CH671031A5

CH671031A5 -

Info

Publication number: CH671031A5
Application number: CH3372/86A
Authority: CH
Inventors: Eliahu Eisenberg; Reuven Padova; Avner Shenfeld; Zvi Hirshfeld; Jacob Stein
Original assignee: Rehovot Biomedic Ass
Priority date: 1985-08-26
Filing date: 1986-08-22
Publication date: 1989-07-31
Also published as: FR2586426B3; FR2586426A1; DE8622419U1; GB2182144A; GB8620368D0; GB2182144B; US4859586A; IL76189A0

Description

BESCHREIBUNG Die Erfindung betrifft einen Kulturbehälter für die gleichzeitige Züchtung von Mikroorganismen auf einem festen und einem flüssigen Nährmedium, gekennzeichnet durch einen einzigen transparenten Behälter mit einem breiten oberen Teil und mit einem breiteren unteren Teil, der so ausgestaltet ist, dass er das flüssige Nährmedium aufnehmen kann, wobei der obere Teil an seinem obersten Teil eine Verschlusskappe und eine hermetisch abdichtende Dichtung umfasst, wobei die Kappe und die Dichtungsstruktur ein verlängertes, sich nach unten erstreckendes Trägerelement für das feste Nährmedium tragen, das Trägerelement im wesentlichen parallel zu der Zentralachse des Behälters verläuft, sich das Trägerelement in einen wesentlichen Teil des oberen Teils des Behälters erstreckt und über dem Niveau des flüssigen Mediums aufhört, und eine Einrichtung für die Einführung der biologischen Probe in den Kulturbehälter.

Die Vorteile, Mikroorganismen zuerst auf einem flüssigen und dann auf einem festen Medium zu züchten, sind bekannt. Man hat dazu verschiedene Einrichtungen vorgeschlagen, und diese können in zwei grundsätzliche Systeme eingeteilt werden:

a. Ein Einkomponentensystem, wie es in der französischen Patentschrift 2 381 103 (des Pasteur-Instituts, angemeldet am 18.2.1977) beschrieben wird. Dieses umfasst ein Gefäss für die gleichzeitige biologische Züchtung auf einem flüssigen und einem festen Medium. Es ist ein Behälter mit einem flüssigen Medium am unteren Teil des Gefässes und mit einem festen Medium am verengten Teil eines mit Schraubschluss versehenen Abdichtungselements, welches den Halsteil des Gefässes verschliesst, vorgesehen.

Dieses System besitzt den Nachteil, dass das feste Kulturmedium nur beschränkt zu sehen ist und dass man nur ein festes Kulturmedium verwenden kann. Dieses System muss durch Behandlung im Autoklaven sterilisiert werden und aseptisch zusammengebaut werden.

b. Ein Zweikomponentensystem, bei dem in dem einen Behälter ein flüssiges Kulturmedium und in einem zweiten Behälter ein Gleitträger aus festem Kulturmedium vorgesehen sind. Die Inkubation erfolgt bei der ersten Stufe in dem flüssigen Medium. Die Behälter sind aneinanderbefestigt, so dass das feste Medium in Kontakt mit dem flüssigen steht und die Inkubation an dem festen Medium weitergeführt wird.

Das Zweikomponentensystem besitzt den grossen Nachteil, dass während der Phase, bei der der erste Behälter geöffnet und der zweite an ihm befestigt wird, eine mögliche Kontamination stattfindet.

Das feste Medium wird in einem getrennten Behälter gelagert und transportiert und kann sich daher durch teilweise Austrocknung zersetzen. Bei dem Zweikomponentensystem, welches im Handel erhältlich ist, besteht ebenfalls die Schwierigkeit, dass sich am Halsteil nach der Entfernung aus dem Inkubator ein Nebel bzw. feiner Niederschlag bildet. Dies verursacht, wie oft in der Literatur beschrieben wurde, Schwierigkeiten.

