AT401182B - Fermentationsverfahren zur kontinuierlichen citronensäuregewinnung - Google Patents

Description

AT 401 182 B

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum kontinuierlichen Gewinnen von Citronensäure durch Fermentation zuckerhaltiger Medien mit Hilfe von Hefen, insbesondere der Gattung Candida.

Die Citronensäure, eine aliphatische Hydroxysäure, ist seit dem letzten Jahrhundert als natürliche Fruchtsäure bekannt. Sie ist in der Natur als Säure und in Form ihrer Salze weit verbreitet und kommt insb. in Früchten, Gemüsen, Milch und Fleisch vor.

Ihre umfängliche Anwendung im Lebensmittel- und Getränkebereich, in der pharmazeutischen Industrie sowie für Reinigungszwecke und als Antioxydans macht eine gewerbliche Produktion unabhängig von den natürlichen Quellen notwendig: So wird Citronensäure seit langem aus Zucker oder Melasse durch Fermentationsverfahren mit Hilfe von Schimmelpilzen der Gattung Aspergillus nach dem Oberflächenverfahren und seit Mitte dieses Jahrhunderts im Submersverfahren hergestellt.

Beide Verfahren erfolgen im Batch-Betrieb, und es werden Ausbeuten zwischen 57 und 77 % innerhalb von 1 - 2 Wochen erreicht.

Seit 1960 wird vor allem in Japan an der Herstellung von Citronensäure mit anderen Mikroorgnismen, insbesondere der Gattung Candida, und anderen Substraten gearbeitet, wobei zunächst n-Alkane im Vordergrund standen.

So wird in der JP-A-58-138387 ein Verfahren zur Gewinnung von Citronensäure aus n-Alkanen beschrieben, bei dem mit Hefestämmen von Candida oder Saccharomycopsis im gerührten, mit Sauerstoff belüfteten 2-Phasensystem eine optimale Umsetzung bei Sauerstoffsättigungswerten von 10-45 % erzielt werden soll. Die gebildete Citronensäure wird nach Unterbrechung des Rührvorganges und Phasentrennung aus der wässrigen Phase isoliert, die mehrfach erneuert werden kann. Auf diese weise werden Citronensäu-reausbeuten bis zu 44 g/l erhalten. Angaben über die Bildung von Isocitronensäure fehlen. Eine gewerbliche Produktion nach diesem Verfahren ist nicht bekannt.

In neuerer Zeit konzentrieren sich die Untersuchungen auf die Citronensäureproduktion ausgehend von zuckerhaltigen Medien.

So wird gemäß der DD-PS 248 376 Citronensäure im Batch-Betrieb gewonnen, indem zunächst Hefen (Yarrowinia lipolytica) auf n-Alkanen oder Substanzen mit längerer CH2-Kette unter Zusatz üblicher Mineral-und Spurensalzlösung bis zur Aufzehrung der N-Quelle angezüchtet werden, wonach Zucker (125 g/l Glucose oder Invertzucker) zugesetzt wird, der dann zu 90 % in Citronensäure mit 5 % Isocitronensäure umgewandelt werden kann. Bei dieser als Batchprozeß ablaufenden Verfahrensweise dürften erhebliche Probleme bezüglich der Restlösungen auftreten.

