DE2359501A1 - Verfahren zur herstellung von mikroorganismen-lysaten - Google Patents

Description

SOCIETA¹ ITALIANA RESINE S.I,R. S.ρ.Α., Mailand, Italien

¹¹ Verfahren zur Herstellung' von Mikroorganismen-Lysaten " Priorität: 30. November 1972, Italien, Nr. 32 277 A/72

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen-Lysaten.

Lange Zeit waren Hefen die einzigen einzelligen Organismen, die als Nahrungsmittel verwendet wurden. Große Mengen Hefen wurden fast ausschließlich bei der Herstellung von Brot, Bier und Wein benötigt.

Erst in den letzten Jahren spielt die großtechnische Herstellung von Nahrungs- und Futtermitteln aus Mikroorganismen eine große Rolle. Das Zellprotoplasma von Hefen und Bakterien enthält große Mengen an Proteinen und geringere Mengen an Kohlenhydraten, Lipiden, Nucleinsäuren, Vitaminen und Zwischenprodukten des Stoffwechsels. Angesichts der sich anbahnenden weltweiten Verknappung an Nahrungs- und Futtermitteln, insbesondere an Proteinen, wurde daher in den letzten Jahren versucht, die

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in Hefen und Bakterien enthaltenen wertvollen Nährstoffe auszunutzen und großtechnische, billige Verfahren zur Herstellung von Nahrungs- und Futtermitteln unter Verwendung dieser Mikroorganismen zu schaffen. Die bisher entwickelten großtechnischen Verfahren werden entweder absatzweise oder kontinuierlich durchgeführt. Sie bestehen aus zwei Stufen.

Die erste Stufe besteht darin, ein flüssiges Nährmedium mit einem Mikroorganismus anzuimpfen, den Mikroorganismus bis zum Erreichen der stationären Phase zu züchten und schließlich die Mikroorganismenzellen aus der Gärmaische abzutrennen. Das flüs~ sige Nährmedium besteht dabei aus Wasser, assimilierbaren Kohlenstoffquellen, assimilierbaren Stickstoffquellen und anorganischen Salzen. Um die Wirtschaftlichkeit dieser Stufe zu verbessern, wurde versucht, möglichst billige Kohlenstoffquellen zu finden. Beispielsweise wurden Melassen, Sulfitablaugen,

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Holzhydrolysate und pflanzliche Abfallprodukte verwendet. Den größten Fortschritt auf diesem Gebiet brachte in den letzten Jahren die Entdeckung, daß Mikroorganismen in der Lage sind, Alkane, insbesondere solche mit 10 bis 30 Kohlenstoffatomen, zu verwerten.

Das Verfahren zur Abtrennung der Mikroorganismen aus der Gärmaische, was den letzten Arbeitsgang in dieser Stufe darstellt, hängt von der Zusammensetzung des Nährmediuras ab. Bei der Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoffquelle werden die Zellen aus der Gärmaische durch Ausflocken, Absetzen oder Zentrifugieren abgetrennt und anschließend in Wasser, das gegebenenfalls eine geringe Menge eines grenzflächenaktiven Mittels -

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enthält, resuspendiert. Nach heftigem Rühren werden die Zellen wieder von der flüssigen Phase abgetrennt. Dieser Vorgang wird einige Male wiederholt, bis die Zellen praktisch frei von Kohlenwasserstoffen sind. ■

Die zweite Stufe bei den Verfahren zur Herstellung von Nahrungsmitteln aus Mikroorganismen besteht im wesentlichen aus einer Behandlung, die- es erlaubt, das Protoplasma von den Zellwänden abzutrennen. Diese Stufe ist deswegen nötig, weil die unveränderten Mikroorganismenzellen trotz ihres hohen Proteingehalts keine zufriedenstellenden Nahrungs- oder Futtermittel darstellen. Dies ist teilweise auf die schlechte Verdaubarkeit der Zellwände und teilweise auf die Undurchlässigkeit der das Protoplasma einschließenden Membranen zurückzuführen. Zellwände und Membranen verhindern also den Austritt des Protoplasmas. Dadurch können die in den Zellen enthaltenen wertvollen Nährstoffe vom menschlichen oder tierischen Organismus nur schwer bzw. nur teilweise verwertet werden.