Die Nachteile der bekannten Zwillingskulturmediensysteme werden durch das neue erfindungsgemässe System im wesentlichen beseitigt, welches gegenüber den vorhandenen Systemen wesentliche Vorteile aufweist. Unter Verwendung spezieller Kulturmedien bzw. Kulturnährböden, welche durch Gammabestrahlung sterilisiert werden können, ist es ebenfalls nicht erforderlich, im Autoklaven zu behandeln, und man erhält ein optimales Kultursystem.

Gegenstand der Erfindung ist ein Kulturbehälter mit einem einzigen Behälter und mit einem flüssigen und einem festen Kulturmedium. Der Behälter kann mit einem flüssigen Medium und mit einem einzigen festen Medium oder mit einer Vielzahl solcher festen Medien auf einer Vielzahl von Trägeroberflächen verwendet werden.

Das feste oder semifeste Kulturmedium oder die Medien

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werden von einem verlängerten Träger getragen, welcher in eine Reihe von Trägersektionen für eine Vielzeit von Kulturmedien unterteilt werden kann.

Der Behälter besitzt einen weiten Hals, und das Verschlusselement trägt den Träger für das feste Medium oder 5 die Medien. In dem Behälter befindet sich in seinem unteren Teil das flüssige Medium, welches auf ein Niveau unterhalb der unteren Kante bzw. des unteren Endes des Trägers für das feste Medium reicht.

Gemäss einer bevorzugten erfindungsgemässen Ausfüh- 10 rungsform soll das gesamte System durch Gammabestrah- • lung sterilisierbar sein wodurch die Notwendigkeit, es im Autoklaven zu behandeln, vermieden wird. Zu diesem Zweck werden mit Vorteil Kulturmedien verwendet, wie sie in der britischen Patentschrift 1 478 238 beschrieben werden, 15 welche durch Gammabestrahlung sterilisiert werden können.

Das flüssige Kulturmedium wird in den Behälter gegeben. Das Verschlusselement, welches den Träger für das feste Kulturmedium trägt, wird eingesetzt (mit dem angebrachten Kulturmedium oder den angebrachten Medien) und dicht 20 verschlossen. Nach der Sterilisation ist das System für die Verwendung fertig. Es kann während Zeiten, die länger sind als 6 Monate, ohne dass es sich zersetzt bzw. verschlechtert, gelagert werden. Selbstverständlich muss die Lagerung in senkrechter Stellung erfolgen, so dass das flüssige Medium 25 von dem festen Medium getrennt ist.

Sollen Mikroorganismen bestimmt werden, so wird eine Blutprobe und eine andere Probe in den Behälter mittels einer Injektionsnadel bzw. Spritzennadel über eine elastische Dichtung in dem Verschlusselement eingeführt und in dem 30 flüssigen Medium verteilt und in diesem während einer geeigneten Zeitdauer (zwischen einigen und bis zu etwa 24 Stunden) inkubiert. Die bevorzugte Zeitdauer beträgt im allgemeinen etwa 6 bis 8 Stunden. Zu diesem Zeitpunkt wird die Flasche geneigt oder umgedreht, und das feste Medium 35 wird mit dem flüssigen Medium überspült, der Behälter wird erneut in senkrechte Stellung gestellt, und die Inkubation wird weitergeführt.

Gegen Ende der Inkubationszeit wird die Oberfläche des festen Mediums visuell von aussen geprüft, und man kann 40 leicht feststellen, ob Kolonien der Mikroorganismen auf dem festen Medium gewachsen sind. Die Flasche ist so gebaut,

dass, wenn eine Vernebelung oder Kondensation an der Fla-scheninnenoberfläche auftritt, die die Prüfung stören kann, die Flasche leicht geneigt werden kann und die kondensier- 45 ten Stoffe durch die Brühe weggewaschen werden, so dass die Flüssigkeit die Agaroberfläche nicht berührt. Wenn dies der Fall ist, kann der Behälter geöffnet werden, und die Bakterien können für weitere an sich bekannte Prüfungen entfernt werden. 50

Der Träger für das Kulturmedium oder die Medien ist am Innenteil des Behälters angebracht, und somit ist die Sichtbarkeit sehr gut. Da der Behälter ein breiter ist, ist es möglich, die Wände mit dem flüssigen Medium zu spülen,

falls eine Vernebelung auftritt, und dies kann erfolgen, ohne 55 dass das feste Medium mit dieser Flüssigkeit in Kontakt kommt.