Eine kontinuierliche Citratproduktion, die aus wirtschaftlichen Gründen favorisiert wäre, ist bislang nicht industriell realisiert worden, vielmehr wurden wiederholt Bedenken bezüglich der Nützlichkeit geäußert (H.J. Peppier u.a. "Microbial Technology" Bd I, Seite 363, Acad. Press., London (1979); P.E. Milsom, "Food Biotechnology" Bd. I (1987) S. 291). T,K. Klasson u.a. (Appl. Biochem. Biotechnol. Vol. 20/21 (1989) S. 491-509) berichten über vergleichende Untersuchungen zur kontinuierlichen und batch-weisen Produktion von Citronensäure aus Glucose durch Fermentation mit Hefe (Candida lipolytica). Dabei wurde kontinuierlich im Einzel-Fermenter mit Verweilzeiten von maximal 30 h und > 50%iger Luftsauerstoffsättigung sowie mit Glucose-konzentrationen (im Zulauf) von 30 bis 150 g/l bei variablen Ammioniumkonzentrationen (von 0,3 bis 1,3 g/l NH* CI) gearbeitet. Bei der kontinuierlichen Fermentation wurden variierende spezifische Produktionsraten von 0 bis 0,11 g/g*h erhalten bei erheblicher Isocitronensäurebildung (3 bis 6,5 g Citronensäure/g Isocitronensäure). Im Batch-Prozeß wurden bis zu 40 g/l Citronensäure einschließlich Isocitronensäure gebildet, bei kontinuierlicher Arbeitsweise lag die Säurekonzentration bei bis zu 14 g/l.

Diese von Klasson et al. mitgeteilten Ergebnisse sind für eine gewerbliche Produktion nicht gerade vielversprechend, insbesondere sind sowohl die gebildete Säurekonzentration als auch insbesondere das Citrat/Isocitrat-Verhältnis unbefriedigend.

Ziel der Erfindung ist daher, ein mit Hefen, insb. mit Candida-Stämmen arbeitendes kontinuierliches Verfahren zur Citronensäuregewinnung zur Verfügung zu stellen, mit dem hohe Citronensäurekonzentratio-nen bei geringem Isocitratanteil erzielt werden können, so daß eine industrielle Produktion wirtschaftlich akzeptabel erscheint.

Das zu diesem Zweck entwickelte, erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art ist dadurch gekennzeichnet, daß im Fermenterzulauf ein C/N-Verhältnis entsprechend 12 bis 22 Mol Glucose pro Mol Ammonium-Verbindung aufrechterhalten wird.

Dabei wird vorzugsweise mit einem Molverhältnis von Glucose zu Ammoniumverbindung von 15 bis 18 gearbeitet und die Glucose-Konzentration im Zulauf zwischen 100 und 400 g/l, insbesondere 200 bis 300 g/l gewählt, wobei Verweilzeiten zwischen 60 und 120 h zweckmäßig sind.

Durch eine solche Abstimmung von Kohlenstoff- und Stickstoffquelle im Zulauf werden überraschend hohe Citratkonzentrationen bei relativ geringem Isocitratanteil und erheblichem Umsatz der Glucose erzielt, 2

AT 401 182 B wobei Raumzeitausbeuten über 1,5 g Citrat/Ih erreicht werden. Die erfindungsgemäßen Bedingungen begünstigen beim kontinuierlichen Prozeß eine angemessene begrenzte Biomasseneubildung zur Kompensation von Auswaschverlusten und zur Erneuerung des Biokatalysators.

Besonders zweckmäßig ist im Gegensatz zur üblicherweise favorisierten möglichst intensiven Belüftung eine Sauerstoffkonzentration im Fermenter entsprechend einer 15 bis 30 %igen Luftsauerstoffsättigung (d.h. bezogen auf den mit Luft unter Normalbedingungen erzielbaren maximalen Sauerstoffsättigungswert, der im Vergleich zur Sättigung mit Sauerstoff an Stelle von Luft um einen Faktor 5 niedriger ist). Besonders zweckmäßig werden um 20 % Luftsauerstoffsättigung im Fermenter aufrechterhalten.

Die von der Verweilzeit abhängige N-Limitierung wird zweckmäßigerweise oberhalb der für den lebenden und produktiven Mikroorganismus notwendigen Stickstoff-Mindestkonzentration gehalten, wobei vorzugsweise N-Konzentrationen im Zulauf von 50 bis 150 mM vorgesehen werden. Günstige Betriebsbedingungen liegen vor mit N-Konzentrationen um 0,1 M und Verweilzeiten von 70 bis 90 h sowie einer etwa 300 g/l Glucose entsprechenden C-Konzentration. Der pH-Wert im Fermenter wird zweckmäßigerweise zwischen 4 und 5,5 (insbesondere um 5,0) eingestellt. Bei Anwesenheit von Eisenspuren (im uM-Bereich) im Fermentationsmedium verschiebt sich das pH-Optimum zu niedrigeren Werten (von ca. 4,6). Temperaturen zwischen 29 und 31°C sind zweckmäßig, wobei 30°C besonders bevorzugt wird. Überraschenderweise hat der Zusatz von Eisenionen zum Fermentermedium einen deutlich negativen Einfluß, d.h. die besten Ergebnisse werden tatsächlich bei Abwesenheit von Eisen im Zulauf erzielt.

