DE2411651A1

DE2411651A1 - Verfahren und vorrichtung zum zuechten und identifizieren von mikroorganismen aus koerperfluessigkeiten

Info

Publication number: DE2411651A1
Application number: DE2411651A
Authority: DE
Inventors: Jack Judson Mehl
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1972-01-06
Filing date: 1974-03-12
Publication date: 1974-09-26
Also published as: LU68830A1; JPS4880775A; IT973543B; FR2221520B2; NL177131B; US3904482A; LU66470A1; AU1258176A; NL177131C; GB1406848A; AU450763B2; IT1059666B; AU1258276A; NL7217589A; GB1431458A; DE2254282C2; BR7305224D0; FR2221520A2; AU4901672A; AU6485374A

Description

PATFNTANVVÄuYE .

Dfpl.-lng. P. WIRTH · Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK DJpMn₉. G. DANNENBERG · Dr. P. WEINHOLD · Dr. D. GUDEL

281134 6 FRANKFURTAM MAIN

TELEFON COem

287014 GR. ESCHENHEIMER STBASSE 39

11. März 1974
33a/-mr-

Beoton, Dickinson & Company

Rutherford
New Jersey
/JS₉ Qp A₉

und Vorrichtung zum Züchten und Identifizieren von Mikroorganismen aus Körperflüeöigkeiten

(Zusatz zu P 22 54 282.1 vom 6,11.1972)

Bs sind verschiedene Verfahren und Vorrichtungen zum Züchten von Mikroorganismen in Gebrauch, inabesondere von Mikroorganismen;die in KÖrperfXitssigkeiten, wie beispielsweise Blut, enthalten sind. Der Untersuchung von Blut in solchen Kulturen kommt besondere Bedeutung zu, weil Blut normalerweise als steril betrachtet wir&omd irgendwelche darin enthaltenen Mikroorganismen Anzeichen für eine aktive Infektion sind. Die derzeitge Praxis

erfordert,

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dass normales Blut für die Untersuchung derart verdünnt wird, dass im allgemeinen ein Verdünnungsverhältnis von Blut zu einem Medium von 1 : 8 und 1:10 für Züchtung3zwecke bereitgestellt wird. Weiter ist, falls Infektionen im Blut entweder durch aerobe oder anaerobe Mikroorganismen verursacht sein können, es bisher erforderlich, diese in getrennten Gefässen zu kultivieren, welche jeweils das geeignete Medium und die geeignete gasförmige Umgebung enthalten.

Drei verschiedene Techniken sand für das Aufnehmen von Blut oder anderen Körperflüssigkeiten üblich; so kann die Entnahme mit Hilfe einer Spitze mit Eadel erfolgen, um Blut aus einer Yene abzuziehen und dann zwei oder drei sterile Medienbehälter mit dem Blut zu impfen. Einzweites Yer. fahren besteht darin, Blut in einem evakuierten Rohr aufzunehmen, das ein Intikoagulationsmittel enthält und danach einen -Teil des Blutes auf das geeignete Medium zu übertragen mit Hilfe einer mit Uadel versehenen Spritze oder durch Entfernen eines durchstechbaren Stopfens von dem evakuierten Rohr und Zumessung der geeigneten Blutmenge unter Verwendung einer Pipette. Bei einem dritten Verfahren wird ein Stück eines flexiblen Schlauches verwendet, das an beiden Enden mit Eadeleinheiten versehen ist, von denen eine sum Einstechen in eine Vene geeignet ist, während die andere sum unmittelbaren Einsetzen in ein evakuiertes G-efäss mit oder ohne flüssigen und festen Nährboden dient. Bei diesem letztgenannten Verfahren ist es jedoch notwendig, den Schlauch abzuklemmen, um zuverhindern, dass susäts liches Blut in das Gefäss übertritt, weil ein bestirntes Verhältnis von Blut zum Medium aufrechterhalten werden muss.

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Es erfordert ausserdem die Verwendung von zwei Arten evakuierter Gefässe, eines für aerobe und eines für anaerobe Organismen.

Eines der Probleme, das beim Züchten von aeroben Mikroorganismen auftritt, ist die Gefahr, dass der das Gefäss verschliessende Stopfen durch den inneren Gasdruck im Gefäss herausgedrückt wird, und in anderen Fällen, wo · eine Schraubkappe verwendet und später entfernt wird, kann der Stopfen beim Öffnen herausgeschleudert werden und zu einer Verunreinigung des Arbeitsplatzes führen.

Bei allen bekannten Verfahren müssen streng aseptische !Techniken eingehalten werden, um ein Infizieren der zu untersuchenden Probe durch fremde Bakterien zu vermeiden.

Bin Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein geschlossenes System zum Aufnehmen, Züchten und Identifizieren von aus Körperflüssigkeiten gewonnenen Mikroorganismen zu schaffen. Weiter schafft die Erfindung ein Verfahren und. eine Vorrichtung zum Züchten von aeroben und/oder anaeroben Mikroorganismen in einer einzigen Vorrichtung. Auch wird nach der Erfindung ein Aufnahmegefäss zur Verfügung gestellt, das automatisch eine gesteuerte Menge einer Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, abzieht, so dass man ein vorbestimmtes Verhältnis von Körperflüssigkeit zu Medium erhält, ohne die Notwendigkeit, die erforderliche Menge an Körperflüssigkeit abzumessen. Weiter sieht die Erfindung eine Ventilationseinrichtung vor, die es gestattet, den sterilisierten Stopfen steril zu halten und eine Verschmutzung des Züchtungsmediums während der Impfung zu vermeiden. Auch ist ein Auslass für die Abgabe von durch das Wachstum der Mikroorganismen entstandenem Gas vorgesehen, sowie

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für den Zutritt von Sauerstoff, der für das Wachstum aerober Mikroorganismen erforderlich ist. Dieser Auslass bzw. Einlass hat eine gesamte Weglänge und eine Anzahl vnn derart engen Kanälen, dass er eine Falle oder Sperre für Mikroorganismen bildet. Dabei sollten die Torrichtungsteile des erfiiidungsgemässen Systems zum Aufnehmen und Züchten von Mikroorganismen nach Gebrauch wegwerfbar und preisgünstig herzustellen sein und eine einfache Handhabung unter Einhaltung aseptischer Bedingungen bim Aufnehmen und Übertragen von Körperflüssigkeiten auf einen Kulturboden ermöglichen. Es ist ein Ziel der Erfindung, eine Torrichtung zu schaffen, welche die gleichzeitige Züchtung aerober und anaerober Mikroorganismen ermöglicht und Einrichtungen zum Steuern und Begrenzen der Sauerstoff-Diffusionsrate durch das Züchtungsmedium bzw. den Kulturboden hindurch enthält.

