DE1810823A1

DE1810823A1 - Verfahren zur Reinigung von Labfermenten aus Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1810823A1
Application number: DE19681810823
Authority: DE
Inventors: Moelker Huibert Corn Mattijsen
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1967-11-25
Filing date: 1968-11-25
Publication date: 1970-10-22
Also published as: FR1592965A; GB1249636A; DK119872B; US3591388A; NL6716065A; DE1810823B2

Description

Verfahren zur Reinigung von Labfermenten aus Mikroorganismen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Labpräparaten aus Mikroorganismen durch Entfernung von verunreinigenden Begleitstoffen, insbesondere unspezifischen Enzymen mittels eines Absorptionsmittels.

Das Lab natürlichen Ursprungs, (öhymosin) Rennin (IUB 3.4. 4.3), das auch als Milchgerinnungsenzym bezeichnet wird, wird aus dem vierten Magen von saugenden Kälbern gewonnen. Wegen des Mangels an Ausgangsmaterial zur Herstellung von Rennin wurden weitläufige Untersuchungen auf die Gewinnung eines Ersatzstoffs als Ausgangsmaterial gerichtet. Es ist seit langem bekannt, dass proteolytische Enzyme die Milch gerinnen lassen. Bekannte Beispiele derartiger Enzyme sind Pepsin, Chymotrypsin, Papain sowie proteolytische von Bakterien gebildete Enzyme, wie sie z,B. von Pseudomonas fluorescens und Bacillus subtilis hervorgebracht werden.

Bei der Käseherstellung wird jedoch nur in manchen Fällen Pepsin verwendet, weil die genannten proleolytischen Enzyme auch

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eine starke proteolytische Wirkung entfalten, was natürlich unerwünscht ist·

Die Entdeckung einer Anzahl von Mikroorganismen, die ein Milchgerinnungsenzym hervorbringen, das im folgenden als Lab aus Mikroorganismen bezeichnet werden soll, wobei das Enzym eine sehr geringe profceolytische Wirksamkeit besitzen soll, ist daher von sehr grosser Bedeutung. Es ist bekannt, dass Labfermente eine spezifische proteolytische Wirksamkeit hinsichtlich des Schutzkolloids X-Casein besitzen und nach der Verdauung des Schutzkolloids das Milchcasein gerinnen lassen. Die Herstellung von Labfermenten aus Mikroorganismen ist in der britischen Patentschrift 970 331 und der USA-Patentschrift 3 275 453 beschrieben» Solche Mikroorganismen finden sich unter den Gattungen Mucor, Rhizopus, Monascus, Colletrichum und Endothia<» Die praktische Anwendung dieser Enzyme bei der Käsebereitung anstelle von Labferment tierischen Ursprungs ist von grosser Bedeutung. E3 ergab sich, dass die Verwendung eines kristallinen Labs aus Mikroorganismen die Herstellung von Käse guter Qualität erlaubt«,

Obwohl die proteolytische Wirksamkeit von Lab aus Mikroorganismen fast zu vernachlässigen ist, zeigte sich in der Praxis, dass das Lab trotzdem etwas mit- unerwünschten proteolytischen. ". Enzymen verunreinigt sein kann, die auch die Caseine der geronnenen Milch zersetzen. Es gibt verschiedene Ursachen für diese

mit

Verunreinigungen. Z.B« kann ein Labferment/einem anderen Mikroorganismus infiziert sein, der unerwünschte und spezifische proteolytische Enzyme ausscheidet, wenn das Lab von einer Kultur des gewünschten Mikroorganismus isoliert wird«i Es ist ebenfalls möglich, dass während einer längeren Bebrütung des Organisnras beispielsweise zur Erzielting höherer Ausbeuten ein unspezifisches proteolytisches Enzym zusammen mit dem Lab vom Mikroorganismus ^: ausgeschieden wird, Es kann weiterhin sein^ dass ein für die Herstellung von Lab interessanter Mikroorganismus nicht verwendet werden kann, weil der Prozentsatz an unspezifischen proteolytischen Enzymon zu hoch ist. Es ist daher bekannt, dass bestimmte Bakterienarten viel Labferment hervorbringen^ jedoch ebenfalls

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grosse Mengen eines unspezifischen Enzyms (vgl, z.B. Appl. Microbiol. 12, Seite 475 (1964)).