Zink- und Manganionen haben einen positiven Einfluß, weshalb für Mindestgehalte von 0,05 mM, insbesondere um 0,15 mM (für Zn++) und von ca. 0,75 mM (für Mn++) gesorgt wird, die für Stickstoffgehalte im Fermenterzulauf von 3 g/l NH*CI gelten und bei Erhöhung der Stickstoffkonzentration proportional zunehmen.

Die Kupferionenkonzentration wird zweckmäßigerweise entsprechend - 2 mg/l Kupfersulfat gewählt und die Magnesiumionenkonzentration in der Gegend von 3-5 mM jeweils bei N-Konzentrationen entsprechend 3 g/l NH4 CI mit proportionaler Zunahme bei steigender N-Konzentration im Zulauf.

Vorzugsweise wird mit nichtgeträgerter Hefe und ohne Biomasserückhaltung gearbeitet, wodurch zum einen das Produktivitätsverhalten optimal und ein steady state bei kontinuierlicher Arbeitsweise über längere Zeiten hinweg eingehalten werden kann, da die aus dem Reaktor ausgewaschene Biomasse durch das geminderte Wachstum stetig nachgeliefert wird. Bei längeren Verweilzeiten ist jedoch auch eine partielle Biomasse-Rückhaltung (z.B. 30%, je nach Bedingungen) zweckmäßig.

Zu brauchbaren Hefen, die für die erfindungsgemäße Citronensäureproduktion eingesetzt werden können gehören Candida fibriae C. guilliermondii C. indermedia C. lipolytica C. oleophita C. parapsilosis C. subtropicalis C. tropicalis C. zeylanoides, insbesondere Candida oleophila, Candida lipolytica, Candida tropicalis und Candida guilliermondii. Besonders intensiv wurde mit dem Stamm Candida oleophila ATCC 20177 gearbeitet, auf den sich die nachfolgend mitgeteilten Versuchsergebnisse weitgehend beziehen.

Figur 1 bis 5 Figur 6 bis 10 Figur 11 und 12 Figur 13 bis 15 Figur 16 Figur 17 und 18

Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen, die im einzelnen folgende Abhängigkeiten zeigen: den Einfluß der Sauerstoffsättigung;

Kurven für die Citrat- und Isocitratsowie Glucosekonzentration im Durchflußfermenter bei unterschiedlichen Verweilzeiten und NHtCl-Konzentrationen im Zulauf; den Einfluß des pH-Wertes; den Einfluß von Eisen auf die Biomassebildung einerseits und die Produktgewinnung andererseits; den Einfluß der Temperatur auf die Citrat- und Isocitratbildung und den Zinkeinfluß. 3

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Einfluß der 02-Sättigung im Fermenter

Die Kurven gemäß Figur 1 bis 5 zeigen den erheblichen Einfluß der Sauerstoffsättigung auf die kontinuierliche Citronensäurebildung mit Hilfe von Candida oleophila ATCC 20177.

Die Fermentation wurde in einem 2 I Rührkesselfermenter (Biostat E, Fa.Braun & Diessel) bei einem pH-Wert von 4,5 durchgeführt. Der pH-Wert und die Sauerstoffsättigung wurden automatisch konstant gehalten.

