1.96
  K   1.49
  P   1.02
  Mg   0.200
  Na   0.068
  Ca   0.014
  Zn   0.0026
  Fe   0.00085
  Mn   0.00025
  Co   0.000041
  Cu   0.000043
  Mo   0.000078
  B   0.000021
表1中所列浓度是在当前所述条件下各组分的适宜浓度。然而，必要时，有可能通过增加或降低特定元素的浓度，来改变表1中各元素的浓度。
接种前，向发酵罐中部分装入营养培养基，并静置过夜，以平衡DO和pH探针。必要时，在发酵期间通过加热以及向发酵罐中供应28％氨水溶液，来将发酵罐中的温度和pH值调到设定点(35℃，pH 3.6)，以便保持pH值。
用150毫升在摇瓶中生长过夜的处于指数生长期的种子培养物(分批培养)接种发酵罐。种子培养的接种物量是发酵罐体积的7.5％(体积比)。当发酵罐中细胞的光学密度大于等于10时，开始连续发酵。
使用28％氨水溶液控制pH值的一个结果是向发酵罐中供应氮。矿物盐浓缩物、硫酸与磷酸的混合物经过调配，以致保持恒定pH值所需的氨进料也供应适当的氮供含高蛋白质含量的细胞生物质生长之用。送入发酵罐中的培养基的C/N比为5.5∶1。
所述工艺产生0.15/小时的稀释率(生长速率)和55.4克/升的平均细胞密度(以干重计)。每100克含于培养基中的甘油的生物质产率(以干重计)为约70％，并且工艺生产率为8.3克/升·小时。
使用溢流***将发酵罐内含物连续收集到20升大瓶(carboy)中，并在约4℃下储存收集到的肉汤(broth)。完成后，从***采集20升肉汤，并离心，得到含约20％到25％(重量比)固体的酵母泥。
最初根据酵母泥的颜色(浅褐色)、香味(芳香，非酵母样气味)和粗蛋白质含量，评估其质量，所述粗蛋白质含量通过凯氏分析法(Kjeldahl analysis)评估为约55％(重量比；以干重计)(N×6.25)。
实施例3：在实施例1经过处理的粗甘油存在下，大规模连续发酵产朊假丝酵母。
以连续方式建立一个500升的实验室有氧发酵罐，带有控制pH值及温度和泡沫，以及测量溶解氧(DO)、供应发酵培养基和收集培养物的设施。
培养基中的组分包括实施例1的经过处理的粗甘油(作为唯一碳源)、矿物盐浓缩物(含有S、K、P、Mg、Na、Ca、Zn、Fe、Mn、Co、Cu、Mo和B)、磷酸、硫酸和水。以5000升批料预混合适量的所有这些组分，以达到下表2中所示的浓度。随后，在90℃下，对合并的培养基进行60到90分钟巴氏灭菌，然后送入发酵罐中。经过巴氏灭菌的合并的培养基的pH值为约1.8。就较大规模来说，可将粗甘油、矿物盐浓缩物和水等培养基组分连续送入混合机/灭菌器中，此后送入发酵罐中，以改进能效并更好地控制无菌状态。
接种前，向发酵罐中部分装入经过巴氏灭菌的合并的培养基和无菌水(各100升)，并静置过夜，以平衡DO和pH探针。此初始培养基含有表2所示的营养物的50％浓度。必要时，通过加热以及供应氨气，将发酵罐中的温度和pH值调到设定点(35℃，pH 3.6)，以保持pH值。
表2-发酵罐净进料中营养物的浓度
  组分   发酵罐中的浓度(克/升)
  甘油   87
  S   2.31
  K   1.88
  P   1.08
  Mg   0.245
  Na   0.085
  Ca   0.017
  Zn   0.0032
  Fe   0.00104
  Mn   0.00031
  Co   0.000050
  Cu   0.000053
  Mo   0.000096
  B   0.000026
用从2升连续发酵罐中收集的细胞密度为50克/升的20升种子培养物接种发酵罐(例如实施例2中所述)。随后，使220升合并的发酵物以分批模式有氧发酵8小时。必要时，在发酵期间，向发酵罐中送入氨气，以将pH值控制在3.60到3.65范围内。每分钟供应1到2个发酵罐体积的空气。
此后，在补料分批模式下，以30升/小时的速率向发酵罐中再送入合并的经过巴氏灭菌的培养基，直到液体体积达到300升。由于通风引起泡沫和气体滞留，故发酵罐总体积接近450升，尽管只存在300升液体。液体体积达到300升后，接着以与进料相同的速率，从发酵罐中取出物质，以使发酵罐以连续模式操作。供应给发酵罐的总体C/N比为9.3∶1。
在约24小时内，细胞密度达到稳态浓度，而且在极少扰动下，使发酵罐保持稳态至少3天。因此，流量为30升/小时时，稀释率为0.1/小时。