Allgemein schafft die Erfindung ein verbessertes System für die Aufnahme einer Probe unmittelbar in ein Rohr, welches ein für das Wachstum von in der Probe enthaltenen Mikroorganismen geeignetes Medium enthält. Es können die verschiedensten Medien verwendet werden und nach Wunsch Substanzen enthalten, die die 3?arbe ändern und dadurch bestimmte Arten von Mikroorganismen klassifizieren. Die Torrichtung bzw. das System umfasst Einrichtungen zur automatischen Aufnahme der geeigneten Probenmenge, so dass ein vorbestimmtes Terhältnis der Probe zum Medium erhalten wird* Weiter sind Mittel für die Übertragung der Probe auf das Medium unter aseptischen Bedingungen vorgesehen, ohne dass hierfür besondere Einrichtungen oder Massnahmen erforderlich sind. Auch dient eine Einrichtung dazu, in dem

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Eohr eine bestimmte Atmosphäre aufrechtzuerhalten, die für das Wachstum sowohl aerober als auch arserober Mikroorganismen in einem einzigen Züchtungsgefäss erforderlich ist.

Bei dem verbesserten Verfahren nach der Erfindung wird eine Einrichtung zum Punktieren einer Vene verwendet, wie zum Beispiel eineEinrichtung mit einem evakuierten Hohr und einem Halter bzw. einer Buchse mit einer Nadel für Mehrfachproben. Eine solche Einrichtung ist in der US-PS 2 460 641 beschrieben, und die Nadel für Mehrfachproben ist den US-PS 3 469 572 und3 -494 552 zu entnehmen. Ein evakuiertes Rohr, welches den gewünschten Nährboden enthält, wird dazu verwendet, die Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, durch die Nadel zu entnehmen. In dem evakuierten Rohr herrscht ausreichender Unterdruck, um eine vor bestimmte Menge an Blut oder dergleichen darin auf zunehmen, und innerhalb des Rohr herrscht eine inerte Atmosphäre wie beispielsweise aus Kohlendioxyd oder Stickstoff.

des Rohrs

Der Stopfen/wird sterilisiert und dann wird eine Belüftungseinrichtung so auf das Rohr aufgesetzt, dass ein steriles Seid um denStopfen herum während der Impfung, beispielsweise der Blutaufnahme, aufrechterhalten w,ird. Die Belüftungseinrichtung v/eist eine Kappe mit etwas grösserem Durchmesser als der desStopfensauf sowie eine im Boden der Kappe gelagerte/HohlnadelDas spitze Ende der Nadel erstreckt sich so weit durch die Kappe hindurch, dass es den das Rohr verschiiessenden Stopfen durchsetzt und eine Verbindung zwischen dem Inneren des Rohrs und der Atmosphäre herstellt. Das andere Ende der Nadel erstreckt sich von dem Stopfen nach ausaen und ist mit einem Belüftungsschutz versehen, der feine Kanäle enthält, so dass Luft

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aus der Umgebung in das Rohr eindringen und im Rohr durch das Wachstum der Mikroorganismen entstandenes G-as austreten kann.

Nachdem das die Kultur enthaltende und mit der Belüftungseinrichtung versehene Rohr in geeigneter Atmosphäre einer Temperatur, beispielsweise in einem Brüter, von etwa 35°C ausgesetat wurde und Wachstum von Mikroorganismen erkennbar ist, kann dem Kulturmedium eine Teilprobe zum weiteren Züchten und anschiiessenden Identifizieren entnommen werden. Die Vorrichtung ist so ausgebildet, dass aerobe Organismen an oder nahe der Oberfläche des Mediums wachsen. Anaerobe Organismen dagegen wachsen an oder nahe dem Boden des Rohres, während fakultative odor aktivmotile Organismen über das Medium verteilt anzutreffen sein können.

Teilprobem des Kulturmediums werden dem Rohr auf aseptische Weise entnommen , um ein Infizieren von aussen zu vermeiden, Terschisdene Techniken können hierfür angewendet v/erden. Der Stopfen kann zusammen mit der vollständigen Belüftungseinrichtung entfernt werden, Dann wird eine Probe vom obersten Teil des Kulturmedium mittels einer sterilen Pipette oder einer sterilen Spritze mit !Tadel entnommen; die Probe wird auf eine Subkultur-Einheit, beispielsv/eise eine Petrischale, übertragen, welche das richtige, feste Kulturmedium zum Identifizieren der vermuteten aeroben Organismen enthält.

Sine zweite Probe kann dem Rohr durch Einführen einer sterilen Pipette oder Spritze mit Nadel derart entnommen werden, dass die jeweilige Spitze sich nahe dem Boden des Rohres befindet. Die Probe wird, wie vorher, wieder auf eine Subkultur-Einheit übertragen. Eine dritte Probe kann in der gleichen Weise aus

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dem mittleren Bereich des Rohres bzw. des darin "befindlichen Kulturmediums entnommen werden. Die Subkulturen v/erden unter Beachtung der thermischen Bedingungen in der* jeweils geeigneten gasförmigen Umgebung weiter gezüchtet, aerobisch in der Gegenwart von atmosphärischer Luft und anaerobisch in Gegenwart von Stickstoff oder von Kohledioxyd oder von ber den bzw. sonstigen, an sich bekannten, Bedingungen. Die jeweilige Organismenart wächst dabei entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von Sauerstoff.

Auch gestattet die Tentilations- bzw. Belüftungseinrichtung es, einen biegsamen Schlauch auf das jteie Ende der Ii ad el dieser Einrichtung aufzusetzen, wie in Fig. 10 gezeigt. Das andere Ende des Sehlauchs wird mit einem Messinstrument zum Peststellen der Anwesenheit eines bestimmten, von Mikroorganismen erzeugten Gases, verbunden..