Die Zusammensetzung des Fermentationsmediums ist in Tabelle 1 wiedergegeben:

Tabelle 1

Fermentationsmedium Glucose 230 g/l NH* CI 4,5 g/l KH2PO* 1,05 g/l Mg SO*. 7aq 0,525 g/l CuSO*. 5aq 1,5 mg/l Na2MoO*. 2aq 300 ug/l ZnSO*. 7aq 0,0315 g/l CoSO*.7aq 0,006 g/l H3B03 0,06 g/l MnS04. 1aq 1,25 mM FeSO*. 7aq 0 mM CaCI2 0,15 g/l NaCI 0,15 g/l KJ 0,15 mg/l Citronensäure 2,5 g/l Thiaminhydrochlorid 3 mg/l Biotin 0,375 mg/l Pyridoxinhydrochlorid 0,9375 mg/l Ca-D-Pantothenat 0,9375 mg/l Nicotinsäure 0,75 mg/l Temperatur 30’C pH-Wert 4,5 pH-Korrektur 45% NaOH-Lösung Sauerstoffsättigung mit Luft/02-Gemisch variiert Rü hrergeschwindigkeit 600 rpm (NH*CI und Vitaminlösungen wurden steril filtriert).

Die Untersuchungen wurden mit kontinuierlicher Fermentation im Chemostaten mit unterschiedlicher Belüftung durchgeführt (die angegebene prozentuale Sauerstoffsättigung bezieht sich auf 100 % Luftsauerstoffsättigung bei normalem Druck mit 1 vvm Luft und bei 1000 rpm im pH 4,5 Medium - dabei entsprechen 100% Sauerstoffsättigung in Wasser unter gleichen Bedingungen einer Sauerstoffsättigung im Medium von pH 3,0 von 97% und von pH 4,5 von 98,2%.)

Wie man sieht, wird die maximale Citronensäurekonzentration und das beste Citrat/Isocitrat-Verhältnis bei etwa 20 % Sauerstoffsättigung erzielt, obwohl die Isocitronensäurekonzentration mit zunehmender Sauerstoffsättigung leicht abnimmt (siehe Figur 2).

Figur 1 zeigt, daß die Biomassebildung bei 20 % Sauerstoffsättigung vermindert ist, wobei die optische Dichte keine überzeugende Korrelation zur Biotrockenmasse zeigt.

Die biomassespezifische Produktivität und die Raum/Zeitausbeute erreichen ihr Maximum ebenfalls bei 20 % Sauerstoffsättigung (siehe Figur 3 und nachfolgende Tabelle 2). 4

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Tabelle 2

Resultate der kontinuierlichen Fermentation mit 4,5 g/l NH* CI und 230 g/l Glucose bei einer Verweilzeit von 54,6 h Größe Wert Biomasse 18,085 g/l Citrat 96,57 g/l Isocitrat 3,48 g/l Citrat-/lsocitrat-Verhä ltnis 27,7 Glucose 74,63 g/l Umsatz 63,77% Ausbeute 43,95% Selektivität 69.6% Raum-Zeit-Ausbeute 1,77 g Citrat/I'h spezifische Produktivität 0,098 g Citrat/ g BTM'h

Bei einer Verweilzeit von ca. 54 h konnten mit 4,5 g/l NH* CI und 20 % Sauerstoffsättigung fast 100 g/l Citronensäure mit einer Selektivität von ca. 70 % kontinuierlich produziert werden. Durch Verlängerung der Verweilzeit unter konstant gehaltenen Fermentationsbedingungen (30 *C, pH 4,5, 20 % Sauerstoff und gleiches Fermentationsmedium) können die Citronensäurekonzentration und die Selektivität maximiert werden.

Intracelluläre Konzentrationsmessungen zeigen, daß das intracelluläre Citrat/Isocitrat-Verhältnis im gesamten Sauerstoffbereich erheblich niedriger als extracellulär war, wie aus Figur 4 hervorgeht.

Die intracelluläre Isocitronensäurekonzentration war mit Ausnahme bei 20 % Sauerstoffsättigung höher als die Citronensäurekonzentration (Figur 5). Dies spricht für ein aktives hochspezifisches Transportsystem, welches die Citronensäure bevorzugt. Bei 20 % Gelöstsauerstoffkonzentration wurde auch wegen einer erhöhten Glykolyserate die niedrigste intracelluläre Glucosekonzentration gemessen (Figur 5).