将从发酵罐连续取出的所收集物质迅速冷却到约4℃，并在1000升收集罐中储存不到3天，随后进行离心、洗涤和下游加工。就较大规模来说，可在收集时，通过连续离心来自发酵罐肉汤的酵母，来更换酵母收集物的分批储料。
使用此***达到的稳态细胞密度以干重计为38.2克/升，而且生物质产率为约44％。工艺生产率为3.82克/升·小时。
最初根据酵母泥的颜色(浅褐色)、香味(芳香，非酵母样气味)和粗蛋白质含量，评估其质量，所述粗蛋白质含量通过凯氏分析法评估为约58％(重量比；以干重计)(N×6.25)。通过转鼓式干燥或转化成酵母提取物，来进一步加工所述物质。在两种情况下，判断产品具有优良的感官质量。
实施例4：在经过处理的粗甘油存在下，补料分批发酵产朊假丝酵母
通过高压釜灭菌2升发酵罐，其装备有再循环和通风***、泡沫控制***、DO测量***以及pH和温度监测与控制***。随后，向发酵罐中装入150毫升包括以下三种组分的经过灭菌的发酵培养基：
(1)经过处理的粗甘油(以与实施例1所述相同的方式处理)，甘油浓度为约500克/升并且pH值为4.0；
(2)(i)矿物盐浓缩物(含有S、K、P、Mg、Na、Ca、Zn、Fe、Mn、Co、Cu、Mo和B)、(ii)硫酸与(iii)磷酸的混合物，而且所述混合物的pH值为0.8；和
(3)水，其量足以稀释甘油以及矿物盐浓缩物、硫酸和磷酸的混合物达到下表3中所示的初始浓度。在供应到发酵罐中之前，这三种组分各自分别经由高压釜灭菌。
表3-发酵罐中营养物的初始浓度
  组分   浓度
  甘油   100
  S   2.45
  K   1.86
  P   1.28
  Mg   0.250
  Na   0.085
  Ca   0.018
  Zn   0.0033
  Fe   0.0011
  Mn   0.00031
  Co   0.000051
  Cu   0.000054
  Mo   0.000098
  B   0.000026
用150毫升活酵母培养物(通过用实质上无菌洗涤新制酵母培养物的琼脂斜面得到的洗涤液(2毫升)接种含150毫升培养基的烧瓶来制备)接种发酵罐。再循环肉汤，通风并使其在35℃温度和pH 3.6下发酵。使用氨(28％水溶液)保持pH值。
2小时后，再以27毫升/小时的总流量向批料中供应培养基。所送入的此培养基的组成与表3中相同。此流量每2小时增加一次，使得新流量等于调整时发酵罐累积体积的0.09倍。
自接种起22小时后，发酵完成(即，容器装满)。此时，测量细胞密度为75克/升(以干重计)，并且产率为约75％。工艺生产率为3.4克/升·小时，并且供应给发酵罐的C/N为4.2∶1。判断酵母泥具有优良的感官质量。
实施例5：由在经过处理的粗甘油存在下生长的产朊假丝酵母制备酵母提取物和酵母细胞壁
本实施例说明来源于在粗甘油上生长的酵母的产品的制备，其中通过使用粗甘油，所述制备得到良好产率，并且没有不良的气味或味道。
向250毫升锥形烧瓶中装入68.0克(以湿重计)由粗甘油得到的酵母泥(以与实施例2所述类似的方式获得)，所述酵母泥以重量比计，含有约25％固体(即，17.0克，以干重计)。随后将水添加到酵母泥中，达到100毫升刻度线。密封锥形烧瓶，并用力振荡混合物，由此获得均质混合物。在此阶段，反应混合物的pH值介于4.5与4.6之间。使用1.3毫升1N NaOH将反应混合物的pH值调到pH 8.5。接着于保持70℃的振荡水浴中保持此反应混合物。向反应混合物中添加0.1重量％(17mg/100ml)酶Protex 6LTM(从Genencor公司得到)。
在4、8、16、20、24、36和48小时时，对反应混合物采样。每次采样期间，将10毫升反应混合物采入有刻度的玻璃离心管中。在5℃温度下，以4000rpm离心样品5分钟。离心结束时，将所得上清液全部转移到有刻度的玻璃管中，并测量和记录上清液体积(约6.5毫升)。将上清液(5毫升)转移到预先称重的表面皿上，并将表面皿放入105℃的烘箱中，保持约24小时。由上清液的干重％和其体积，计算出产率％为57％，即9.7g提取物(以干重计)。
由经过离心的反应混合物得到的上清液保留为可溶性酵母提取物，并且残余物主要是由酵母细胞壁(其可经过进一步加工而获得富含β-葡聚糖和甘露聚糖的部分)组成。