Die Erfindung ist nachstehend anhand der Zeichnung beispielsweise näher erläutert, und zwar zeigen:

Fig. 1 in auseinandergezogener Darstellung eine Ansicht einer betriebsfertigen erfindungsgemässen Vorrichtung zum Züchten von Mikroorganismen;

S¹Ig. 2 vergrössert und im Schnitt eine Teilansicht der Belüftungseinrichtung auf dem in Pig. 1 gezeigten Rohrjf

Pig. 3 stark vergrössert einen Schnitt nach der Linie 3-3 der Pig. 2;

Pig. 4 einen Axialschnitt durch die von dem Rohr abgenommene Belüftungseinrichtung mit dem Stopfen;

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Pig. 5 eine Seitenansicht des Rohres in einem Halter in situ am Arm eines Patienten und bereit, ein vorbestitnmtes Yolumen an Blut aufzunehmen;

Pig. β eine der Pig. 5 entsprechende Ansicht, wobei das Rohr von dem in situ verbleibenden Halter entfernt wurde, nach erfolger Entnahme der Blutprobe;

. 7 dienen der Erläuterung verschiedener Verfahren zur bis 9 Entnahme von Üeilproben bzw. Subkulturen aus dem im Rohr enthaltenen Kulturmedium;

Pig. 10 eine Seitenansichten der gezeigt ist, wie von im Rohr gezüchteten Mikroorganismen gebildete Gase zum Analysieren dieser Gase abgeleitet werden können;

Pig. 11 vergrössert einen axialen £eilschnitt durch die Belüftungseinrichtung der Pig. 4 mit einem entfernbaren Zapfen innerhalb der Kanüle; und

Pig. 12 teilweise im Schnitt eine Seitenansicht für eine andere Porm des Behälters für das Kulturmedium, wobei sich die Belüftungseinrichtung an ihrem Platz befindet.

Das Ku^tursystem bzw. die Vorrichtung zum Züchten von sowohl strikt aeroben als auch anaeroben Mikroorganismen ist in Pig. 1 aus einander gezogen gezeigt und allgemein mit 10 bezeichnet. Ein evakuiertes Rohr 12, das aus Glas oder durch-

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sichtigem Kunststoff bestehen kann, der nicht toxisch und inert gegenüber dem Nährboden und den zu züchtenden Organismen ist, wird verwendet. Ein durchstechbarer Stopfen 14 ist lösbar in das offene Ende 15 des Rohres 12 eingesetzt.

EineBelüftungseinrichtung 16 wird auf das Rohr 12 aufgesetzt, wie in Eig. 2 gezeigt'. Die Belüftungseinrichtung weist eine Kappe 18 aus biegsamem Kunststoff, beispielsweise Polyäthylen, auf. Die Kappe 18 hat einen zylindrischen Hauptteil mit etwas grösserem Durchmesser als der Stopfen 14 des Rohres 12 und nimmt mit ihrem offenen Ende das mit dem Stopfen 14 versehene Ende des Rohres 12 auf. Der Boden der Kappe 18 ist mit 19 bezeichnet. In der Mitte des Bodens ist eine Nahe 20 mit einer axialen Bohrung 21 ausgebildet, durch die eine Kanüle oder Nadel 24 axial in die Kappe 18 einsetzbar ist. Die !Tadel 24 asfc fest in der Bohrung 21 angebracht, beispielsweise durch ein !Epoxyharz. Sie ist zwischen ihren Enden 25 und 26 in der Habe 20 gelagert. Das Ende 25 ist angespitzt, um das Durchstechen des Stopfens 14 zu erleichtern, v/odurch eine Verbindung zwischen dem Inneren des Rohres 12 und seiner Umgebung aufrechterhalten wird.

V/ie in Pig. 2 gezeigt, ist die Belüftungseinrichtung so auf dem Rohr 12 angebracht, dass das spitze Ende 25 der Nadel sich durch den Stopfen 14 hindurch erstreckt, wobei das spitze Ende 25 sich oberhalb des Kulturmediums bzw. Nährbodens 30 befindet. Wenn die Torrichtung 10 in eine erwärmte Umgebung gebracht wird, kann durch die Kanüle bzw. Nadel 24 ein Gasaustausch stattfinden, intern innerhalb des Rohres oberhalb des Nährbodens 30 befindliches Gas durch die Nadel 24 nach aussen gelangt und die gewünschte Atmosphäre von aussen in den Raum oberhalb des Nährbodens'30 eintreten kann.

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Zu der Belüftungseinrichtung 16 gehört eine Schutshülse 28 aus Kunststoffι die mit um ihre Innenfläche vertalten Rippen 29ausgebildet ist, die, wenn die Schutzhülse 28 auf die Nabe 20 aufgesetzt ist, die Aussenflache der Nabe berühren und auf dieee Weise Kanäle 31 bilden, durch die das Gas oberhalb des Nährbodens 30 über die Nadel 24 austreten kann. Gleichzeitig strömt die äussere Atmosphäre durch die Nadel 24 ein, so dass in dem Rohr 12 enthaltene aerobe Mikroorganismen mit optimaler Rate wachsen können.

Bei der in Fig. 11 gezeigten anderen Ausführungform einer Belüftungseinrichtung 16' kann der Durchgang durch die Nadel bsw. Kanüle 24 anfänglich durch ein viskoses Material 52 verstopft sein, wie beispielsweise eine Mischimg aus Petroleumgelee und Paraffin. Dies kann dann zweckmässig sein, wenn es wünschenswert ist, von dem Kulturmedium anfänglich allen Sauerstoff fernzuhalten, wenn anaerobe Mikroorganismen gezüchtet v/erden. Wenn dann der von diesen Mikroorganismen erzeugte Gasdruck ansteigt, am Beispiel Kohlendioxid, Methan oder ein sonstiges anderes Gas als Sauerstoff, wird der Zapfen aus dem viskosen Material 52 aus der Nadel 24 herausgedrückt und stellt dadurch einen kontinuierlichen Durchgang von der Oberfläche des Kulturmediums zur äusseren Atmosphäre her, wodurch jede Gefahr eines Herausdrückens des Stopfens 14 (Pig. 2) unter der Wirkung des Gasdrucks vermieden wird. In diesem fortgeschrittenen Wachsturnsstadium der Mikroorganismen hat ein Hineindiffundieren von atmosphärischeni Sauerstoff zur Oberfläche des Kulturmediums keine schädliche oder hindernde Einwirkung mehr auf das Wachstum der Anaeroben.