Einfluß der Stickstoffkonzentration sowie der Verweilzeit

Die Figuren 6 bis 10 zeigen die Abhängigkeit der Citratbildung und des Citrat/Isocitrat-Verhältnisses · vom Stickstoffgehalt im Zulauf sowie von der Verweilzeit:

Das Medium für die Fermentation gemäß Fig.9 entsprach Tabelle 3, jedoch mit halbierten Konzentrationen und 260 g/l Glucose und ohne Fe++. Gearbeitet wurde mit getragener Biomasse (alle übrigen Versuche wurden mit ungeträgerter Hefe und ohne jede Biomasse-Rückhaltung durchgeführt). Figur 10 wurde mit einem Fermentationsmedium gemäß Tabelle 3 aufgenommen, jedoch mit 250 g/l Glucose, ohne Fe++ und mit 2 mg/l CuSO* 5aq. 5

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Tabelle 3

Fermentationsmedium Glucose 120 g/l NH+CI 3 g/l KH2PO4 0,7 g/l MgSO*. 7aq 0,35 g/l CuSCU. 5aq 1 mg/l Na2Mo04. 2aq 200 ug/l ZnS04. 7aq 0,021 g/l C0SO4. 7aq 0,004 g/l H3BO3 0,04 g/l MnS04. 1aq 0,5 mM FeSCX. 7aq 0,5 mM CaCI2 0,1 g/l NaCI 0,1 g/l KJ 0,1 mg/l Citronensäure 2,5 g/l Thiaminhydrochlorid 2 mg/l Biotin 0,25 mg/l Pyridoxinhydrochlorid 0,625 mg/l Ca-D-Pantothenat 0,625 mg/l Nicotinsäure 0,5 mg/l Temperatur 30 *C pH-Wert 4,5 bzw. 5,0 pH-Korrektur 22,5% (NH4CI und Vitaminlösungen wurden steril filtriert). Belüftungsrate 4-5 l/h reiner Sauerstoff Magnetrührer 900-1300 SKE

Ein Vergleich von Fig.9 u.10 zeigt, daß mit zuwenig Stickstoff im Zulauf trotz langer Verweilzeiten (»100h) keine wirtschaftlich zufriedenstellende Citratbildung erreicht werden kann. Vielmehr setzt die gewerbliche Citratbiidung einen optimierten Stickstoffgehalt voraus, wobei mit geringeren Verweilzeiten und höheren Stickstoffgehalten hohe Citratausbeuten erzielt werden, während die Glucoseumwandlung und das Citrat/Isocitrat-Verhältnis mit etwas geringerem Stickstoffgehalt und höherer Verweilzeit leicht verbessert sind (Figur S). In diesem Fall entsprach die Zusammensetzung des Fermentationsmediums - abgesehen von der Glucosekonzentration, die bei 250 g/l lag - der Tabelle 1.

Mit der niedrigsten Verweilzeit wurde eine mindere Glucoseausnutzung bei ebenfalls leicht verminderter Citratkonzentration beobachtet (Figur 6). Die Zusammensetzung des Fermentationsmediums entsprach Tabelle 1.

Beim Versuch mit 6 g/l NH* CI (Fig.7) konnten schon mit Verweilzeiten von ca. 63h ca.130 g/l Citronensäure gebildet werden. Dabei lag die Raum/Zeit-Ausbeute bei 2 g/l· h. Das eingesetzte Fermentationsmedium ist in Tabelle 4 zusammengestellt: 6