Das Auftreten einer unspezifischen proteolytischen Aktivität in Labpräparaten aus Mikroorganismen hat verschiedene Nachteile bei der Käseherstellung. Es wurde bereits ausgeführt, dass die in der Milch vorliegenden Proteine weiter abgebaut werden, wodurch die Konsistenz des Käsesunbefriedigend wird· Darüber hinaus können unerwünschte Gewichtsverluste auftreten, weil die Abbauprodukte der Proteine zusammen mit der Molke aus dem Quark gezogen werden.

Ein weiterer Nachteil der Gegenwart unspezifischer proteo- | lytischer Enzyme in Labpräparaten aus Mikroorganismen besteht darin, dass während des Alterns des Käses dieser einen bitteren Geschmack entwickelt, der durch kleine Mengen sehr bitterer Peptide verursacht wird, die sich durch die Zersetzung des Caseins unter dem Einfluss sehr kleiner Mengen von unspezifischem Enzym bildet, das im Labferment vorhanden ist, vgl. Proc. 16th Int. Dairy Gongr. Kopenhagen 1961, Bd. B 353. Die Entwicklung dieses bitteren Geschmacks ist natürlich ein grosser Nachteil bei der Anwendung von Lab aus Mikroorganismen zur Käseherstellung.

Wegen d4r genannten Nachteile ist es wünschenswert, zur Koagulierung von Milch ein Labpräparat zu verwenden, dan einen fast zu vernachlässigenden Gehalt an unspezifischen proteolytischen % Enzymen besitzt, damit ein Käse mit gutem Geschmack hergestellt werden kann.

Die Erfindung betrifft daher die Schaffung eines gereinigten Labferments aus Mikroorganismen, mit dem Käse erster Qualität mit einem sehr guten Seschmack hergestellt werden kann. Um diese Aufgabe zu lösen, erwies sich als notwendig, das KlIchger innungs enzym von den unspezifischen proteolytischen Enzymen selektiv abzutrennen.

Es ist bekannt, dass Proteine an eine grosse Zahl vcn Absoi'ptionsmitteln gebunden werden können. Es ist insbesondere

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bekannt, dass Silikate eine unspezifische Proteinabsorption zeigen, vgl.z.B. Advances in Enzymology 14, Seite 400 (1953)· Beispiele dafür sind die nicht spezifische Absorption von Proteinen aus dem Urin auf Permutit (j.Biol.Chenu 148, Seite 501 (1943)) oder aus Cabunit (Acta Endocrinologica 20, 101 (1955)) und die Reinigung von Galactokinase mittels Bentonit (Arch.Bioch. 18, Seite 137 (1948)), wobei etwa 50 $ der Proteine unspezifisch ■ absorbiert werden«

Es wurde ein Verfahren zur Entfernung von unspezifischen geschmacksverschlechternden Enzymen aus Lab aus Mikroorganismen . gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine wässrige Lösung des verunreinigten Labferments mit einem absorbierend wirkenden Silikat bei einem pH-Wert zwischen 3 und 9 behandelt und anschliessend das Absorptionsmittel aus der Lösung abtrennt. Durch dieses Verfahren werden die unspezifischen Enzyme, insbesondere Proteasen u*a· unerwünschte Produkte aus dem Labpräparat durch Absorption entfernt und es verbleibt gereinigtes Labferment in Lösung.