In Pig. 4 ist die Belüftungseinrichtung 16 gezeigt, um eine der Möglichkeiten zum Entfernen des Stopfens 14 von dem Rohr

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12 zu erläutern, falls eine Teiprobe unter Aufrechterhaltung aseptischer Bedingungen dem Rohr 12 entnommen werden soll. Der zylindrische Hauptteil ,der zur Belüftungseinrichtung gehörenden Kappe 18 wird hierfür zur festen Anlage am Stopfen 14 zusammengedrückt und dann durch Hochziehen der Stopfen vom Rohr 12 entfernt. Der Stopfen 14 ist dabei, wie gezeigt, von der Nadel 24 durchsetzt dargestellt, wobei deren spitzes Ende 25 sich durch den Stopfen hindurch erstreckt.

Fig. 7 zeigt das Rohr 11 nach Entfernung des Stopfens 14. Eine Pipette 40 mit elastischem Ballon 42 am äusseren Ende wird in die im Rohr 12 enthaltene Kultur eingeführt. Eine beliebige Menge des geimpften Kulturmediums kann dann für Zwecke von Subkulturen dem Rohr entnommen werden.

8 zeigt ein anderes Verfahren zur Entnahme einer Teilprobe. Hier ist nur die Belüftungseinrichtung 16 entfernt und eine sterile Spritze 44 mit Nadel dient zum Abziehen des Gemisches aus dem Rohr 12 nach Durchstechen des Stopfens mit der Nadel 45· Natürlich ist die Nadel 45 lang genug, um mit ihrem spitzen Ende 46 in das Kulturmedium einzutauchen.

Bei dem in 2?ig. 9 gezeigten Verfahren wird eine Mikropipette 47 verwendet, mit einem Durchmesser, der die gleitende Einführung durch die Nadel 24 der Belüftungseinrichtung 16 hindurch ermöglicht. Die Mikropipette ist mit einem flexiblen Ballon 48 dargestellt. Stattdessen kann jedoch auch eine andere Einrichtung zum Abziehen der Teilprobe verwendet werden, z.B. eine hypοdermisehe Spritze mit einer langen Nadel, die in die Kanüle 24 eingeführt wird. Nach Entnahme der leil

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probe wird die Schutzhülse 28 wieder auf die Habe 20 zur Aufrechterhaltung aseptischer Bedhgungenaufgesetzt.

Auch bei dem anhand der Fig. 10 gezeigten Verfahren ist von der Belüftungseinrichtung Λ β nur die Schutzhülse 28 abgenommen worden. An das äussere Ende 26 der Nadel 24 ist ein biegsamer Schlauch 50 angeschlossen, so dass in dem Rohr 12 entstandenes Gas über den Schlauch 50 abgeleitet und mit Hilfe geeigneter Geräte analysiert werden kann, um die Anwesenheit eines für bestimmte Arten von Organismen typischen Gases festzustellen.Auch ist das Volumen des von den Mikroorganismen erzeugten Gases als Indiz der Wachstumsrate der Kultur innerhalb des Rohres 12 zu verwenden.

Bei der in Fig. 12 gezeigten Ausführungsform kann der Behälter 55 etwa so geformt sein, wie er dort gezeigt ist. Der rohrartige Halsteil 54 hat etwa Grosse und Form des oberen Seils der Behälter bzw. Rohre 12 der anderen&usführungsform, so dass er mit der Belüftungseinrichtung 16 in der oben beschriebenen und in Fig. 4 gezeigten Weise zusammenarbeiten kann. Der Hauptvorteil eines Behälters 55 in der in Fig. 12 gezeigten Gestalt liegt in der Möglichkeit, eine wesentlich grö'ssere Blutprobe aufzunehmen. Wenn in dem Blutstrom nur einige von einer gegebenen Art von Mikroorganismen vorhanden sind, besteht statistisch eine weit bessere Chance, diese Art von Mikroorganismen zu entdecken, wenn die Grosse der Blutprobe wesentlich gesteigert werden kann, während das Ver.dünnungsverhältnis von 1 jj 8 bis 1 : 10 für die Züchtung beibehalten bleibt.

Ein weiteter Vorteil eines Behälters 55 gemäss Fig. 12 liegt in der Grundfläche, die es gestattet, den Behälter 55 aufrecht hinzustellen, ohne dafür ein Gestell oder einen

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Halter zu benötigen.

Bei Anwendung der Erfindung kann jede Act eines Kulturmediums verwendet werden, um Mikroorganismen zu züchten, die in einer Körperflüssigkeit enthalten sein können. Ein Beispiel für ein Kulturmedium, das verwendet werden kann, ist Supplemented Peptone Broth Blutkulturmedium, das von der Firma Beeton, Dickinson& Company vertrieben wird. Zahlreiche Kulturmedien sind im Handel erhältlich um spezifische Mikroorganismen zu züchten, und viele werdeafür die Züchtung einiger Typen von Mikroorganismen abgewandelt. Körperflüssigkeiten, die unter Terwendung der Erfindung für Züchtungszwecke benutzt werden können, sind beispielsweise Synovialflüssigkeit, Rückenmarksflüssigkeit, Peritonal flüssigkeit, Pleuralflüssigkeit, Urin , Blut, usw.