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Tabelle 4

Fermentationsmedium für kontinuierliche Fermentation mit 6 g/l NH*CI und 300 g/l Glucose bei einer Verweilzeit von 63 h Glucose 300 g/l NH* CI 6 g/l KH2PO* 1,4 g/l MgSO*. 7aq 0,7 g/l CuSO*. 5aq 3 mg/l Na2 MoO*. 2aq 400 ug/l Zn SO*. 7aq 0,02 g/l CoSO*. 7aq 0,008 g/l H3BO3 0,08 g/l MnS04. 1aq 1,5 mM FeSO*. 7aq 0 mM CaCI2 0.2 g/l NaCI 0,2 g/l KJ 0,2 mg/l Citronensäure 2,5 g/l Thiaminhydrochlorid 4 mg/l Biotin 0,5 mg/l Pyridoxinhydrochlorid 1,25 mg/l Ca-D-Pantothenat 1,25 mg/l Nicotinsäure 1 mg/l Temperatur 30*C pH-Wert 4,5 pH-Korrektur 45% NaOH-Lösung (NH*CI und Vitaminlösungen wurden steril filtriert). Sauerstoffsättigung 20% Rührergeschwindigkeit 600 rpm

Tabelle 5 zeigt die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse:

Tabelle 5

Resultate der kontinuierlichen Fermentation mit 6 g/l NH* CI und 300 g/l Glucose bei einer Verweilzeit von 63h Größe Wert Biomasse Citrat Isocitrat Citrat-/lsocitrat-Verhä ltnis Glucose Umsatz Ausbeute Selektivität Raum-Zeit-Ausbeute spezifische Produktivität 25,895 g/l 127,06 g/l 4,98 g/l 25,5 63,12 g/l 76,32% 44,68% 68,35% 2,01 g Citrat/I'h 0,076 g Citrat/ g BTM'h

Bei der Optimierung von Nährmedienkomponenten wurde ein Medium mit 3 g/l NH* CI und 120 g/l bzw. 180 g/l Glucose verwendet. Die Versuche wurden im Kleinfermenter aus Glas mit Doppelmantel und einem Gesamtvolumen von 1000 ml durchgeführt. 7

AT 401 182 B Für die Durchmischung wurden die Fermenter auf Magnetrührer gesetzt, die einen Rührfisch im Bioreaktor antrieben. Die Sauerstoffversorgung wurde mit reinem Sauerstoff gewährleistet, um die bessere Sauerstoffversorgung im Rührkessel zu simulieren.

Das Substrat sowie die NaOH-Lösung wurden mit Peristaltikpumpen aus 5 bzw. 20 I-Vorratsflaschen in den 5 Fermenter gepumpt. Ein einfaches Steigrohr sicherte das konstante Volumen der Fermentationslösung.

Die Zulaufsubstratkonzentration wurde unter Berücksichtigung der Verdünnung durch die zudosierte Lauge korrigiert. Durch die Summe der Substratmenge und der zudosierten NaOH-Lösung pro Zeiteinheit wurde unter Berücksichtigung des Arbeitsvolumens des Reaktors die Verweilzeit ermittelt. Zum Erreichen vom steady state wurden in der Regel 5 bis 10 Verweilzeiten benötigt. io Analysiert wurden die Biomassekonzentration, die optische Dichte, die Konzentration an Citrat, Isocitrat, Glucose und die Stickstoffkonzentration.

Alle Fermentationen wurden bei 30 ’C und mit Ausnahme von der Manganoptimierung (pH 5) bei pH 4,5 durchgeführt. In Tabelle 3 ist das Ausgangsmedium für die Optimierung der kontinuierlichen Citronen-säurefermentation mit Candida oleophila ATCC 20177 angegeben. Nach der jeweiligen Optimierung wurde i5 der optimale Wert für die nachfolgende Optimierung mit berücksichtigt. pH-Einfluß

Der pH-Einfluß wurde bei 30 Ό und einer Verweilzeit von ca. 40 h mit 120 g/l Glucose und 3 g/t NH* CI 20 im Chemostaten untersucht. Es wurde ein Medium analog Tabelle 3 mit 5 uM Eisen verwendet (I).

Im Versuch ohne Eisen wurde ein Medium analog Tabelle 1 mit 250 g/l Glucose und 3 mg/l Kupfersulfat verwendet (II).