Das System mit einem einzigen Behälter vermeidet somit die Kontaminierungsgefahr gegen Ende der Inkubation in dem flüssigen Medium. Es wurde gefunden, dass das neue 60 System mit einer Vielzahl von Kulturmedien, wie beispielsweise a. modifizierte tryptische Sojalösung bzw. -brühe, modifiziertes tryptisches Soja-Agar,

b. modifizierte Columbiabrühe bzw. -lösung, modifizier- 65 tes Columbia-Agar,

c. modifizierte Gehirn-Herzinfusionsbrühe bzw. -lösung, modifiziertes Gehirn-Herz-Agar,

d. modifizierte tryptische Sojabrühe bzw. -lösung, modifiziertes Schokoladen-Agar,

verwendet werden kann. Diese werden für aerobe Kulturen verwendet, und in diesem Fall wird der Kulturbehälter vorteilhafterweise (vor der Sterilisation) mit einer geeigneten Gasatmosphäre, welche eine geeignete Menge an Kohlendioxid enthält, gefüllt.

Beispiele für Kulturmedien für die anaerobe Züchtung bzw. für anaerobe Identifikationen sind:

a. modifizierte ergänzte Gehirn-Herzinfusionsbrühe bzw. -lösung, modifizierter ergänzter Gehirn-Herzinfusions-Agar,

b. modifizierte ergänzte Gehirn-Herzinfusionsbrühe bzw. -lösung, modifizierter Schokoladen-Agar.

Man kann ebenfalls andere Nährmedien bzw. Nährböden verwenden, und es wird beispielsweise auf die genannte britische Patentschrift Bezug genommen, welche die Herstellung gammasterilisierter Medien betrifft.

All diese Medien halten die zerstörenden Wirkungen der Gammabestrahlung bis mindestens 3,5 Mrad aus, und dies stellt eine vollständige Sterilisierung des Inneren des Kultursystems sicher. Man hat verschiedene Tests durchgeführt, und es gab keine falschen Positive. Das integrierte System mit einem Zweiphasenmedium in einem Behälter verhindert die Kontaminierungsgefahr, welche bei Systemen mit zwei Behältern auftritt.

Die oben angegebenen modifizierten Medien erlauben das Wachstum von selbst 0,1 koloniebildenden Einheiten (C.F.U) pro ml, und es ist möglich, ein Wachstum von anaeroben Bakterien auf der Oberfläche von einem Nährmedium mit fester Phase zu erhalten, welches so gut ist, wie man es unter strikten anaeroben Bedingungen auf Petrischalen erhält.

Sowohl im Falle der aeroben als auch der anaeroben Medien wird ein geeignetes Gasmedium, welches im allgemeinen aus Luft, die mit etwa 10% Kohlendioxid angereichert ist, für aerobe Medien und Sticksotff mit etwa 10% Kohlendioxid für anaerobe Medien besteht, in den Kolben bzw. Behälter vor der Sterilisation eingeführt.

Die Ergebnisse sind wesentlich besser als solche, die man mit den bis heute verwendeten Kultursystemen erhalten hat.

