DE2358434A1 - Verfahren zur reinigung von pflanzlichen flavonextrakten - Google Patents

Description

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Frankreich

¥erfähreii zur Reinigung Ir&ri

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ist "bekajini;, bestimmte Fflanzerti z* B. die Friichthülleii Öitrüsffaölilieiij die Blätter von Hamamelis Virginiana und die 4S -unreifen Beeren versehiedener ßhamnusarten (z, B. Amygdalinus_t Φ öieoides, saxatilis und infectöria), bestimmten Benandlungen ® zu. unterwerfen, um daraus die Flavonpigmente zu extrahieren, W die im Überfluß darin vorliegen*

^. Zur Durclifülirung dieser Extraktiaii werden nach, den versöhie- * d'ensten literaturbekannten Methoden die "pflanzlichen Ausgangs-

Df. Müller-Borfr Dr. Manilz · Dr. Deufel · Dipl.-Ing. Finslerwald Dipl.-Ing. Grärnkow

33 Bfäqnsäiweig, Am BOrgeipärk ä 8 München 22, Robert-Koch-Straße 1 7 Stuttgart-Bad Cannstatt, MarktstraBe 3

telöforr (0531)7388? Tölefon (0811) 293645, TelexS-220S0 mbpat Telefon (0711) 567261

"Bähk: Zentralkasse Bayer, Völfebanken, München, Kto.-Nr. 9822 Posfettei*: Müft»enK4S5 -

materialien zerkleinert und anschließend mit Wasser extra— liiert j dem gegebenenfalls Alkohole oder Ketone zugesetzt sind, wobei "bei einer geeigneten temperatur gearbeitet wird.

Die auf diese Weise erhaltenen Extrakte sind sehr unrein und enthalten neben den Flavonpigmenten eine bestimmte Zahl von aus dem Pflanzengewebe stammenden Substanzen sowie Abbauprodukte derartiger Substanzen, die im Laufe der Extraktionsoperation gebildet werden.

Die Flavonpigmente können aus diesen komplexen Extrakten nach üblichen bekannten Verfahren der Naturstoffchemie abgetrennt werden, z. B. durch Verteilung zwischen Lösungsmitteln, d. h. also Verteilungschromätographie, durch Chromatographie auf verschiedenen Trägerstoffen oder durch Ausfällung mit selektiven Reagenzien.

Es zeigte sich jedoch, daß bestimmte Verunreinigungen die Piavonpigmente im Verlaufe dieser' bekannten Reinigungsoperationen begleiten und nur schwierig von diesen abzutrennen sind, so daß die erhaltenen Flavonoide, obwohl sie gereinigt sind, für bestimmte Verwendungszwecke der Humanmedizin ungeeignet sind. Die gereinigten Produkte zeigen in der Regel eine pyrogene und allergieerzeugende Wirkung, was sie vom Gebrauch als injizierbare Präparate und von transcutanen Applikationen ausschließt.

Bei den für diese unerwünschten Effekte verantwortlichen Verunreinigungen handelt es sich einesteils um Pflanzenproteine und insbesondere um die Nucleinbasen-Proteiiie oder Histone, die an die Flavonoide entweder direkt gebunden sind oder über bestimmte zweiwertige Kationen, z. B. Ga⁺*, Ou⁺* oder Oligoelemente, die mit den Proteinen und den Flavonoiden gemischte Chelate bilden, und andererseits um Produkte mit vergleichs-

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weise hohem Molekulargewi ent:, die verwandt sind mit Leucocyantanninen, die bei der oxydativen Kondensation der Flavonoide seitist gebildet werden, die sowohl von den Flavonoiden als auch den Proteinen leicht adsorbiert werden, und deren Bildung während.der ersten Stadien der Behandlung des Pflanzenmaterials praktisch nicht zu vermeiden ist.

Diese Verunreinigungen, die .selbst dann, wenn sie nur in Spuren vorliegen, ihre nachteilige, biologische Wirkung entfalten, müssen daher vollständig entfernt werden. Eine Behandlung der Rohextrakte vor jeder Fraktionieroperation erweist sich daher als unvermeidlich.

.Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung von pflanzlichen Rohextrakten geschaffen, das sich durch einfache Durchführbarkeit auszeichnet und apyrogene Flavonextrakte ergibt, die so, wie sie anfallen, verwendbar sind oder als Ausgangsmaterial zur Abtrennung der Flavonpigmente dienen können. Die erhaltenen Extrakte sind direkt in der Humanmedizin verwendbar und auch für Verabreichungsformen geeignet, bei denen parenteral oder transcutan appliziert wird-, · ·

Das Verfahren der Erfindung zur Reinigung von rohen wäßrigen oder wäßrig-alkoholischen Flavonextrakten ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktlösung nacheinander selektiv adsorbiert an einem komplexbildenden Ionenaustauscherharz, einem sauren Ton und an-aktiviertem Aluminiumoxid, und nach der Adsorption die gereinigte Lösung entweder chemisch behandelt zur Abtrennung der darin befindlichen Flavonoide .oder trocknet zur Gewinnung von in pharmazeutische Präparate überführ.baren Pulvern.

Die drei Etappen der Adsorption ermöglichen und haben zum Ziele, nacheinander die Metalle plus chelatbildenden Mittel,

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die löslichen Proteine und schließlich die kondensierten Tannoide, also gerbstoffartigen Verbindungen, zu entfernen. Die reinen Flavonoide können aus der gereinigten Lösung auf chemischem Wege nach an sich bekannten chemischen Verfahren abgetrennt werden. Die durch Trocknen erhaltenen Pulver finden Anwendung in der Humantherapie. .

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform.handelt es sich bei dem Ionenaustauscherharz um ein Harz mit aktiven Phosphonsäuregruppen, und beim sauren Ton um Montmorillonit.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird nach der Adsorption an Harz und Aluminiumoxid die Lösung auf 0 bis 2 ⁰G gekühlt und in ein isothermes Kühlgefäß dekantiert.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die Adsorption an Ton und Aluminiumoxid unter einem Stickstoffstrom in einem geschlossenen isothermen Kühlgefäß durchgeführt.

Gemäß einer, weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die abschließende Behandlung der gereinigten Lösung innerhalb von 2 Stunden nach erfolgter Reinigung durchgeführt.

Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren umfaßt drei aufeinanderfolgende Adsorptionsstufen, um die chelatbildenden Metalle, die löslichen Proteine und die kondensierten gerbstoff artigen Tannoide aus den rohen wäßrigen oder wäßrig-alkoholischen Flavonextrakten zu entfernen,die durch klassische Extraktionsverfahren erhalten wurden.

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Die erste: Reinigungsstufe bestellt darin, die Oligqelemente auf einem geeigneten lonenaustauscherharz zu fixieren, ζ» B. auf einem unter der Handelsbezeichnung ^Buolite ES 63^f bekann- · ten Harz j, bei dem es sich um ein spezielles phösphongruppen— haltiges Nickel-, Cobalt—, Kupfer- und Sinkharz handelt, wobei von einer 10 bis 15 T&Lgen wäßrigen Extrakt!ösung, die praktisch neutral ist, ausgegangen wird, worauf die erhaltene Lösung mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und die saure Iiösung auf OG gekühlt und bei dieser Temperatur etwa 48 Stunden lang gehalten · wirdv Während der Aufbewahrung bildet sich ein komplexer Niederschlag, der vor al—-lern gemischte Sulfate von basischen-Proteinen undCalcium sowie mäaig kondensierte Poflyuronide enthält* Die erhaltene Lösung wird zweckmäßigerweise z-ent-rifugiert oder filtriert» worauf ihr pH-Wert mit Hilfej von Natron- oder Kalilauge auf 7 eingestellt wird· '