Dass in einer Lösung von Labferment aus Mikroorganismen duroh Silikate eine selektive Abtrennung des Labs von den der Art nahe verwandten unspezifischen proteolytischen Enzymen erreicht werden kann, ist durchaus überraschend, Nach dem erfindungsgemässen Verfahren werden die unspezifischen Enzyme zum grössten Teil absorbiert und das Lab bleibt in Lösung zurück, ohne "dass es seine Aktivität verliert. Die Absorption der verunreinigenden Enzyme

des kann durch Zugabe eines Absorptions-mittels zur Lösung/Labferments und Rühren des Gemisches über eine Zeitspanne und anschliessender Entfernung des Absorptionsmittels, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren oder mittels Durchleiten der zu reinigenden Lösung durch eine Sä,ule des Absorptionsmittels durchgeführt werden.

Es wird schliesslich ein Enzymkonzentrat oder, falls dies gewünscht wird, ein trockenes Enzympräparat erhalten, wenn das Wasser der Lösung verdampft wird oder das Milchgerinnungsenzym durch übliche Verfahren, a„B« durch Aussalzen oder Fällen mit einem organischen Lösungsmittel ausgefällt wird» Anstelle eines

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einzigen ATdSorptionsmittels kann auch ein Gemisch von zwei oder mehr Absorptionsmitteln verwendet werden· Es ist ebenfalls möglich, die Behandlung mit dem gleichen oder einem anderen Absorptionsmittel zu wiederholen.

Aus Labpräparaten, in denen das Verhältnis zwischen der Gerinnungsaktivität und der proteolytischen Aktivität etwa 6000 bis 11 000 betrug, wurden gereinigte Labpräparate erhalten, bei denen dieses Verhältnis auf einen Wert von etwa 14 000 bis 20 verbessert wurde.

Die Wahl des pH-Wertes während der Absorption wird durch die Stabilität des Labs aus Mikroorganismen bei verschiedenen pH-Werten und durch die Absorptionseigenschaften des Absorptionsmittels bestimmt· Das Lab ist bei einem pH-Wert zwischen etwa 3 und 9, je nach der verwendeten Temperatur, stabil. Andererseits tritt die Absorption der proteolytischen Enzyme innerhalb dieses gesamten pH-Bereichs auf» Die Absorptionseigenschaften fallen dementsprechend, wenn der pH-Wert ansteigt. Unterhalb eines pH-Wertes 4 wird in der Regel auch etwas Lab aus Mikroorganismen absorbiert, während ausserhalb des pH-Bereichs 3 bis 9 das Lab vergällt wird_e Die Reinigung wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 5 durchgeführt, insbesondere zwischen 4,5 und 6, wobei die besten Ergebnisse erhalten werden.

Als Ausgangsmaterial zur Reinigung kann ein Labpräparat in ^ Pulverform verwendet werden, das in Wasser oder einer Pufferlösung bei einem pH-Wert zwischen 3 und 9, vorzugsweise etwa 5 gelöst wird. Es ist jedoch ebenfalls möglich, zu diesem Zweck eine Fermentationsflüssigkeit zu verwenden, die das Labferment enthält. Es ist sogar möglich, die Reinigung während der letzten Phase der Fermentation eines das Lab produzierenden Mikroorganismus durchzuführen. Vorzugsweise wird als Ausgangsmaterial eine Tauchkultur oder ein wässriger Extrakt einer Oberflächenkultur eines das Lab erzeugenden Mikroorganismus verwendet, weil in diesem Fall die Isolierung und Reinigung des Labs gleich-zeitig z.B. durch Filtrieren über einem Silikat vorgenommen werden kann.

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Beispiele sehr geeigneter Absorptionsmittel sind natürliche und synthetische Silikate, insbesondere Beritonit, wie die Typen BIV 350 bianco, BIV 220 alvorio und Micro BIV der Societa AZ. Mineraria Isole Pont ine, Rom, Permutit, wie Decalso Ϊ¹ der Permutit Company, London, Attapulgit und chemisch reines kolloidales Siliciumdioxyd, das unter der Bezeichnung Aerosil bekannt ist. Eine gute Reinigung kann auch mittels Cabunit und Frankonit

erzielt werden. Andere Silikate können ebenfalls verwendet werden, z.B. Asbest, Kaolin, Silicagel, Bimspulver, Tripoli und Celit. Die sechs erstgenannten Silikatgruppen sind besonders gut geeignet wegen ihrer hohen Selektivität.