Dass mit der vorliegenden Erfindung die äusserst wünschenswerte gleichzeitige Züchtung sowohl aerober als auch anaerober Mikroorganismen ermöglicht wird, liegt an der Verwendung von Konstruktionsbedingungen, die einen sehr stark abfallenden Sauerstoffgradienten ergeben. Obwohl in der Umgebung einer Vorrichtung nach der Erfindung Sauerstoff sogar mit normalem atmosphärischem Partialdruck vorhanden ist, sind die Konstruktionsfaktoren so proportioniert und kombiniert, dass die zum Boden der Säule aus Kulturmedium durch-diffundierende Menge an Sauerstoff geringer als diejenige ist, die das Wachstum wie auch die Veriöehrung von darin enthaltenen anaeroben Mikroorganismen nachteilig beeinflussen könnte*· Die signifikanten Faktoren sind die im folgenden in Ausdrücken abnehmender Sauerstoffdiffusionsrate angegebenen, in Bezug auf:

1. der Gesamtquerschnitt der Mikroorganismenfalle, d.h. der zwischen den Rippen 29g&ildeten Kanäle 31; je

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. kleiner dieser Querschnitt ist, umso geringer ist die

Biffusionsratej
2. mit wachsender Länge des Kanals 31 vermindert sich

die Diffusion;
3.je geringer der Querschnitt der lichten ¥eite der Kanüle 24 von der/lüftungseinrichtung 16 ist, umso geringer wird die Sauerstoffdiffusion;

4. je länger der Kanal in der Kanüle 24 ist, umso geringer wird die Sauerstoffdiffusion;

5. je kleiner der Querschnitt an der Oberseite der Säule von Kulturmedium 30 ist, umso geringer wird die Sauerstoffdiffusion; und

6. je länger die Säule von Kulturmedium 30 (von der Oberseite bis zum Boden) ist, umso geringer wird die Diffusion.

Die Dimensionsbereiche der Eaktoren in Kombination sind gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung im wesentlichen die folgenden!

1. der 6-esamtquerschnitt der Kanäle 31 liegt im Bereich von etwa 0,000025 Quadratzoll bis 0,0025 Quadratzoll in Kombination mit:

2. der Länge der Kanäle 31 im Bereich von etwa 0,2 bis 0,625 Zoll in Kombination mit:

3. dem Durchmesser des lichten Querschnitts der Kanüle 24 im Bereich von etwa 0,016 bis 0,052 Zoll in Kombination mit:

4. der Länge des Kanals in der Kanüle 24 im Bereich von

etwa 0,5 bis 2,0 Zoll in Kombination mit: 5. der Gesamtquerschnittsfläche an der Oberseite der Säule von Kulturmedium 30 äquivalent einer Scheibe mit Durchmesser im Bereich von etwa 10 bis 20 mm in Kombination mit:

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6. einer Länge der Säule des Kulturmediums 30 zwischen etwa 50 und 200 mm.

Das nachfolgende Beispiel dient der Erläuterung der Verwendung der Erfindung zum Züchten von Mikroorganismen, die sowohl streng anaerobisch als auch streng aerobisch in dem gleichen Kulturbehälter unter Verwendung des gleichen Kulturmediums sein können, wobei die verwendete Körperflüssigkeit Blut ist.

Beispiel

Es wird ein Blutentnahmegerät verwendet, wie es in den US-PS 3 469 572 und 3 494 352 beschriebe ist, wo mittels einer Nadel für Mehrfachproben eine Kulturprobe zusammen mit anderen Blutproben für hämatologische oder andere Bestimmungen im Laboratorium unter Verwendung der gleichen Venenpunktur entnommen wird. Palis nur eine Kulturprobe benötigt wird, kann eine Blutentnahmeeinrichtung gemäss der US-PS 2 460 641 verwendet werden. Die Bjutentnahmeeinheit nach diesen Patenten weist eine Entnahmenadel "F", einen Halter "H" zum Lagern der Nadel und zum Aufnehmen und Verbinden eines evakuierten Kohres mit der !Tadel auf. Zunächst wird eine Venenpunktur in üblicher Yfeise gemacht. Ein Bohr von 16· mm Durchmesser, das ein vorbestimmtes Volumen an gasförmigem Kohlendioxyd und Stickstoff von vorbestimmtem, nfedrigerem als atmosphärischem Druck sowie ein flüssiges Blutkulturmedium über eine Länge von 120 mm enthält, wird in den Halter "H" eingesetzt. Als Kulturmedium wird Supplemented Peptone Broth Blutkulturmedium von der

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Firma Becton, Dickinson& Company verwendet. Wie in Pig. gezeigt ist, v/ird das Rohr 12 so in den Halter "H" eingesetzt, dass der Stopfen 14 von dem einen Ende der Entnahmenadel" IT" durchstosseii wird. Nur eine vorbestimmte Menge an Blut wird von dem Rohr 12 aufgenommen, derart, dass das Verhältnis von Blut zu Kulturmedium darin zwischen 1 : S und 1 : 10 liegt. Das Rohr wird dann von dem Halter "H" wie in Pig. 6 gezeigt abgenommen und i3t damit für die Weitergabe an das Laboratorium bereit. Bevor das Rohr jedoch in die geeignete thermische Umgebung verbracht wird, wird der Inhalt durch wiederholtes Umkehren gründlich durchmischt, und eine Belüftungseinrichtung wird so auf das Rohr aufgesetzt, dass der Stopfen von der Nadel der Belftungseinrichtung durchstochen wird. Biese !Tadel hat eine Länge von 1,45 Zoll und einen Durchmesser des lichten Querschnitts von 0,04 Zoll. Die Belüftungseinrichtung wird mit einer Schutzkappe versehen, um die Sterilität zu bewahren und eine Strömung gasförmiger AussenatmoSphäre in das Rohr hinein sale von den Mikroorganismen stammender gasförmiger Substanz aus dem Rohr heraus zu ermöglichen. Die Belüf tungs kappe schafft eine Anzahl von Kanälen, die eine Mikrobensperre bilden, sodass die Diffusion der gasförmigen Atmosphäre

in das Rohr in einer gesteuerten Rate aufrechterhalten wird. Die Kanäle haben einen Querschnitt von 0,00025 Quadratzoll und eine Länge von 0,625 Zoll. Der Gummist-opfen 14 des Rohrs 12 v/ird in aseptischem Zustand gehalten, damit er nicht von aussen durch Bakterien verunreinigt wird. Wenn aerobe oder sowohl anaerobe als auch aerobe Züchtung erfolgen soll, ist die Atmosphäre innerhalb des Inkubators Luft oder Luft mit zugefügtem KohlendicKyd.

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Die so vorbereitete Züchtungseinheit wird in aufrechter Stellung in einem Inkubator von der richtigen Temperatur . und Atmosphäre für 12 bis 24 Stunden gehalten und darauf wird eine Probe für eine Subkultur oder zum Einfärben bzw. Beizen entnommen. Dies kann mit jeder beliebigen der Techniken erfolgen, wie sie oben anhand der !Figuren 7 bis 9 zum Entnehmen von Proben aus dem Rohr beschrieben wurden.