Man hat Versuche mit einem grossen Bereich von Mikroorganismen durchgeführt, und es wurden zufriedenstellende Ergebnisse mit praktisch keinen falschen Positiven erhalten. Dies gilt für die Züchtung von anaeroben Mikroorganismen, welche zu sichtbaren Kolonien auf der festen Phase wachsen können. Es ist möglich, zwei unterschiedliche feste Kulturmedien auf den entgegengesetzten Seiten des Trägerelements vorzusehen. Wenn dieses eine dreieckige oder quadratische Form aufweist, können gleichzeitig drei oder vier Medien verwendet werden. In den meisten Fällen sind die verwendeten Kulturmedien (flüssig und fest) gleich oder ähnlich.

Die Erfindung wird durch die beigefügten schematischen Zeichnungen erläutert, welche nicht massstabsgetreu sind, und worin

Fig. 1 einen teilweise longitudinalen Querschnitt eines erfindungsgemässen Kulturbehälters zeigt,

Fig. 2 einen Querschnitt der Vorrichtung der Fig. 1 zeigt,

Fig. 3 einen teilweise longitudinalen Querschnitt eines anderen erfindungsgemässen Behälters zeigt,

Fig. 4 eine perspektivische Ansicht eines Trägerelements für zwei identische oder unterschiedliche Kulturmedien zeigt, und

Fig. 5 eine Ansicht eines anderen erfindungsgemässen Behälters zeigt.

Wie aus den Fig. 1 und 2 hervorgeht, umfasst das Kultursystem einen transparenten Behälter 11, der mit einem breiten Halsteil 12, an dem ein Aussengewinde 13 vorgesehen ist, und mit einem Verschlusselement 14 ausgerüstet ist.

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Das Verschlusselement 14 besteht aus einer Kappe 15 mit einem Innenschraubengewinde 16. In dieses ist fest eine Dichtung 17 eingepasst, die aus einem elastischen Material besteht, wie aus Kautschuk oder einem geeigneten Kunststoff, eingepasst, wodurch das obere Ende des Halses des Kolbens verschlossen ist, wodurch ein hermetischer Verschluss erreicht wird. Es besitzt einen sich nach unten erstreckenden Zentral teil 18, welcher einen Stab 19 trägt, an den ein verlängerter Träger 20 aus dem festen Kulturmedium angebracht ist. Dieser besitzt einen kreisförmigen Rand, und man erhält so eine scheibenförmige Bauart, in die man das Nährmedium giessen kann, welches sich auf dem Trägerelement verfestigt. Dieser Träger kann an seiner hinteren Oberfläche eine ähnliche Form aufweisen, und er kann für das gleiche Nährmedium oder für ein anderes verwendet werden.

Wie gezeigt, wird der Behälter bis zum Niveau 21 mit dem flüssigen Nährmedium 22 aufgefüllt, so dass ein ausreichender Abstand zwischen der oberen Oberfläche der Flüssigkeit und dem unteren Ende des Trägers aus festem Kulturmedium vorhanden ist. In einem Behälter mit einem Durchmesser von etwa 55 mm und einer Höhe von etwa 120 mm reicht eine Menge von etwa 50 ml flüssigem Kulturmedium aus. In diesem Fall wird eine Kappe mit einem Durchmesser von etwa 30 mm verwendet. Es ist offensichtlich, dass diese Dimensionen nur zur Erläuterung dienen.

Ein ähnliches Kultursystem ist in Fig. 3 dargestellt, welches einen konischen transparenten Behälter 31 (aus Glas oder Kunststoff) mit einem breiten Halsteil 32, wo ein Verschlusselement 33 mit einer Innendichtung 34 mit einem sich nach unten erstreckenden Teil 35, der über den Stab 36 das paddelartige Trägerelement 37 des Kulturmediums trägt, umfasst. Der Träger besteht bevorzugt aus einem eingesetzten Kunststoffmaterial. Dieses kann eine Oberfläche aufweisen, die auf solche Weise behandelt wurde, dass sie eine bessere Haftung des Kulturmediums ermöglicht. Bei dieser Ausführungsform wird ein flüssiges Nährmedium 38 bis zu einem Niveau gut unterhalb des unteren Endes des Trägerelements 37 eingefüllt. Dieses System wird auf gleiche Weise wie das verwendet, wie es in den Fig. 1 und 2 dargestellt wird.