Es wurde weiter gefunden, dass Labpräparate* die erfindungsgemäss hergestellt sind, hervorragend g-e zur Herstellung von Käse guter Qualität und ohne bitterem Geschmack geeignet sind· In diesen Labpräparaten wird durch die erfindungsgemässe Reinigung das Verhältnis zwischen der Gerinnungsaktivität und der proteolytischen Aktivität stark erhöht» Es ist offenbar, dass das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Labpräparaten verwendet werden kann_? deren Anwendung nicht auf bestimmte Käsearten begrenzt ist. Es ist nunmehr möglich geworden, verschiedene Käsearten in grosstechnischem Maßstab mit einem Geschmack herzustellen, der nicht von Käse unterschieden werden kann, der mit tierischem Labferment hergestellt worden ist«

Die Gerinnungsaktivität wird durch Messung der Zeit bestimmt, die zwischen der Zugabe einer Lablösung zu Milch (oder umgekehrt) und dem Gerinnen der Milch verstreicht, was als Maßstab für die Wirksamkeit des Enzympräparats betrachtet wird« Die Gerinnungskraft wird gemäss Soxhlet bestimmt.

Eine Gerinnungseinheit bezeichnet die Enzymmenge, die die Gerinnung von 1 ml Substrat in 40 Min» bei 35°C verursacht.

Die Gerinnungsaktivität wird wie folgt bestimmt; Ein graduierter Messzylinder von 50 ml wird mit 25 ml ürischmilch gefüllt und 15 Min. auf 35⁰O erwärmt. In einem zweiten graduierten Messzylinder von 50 ml wird ein ml einer Lablösung

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einige Minuten auf 35⁰C erwärmt» Wenn ein Labpulverpräparat verwendet wird, wird dieses in einer Pufferlösung nach Mulder gelöst, die 100 g Natriumchlorid und 10g Hatriumacetat je Liter enthält und einen pH-Wert 5,65 besitzt, der mit Essigsäure eingestellt ist» Anschliessend wird die vorerwärmte Milch schnell zur Lablösung zugegeben. Die Zeit die zur Ausflockung der Milch erforderlich ist, wird bei 35°O gemessen. Die Aktivität des Präparats wird wie folgt berechnet:

Wenn die Gerinnungszeit t Minuten ist, beträgt die Labmenge η mg je ml und die Aktivität ist gleich

25 x 40

Aktivität = Einheiten/mg f

η χ t ^

Die proteolytische Aktivität wird dadurch bestimmt, dass die Absorption der in Trichloressigsäure löslichen Bruchstücke bei 280 m/U gemessen wird, die nach dem partiellen Abbau von Casein beim pH-Wert 6,0 erhalten werden. Die Einheit der proteolytischen Aktivität wird als die Enzymmenge definiert, die bei einem pH-Wert 6,0 und bei 35°C je Minute eine Menge löslicher Fragmente bildet, die ein Mikromol Tyrosin entspricht, gemessen in einem Bereich, in dem Dosis und Wirkung eine gerade lineare Beziehung aufweisen.

Die Bestimmung wird wie folgt durchgeführt: f

Zu 5 ml einer Lösung von 1 $ Casein in 0,1 m- Phosphatpuff er vom pH-Wert 6,0, die vorher 5 Min. auf 35°C erwärmt wurde, wird 1 ml der EnsymlÖsung zugefügt, die geprüft werden soll. Die Lösung wird gründlich vermischt und 50 Ιίϊη. bei 55 C inkubiert. Anschliessend werden 5 ml einer 5 5^-igen Lösung von Irichloressigsäure zugefügt, wobei das nicht abgebaute Casein ausfällt. 10 Min· später wird die erhaltene Suspension abfiltriert und dann die Absorption des Piltrats bei 280 m/U gemessen.