利用凯氏分析法(Buchi AG)，测量上清液酵母提取物中的含氮量，得到粗蛋白质的测量值(N×6.25)。利用甲醛滴定法(Formol titration method；Am J EnolVitic，52，4，400-401，按引用并入本文中)测量游离氨基氮的含量。由这两个测量值，根据游离氨基氮与总氮的比率，计算出水解程度，并且结果概述于下。使用市售酶检测试剂盒(enzymatic test kit；Megazymes Intl)，以分光光度法测量酵母提取物中谷氨酸盐的浓度，并且结果也概述于下。
完成消化的时间          ：约24小时
产率                    ：57％，即由17克酵母泥(以干重计)得到9.7
                        克提取物(以干重计)
上清液中酵母提取物的浓度：约10％到13％(重量比；以干重计)
酵母提取物中的含氮量％  ：约8.5％到10.0％(重量比；以干重计)
24小时结束时的FAN％     ：约3.5％到5.0％(重量比；以干重计)
24小时结束时的DH％      ：约45％到55％
谷氨酸盐％              ：占酵母提取物约11％到12％(以干重计)
感官分析                ：可口的咸味/肉味(2％溶液)
                        ：没有检测到痕量类似于粗甘油的气味或味道。
除上述实验外，还进行了数个其它实验，其中尝试测试不同的蛋白酶以优化这些特定酶的反应条件。改变了pH值、培育温度和反应时间等关键参数。还对由下表4中概述的优化实验产生的所有酵母提取物进行了感官分析。
表4-pH值、温度和反应时间优化的实验结果
酶 时间 温度 pH   产率％(以干重计) 味道
  Protex6L   24小时   70℃   7.5   51.2   肉味/咸味
  Protex6L   24小时   70℃   8.0   48.2   肉味/咸味
  Protex6L   24小时   70℃   8.5   57.4   肉味/咸味
  Protex6L   24小时   55℃   7.5   41.0   苦味
  Protex6L   24小时   55℃   8.0   43.8   苦味
  Protex6L   24小时   55℃   8.5   38.6   苦味
  菠萝蛋白酶(Bromelain) 24小时 70℃ 7.0 38.2 苦味
  菠萝蛋白酶 24小时 70℃ 7.5 40.1 苦味
  菠萝蛋白酶 24小时 70℃ 8.0 42.1 苦味
  菠萝蛋白酶 24小时 55℃ 7.0 42.1 苦味
  菠萝蛋白酶   24小时   55℃   7.5   41.2   苦味
  菠萝蛋白酶 24小时 55℃ 8.0 41.9 苦味
  Alcalase2.4LFG   48小时   55℃   7.0   51.1   苦味
  真菌蛋白酶60000 48小时 55℃ 6.0 58.3 味道差
  木瓜蛋白酶6000升   48小时   70℃   6.0   48.7   鱼味
  ValidaseFP 1000G 48小时 55℃ 6.5 56.1 柠檬味
  Promod144P+Promod192P+Depol 667P 48小时 55℃ 6.0 57.4 不能接受
在进行本实验的过程中，发现在70℃和pH 8.5下，用PROTEX 6LTM消化来自TCG的酵母细胞是制造酵母提取物的适当条件，此举得到57％产率以及引人注目的浅黄色和肉味。
实施例6：由在经过处理的粗甘油存在下生长的产朊假丝酵母制备干酵母细胞壁
根据实施例3中所述的方法，大规模制备产朊假丝酵母细胞。随后根据实施例5，使用所得酵母泥制备酵母提取物。离心取出酵母提取物溶液后，将残余物再悬浮于等体积的水中，并且再离心。再重复此洗涤过程2次。接着，再悬浮所得残余物(含有约20％干物质)达到10％(重量比)固体的浓度，并送入蒸汽加热的转鼓式干燥机中。干燥机中的进料速率为每分钟约70到90毫升，并且有规律地进行调整以配合干燥机的转速，并防止转鼓上酵母泥的任何累积。
接着，通过用研棒和研钵研磨，减小收集到的干燥固体的粒度，得到自由流动的粉末。根据Megazymes公司(爱尔兰)提供的方法，发现此粉末含有93.3％干物质，经过分析，其中约10.5％为β-葡聚糖(以干重计)。
实施例7：由在经过处理的粗甘油存在下生长的产朊假丝酵母获得的酵母细胞壁制备β-葡聚糖