Die Zell-Lysis hat den Vorteil, daß nach der erfolgten Extraktion des Protoplasmas aus dem inneren der Zelle die vorhandenen Lipide leicht von den anderen Bestandteilen getrennt werden können. Dies ist wichtig, da die Lipide weniger wertvolle Nährstoffe sind und den Mikroorganismen einen unangenehmen Geschmack und Geruch verleihen. Außerdem ist es möglich, aus den abgetrennten Lipideri große Mengen an Sterinen, insbesondere Ergosterin, das Ausgangsmaterial zur Herstellung von Vitamin D₂, zu gewinnen. Die Zellen enthalten auch andere unerwünschte Bestandteile,. z>B*; Nucleinsäuren, die in großen Konzentrationen _j

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gesundheitsschädlich sind, und Pigmente (z.B. Chlorophyll und Xanthophyll), die den Wert der Produkte durch ihre starke Färbung mindern. Diese vorgenannten Produkte lassen sich aus den Zellen leicht durch eine vorhergehende Iytisehe Behandlung abtrennen. Diese Produkte können dann nach Aufarbeitung und Reinigung als Zusatzstoffe in der Futtermittelindustrie verwendet werden.

Zur Extraktion des Protoplasmas aus dem inneren der Mikroorganismenzellen kommen bei großtechnischen Verfahren die Hydrolyse, Plasmolyse und Autolyse in Frage. Zur Hydrolyse werden die Mikroorganismenzellen in einer sauren oder alkalischen wäßrigen Lösung suspendiert. Durch Angriff der Säure oder der Base wird die Zellmembran aufgebrochen, so daß das Protoplasma durch die Löcher in der Zellwand austreten kann. Dieses ,Verfahren läuft ziemlich rasch und vollständig ab, führt aber zu beträchtlichen Verlusten an wertvollen Bestandteilen, was auf sauren oder alkalischen Abbau des Protoplasmas zurückzuführen ist.

Bei der Plasmolyse werden die Mikroorganismenzellen in einer wäßrigen Lösung suspendiert, die hohe Konzentrationen an anorganischen Salzen oder organischen Verbindungen, wie. Zucker, enthält. Dies führt zu einer Veränderung der osmotisehen Eigenschaften der Zellmembran und folglich zum Austritt des Protoplasmas aus dem Inneren der Zelle. Bei plasmolytisehen Verfahren tritt kein Abbau der Protoplasmabestandteile ein, jedoch gehen wertvolle Bestandteile verloren, da der Austritt des Protoplasmas nicht vollständig ist. Außerdem ist die Abtrennung der wertvollen Verbindungen aus der wäßrigen Phase schwierig, da an- J

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organische Salze oder organische Verbindungen in hohen Konzentrationen vorhanden sind.

Bei der Autolyse, die im allgemeinen der Hydrolyse und der Plasmolyse vorgezogen wird, werden die Mikroorganismenzellen in Wasser suspendiert,und die Suspension wird auf einen bestimm ten pH-Wert eingestellt und erwärmt. Auf diese Weise wird durch die in der Zelle selbst enthaltenen Enzyme ein Bruch der Zellmembran und somit der Austritt des Protoplasmas verursacht. Die pH- und Temperaturbedingungen hängen von der Art der in der Zelle■_enthaltenen Enzyme ab. Die Autolyse wird im allgemeinen . bei Temperaturen im Bereich von 45 bis 55°C durchgeführt. Jedoch sind auch autolytisehe Verfahren unter diesen Bedingungen nicht genügend leistungsfähig, da der Bruch der Zellmembran nicht bei allen vorhandenen Zellen eintritt und die Lysis nicht so weitgehend .ist, daß ein vollständiger Austritt der intrazellulären Substanzen eintritt,

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches und leistungsfähiges Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen-Lysäten zu schaffen, bei dem unter milden Bedingungen eine vollständige Autolyse der Mikroorganismenzellen eintritt, ohne daß ein Abbau von wertvollen Zellbestandteilen eintritt.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß sich diese Aufgabe lösen läßt, wenn man die in Wasser suspendierten Mikroorganismenzellen vor der Autolyse einer durch Sprühtrocknung hervorgerufenen Thermo Schockbehandlung unterzieht. '--".'■

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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen-Lysaten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die in Wasser suspendierten Mikroorganismenzellen einer durch Sprühtrocknung hervorgerufenen ThermoSchockbehandlung unterzieht und das erhaltene Produkt der Autolyse unterwirft.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können beliebige Mikroorganismenzellen und insbesondere Hefen verwendet werden.

Während der Sprühtrocknungsbehandlung wird der Großteil des Wassers aus der Suspension entfernt. Es wird angenommen, daß gleichzeitig mit der Sprühtrocknung in den Zellen Veränderungen vor sich gehen, die sie gegenüber der Autolyse empfindlicher machen. Unabhängig von der theoretischen Erklärung steht jedoch fest, daß die Sprühtrocknung eine Steigerung der Autolyseausbeute bewirkt, auch wenn diese Autolyse unter äußerst milden Bedingungen durchgeführt wird.