Das Ensya wird mit zwei Konsentrationen untersucht, die so ausgewählt sind, dass die beiden Messpunkte innerhalb des Bereichs fallen, in dem eine lineare Beziehung zwischen der Enzym-

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dosis und der Wirkung auftritt» Die Vergleichsbestimmung wird durchgeführt, indem zunächst Trichloressigsäure zur Gaseinlösung zugesetzt wird und anschliessend die Enzymlösung. Der gefundene Wert wird mit dem einer standardisierten Tyrosinlösung verglichen, die in gleicher Weise bestimmt wird.

Die Enzymaktivität wird wie folgt berechnetι ,

Aktivität = Einheiten/mg

30 χ Δη χ Έ ·

wobei ÄE die Absorptionsdifferenz ist, die bei.den beiden ver-' schiedenen Enzymkonzentrationen gemessen wird und aufgrund der Vergleichswerte korrigiert wird,

Δη die Differenz der Enzymkonzentration zwischen den beiden gemessenen Lösungen in mg/ml ist und

E die Absorption ist, die für den Standard mit 1 Mikromol Tyrosin gemessen wurde.

Das Verhältnis der Gerinnungsaktivität zur proteolytischen Aktivität wird aus den gefundenen Werten gemäss der 'Formel

30 000 χ Δη χ E₃
η χ t χ Δε

gemessen. Der Geschmack von Käse, der mit gereinigten Labpräparaten hergestellt wurde, wurde nach einem Untersuchungsverfahren beurteilt, das von "The Committee on Sensory Evaluation of the Institute of Pood Technologists" gemäss Pood Technology 18_S Seite 1135 (1964) empfohlen wurde* Der Geschmack von Käse, der mit gereinigten Labpräparaten hergestellt wurde, wurde durch Vergleich mit Käse bestimmt, der mit entsprechenden aber ungereinigten Labpräparat en hergestellt wurde, wobei die Prüfung durch eine Gruppe erfahrener Geschmacksexperten im Laboratorium vorgenommen wurde.

Einzelproben-

Zu diesem Zweck wurde der sogenannte/Test mit einer Einzelprobe gemäss Food Technology 11, (1957)? Einschub 25 vorgenommen.

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_ 9 —

Dieser Test besteht darin, dass eine Gruppe erfahrener Geschmacksprüfer befragt werden, ob in einem Produkt eine bestimmte Eigenschaft vorhanden oder abwesend ist und, falls möglich, wie stark diese Eigenschaften zum Vorschein kommen. Die Ergebnisse einer vollständigen vergleichenden Prüfung werden nach ihrer Variationsbreite analysiert·

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, wobei die Herstellung gereinigter labpräparate und deren Anwendung wiedergegeben ist»

Beispiel 1

10g eines festen Labpräparats aus Mikroorganismen aus Mucor pusillus wurden in 250 ml destilliertem Wasser gelöst. Zur erhaltenen Lösung wurden 10g Bentonit BIV 350 bianco zugegeben, wonach der pH-Wert auf 5,0 mittels 1 η-Essigsäure eingestellt •wurde« Die erhaltene Suspension wurde 15 Min. gerührt und anschliessend über ein Faltenfilter filtriert» Die Gerinnungsaktivität und die proteolytische Aktivität wurden vor und nach der Absorption nach den oben genannten Verfahren gemessen und zusammen mit dem Verhältnis R in folgender Tabelle zusammengestellt:

Aktivitäten vor der nach der

Einheiten/ml Absorption Absorption

Gerinnungsaktivität 13 600 E 13 450 E

proteolytische Aktivität 2,40 E 0,96 E

R 5,67 χ 10³ 14,01 χ 10³

Beispiel 2

Zu 50 ml einea rohen wässrigen Extrakts einer Oberflächenkultur νυη Mucor puaillus mit einem Gehalt von 600 fjoxhleb E/ml wurden 500 mg Bentonit BIV 220 alvorio zugefügt. Die erhaltene LiuspenBion wurde auf einen pH-Wert 5,0 mit 1 n-Essigßäure einge-

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stellt und 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt« Anschliessend wurde die Suspension zentrifugiert und die erhaltene überstehende Flüssigkeit auf -5°G abgekühlt und 42 ml eines klaren Extrakts erhalten. Zu diesem Extrakt wurde unter Rühren 96 ml Äthanol von -15⁰C zugefügt. Der erhaltene Rückstand wurde filtriert und in einem Vakuumexsiccator getrocknet. Die Ausbeute betrug etwa 23 900 Soxhlet-Einheiten. In gleicher Weise wurde ein Präparat ohne Verwendung von Bentonit hergestellt. In diesem Falle betrug die Ausbeute 24 100 Soxhlet-Einheiten. Die Gerinnungsaktivität und die proteolytische Aktivität sind in der folgenden Tabelle zusammen mit ihrem Verhältnissen dargestellt:

Aktivitäten Rohextrakt ungereinigtes gereinigtes _i Endprodukt Endprodukt'

Gerinnungsaktiv. 30 000 E 24 100 E 23 900 E proteolytische Akt. 5,50 E 4,61 E 1,65 E R 5,45 x 10³ 5,22 χ 10³ 14,48 χ 10³

Beispiel 3

Das gereinigte Lab, das gemäss Beispiel 1 erhalten wurde, wurde zur Herstellung von Käse in einem Vergleichsversuch mit ungereinigtem Lab verwendet.

Zu 20 1 ungekochter Frischmilch wurden 3 ml der gereinigten Lablösung, die gemäss Beispiel 1 erhalten wurde, sowie 4 g Kaliumnitrat und 1 ^G/o einer Ausgangskultur zugegeben. Die Temperatur, bei der die Koagulation erfolgt, betrug 30⁰C und die Koagulationszeit 31 Min.

In gleicher Weise wurden 20 1 Milch mit 3 ml des ungereinigten Labpräparats von Beispiel 1 koaguliert, wobei die Gerinnungsseit 30 1/2 Min· betrug.

Die geronnene Milch wurde in Scheiben geschnitten, wobei Molke austrat. Zur weiteren Abscheidung.der Molke wurde die Masse

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20 Min· mit einer Käseharfe in Bewegung gehalten. Bach Entfernung von 10 1 Molke wurden 6 1 Wasser von 45°C zur geronnenen Milch zugesetzt, wonach die Temperatur 37⁰C betrug. Die Masse wurde etwa 50 Min. mit einer Käseharfe bewegt. Danach wurde die geronnene Milch von der Molke mittels einer durchlöcherten Siebplatte abgepresst. Schliesslich wurde die geronnene Milch in zwei Teile eingeteilt. Diese Teile wurden in warme Käseformen eingefüllt, die unter eine Presse gelegt wurden. Nach 6 Wochen bzw. 6 Monaten wurden die beiden erhaltenen Käse von einer Gruppe von acht erfahrenen Geschmacksprüfern einem Geschmackstest gemäss Simone und Mitarbeitern unterworfen.

Jls wurden von den acht Geschmacksprüfern folgende Ergebnisse erhalten:

Der mit dem gereinigten Lab erhaltene Käse ist unter A angeführt und der Käse aus dem ungereinigten Ausgangsmaterial unter B.