已经发现，酵母细胞壁(由上述实施例5中所述的酵母提取方法作为副产物形成)含有约10.5％β-葡聚糖(以干重计)。去除α-葡聚糖(通过用α-淀粉酶处理)和脂质(在回流下，用2-丙醇萃取2小时)后，β-葡聚糖的含量增大到15％。还发现用热柠檬酸钠缓冲液萃取(去除甘露糖蛋白组分)，能将残余物中β-葡聚糖的含量增大到20％。β-葡聚糖的含量是使用购自Megazyme InternationalIreland公司的酶分析试剂盒测量得到。
实施例8：制备由在经过处理的粗甘油存在下生长的产朊假丝酵母得到的矿化酵母产品
通过高压釜灭菌2升发酵罐，其装备有再循环和通风***、泡沫控制***、pH和温度监测与控制***以及DO测量***。向发酵罐中装入1750毫升包括以下三种组分的无菌发酵培养基：
1)根据实施例1方法制备250毫升经过处理的粗甘油(作为唯一碳源)，并且其含有650克/升甘油；
2)0.5升(i)矿物盐浓缩物(含有S、K、P、Mg、Na、Ca、Zn、Fe、Mn、Co、Cu、Mo和B)、(ii)硝酸与(iii)磷酸的混合物；和
3)1升水
发酵罐中营养物的初始浓度如下表5中所示：
表5-发酵罐中营养物的初始浓度
  组分   发酵罐中的浓度(克/升)
  甘油   约93
  N(来自硝酸)   1.46
  S   0.04
  K   1.38
  P   0.944
  Mg   0.185
  Na   0.063
  Ca   0.013
  Zn   0.0024
  Fe   0.00079
  Mn   0.00023
  Co   0.000038
  Cu   0.000040
  Mo   0.000072
  B   0.000019
使用氨水溶液将pH值校正到3.6，随后用200毫升纯种子培养物(通过在摇瓶中过夜分批发酵来制备)接种内含物。
使***在35℃下以分批模式发酵过夜，或直到在700纳米下的光学密度达到10。随后，将***转换到连续模式，其中以26毫升/小时送入经过处理的粗甘油(根据实施例1制备，以重量/体积比计，为65％)。以69毫升/小时送入矿物盐浓缩物、硝酸和磷酸的混合物，并且以56毫升/小时供应水，以便保持表6中所示的进料组成。
表6-发酵罐净进料中营养物的浓度
  组分   发酵罐中的浓度(克/升)
  甘油   约110
  N(来自硝酸)   5.10
  S   0.06
  K   1.99
  P   1.32
  Mg   0.267
  Na   0.091
  Ca   0.019
  Zn   0.0035
  Fe   0.00114
  Mn   0.00033
  Co   0.000055
  Cu   0.000058
  Mo   0.000104
  B   0.000027
加入控制pH值(氨水溶液)和泡沫(例如Dow-Corning公司的Antifoam1520USTM)的试剂后，稀释率为0.1/小时。
必要时，在发酵期间，通过自动添加氨水溶液，将pH值保持在3.6与3.7之间。使温度升到35.0℃，随后必要时通过供应冷却水，保持此温度。
当发酵罐中的细胞密度达到稳态(或超过每升40克干生物质)时，利用改良的矿物盐混合物更换矿物盐浓缩物、硝酸与磷酸的混合物，所述改良的矿物盐混合物的组成与表6中所示进料组成一致，只是在进料组合物中还存在0.11克/升浓度的硒酸钠。
在发酵罐在送入改良的矿物盐混合物的同时达到新的稳态平衡(在约24到48小时内发生)后，接着使用第二种改良的矿物盐混合物，其中硒酸钠的浓度有所增加，以致进料组合物中硒浓度为0.22克/升。再次达到平衡期，此后使用第三种改良的矿物盐混合物，其中硒酸钠的浓度有所增加，以致进料组合物中硒浓度为0.33克/升。
以此方式增加发酵罐进料(稳态)中硒的浓度。持续增加，直到由细胞密度降低到小于30克/升(以干重计)观察到，硒含量开始对酵母生长有毒。这对应于35％的由甘油得到的生物质的产率。在细胞密度降低到约30克/升时，停止发酵。
停止发酵时，连续发酵的生产率为3克/升·小时。供应到发酵罐的进料中的C/N比为10.6∶1。
收集发酵罐的溢出物，并在4℃下储存。定期取出收集物，通过离心浓缩，并将所得酵母泥转鼓干燥，达到固体含量大于90％(重量比)。利用原子吸收光谱法(Atomic Absorption Spectroscopy)测量酵母的含硒量，并且结果概述于表7中。据判断，干酵母的感官特性是可接受的，而且不存在由粗甘油原料引起的污染。
表7：矿化酵母产品的含硒量
  发酵罐进料中硒酸钠的浓度，克/升   细胞密度，克/升  酵母中的硒浓度，ppm
  0   50  0
  0.11   41  500
  0.22   42  1820