Eine weitere Möglichkeit zum Entnehmen einer Probe des im Inkubator behandelten Kulturmediums mit Blut besteht darin, die Belüftungseinrichtung abzunehmen; den Inhalt des Eohrs durch wiederholtes Umkehren zu mischen; die Belüftungseinrichtung wieder aufzusetzen; die Schutzhülse 28 abzunehmen; und dann den Behälter bzw. dac Rohr umzukehren, so dass die Belüftungseinrichtung nach unten gerichtet ist und leicht zu schütteln, um einen oder mehrere Tropfen des flüssigen Inhaltes durch die Kanüle 24 auf ein Substrat zu geben, etwa ein Subkulturraedium oder eine Glasplatte. Jede der verschiedenen Arten vo η Probeentnahmen muss jedoch unter aseptischen Bedingungen erfolgen, um eine Verunreinigung von aussen zu vermeiden.

Bei der Verwendung von anderen Körperflüssigkeiten als Blut kamnatürlich ein entsprechend anderes Kulturmedium verwendet werden, insbesondere, wenn die Vermutung besteht, dass eine spezifische Art von Mikroorganismen in der betrefifeiden Körperflüssigkeit vorhanden ist.

( In der Zeichnung Fig. 3 ist die Darstellung der Rippen 29 unkorrekt, die sich an der Hülse 28 (vgl. Fig.2) und nicht wie in Fig. 3 an der Nabe 20 befinden müssen. Der Fehler wurde nur im rechten Teil der Fig. 3 provisorisch korrigiert, wo die Rippen 29 und Durchlässe 31 bereits richtig dargestellt sind. Eine vollständig korrigierte Fig. 3 wird nachgereicht werden.)

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Claims

1974 Beeton, Dickinson & Company

Da/mr ' *p Zusatz zu P 22 54 282.1

Ansprüche

Verfahren zum Züchten von in einer Probe einer Körperflüssigkeit enthaltenen Mikroorganismen, wobei ein in einem Behälter vorgesehenes Kulturmedium mit der Probe der Körperflüssigkeit geimpft wird, gekennzeieliet durch die folgenden Yerfahrensschritte: e.s wird in dem Behälter im Raum oberhalb des Kulturmediums eine gasförmige Atmosphäre von geringerem als atmosphärischem Druck aufrechterhalten, wodurch die Probe automatisch aufhört, den Behälter weiter zu füllen, vieim das Yolumen der Probe relativ zum Kulturmedium ein volurnetrisches Verhältnis im Bereich zwischen etv/a 1 zu 8 bis 1 zu 10 erreicht;

eine Belüftungseinrichtung mit Mitteln zum Aufrechterhalten einer Verbindung für strömende Medien zwischen dem Inneren des Behälters und der äusseren Atmosphäre wird angebracht;

in der Verbindung für strömende Medien zwischen dem Inneren des Behälters und der äusseren Atmosphäre wird eine Sperre für Mikroorganismen derart vorgesehen, dass Gas durch diese Sperre hindurchtreten kann, Mikroorganismen jedoch an dem Durchtritt gehindert sind; das geimpfte Kulturmedium wird darauf den geeigneten Umgebungs be dingungen vori. Temperatur und gasförmiger Atmosphäre für eine Zeitspanne unterworfen, die erforderlich ist, um maximales Wachstum zu erleichtern, so dass aerobe Mikroorganismen im oberen Teil des Mediums wachsen und sich vermehren können, während anaerobe Mikroorganismen gleichzeitig im Bodenbereich des Kulturmediums wachsen und sich vermehren können, schliesslich fakultative und aktiv-

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motile Mikroorganismen über das ganze Medium verteilt wachsen und sich vermehren können.

Verfahren zum Züchten von in einer Probe einer Körperflüssigkeit enthaltenen Mikroorganismen, wobei ein in einem Behälter 'enthaltenes Kulturmedium mit der Probe geimpft wird, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

e s wird in dem Behälter im Ilaurn oberhalb des Kulturmediums eine gasförmige Atmosphäre von geringerem als atmosphärischem Druck aufrechterhalten, wodurch die Probe automatisch aufhört, den Behälter weiter zu füllen, wenn das Volumen der Probe relativ zum Kulturmedium ein volumetris dies Verhältnis im Bereich zwischen etwa 1 zu 8 bis 1 zu 10 erreicht;

eine Belüftungseinrichtung mit einer zum Aufrechterhalten einer Verbindung für strömende Medien zwischen dem Innern des Behälters und der äusseren Atmosphäre geeignete Kanüle wird angebracht, in der eine druckempfindliche, für G-as undurchlässige Sperre vorgesehen ist, die auf von den im Behälter gezüchteten Mikroorganismen erzeugten Gasdruck ansprechen und durch einen vorbestimmten Anstieg dieses Druckes herausgedrückt werden kann; wenigstens ein von der Belüftungseinrichtung geformter Durchgang für Strötaungsverbindung durch die Kanüle vom Inneren der Belüftungseinrichtung und von der äusseren Atmosphäre nach Beseitigung der Sperre aus der Kanüle wird vorgesehen;

in der Verbindung für strömende Medien zwischen dem Inneren des Behälters und der äusseren Atmosphäre wird eine Falle für Mikroorganismen derart vorgesehen, dass Gas durch diese Sperre hindurchtreten kann, Mikroorganismen jedoch an dem Durchtritt gehindert sind,· und

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«Ο

schliesslich das geimpfte Kulturmedium den richtigen Umgebungsbedingungen von !Temperatur und gasförmiger Atmosphäre für eine Zeit aussetzen, die erforderlich ist, um maximales Wachstum von anaeroben Organismen innerhalb des gesamten Kulturmediums zu erleichtern.

3. Verfahren nach .Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Belüftungseinrichtung mit einer Torrichtung zur Gasanalyse verbunden und die Zusammensetzung der von den Mikroorganismen erzeugten gasförmigen Atmosphäre bestimmt wird, während diese Mikroorganismen gezüchtet werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die der Züchtung unterworfene Probe Blut ist.