Die Kulturmedien werden in den Behälter und in den Träger eingefüllt, wo das feste Medium sich verfestigen kann, während sich der Träger in horizontaler Stellung befindet. Vor dem Zusammenbau und dem dichten Verschluss wird die Gasatmosphäre im Behälter auf die beabsichtigte Verwendung eingestellt, und das System wird in senkrechter Stellung einer ionisierenden Bestrahlung, bevorzugt mit Gammabestrahlung, sterilisiert.

Nach dem Einfüllen der Probe mittels einer Spritzenbzw. Injektionsnadel über die Dichtung 34 wird das flüssige Medium mit der Probe vermischt. Dies kann eine Menge von einigen Millimetern Blut oder einer anderen Flüssigkeit sein. Nach der Inkubation während etwa 4 bis 8 Stunden wird das flüssige Medium auf irgendwelche Änderungen

(Farbe, Konsistenz, Gasbildung) untersucht, und das feste Nährmedium wird mit der Flüssigkeit gespült, und die Inkubation' wird weiter fortgeführt. Das feste Medium kann in vorbestimmten Intervallen mit dem flüssigen Medium kontaktiert bzw. behandelt werden. Nach einer vorbestimmten Zeitdauer wird das feste Kulturmedium visuell geprüft, und die Kolonien können für die weiteren an sich bekannten Testverfahren entfernt werden. Das neue System kann für eine Vielzahl von Verwendungen verwendet werden. Es ist für Blutkulturen oder für Kulturen anderer physiologischer fluider Materialien bzw. Flüssigkeiten geeignet. Es kann verwendet werden, um die Sterilität von Lösungen, die für die Injektion bestimmt sind, wie für Infusionslösungen, Expanderlösungen, Beschickungslösungen, Dialyselösungen, Wasser und für andere ökologische Tests, bestimmt sind, und es kann verwendet werden, um die Sterilität von pharmazeutischen Produkten und Nahrungsmitteln usw. zu prüfen. Das sterilisierte System besitzt eine geeignete Haltbarkeit ohne offensichtliche Verschlechterung oder einen Verlust der Leistungsfähigkeit. Solche Systeme können in einer Vielzahl von Formen und Grössen, abhängig von der beabsichtigten Verwendung, hergestellt werden. Die obige Beschreibung dient nur zur Erläuterung, und selbstverständlich können Modifizierungen in der Form und Grösse und Anordnung der Teile durchgeführt werden.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemässen Kultursystems ist in Fig. 5 und Fig. 5a, welche ein Querschnitt durch die Vorrichtung der Fig. 5 ist, dargestellt.

Die in Fig. 5 dargestellte Vorrichtung umfasst eine Kunststoffflasche mit einem quadratischen Bodenteil 51, in der sich ein Kulturmedium 52 befindet, und einen konischen oberen Teil 53, welcher sich in den Halsteil 54 erstreckt, der mit einem Aussenschraubengewinde 55, auf dem eine Kappe 56 befestigt ist, ausgerüstet ist. Die Kappe 56 umfasst eine Innendichtung, welche nicht gezeigt wird, die eine hermetische Abdichtung zwischen der Kappe 56 und dem Halsteil 54 ergibt. Von der Dichtung erstreckt sich abwärts ein Trägerelement 57, an dem ein rechteckiges Element 58 der in Fig. 4 dargestellten Art befestigt ist, und welches bevorzugt auf seinen beiden Flächen unterschiedlich feste Kulturmedien trägt. Wie aus der Figur ersichtlich ist, erstreckt sich das Element 58 tief in den konischen Teil 53 und hört über dem Niveau des flüssigen Kulturmediums 52 auf. Das Kultursystem wird, wie anhand der vorherigen Figuren erläutert, hergestellt, und es wird die gleiche gewünschte Gasatmosphäre erzeugt. Nach der Sterilisation, bevorzugt mit Gammabestrahlung, ist das Kultursystem für die Verwendung fertig.