  0.33   35  2580
应了解，仅借助实施例描述了本发明，并且所属领域技术人员根据本文的揭示内容将显而易见本发明的修改和/或变更，而这些修改和/或变更也认为是在随附权利要求书所界定的本发明的范围和精神之内。

Claims (46)

1.一种制备营养性、治疗性或感官性酵母产品的方法，其包含：
（a）在包含作为至少一种碳源的粗甘油以及一种或多种氮源的培养基存在下，在有氧条件下生长产朊假丝酵母（Candida utilis），以产生酵母细胞；其中所述培养基中的碳氮比小于90:1，且所述粗甘油以重量比计含有20%到95%的甘油，并在添加到所述培养基中前，经历一种或多种处理以去除一种或多种杂质，以得到具有95%到100%甘油产率的经过处理的粗甘油；和
（b）加工步骤（a）中的所述酵母细胞，获得所述营养性、治疗性或感官性酵母产品；
其中，所述酵母的生长展现大于或等于0.85克/升·小时的工艺生产率。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述粗甘油以重量比计，含有40%到90%甘油。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述粗甘油以重量比计，含有80%到90%甘油。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述粗甘油是唯一碳源。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述氮源是选自氨、一种或多种氨类无机盐、一种或多种有机铵盐、酵母提取物、硝酸、一种或多种无机亚硝酸盐、一种或多种无机硝酸盐或其组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳氮比小于或等于80:1。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述碳氮比小于或等于40:1。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述碳氮比小于或等于20:1。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述碳氮比小于或等于10:1。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述产朊假丝酵母是以连续或半连续补料分批模式生长。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述产朊假丝酵母是以0.05/小时到0.25/小时的稀释率的稳态连续模式生长。
12.根据权利要求1所述的方法，其中溶解氧的浓度大于2%的空气饱和度。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述溶解氧的浓度大于5%的空气饱和度。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基中甘油的浓度为0.1克/升到500.0克/升。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述培养基中甘油的浓度为50.0克/升到200.0克/升。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述培养基中甘油的浓度为70.0克/升到150.0克/升。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述产朊假丝酵母是在pH4.5或4.5以下生长。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述pH值为3.6。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述酵母是在25.0℃到36.0℃温度下生长。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述温度为35.0℃。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述产朊假丝酵母生物质的产率为25.0%到80.0%。