5. Vorrichtung zum Sammeln, Züchten isnd Identifizieren von in einer Brobe einer Körperflüssigkeit enthaltenen Mikroorganismen, mit einem Behälter, der mindestens ein geschlossenes und ein offenes Ende aufweist, und einen elastischen ^Schluss für das offene Ende, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter 12 einen Innendurchmesser von 10 bis 20 mm hat und teilweise mit zum Züchten der im Behälter enthaltenen Mikroorganismen geeigentem Fährmedium gefüllt ist, das im Behälter eine Säule von 50 bis 200 mm Höhe bildet; dass der Kaum oberhalb des Uährmediums von einer gasförmigen Atmosphäre gefüllt ist, von einem vorbestimmten, unterhalb des atmosphärischen Drucks liegenden Druck, wodurch die Vorrichtung in der lage ist, ein vorbestimmtes Volumen der Probe zum Erzielen eines Verhältnisses von Probe zu Uährmedium im Bereich von etwa 1 ί 8 bis 1 : 10 aufzunehmen;

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dass eine Belüftungseinrichtung (16) mit einer Kanüle, die mit dem Verschluss (14) zusammenwirkt, vorgesehen - ist, und Teile (29) aufweist, die wenigstens einen Durchgang (31) bilden, der die äussere Atmosphäre über die Kanüle·(24) mit der gasförmigen Atmosphäre innerhalb des Behälters (12) verbindet, wobei im Strömungsweg des Durchgangs und der Kanüle eine IPaIl e für Mikroorganismen vorgesehen ist und die Kanüle eine Länge zwischen 0,5 und 2,0 Zoll und einen lichten Querschnitt mit einem Durchmesser zwischen 0,016 und 0,052 Zoll hat, während der Durchlass eine Querschnittsfläche zwischen 0,000025 und 0,0025 Quadratzoll und eine Länge zwischen 0,2 und 0,625 Zoll hat.

6. Torrichtung nach Anspruch 5> dadurch geke η.Ώ. -zeichnet, dass die Belüftungseinrichtung (16) einen kappenartigen Teil (18) aufweist, der das mit dem Versöhlusa

offene
(14).versehene/Ende des Behälters (12) übergreift und oben eine Nabe ('2O) mit einer axialen Bohrung für die Kanüle (24) trägt, dass auf der Nabe eine den nach aussei! gerichteten Teil der Kanüle umgebende Abschirmung (28) gelageet ist, mit einer Anzahl radialer, sich über ihre Innenfläche erstreckender Rippen (29), die zusammen mit der Habe (20) eine Anzahl von Durchlässen (31) formen, die eine mikrobische Falle bilden, aber die Zirkulation von mikrobischem Gas aus dem Inneren des Rohrs (12) zur äusseren Atmosphäre sowie eine Diffusion von atmosplirischem Sauerstoff von aussen zur Innenseite des Behälters zulassen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Blut ist und dass der Unterdruck in der Röhre (12) geeignet ist, ein vorbestimmtes Volumen an Blut für ein Verhältnis von Blut

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te

zu Kulturmedium ita wesentlichen zwischen 1 : 8 und 1 : 10 aufzunehmen.

8. Torrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7» dadurch gekennze ich η et, dass die gasförmige Atmosphäre im Behälter (12) Stickstoff ist.

9·ί· Torrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die gasförmige Atmosphäre im Behälter Kohlendioxyd ist.

10. Torrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, d a d u r ch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen, die aufgenommen, gezüchtet und identifiziert werden, anaerobe Mikroorganismen sind.

11. Torrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadur ch gekennze ichnet, dass die Mikroorganismen, die aufgenommen, gezüchtet und identifiziert werden, aerobe Mikroorganismen sind,,

12. Torrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennze ichnet, dass unter den in der zu züchtenden Probe enthaltenen Mikroorganismen sowohl aerobe als auch anaerobe sind.

15- Torrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 12. dadurch gekennzeichnet» dass die Belüftungseinrichtung (16) eine abnehmbare Hülse (28) zum ümschliessen der kanüle (24) aufweist, wobei die Hülse auf der Innenseite eine Anzahl von Rippen (29) hat, durch die, wenn die Hülse auf der Belüftungseinrichtung angebracht ist, eine Anzahl von Durchlässen (31) geformt werden, die Pallen für Mikroorganismen darstellen.

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14. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder einem der folgenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Belüftungseinrichtung (16) einen Körperteil (18) und einen an diesem befestigbaren abnehmbaren Teil (28) aufweist, die zusammen eine Palle bilden, die für Mikroorganismen undurchlässig, für Gase dagegen durchlässig ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder einem der folgenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter (55? i'ig. 12) einen schmalen Halsteil (54) in fester bzw. einstückiger Verbindung mit einem verbreiterten Körperteil (53) aufweist und in der Lage ist, ein grosses Probevolumen aufzunehmen, wodurch die statistische Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein eines zahlenmässig relativ seltenen Mikroorganismus . innerhalb der Probe wesentlich vergrössert wird, während zugleich ein Verdünnungsverhältnis im Berebh von 1:8 bis 1 :.1O von Körperflüssigkeit zu Kulturmedium beibehalten bleibt.

16. üir eine Vorrichtung nach Anspruch 5 oder einem der folgenden Ansprüche geeignete Belüftungseinrichtung, die entfernbar auf einem Behälter mit einem offenen, mit

en einem elastischen Verschluss versehen/Ende lagerbar ist, wobei im Behälter ein Kulturmedium für die Aufnahme, Züchtung und Identifizierung von Mikroorganismen innerhalb einer Probe einer Körperflüssigkeit vorgesehen ist, und wobei die Belüftungseinrichtung sich kennzeichnet durch:

einen rohrartigen Körperteil (18) mit einem geschlossenen Ende (19), der geeignet ist, das offene Ende des Behälters (12) zu umschliessen;
eine am geschlossenen Ende geformte Nabe (20) mit einer

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Vc

axialen Bohrung darin, in welcher eine Kanüle (24) fest gelagert.ist, sie mit einem spitzen Ende (25) innerhalb des rohrartigen Körperteils (18) angeordnet und geeignet ist, den elastischen Verschluss (14) im offenen Ende des Behälters (12) zu durchdringen; eine das andere Eids der Kanüle (24) umgebende, abnehmbar auf der Fabe (20) gelagerte Abschirmung (28);* wobei die Habe (20) und die Abschirmung (28) derart ausgebildet und angeordnet sind, dass sie eine mikrobische Falle mit mindestens einem Durchlass (31) bilden, der die äussere Atmosphäre über die Kanüle mit der gasartigen Atmosphäre innerhalb des Behältern (12) verbindet, wobei die mikrobische Falle im Wege des Durchlasses (31) und der Kanüle (24) liegt.

17. Torrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchlass eine Querschnittsfläche zwischen 0,000025 und 0,0025 Quadratzoll und eine Länge zwischen 0, 2 und 0,625 Zoll hat.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurc.h gekenn ze i c h η e t, dass die Kanüle (24) eine Länge zwischen 0,5 und 2,0 Zoll und einen lichten Querschnitt mit einem Durchmesser von 0,016 bis 0,052 Zoll hat.

19. Torrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass innerhalb der Kanüle in abdichtendem Eingriff eine ■ auf Druck ansprechende, gasundurchlässige Sperre (52) angeordnet ist, die auf inneren, von Mikroorganismen im Behälter (12) erzeugten Gasdruck anspricht und bei einem vorbestimmten

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Anstieg dieses Gasdrucks ausstossbar ist.

20. Vorrichtung zum Sammeln, Züchten und Identifizieren von in einer Probe einer Körperflüssigkeit enthaltenen Mikroorganismen, mit einem Behälter, der mindestens ein geschlossenes und ein offenes Ende aufweist, und einen elastischen Verschluss;für das offene Ende, dadurch gekennz eichnet, daxs der Behälter (12) teilweise mit zum Züchten der im Behälter enthaltenen Mikroorganismen geeigneten Uahrmedium gefillt ist; dass der Raum oberhalb des Nährmediums von einer gasförmigen Atmosphäre gefüllt ist, von einem vorbestimmten, unterhalb des atmosphärischen Drucks liegenden Druck, wodurch die Vorrichtung in der Lage ist. ein vor bestimmtes Volumen der Probe zum Erzielen eines Verhältnisses von Probe zu Nährmedium im Bereich von etwa 1:8 bis 1 : 10 aufzunehmen; dass eine Beliftungseinrichtung (16) mit einer Kanüle, die mit dem Verschluss (14) zusammenwirkt, vorgesehen ist, und Teile (29) aufweist, die wenigstens einen Durchgang (31) bilden, der die äussere Atmosphäre über die Kanüle (24) mit der gasförmigen Atmosphäre innerhalb des Behälters (12) verbindet, wobei im Strömungsweg des Durchgangs und der Kanüle eine !Falle für Mikroorganismen vorgesehen ist, wobei die Belüftungseinrichtung (16) Mittel (31) zum Er3eugen eines sehr stark abnehmenden Sauerstoffgradienten aufweist, wodurch die bis zum Boden des Kulturmediums (30) durchdiffundierende Menge an Sauerstoff gering genug ist, um das Wachstum und die Vermehrung zu züchtender anaerober Mikroorganismen nicht nachteilig zu beeinflussen; wobei zu diesen Mitteln eine Balance gehört, zwischen: dem Gesamtquerschnitt des Durchlasses (31), mit dessen Grosse die Diffusionsrate des Sauerstoffes zunimmt und abnimmt;
der Länge des Durchlasses zum Steuern der Diffusionsrate

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von Sauerstoff durch das Medium, wobei die Diffusionsrate sich umgekehrt mit dieser Länge ändert; dem Querschnittsdurchmesser von der Kanüle (24) zum Steuern der Diffusionsrate von Sauerstoff durch das Medium, wobei diese mit abnehmenden Durchmesser absinkt; der Querschnittsfläche des Behälters (12) in der Fähe seines offenen Endes als Fläche zum Steuern der abnehmenden Bate von Sauerstoffdiffusion durch das Medium, wobei diese Rate mit der Fläche abnimmt;

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. und ' ■

der Säule von Kulturmedium(30) die mit wachsenderLänge die Diffusionsrate des Sauerstoffs abnehmen lässt.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Behälter (12) die Höhe des Kulturmediums (30) zwischen 50 und 200 mm beträgt.

22. Vorrichtung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennz eich net, dass der Querschnittsdurchmesser des Behälters (12) nahe seinem oberen Ende zwischen 10 und 20 mtr. beträgt.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, d &. -durch gekennzeichnet, dass die Länge der in der Belüftungseinrichtung (16) gelagerten Kanüle (24) zwischen 0,5 und 2,0 Zoll beträgt.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanüle (24) der Belüftungseinrichtung (16) einen Querschnittsdurchmesser zwischen 0,016 und 0,052 Zoll hat.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 24, d a ■'.-durch gekennzeichnet, dass die Länge des Durchlasses zwischen 0,02 und 0,625 Zoll beträgt.

26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis <5, d a du r ch

gekennzeichnet, dass die G-esaintquerselmitts-

mindestens
fläche des genannten/einen Durchlasses (31) zwischen 0,000025 und 0,00 25 Quadratzoll beträgt.

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27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamte Querschnittsfläche des besagten mindestens einen Durchlasses (31) zwischen 0,000025 und 0,0025 Quadratzoll beträgt; die Länge des Durchlasses zwischen 0,2 und 0,625 Zoll; der Durchmesser des lichten Querschnitts der Kanüle (24) zwischen 0,016 bis 0,052 Zoll; die Länge der Kanüle zwischen 0,5 und 2,0 Zoll; die Gesamtquerschnittsfläche des Oberteils des Behälters nahe seinem offenen Ende zwischen 10 und 20 mm; und die Höhe des Kulturmediums (30) im Behälter zwischen 50 und 200 mm.

28.Torrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die

mindestens .

Gesamtquerschnittsfläche des /einen Durchlasses (31; 0,00025 Quadratzoll beträgt; die Länge des Durchlasses 0,625 Zoll; der Durchmesser des lichten Querschnitts der Kanüle (24) 0,04 Zoll; die Länge der Kanüle 1,45 Zoll; der Durchmesser der gesamten Querschnittsfläche am Oberteil des Behälters nahe seiner Öffnung 16 mm; und die Länge der Säule von Kulturmedium 120 mm.

ntanwalt:

Dannenberg

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