Die zweite Reinigungsstufe besteht darin j die basischen P ro-r teine an einem Ädsoa^ptiionston zu fixiereii,^ bei dem es sich z», B-* um Montmorillonit handeln kann* Eis werden 2 ?S Mont— morillonit zugefügt _f der zuvor ia ,fasser dispergiert und. gequollen worden wary und das (iemiseh wird mindestens 2 Sfemden lang gerührt:. Danach wird der ΐοη durdi Zentrifugieren entfernt und die Behandlung ein zweites Mal mit t f^a 3^a= wiederholt. Diese Operationen werden vorzugsweise in einem mit einem Deckel verschlossenen Gefäß durchgeführt unter Einleiten eines inerten Gasest z. B, von Stickstoff... .'-:.-

Die dritte Reinigungsstufe besteht darin, die Tannoide an · neutralem aktiviertem Aluminiumoxid solcheii: ÜlypSj wie er für^; chromatographische Trennverfahren verwendet wird, zu fixieren,; wobei 5 0/00 Aiuminiumoxid ein^r Teilchengröße von 2%. ' bis 50 Mikron in dem praktisch durchv/eg neutralen Extrakt verwendet werden. Das Gemisch aus wäßriger Extraktlösung und Aluminiumoxid wird 1 Stunde lang gerührt in eiiiem geschiosse-

nen Gefäß unter Einleiten von Stickstoff wie bei der zweiten Reinigungsstufe. Das Aluminiumoxid wird sodann durch Filtration entfernt und die Behandlung wird mit 2,5 o/oo Aluminiumoxid wiederholt.

Der erhaltene Extrakt wird mit Hilfe von Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und auf 0 G gekühlt und bei dieser Temperatur 48 Stunden lang belassen. Es bildet sich ein Niederschlag, der durch Filtration abgetrennt wird. Der pH—Wert wird sodann mit Kalilauge auf 4,00 eingestellt.

Die erhaltene gereinigte Lösung kann sowohl sofort dazu verwendet werden, um die Flavonoide durch irgendein bekanntes chemisches Verfahren daraus abzutrennen, als auch direkt für therapeutische Ehdanwendungszwecke verwendet werden. Im letzteren Falle ist es unerläßlich, die Lösung ohne Wartezeit zu trocknen, z. B. durch Zerstäubung, d. h. Sprühtrocknung, oder vorzugsweise durch Lyophilisation. In jedem Falle ist zu beachten, daß die gereinigte Lösung nicht langer als einige Stunden aufbewahrt werden darf, da sie rasch Änderungen unterliegt, die die Vorteile der Reügungsbehandlungen zunichte machen können.

Das erhaltene getrocknete Produkt eignet sich für alle gewünschten pharmazeutischen Formen, z. B. für Tabletten, GeI-kapseln und Granalien, einschließlich für injizierbare Formulierungen, falls das physiologische Lösungsmittel und das lyophilisierte Pulver kurz vor der Injektion miteinander vermischt werden. Bas getrocknete Produkt kann auch in Öremes und Salben überführt werden für medizinischen und kosmetischen Gebrauch, sofern der Wassergehalt derartiger Formulierungen auf ein strikt einzuhaltendes Minimum vermindert wird. Das durch direkte Trocknung der Lösung erhaltene Pulver wirkt . nicht allergisch und ist nicht oder nur wenig pyrogen. Die aus der gereinigten lösung abgetrennten Flavonoide sind an—

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allergisch und apyrogen. .

Die folgenden Beispiele sailen die Erfindung näher erläutern,

Beispiel 1

Es wurde von einer wäßrigen Lösung mit 12 $ Trockensubstanz ausgegangen, die durch erschöpfende Behandlung von Orangenfruchthüllen mit Wasser erhalten worden war.