Es wurde festgestellt, daß man die besten Ergebnisse erhält, wenn man Suspensionen mit einem Gehalt an Mikroorganismenzellen von 5 bis 15 Gewichtsprozent verwendet und diese Suspensionen in Sprüh- oder Zerstäubevorrichtungen oder in Prilltürme einspeist, in die Luft oder ein Inertgas, wie Stickstoff, als Verdampfungsmittel eingeleitet wird. Das getrocknete Produkt wird am Boden der Trocknungsvorrichtung als Granulat oder Pulver gesammelt.

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Beim erfihdungsgemäßen Verfahren ist es wesentlich, die Trocknungsbedingungen so zu regulieren, daß der Wassergehalt im getrockneten Produkt weniger als etwa 10 Gewichtsprozent beträgt. Zu diesem Zweck wird die als Verdampfungsmedium verwendete Luft oder das Inertgas vor der Einleitung in die Trocknungsvorrichtung auf Temperaturen von 150 bis 400⁰C vorerwärmt. Die besten Bedingungen werden erreicht, wenn,das eingeleitete Gas auf Temperaturen von 200 bis 250⁰C vorerwärmt wird und das Produkt 1 bis 40 Sekunden und vorzugsweise 5 bis 20 Sekunden der Trocknung unterzogen wird. Auf diese V/eise erhält man bei Temperaturen von 30 bis 90⁰C ein Produkt mit einem Wassergehalt von 5 bis 8 Gewichtsprozent. Dieses Produkt, das für das Aütolyseverfahren besonders geeignet ist, wird am Boden der Trocknurtgsvörrichtung gesammelt.

Die auf diese Weise behandelten Mikroorgariismerizellen werden an-

schließend in Wasser suspendiert. Dabei wird im allgemeinen . 1 Gewichtsteil Zellen pro 2 Gewichtsteile Wasser verwendet. Die Suspension wird "gegebenenfalls unter Rühren 10 bis 48 Stunden auf Temperaturen von 30 bis 50⁰C erwärmt. Die besten Ergebnisse erhält man bei einer Temperatur von 45⁰C und einer Behandlungsdauer von 24 bis 40 Stunden. Während dieser Phase werden durch die Wirkung der autolytisehen Enzyme die Zellmembranen und wahrscheinlich auch die Zellwände der Mikroorganismen durch teilweise Auflösung (Lysis) stark verändert, worauf das Protoplasma austreten kann. Die autolytisehe Behandlung kann in Gegenwart von organischen oder anorganischen Verbindungen vorgenommen werden. Beispiele für solche Verbindungen, die in Mengen von 1 bis 100 rag/kg trockene Zellen züge- · _i

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setzt werden, sind Salze von Magnesium, Calcium und Zink, wie die Sulfate oder Halogenide, insbesondere Chloride,und Äthylendiamihtetraessigsäure, insbesondere das Natriumsalz dieser Säure.

Nach Beendigung der Autolyse wird die wäßrige Suspension in geeigneter Weise verdünnt, und der Zellinhalt, insbesondere Proteine, wird von den unlöslichen Resten der Zellwände abzentrifugiert. Der feste Rückstand wird sodann mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung extrahiert, wodurch gegebenenfalls ausgefallene Proteinfraktionen löslich gemacht werden.

Die vereinigten Proteinextrakte können direkt oder nach weiterer Reinigung als Nahrungs- oder Futtermittel verwendet werden. Beispielsweise können die auf die vorstehende Weise von den Zellwänden abgetrennten Proteine durch Fällung mit Salzen oder Säuren, Elektrophorese oder Chromatographie weiter gereinigt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf Hefen oder andere Mikroorganismen anwenden, die auf verschiedene Weise erhalten worden sind, beispielsweise durch Züchtung in Sulfitablaugen, Melassen oder Kohlenwasserstoffen.

In den nachstehenden Beispielen wird die Autolyse an Hefen durchgeführt, die durch Züchtung unter Verwendung von linearen Alkanen als Kohlenstoffquellen unter nachfolgendem Abtrennen und Waschen erhalten worden sind. In der ersten Stufe werden Hefen in einem stark belüfteten flüssigen Medium mit J