	Käse	A	Käse	si
	Nach 6 Wochen	Nach 6 Monaten	Nach 6 Wochen	Nach 6 Monaten
Bitter	υ	υ	1	2
etwas bitter	1	0	Y	6
nicht bitter	7	8	0
Beispiel 4

Hach der Fermentation in Gegenwart des Mycels wurden 10 g Bentonite Micro BIV zu 4 1 einer Tauchkultur von Rhizcpus peka zugesetzt. Die Aktivität der LL'sung betrug 120 000 Sc::hlet-Einheiten je 1 und die proteolytische Aktivität 60 Einheiten je Der pH-Wert der Fermentationsflüssigkeit wurde auf einen Viert 5,0 mit 1 η-Salzsäure eingestellt und die Suspension weitere 15 Min· gerührt. Anschliessend wurde die Gärung unterbrochen und die festen Substanzen aus der Kultur abfiltriert« Die Gerinnungsaktivität und die proteclytische Aktivität vairde im klaren Filtrat bestimmt. Eine Gerinnungsaktivität ve:: 11Λ 000

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Soxhlet-Einheiten je 1 und eine proteolytische Aktivität von 8 Einheiten je 1 wurde gefunden, so dass das Verhältnis R zwischen der Gerinnungsaktivität und der proteolytischen Aktivität von 2 000 auf 14 250 verbessert wurde.

. In gleicher Weise wie gemäss Beispiel 3 wurde Käse mit einem labpräparat hergestellt, das mit 0,35 1 Bentonit behandelt worden war, sowie mit einem unbehandelten Labpräparat· Die Geschmacksprüfung gemäss Beispiel 3 durch eine Gruppe erfahrener Geschmacksprüfer zeigte, dass der Geschmack des mit dem gereinigten Lab hergestellten Käses erheblich rerbessert worden war, wie < aus der folgenden Tabelle hervorgeht.

Käse aus gereinigtem Lab	Nach 6 Monat en	Käse aus	rohem Lab
Nach 6 Wochen	0 1 7	Nach 6 Wochen	Nach 6 Monaten
Bitter . 0 etwas bitter 1 nicht bitter 7	6 2 0	2 6 0

Beispiel 5

Zu 10 g eines Labferments aus Mikroorganismen aus einer Oberflächenkultur von Hueor pusillus, gelöst und 250 ml Wasser, wurden 10g eines synthetischen Natriumaluminiumsilikats Decalso F zugegeben. Der pH-Wert der Lablösung wurde auf 5,0 mit 1 η-Essigsäure eingestellt. Die iiösung wurde 20 Min· gerührt und anschliessend das Absorptionsmittel abfiltriert. Das Labferment wurde durch Zugabe von 115g Ammoniumsulfat (bis zur Sättigung ö,76) isoliert. Der Niederschlag wurde abfiltriert, dialysiert und zur Trockne eingedampft und 4,68 g gereinigtes Lab A mit einer Aktivität von 790 000 Soxhlet-Einheiten/g erhalten« 10 g des gleichen Ausgangsmaterials wurden in gleicher Weise behandelt, jedoch kein Absorptionsmittel zur Lösung des rohen Labs zugesetzt. Die Ausbeute betrug 4»92 g Lab B einer Aktivität von 765 000 Soxhiet-Einhei-fcen/g.

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Nach der Bestimmung der proteolytischen Aktivität der Proben A und B zeigte eine Berechnung, dass das Verhältnis R beim Lab A 23 500 und beim Lab B 6 475 betrug.

Auch in diesem Falle wurde durch erfahrene Geschmacksprüfer sichergestellt, dass mit dem gereinigten lab A hergestellter Käse eine erhebliche Geschmacksverbesserung erzielt werden konnte.

Beispiel 6

100 ml von Lab aus Mikroorganismen aus Endothia parasitica ™ vom pH-Wert 5,0 mit einem Gehalt von 100 Soxhlet-Einheiten Gerinnungsaktivität je ml wurden über eine Säule mit 3 g eines . synthetischen Hatriumaluminiumsilikats Decalso ¥ gegeben. Die Säule wurde mit 15 ml einer Lösung von 0,01 m-Natriumacetat vom pH-Wert 5,0 ausgewaschen.