'Derartige Lösungen werden z. B. gleichzeitig mit den ätherischen Ölen in zur oberflächlichen Abschabung und Entschalung von Früchten bestimmten Maschinen gewonnen und stellen somit normale Nebenprodukte der früchteverarbeitenden Industrien dar. "-"""'

1OOO 1 der Lösung mit 10 fo Trockenextrakt, die auf Kieselgur sorgfältig filtriert war und deren .pH-Wert zwischen 6,5 und 7».5 "liegen muß, wurde mit einer ,Geschwindigkeit von

200 Liter pro Stunde durch eine Säule von 100 1 gegeben,

dem ' - '

die mit/unter der Bezeichnung "Duolite ES 63" bekannte· Harz,

das zuvor.mit Na⁺-Ionen gesättigt worden war, gefüllt war* Die das Harz durchtränkende Lösung wurde durch ein entsprechendes Volumen Wasser ersetzt. Es wurden auf diese Weise ' 990 1 einer Lösung erhalten, die von Schwermetallen völlig frei war.

Die erhaltene Lösung wurde auf etwa 0 G mit Hilfe eines
Plattenwärmeaustauschers gekühlt und anschließend auf einen pH-Wert von 2, der genau gemessen wurde, angesäuert, was etwa 6 1 konzentrierte Schwefelsäure erforderte.

Die erhaltene Lösung wurde in eine Kühlkammer oder ein
isothermes Kühlgefäß eingebracht, worin sie 48 Stunden lang

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stehen gelassen wurde. Am Boden des Gefäßes setzte sich. ein. Niederschlag ab, der etwa 50 kg Feuchtgewicht entsprach. Der gebildete Niederschlag wurde durch Dekantieren abgetrennt und mit 100 1 Wasser gewaschen, worauf erneut durch Dekantieren abgetrennt wurde.

Die dekantierte Flüssigkeit wurde auf Kieselgur filtriert und in ein Gefäß mit abnehmbarem Deckel eingebracht, auf dessen Boden ein Rührer vorgesehen war."Bs wurde auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert, was etwa 7 kg Natriumhydroxidpastillen erforderte. . .

Es wurde sodann ein Stickstoffstrom mit Hilfe einer porösen Verteilervorrichtung eingeleitet und unter Rühren wurden 100 1 einer 20 kg Montmorillonit enthaltenden Dispersion zugesetzt. Es wurde 2 Stunden lang gerührt, worauf das Gemisch 2 Stunden lang ruhig stehen gelassen wurde. Ein erneutes Rühren ermöglichte eine weitere Suspendierung und die Abtrennung des Tons in einer Schleuderzentrifuge.

Die erhaltene klare Flüssigkeit wurde wieder in das angegebene Gefäß gegeben, in welches nach Sättigung mit Stickstoff 50 1 einer 10 kg Montmorillonit enthaltenden Dispersion eingebracht wurden.

Es wurde 2 Stunden lang gerührt, worauf 2 Stunden lang stehen gelassen wurde. Dann wurde erneut durch Rühren suspendiert, worauf der Ton in einer Schleuderzentrxfuge abgetrennt wurde.

Das durch Abschleudern gewonnene Tonmaterial wurde mit 100 1 Wasser gewaschen, worauf erneut mit einer Schleuderzentrifu— ge getrennt wurde. Das beim Waschen des Tons anfallende Waschwasser wurde mit der Hauptflüssigkeit vereinigt.

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Während des Rührens und. Dekantierens wurde die Stickstoffeinleitung unterbrochen und der "bewegliche. Deckel wurde mit Hilfe seiner pneumatischen Abdichtung gasdicht aufgesetzt.

Die Flüssigkeiten wurden in einem Gefäß des angegebenen Typs vereinigt und unter maximalem Rühren sowie unter Einleiten von Stickstoff wurden sodann 5 kg aktiviertes Aluminiumoxid für chrömatographische Zwecke zugefügt, das zermahlen und auf eine Teilchengröße von 20 Ms 5p Mikron gesiebt sowie vorher in 25 1 Wasser dispergiert worden war. _:

Das Rühren wurde 1 Stunde laiig iortgeset'zt und danach be endet , worauf filtriert und die llltratlösuaig in; einem Gefäß des angegebenen Typs gesammelt wurde. Es wurden sodann 2,5 kg Aluminiumoxid zugesetzt, und erneut 1 Stunde ^läö,g gerührt» Das Rühren wurd& sodann abgebrochen vmä das Gemisch wurde filtriert. Am Ausgang des filters wurde die erhaltene Lö~ sung in einem Plattehwär^aus tauscher mx£ 2 ^o gekühlt, worauf sie in einem Säüilgefaß gesammelt wurde» Die lösung wurde auf einen pH-Wert Von 2,00(+0,05) eingestellt, was etwa ;4"1 - ■ konzentrierte Schwefelsäure erfordert©» Die liösung wurde SQ-dänn 48 Stunden lang bei dieser Semperatüi· unter ieichtem Einleiten von Stickstoff gehalten* Ss bildete sich ein dichter Niederschlag von etwa 30 kg Naßgewicht^ der iöturch Filtration abgetrennt wurde, wobeivdie erhaltene Jliltratlösung in einem Gefäß gesammelt wurde, das mit' einer Permanent-Stickstoffeinleitungsvorrichtung ausgestattet war»

Die noch kalte Lösung wurde auf einen pH-Wert von 5,00 (■i OjO5J neutralisiert,· was etwa 5^ kg^ Natriumhydroxid in Pastillenform erforderte. Die noch Immer kalte und mit Stickstoff gesättigte Lösung wurde sofort konzentriert bei.einem Vakuum von ΙΟ bis 20 Torr bei einer 4Ö ⁰G nicht übersteigenden Temperatur, die genau gemessen wurde,'bis der Gehalt an Trockensubstanz 25 Ύ° betrug. Die erhaltene Lösung muß einen

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pH-Wert von 4,00 (+ 0,05) aufweisen, wobei der pH-Wert bei Bedarf mit Hilfe von Schwefelsäure oder Natronlauge eingestellt wurde.

Die Lösung wurde sofort eingefroren und lyophilisiert oder statt dessen sprühgetrocknet. Zum Versprühen wurde ein gleiches Volumen Methanol zugefügt, um die thermischen Einflüsse auf das Produkt zu vermindern. Ferner erwies es sich als zweckmäßig, einen Sprühtrockner zu verwenden, der mit einer Kühlvorrichtung für das Pulver und einer kontinuierlichen Verpackungsvorrichtung ausgestattet war.

Wurde lyophilisiert, so wurde das Vakuum der Lyophilisationskammer nach der Trocknung des Produktes durch Stickstoff aufgehoben, um das Produkt mit Stickstoff zu sättigen. Wurde versprüht, so wurde das erhaltene gekühlte Produkt unter eine Vakuumglocke gebracht und 1/2 Stunde lang bei 5 bis 10 Torr gehalten, wonach das Vakuum mit Stickstoff aufgehoben wurde, um jede Spur von eingeschlossenem Sauerstoff zu entfernen. In beiden Fällen wurden die erhaltenen Pulver unter Stickstoffatmosphäre konditioniert und durch Trockenmittel geschützt. . " ;

Das auf diese Weise erhaltene Pulver konnte direkt für therapeutische Zwecke verwendet werden und entsprach demjenigen Produkt, das in der Propharmacopöe als "Gitroflavonoid" bezeichnet wird. Es bewirkte keine allergischen Reaktionen und erwies sich als apyrogen, wenn der Rohextrakt noch keine Gärung erlitten hatte.

Die im Vakuum auf 25 % konzentrierte Lösung ließ sich ferner als Ausgangsmateriäl in einem Flavonoid-Extraktionskreislauf verwenden durch Flüssigkeit-Flüssigkeit-Austausch oder selektive Ausfällung unter solchen Bedingungen, daß das zwischenzeitliche Aufbewahren unter dauernder Stickstoffeinleitung

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erfolgte und nicht langer als 2 Stunden dauerte.