Fermentationsmedium I Analog Tabelle 3 MnS04. 1aq FeSO*. 7aq Temperatur pH-Wert pH-Korrektur Belüftungsrate Magnetrührer 0,5 mM 5fciM 30 *C 2,0 bis 6,0 22,5 % NaOH-Lösung 4-5 l/h reiner Sauerstoff 1300 SKE

Fermentationsmedium II Analog Tabelle 1 MnS04. laq FeSOt. 7aq Temperatur pH-Wert pH-Korrektur Belüftungsrate Magnetrührer 1,125 mM OuM 30 *C 4,0 bis 6,0 22,5 % NaOH-Lösung 4-5 l/h reiner Sauerstoff 900 SKE 25 30 35 40 45

Figur 11 und 12 zeigen den Einfluß des pH-Wertes auf die Produktbildung: Eine Erhöhung des pH-50 Wertes von 2 auf 4 führt zu einer deutlichen Glucoseabnahme und Zunahme des Citrat/Isocitrat-Ver hältnisses und der Citratkonzentration (Figur 11). Wie Figur 11 zeigt, wird eine optimale Citratbildung im Bereich von pH 4 - 5 beobachtet, die, wie weitere Experimente ergaben, bei Abwesenheit von Eisen leicht zu höheren Werten verschoben ist (mit geringen Eisenmengen liegt das Optimum näher an 4,5 ohne im Bereich von 5). Die vorstehenden Abhängigkeiten wurden mit verminderten Verweilzeiten von etwa 35 h 55 aufgenommen. 8

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Eiseneinfluß

Es wurde ein Medium analog Tabelle 3 mit variierender Eisenkonzentration zwischen 20 uM und 1000 U.M (1 mM) verwendet.

Fermentationsmedium Analog Tabelle 3 FeSO*. 7aq Temperatur pH-Wert pH-Korrektur Belüftungsrate Magnetrührer 20-1000 uM 30--C 5,0 22,5 % NaOH-Lösung 4-5 l/h reiner Sauerstoff 900 SKE

Oie Figuren 13 bis 15 zeigen deutlich, daß mit steigendem Eisengehalt zwar ein deutliches Anwachsen der Biomasse zu verzeichnen ist, während jedoch die Citratbildung bereits durch geringe Eisengehalte vermindert wird. Das gleiche gilt für das Citrat/Isocitrat-Verhältnis sowie die Raum/Zeitausbeute und die spezifische Produktivität (Figur 14 und 15).

Temperatureinfluß

Fermentationsmedium Analog Tabelle 3 Glucose CuSO* . 5 aq MnS04. 1aq FeSO*. 7aq Temperatur pH-Wert pH-Korrektur Belüftungsrate Magnetrührer 180 g/l 2 mg/l 0,75 mM 0 UM 30 *C 4.5 22.5 % NaOH-Lösung 4-5 l/h reiner Sauerstoff 900 SKE

Figur 16 zeigt einen empfindlichen Einfluß der Temperatur auf die Citratbildung und insbesondere das Citrat/Isocitrat-Verhältnis: Ein Optimum wird bei 30 · C gefunden.

Einfluß von Zinkionen

Wie aus Fig. 17 u. 18 hervorgeht, haben Zinkionen eine erheblichen Einfluß auf die erzielbare Citratkonzentration und das Citrat/Isocitratverhältnis, die ganz offensichtlich nicht konform zur Biomasse und optischen Dichte im Fermenter sind. Zweckmäßigerweise sollte daher (auch hier wiederum N-abhängig) mit Zn++-Konzentrationen um 0,15 mM bei 3 g/l NH*CI gearbeitet werden. Die Zusammensetzung des Fermentationsmediums entsprach wiederum der Tabelle 3, jedoch mit 0,75 mM Mn++, 3 mM Mg**, 2 mg/l CuSO* 5aq aber ohne Fe++-lonen.