Das gesamte Eluat der Säule enthielt 9 800 Soxhlet-Einheiten, wobei die gesamte proteolytische Aktivität atif 0,47 Einheiten abgesunken war, gegenüber 1,43 Einheiten im Ausgangsmaterial,

Auch in diesem Pail ergab die Geschmacksprüfung, dass der M bittere Geschmack, der bei Verwendung von ungereinigtem Lab zur Käseherstellung auftrat, vollständig bei Käse verschwunden war, der mit gereinigtem Lab hergestellt worden war.

Beispiel 7

10 g Lab aus Mikroorganismen aus Muoor pusillus Lindt wurde in 125 ml 0,05 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Suspension von 10 g Asbestfaden! in 125 ml Wasser, zugefügt. Die erhaltene Suspension wurde 15 Min. bei Raumtemperatur gerührt und dann abfiltriert, Die Gerinnungsaktivität und die proteolytische Aktivität des Filtrate wurden gemessen

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und mit den Werten der Ausgangslösung verglichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt: - .

Aktivität in E/ml vor Absorption nach Absorption

Gerinnungsaktivität 13 400 E .11 000 E proteolytische Aktivität 2,38 E 0,96 E R 5 630 11 460

Beispiel 8

10 g Lab aus Mikroorganismen aus Mucor pusillus lindt wurden in 125 ml 0,05 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 3,5 gelöst. Zur Lösung wurde eine Suspension von 10 g Bentonit in 125 ml "wasser zugefügt und die erhaltene Suspension 15 Min« bei Raumtemperatur gerührt. Hacn der Entfernung des Bentonits durch Abfiltrieren wurde die Gerinnungsaktivität und die proteolytische Aktivität der Lösung gemessen und mit den Vierten dei· AusgangsIosung verglichen. Die Ergebnisse sind in folgender tabelle aufgeführt:

Aktivitäten in E/ml vor Absorption nach Absorption

Ger irinungs aktivität	13	400	E	3	5 CiO	E
proteolytische Aktivität	2	,44	E	o,	15	E
R	5	490		23	400

Beispiel 9

_o 10 g Lab aus Mikroorganismen aus Mucor pusillus Lindt wur- ° den in 125 ml 0,05 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 5,0 gelöst« Zu

oo dieser Lösung wurde eine Suspension von 10g Aerosil in 125 ml _to Wasser zugefügt und das Gemisch 15 Min, bei Raumtemperatur ge- ^ rührt, liach dem Filtrieren wurde die Gerinnungsaktivität und die cn proteolytische Aktivität der Lösung gemessen und mit den Werten

cn der Ausgangslösung verglichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden ^Tabelle zufjammenges teilt: - -

. AIctiνitäten in lü/ml vor Absorption nach Absorption

Gerinnungsaktivität "proteolytlsehe aktivität

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Claims

Patentansprüche

1· "Verfahren zur Reinigung von Labfermenten aus Mikroorganismen von unspezifischen geschmacksverschlechternden Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung des unreinen Labferments mit einem absorbierenden Silikat bei einem pH-Wert zwischen 3 und 9 in Berührung bringt und das Absorptionsmittel anschliessend aus der Lösung entfernt·

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Behandlung bei einem pH-Wert von etwa i? durchführt«

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsinaterial eine Tauchkultur oder einen wässrigen Extrakt einer Oberflächenkultur eines Mikroorganismus, der Lab produziert, verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 eis 3, dadurch g e i: e η η -

ζ ei ohne t, dass man die Behandlung in einer Säule durchführt.

t?«

Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch g e k e η η ■zeichne t, dass man als Absorptionsmittel Aerosil, Permut it, Attapulgit, Bentonit, Cabunit, Frankonit oder ein Geraisch dieser Stoffe verv/endet.

6. Verwendung des nach Anspruch 1· bis 5 gereinigten Labferments zur Herstellung von Käse.

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