Beispiel 2

1000 kg unreife Beeren von Rhamnus amygdalinus wurden auf eine Teilchengröße von 1 "bis 2. mm zerkleinert in einer Mahlvorrichtung aus rostfreiem Stahl und am Ausgang der Mahlvorrichtung in 500 1 Wasser von 95 ⁰G aufgefangen. Das Gemisch aus Wasser und zerkleinerten Beeren wurde bei 95 °G gehalten durch direktes Einleiten von filtriertem und entöltem Wasserdampf. -

Die erhaltene Masse wurde sodann in einen Perkolator von 2000 1 Fassungsvermögen eingebracht und die Perkolation wurde unter Druck mit 2000 1 Wasser bei 110 ⁰G durchgeführt. Der den Perkolator verlassende Saft wurde gesammelt und sofort auf 20 C in einem Plattenwärmeaustauscher gekühlt, worauf er unter Vakuum bei 10 bis 20 Torr bei einer Temperatur von maximal 40 G in solcher Weise konzentriert wurde, daß das erhaltene Volumen 1000 1 betrug. Das erhaltene Konzentrat, das etwa 10 fo gelöste Stoffe enthielt und, einen pH-Wert von 5,5 bis 6,0 aufwies, wurde zentrifugiert und filtriert.

Die erhaltenen 1000 1 Rhamnus-Konzentrat wurden sodann genauso weiterbehandelt wie die 1000,1 Flavonextrakt aus Citrusfrächten gemäß Beispiel 1, wobei in sämtlichen Verfahrensstufen Punkt für Punkt genau beachtet wurde.

Das erhaltene Pulver, das reich an Oampherolderivaten war, ließ sich direkt für therapeutische 2wecke verwenden aufgrund seiner Eigenschaften, insbesondere diuretischen Eigenschaften, Ferner ließ es sich als Ausgangsmaterial verwenden zur Isolierung von Oampherol und seinen Derivaten nach üblichen bekannten Verfahren.

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Zur Isolierung der reinen Produkte konnte auch die Endlösung mit 25 i° Trockensubstanz herangezogen werden unter Beachtung der in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen.

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Claims (1)

1$ "■;■" ■■;.-

Patenten s ρ r ü c h e

Verfahren zur Reinigung von pflanzliehen Flavonextrakten, dadurch gekennzeichnet, daß"man die Extraktlösung nacheinander selektiv adsorbiert an einem komplexbildenden Ionenaustauscherharze einem sauren Ton und an aktiviertem Aluminiumoxid, und nach der Adsorption die gereinigte Lösung entweder chemisch behandelt zur Abtrennung der darin befindlichen Plavonoide oder trocknet zur Gewinnung von in pharmazeutische Präparate überführbaren Pulvern,

2t Verfahren .nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Austauscherharz ein Harz mit aktiven Phosphönsäuregruppen verwendet,

3, Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ton Montmorillonit verwenäet> .

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3₁ dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Adsorption an Harz und Aluminiumoxid die erhaltene Lösung auf 0bis 2

thermen Kühlgefäß dekantiert,

erhaltene Lösung auf 0 bis 2 ^QG kühlt und in einem

5, Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Adsorption an Ton Und aktiviertem Aluminium·^ oxid unter einem Strom von inertem G-as in einem geschlos-

. senen Kühlgefäß durchführt. :■_"·..

6. Verfahren nach Ansprüchen 4 und 5, dadufch gekennzeichnet, daß man nach der Adsorption an aktiviertem Aluminiumoxid die Lösung unter Einleiten von Inertgas in dem Kühl gefäß für die Dekantierung hält.

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7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als inertes Gas Stickstoff verwendet.

8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß man die abschließende Behandlung der gereinigten Lösung innerhalb von zwei Stunden nach Beendigung der Reinigung durchführt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die gereinigte Lösung konzentriert und das Konzentrat zu · einem Pulver trocknet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man. die Trocknung durch Versprühen oder Lyophilisation bewirkt.

11. Verfahren nach Ansprüchen 9 oder 10, dadurch gekennzeichne τ daß man das erhaltene Pulver kühlt und kontinuierlich, entwässert.

12. Pharmazeutisches Mittel mit einem Gehalt an nach dem Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 11 gereinigtem Extrakt.

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