Nach der Inkubation bilden sich im allgemeinen Tröpfchen an den Seitenwänden, welche die visuelle Prüfung des Wachstums des festen Kulturmediums stören können. Bedingt durch die abgeschrägte bzw. abfallende Seitenwand des konischen Teils ist es möglich, den Behälter zu neigen und die Seitenwände mit dem flüssigen Kulturmedium zu spülen, ohne dass das feste Kulturmedium berührt wird.

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1 Blatt Zeichnungen

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PATENTANSPRÜCHE

1. Ein Kulturbehälter für die gleichzeitige Züchtung von Mikroorganismen auf einem festen und einem flüssigen Nährmedium, gekennzeichnet durch einen einzigen transparenten Behälter (11, 31, 53) mit einem breiten oberen Teil (12, 32, 54) und mit einem breiteren unteren Teil, der so ausgestaltet ist, dass er das flüssige Nährmedium (22, 38, 52) aufnehmen kann, wobei der obere Teil an seinem obersten Teil eine Verschlusskappe (15, 33, 56) und eine hermetisch abdichtende Dichtung (17, 34) umfasst, wobei die Kappe und die Dichtungsstruktur ein verlängertes, sich nach unten erstreckendes Trägerelement (20, 37, 58) für das feste Nährmedium tragen, das Trägerelement im wesentlichen parallel zu der Zentralachse des Behälters verläuft, sich das Trägerelement in einen wesentlichen Teil des oberen Teils des Behälters erstreckt und über dem Niveau des flüssigen Mediums aufhört, und eine Einrichtung für die Einführung der biologischen Probe in den Kulturbehälter.
2. Kulturbehälter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter einen breiten unteren Teil und einen engeren Halsteil umfasst.
3. Kulturbehälter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der obere Teil des Behälters eine konische Form aufweist, welche ein Neigen des Behälters zur Entfernung von Tröpfchen, welche an dem oberen Teil nach der Züchtung haften, erlaubt, ohne dass das feste Medium von dem flüssigen Medium berührt wird.
4. Kulturbehälter nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger des festen Mediums sich unterscheidende feste Nährstoffe auf jeder seiner gegenüberliegenden Oberflächen enthält.
5. Kulturbehälter nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet. dass er durch ionisierende Bestrahlung, bevorzugt Gammabestrahlung, sterilisierbar ist.
6. Kulturbehälter nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass er entsprechend den zu bestimmenden Mikroorganismen ein gasförmiges Medium, wie Luft und Kohlendioxid für aerobe, und Stickstoff und ein anderes Inertgas und Kohlendioxid für anaerobe Mikroorganismen, umfasst.
7. Kulturbehälter nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium, welches vor der Sterilisation eingeführt ist, ein Medium ist, welches modifiziert wurde, so dass es nach der Sterilisation durch ionisierende Strahlung ein geeignetes Medium ergibt.
8. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Mikroorganismen und für die Identifizierung von Mikroorganismen in physiologischen Fluiden oder in pharmazeutischen Produkten, Nahrungsmitteln, Industrieprodukten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine flüssige Probe über die Dichtung in den Behälter nach einem der Ansprüche 1 bis 7 einführt, die Probe mit dem flüssigen Kulturmedium behandelt und sie darin dispergiert, während einer vorbestimmten Zeit inkubiert, das feste Nährmedium mit dem flüssigen Medium, welches sich in dem gleichen Behälter befindet, behandelt, die Inkubation während einer vorbestimmten Zeit weiterführt und nach dieser Zeit bestimmt, ob Kolonien auf dem festen Medium vorhanden sind.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das feste Kulturmedium wiederholt mit dem flüssigen Medium während der Inkubationszeit des festen Mediums behandelt wird.