Die nachfolgende Tabelle enthält eine Zusammenstellung von Untersuchungsergebnissen, die mit unterschiedlichen Glucose- und NI-UCI-Konzentrationen im Zulauf und unterschiedlichen Verweilzeiten unter sonst weitgehend gleichen Bedingungen erhalten wurden. 9

Claims (12)

1. AT 401 182 B Größe Einheit Wert NH* CI g/i 3 4,5 4,5 6 6 6 7,5 Glucose g/i 250 250 350 300 350 400 400 Glucose/NH*CI g/g 83 55,6 77,8 50 58,3 66,7 53,3 Verweilzeit h 100 54,6 68,2 63 75,7 79 79 Biomasse g/i 12 18,1 18,1 25,9 28 30,7 37,5 Citrat g/i 82 98 105,7 127,1 126,6 125 143,5 Isocitrat g/i 3,3 2,95 3,8 5 5,53 5,7 8,5 Citrat-/lsocitrat - 25 33,3 27,8 25,5 22,9 22 17 Glucose g/i 118 74,6 154,8 63,1 60,2 75,7 0 Umsatz % 47 63,8 51,2 76,3 80,8 78,2 100 Ausbeute % 33 44 28 44,7 40,6 36,1 46 Selektivität % -72 69,5 54,6 68.4 50,3 46,1 46 RZA g Citrat/(l*h) 0,82 1,77 1,55 1,95 1,67 1,58 1,82 BSP g Citrat/(g*h) 0,07 0,098 0,086 0,076 0,06 0,052 0,048 Patentansprüche 1. Verfahren zum kontinuierlichen Gewinnen von Citronensäure durch Fermentation zuckerhaltiger Medien mit Hilfe von Hefen, insbesondere der Gattung Candida, dadurch gekennzeichnet, daß im Fermenterzulauf ein C/N-Verhältnis entsprechend 12 bis 22 Mol Glucose pro Mol Ammonium-Verbindung aufrechterhalten wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Fermenterzulauf ein Molverhältnis von Glucose zu Ammonium-Verbindung von 15 bis 18 bei einer Glucosekonzentration von 200 bis 300 g/l aufrechterhalten wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mit einer Verweilzeit von 60 bis 120 h gearbeitet wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß im Fermenter eine Sauerstoffkonzentration entsprechend einer 15 bis 30-%igen Luftsauerstoffsättigung, insbesondere einer um 20-%igen Luftsauerstoff Sättigung, aufrechterhalten wird.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine von der Verweilzeit abhängige N-Limitierung oberhalb der für den lebenden und produktiven Mikroorganismus notwendigen Stickstoffmindestkonzentration eingehalten wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet daß mit einer N-Konzentration im Zulauf von 50 bis 150 mmol/l gearbeitet wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet daß mit einer N-Konzentration um 0,1 mol/l, mit einer Verweilzeit von 70 bis 90 h und mit einer etwa 300 g/l Glucose entsprechenden C-Quelle-Konzentrationim Fermenterzulauf gearbeitet wird.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß im Fermenter ein pH-Wert zwischen 4 und 5,5, insbesondere um 5,0, eingestellt wird.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß im Fermenter eine Temperatur von 29 bis 31 *C eingehalten wird.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß bei Anwesenheit von Eisenspuren im uM-Bereich als Verunreinigung im Fermentationsmedium mit einem pH-Wert um 4,6 gearbeitet wird. 10 AT 401 182 B
11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß im Fermenterzulauf N-abhängig eine Zinkionenkonzentration von £ 0,05 mmol/l, insbesondere um 0,15 mmol/l, eine Mangan-ionenkonzentration von etwa 0,75 mmol/l, eine Kupferionenkonzentration entsprechend 6 bis 8 amol/l Kupfersulfat und eine Magnesiumionenkonzentration von 3 bis 5 mmol/l bei einer N-Konzentration im Zulauf entsprechend 3 g/l NH* CI mit proportionaler Erhöhung bei erhöhter N-Konzentration eingehalten wird.
12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Durchflußfermenter mit Biomasse-Rückhaltung und ungeträgerter Hefe gearbeitet wird. Hiezu 9 Blatt Zeichnungen 11