22.根据权利要求1所述的方法，其中以干重计，细胞密度为5.0克/升到大于或等于150.0克/升。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述产朊假丝酵母的生长展现大于或等于1.00克/升·小时的工艺生产率。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述产朊假丝酵母的生长展现大于或等于2.00克/升·小时的工艺生产率。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述产朊假丝酵母的生长展现大于或等于3.00克/升·小时的工艺生产率。
26.一种制备营养性、治疗性或感官性矿化酵母产品的方法，其包含：
（a）在包含作为至少一种碳源的粗甘油、一种或多种氮源以及一种或多种选自由硒、铬、钼、锗、锌、铁、铜、镁、锰、和碘的元素的培养基存在下，在有氧条件下生长产朊假丝酵母，以产生矿化酵母细胞，其中，以干重计，所述矿化酵母细胞含有硒、铬、钼、锗、锌、铁、铜、镁、锰和碘的一种或多种元素的含量增高，且增高的含量是100ppm到50000ppm的各增高元素；
其中所述粗甘油以重量比计含有20%到95%的甘油，并在添加到所述培养基中前，经历一种或多种处理以去除一种或多种杂质，以得到具有95%到100%甘油产率的经过处理的粗甘油；和
（b）加工步骤（a）中的所述矿化酵母细胞，获得所述营养性、治疗性或感官性矿化酵母产品。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述元素是硒。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述矿化酵母产品含有200ppm到70000ppm的有机硒。
29.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述粗甘油以重量比计，含有40%到90%甘油。
30.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述粗甘油是唯一碳源。
31.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述氮源是氨和硝酸。
32.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述培养基中的碳氮比小于90:1。
33.根据权利要求26所述的方法，其中所述产朊假丝酵母是以连续或半连续补料分批模式生长。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述产朊假丝酵母是以0.05/小时到0.25/小时的稀释率的稳态连续模式生长。
35.根据权利要求26或27所述的方法，其中溶解氧的浓度大于2%的空气饱和度。
36.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述培养基中甘油的浓度为0.1克/升到500.0克/升。
37.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述产朊假丝酵母是在pH3.0到pH8.0下生长。
38.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述pH值为4.5或4.5以下。
39.根据权利要求26所述的方法，其中所述产朊假丝酵母是在20.0℃到40.0℃温度下生长。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述温度为25.0℃到36.0℃。
41.根据权利要求26或27所述的方法，其中产朊假丝酵母的产率为25.0%到80.0%产率。
42.根据权利要求26或27所述的方法，其中以干重计，细胞密度为5.0克/升到大于或等于150.0克/升。
43.根据权利要求26或27所述的方法，其中产朊假丝酵母的生长展现大于或等于0.85克/升·小时的工艺生产率。
44.根据权利要求26或27所述的方法，其中产朊假丝酵母的生长展现大于或等于1.00克/升·小时的工艺生产率。
45.根据权利要求26或27所述的方法，其中产朊假丝酵母的生长展现大于或等于2.00克/升·小时的工艺生产率。
46.根据权利要求26或27所述的方法，其中产朊假丝酵母的生长展现大于或等于3.00克/升·小时的工艺生产率。
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