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linearen Alkalien in Berührung gebracht. Während des Zellwachstums werden die Kohlenwasserstoffe verwertet. Nach Beendigung des Wachstums werden die Zellen aus der Gärmaische durch Ausflocken, Sedimentieren oder Zentrifugieren abgetrennt und anschließend wieder in Wasser suspendiert, wobei eine geringe Menge eines grenzflächenaktiven Mittels zugesetzt wird. Nach heftigem Rühren werden die Zellen wiederum aus der flüssigen Phase abgetrennt. Sodann wird wiederum Wasser zugesetzt, worauf eine nochmalige Abtrennung der Zellen erfolgt. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt, bis praktisch kohlenwasserstoffreie Zellen erhalten werden. Nach dem letzten Waschgang wird der Zellengehalt in der wäßrigen Suspension auf 5 bis 15 Gewichtsprozent eingestellt_} und die wäßrige Suspension wird der Sprühtrocknung unterzogen. ' ·

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Ein Nährmedium, das Wasser, Stickstoffquellen, anorganische Salze und ein Gemisch aus linearen Alkanen mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 200 enthält, wird mit einem Stamm von Candida lipolytica angeimpft und anschließend 64 Stunden bei 30⁰C unter Rühren und Durchleiten von Luft gezüchtet. Anschließend werden die gebildeten Zellen aus der verbrauchten

. Gärmaische durch Abzentrifugieren abgetrennt und mehrmals mit Wasser gewaschen. Sodann wird durch Zusatz von Wasser eine 1Ogewichtsprozentige Hefesuspension hergestellt, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren der ThermoSchockbehandlung durch ^Sprühtrocknung unterzogen wird. Dabei wird die Hefesuspension

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unter Druck in den Kopf einer Sprühtrocknungsvorrichtung mit

Form
der/eines senkrecht stehenden Zylinders eingespeist. Am Fuß der Trocknungsvorrichtung wird auf 240°C vorerwärmte Luft eingeblasen. Die Trocknungsvorrichtung ist außerdem am oberen Ende mit seitlichen Auslaßöffnungen für die Luft versehen. Die Temperatur der austretenden Luft beträgt 70°C. Bei einer Kontaktzeit von etwa 15 Sekunden wird im Becken am Fuß der Trocknungsvorrichtung ein Produkt der folgenden Zusammensetzung erhalten:

Gewichtsprozent

Wasser 6

Lipide 4

Asche 7

Fasern 1

Protein 50

stickstoffreie Produkte 32

100 g sprühgetrocknete Hefe werden in 200 ml vollentsalztem Wasser suspendiert und homogenisiert. Diese Suspension wird 40 Stunden bei 40°C inkubiert. Nach der Inkubation wird das Produkt bei etwa 200Ox g zentrifugiert. Im erhaltenen Überstand wird der Gehalt an Stickstoff und Feststoffen bestimmt. Es werden 75 Prozent des Stickstoffs und 60 Prozent der ursprünglichen Hefe in löslicher Form gewonnen.

Beispiel2

100 g der gemäß Beispiel 1 gezüchteten Hefe werden gemäß Beispiel 1 der Autolyse unterzogen, wobei aber keine vorherige Sprühtrocknung vorgenommen wird. Nach der Inkubation gemäß Beispiel 1 wird das Produkt bei etwa 200Ox g zentrifugiert. Im erhaltenen Überstand wird der Gehalt an Stickstoff und Fest- _j

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stoffen bestimmt. Es werden 50 Prozent des Stickstoffs und 45 Prozent der ursprünglichen Hefe in löslicher Form gewonnen«

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen-Lysäten, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Wasser suspendierten Mikroorganismenzellen einer durch Sprühtrocknung hervorgerufenen Thermoschockbehandlung unterzieht und das erhaltene Produkt der Autolyse unterwirft.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Suspension mit einem Gehalt an Mikroorganismenzellen von 5 bis 15 Gewichtsprozent der Sprühtrocknung unterwirft. . .

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Mikroorganismensuspension in eine Sprüh- oder Zerstäubevorrichtung oder in Prilltürme einspeist, in die Luft oder* ein Inertgas, wie Stickstoff, mit Temperaturen von 150 bis 400°C, vorzugsweise 200 bis 250⁰C, unter Einhaltung von Kontaktzeiten von 1 bis 40 Sekunden, vorzugsweise 5 bis 20 Sekunden, eingeleitet wird. .

   4. , Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Sprühtrocknung den Wassergehalt des Produktes auf höchstens 10 Gewichtsprozent und vorzugsweise 5 bis 8 Gewichtsprozent vermindert.

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   5ο Verfahren nach Ansprucht_s dadurch gekennzeichnet, daß man das nach der Sprühtrocknung erhaltene Produkt in Wasser suspendiert und unter Erwärmen auf Temperaturen■von 30 bis
   50⁰C tObis 48 Stunden der Autolyse unterwirft.

   6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Autolyse 24 bis 40 Stunden bei Temperaturen von 45°C durchgeführt.

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