DE2308013A1 - Katalasearme glucoseoxidase und verfahren zu ihrer gewinnung - Google Patents

Katalasearme glucoseoxidase und verfahren zu ihrer gewinnung

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DE2308013A1 DE19732308013 DE2308013A DE2308013A1 DE 2308013 A1 DE2308013 A1 DE 2308013A1 DE 19732308013 DE19732308013 DE 19732308013 DE 2308013 A DE2308013 A DE 2308013A DE 2308013 A1 DE2308013 A1 DE 2308013A1
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Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg/Lahn 2308013
Aktenzeichen: Hoe 73/B 003 - Ma 156
Datum: 14. Februar 1973
Katalasearme Glucoseoxidase und Verfahren zu ihrer Gewinnung
Die Anmeldung hat eine katalasearme Glucoseoxidase und ein Verfahren zu ihrer Gewinnung aus vorgereinigter Glucoseoxidase zum Gegenstand.
Es sind bereits Verfahren beschrieben worden, Glucoseoxidase aus Schimmelpilzen zu isolieren. Bei den meisten dieser Substanzen handelt es sich um Rohprodukte. Es sind auch reinere Glucoseoxidasen im Handel. Sie enthalten jedoch auf etwa 250 E Glucoseoxidase etwa 10 E Katalase. Wie diese Präparate hergestellt werden, ist nicht bekannt.
Es ist gezeigt worden, daß eine katalasefreie oder zumindest katalasearme Glucoseoxidase als Wachst ums hemmer für Turnorzellen verwendet werden kann.
Die katalasearme Glucoseoxidase ist dadurch gekennzeichnet, daß sie an Glucoseoxidase-Aktivität mehr als 250 E/mg Protein besitzt und an Katalase-Aktivität weniger als 0,1 E/mg Protein enthält.
Das Verfahren zur Gev/innung von katalasearmer Glucoseoxidase ist dadurch gekennzeichnet, daß man vorgereinigte Glucoseoxidase-Präparate mit wasserlöslichen Salzen von Acridinbasen, vorzugsweise Diaminoäthoxiacridinlactat fällt und durch Chromatographie an Kationenaustauschern und Anionenaustausehern reinigt. Das Verfahren zur Gewinnung von katalasearmer Glucoseoxidase ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial vorgereinigte Glucoseoxidase-Präparate aus Schimmelpilzen, vorzugsweise aus Aspergillus niger oder Peniei Ilium notatum verwendet.
409837/0914
Besonders gute Reinigungserfolge werden erzielt, wenn man Kationenaustausch er mit funktioneilen SuIfoäthylgruppen und Anionenaustauschern mit funktioneilen Diäthy!aminogruppen verwendet. Das erfindungsgemäß hergestelle Präparat ist elektrophoretisch und in der Ultrazentrifugenanalyse einheitlich.
Für die Bestimmung der Glucoseoxidase wird Glucose und Sauerstoff in Gluconolacton und Wasserstoffperoxid übergeführt. Das dabei entstandene Wasserstoffperoxid kann 1. jodometrisch oder 2. colorimetrisch (nach Bergmeyer, H.U. Methoden der Enzymatischen Analyse, Bd. 1, Seite 416, 2. Aufl., 1970, Verlag Chemie-Weinheim) bestimmt werden.
Eine Gluxoseoxidase-Einheit entspricht derjenigen Enzymmenge, die 1^u Mol Glucose pro Minute bei Substratsättigung umsetzt.
Die Aktivität der Katalase wurde nach Bergmeyer, H.U. (Methoden der Enzymatischen Analyse, Bd. 1, Seite 6*J5, 2. Aufl., 1970, Verlag Chemie-Weinheim) erreicht, indem man die Zeit bestimmt, die für die Abnahme der Wasserstoffperoxidkonzentration von 500 auf Extinktionseinheiten bei 21IO nra erforderlich ist.
Eine Katalase-Einheit entspricht derjenigen Enzymmenge, die bei 25 C in 100 see aus einer Ho0o-Lösung beliebiger Konzentration
-2
(ca. 10 M) die Hälfte des darin enthaltenen Peroxidsauerstoffs freisetzt.
Zur Fällung der Glucoseoxidase wird die Acridinverbindung in einer Menge eingesetzt, die 0,5 - 3 g» bezogen auf 10g Glucoseoxidase, entspricht.
409837/0914
Beispiel "*
10 g im Handel erhältliche Glucoseoxidase aus Aspergillus niger mit einer Glucoseoxidaseaktivität von 15 E/mg Protein und einer Katalaseaktivität von 1 E/mg Protein wird 10 J6ig in 0,01 molarem Natriumphosphat pH 6,0, das aus Phosphorsäurelösung und Natriumhydroxid hergestellt wird, gelöst und gegen 0,01 molarern Natriumphosphat pH 6,0 dialysiert. Anschließend wird mit einer 3 $igen wäßrigen Lösung von Diaminoäthoxiacridin-Lactat gefällt, wobei auf 10 mg Protein 1 mg Diaminoäthoxiacridin-Lactat verwenaet wird. Man läßt 15 Stunden bei 1I0C stehen. Der Diaminoäthoxiacridin-Lactat-Protein-Komplex, der sich dabei am Boden abgesetzt hat, enthält die Glucoseoxidase. Er wird durch Zentrifugation isoliert und die Glucoseoxidase durch Suspendieren des Sedimentes in 35 ml einer 5 Jigen Natriumchloridlösung freigesetzt.
Die Glucoseoxidase-enthaltende Lösung wird von dem schwerlös liehen
H S C!
Chlorid der Acridinbase durch Filtration abgetrennt. Die/ Enzym enthaltende Lösung wird gegen destilliertes Wasser und anschließend gegen 0,008 molares Natriumacetat pH 1J,0 bei 1I C dialysiert. Es folgt eine Chromatographie an Sulfäthyl(SE)-Sephadex^ C-50 (Deutsche Pharmacia, Frankfurt/iM) in der Kälte, wobei der Ionenaustauscher mit 0,008 molarem Natriumacetat pH 1IjO äquilibriert worden war. Die Glucoseoxidase wird eluiert mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,3 molarem Natriumchlorid in 0,008 molarem Natriumacetat pH 1IjO. Der erste Elutionspeak enthält die Glucoseoxidase. Die Lösung wird mit Natriumhydroxid auf pH 6 eingestellt und gegen 0,01 molarem Natriumphosphat pH 6,0 dialysiert. Es schließt sich eine Chromatographie mit Diäthylaminoäthyl(DEAE)-Sephadex^ A-50 an (Deutsche Pharmacia, Frankfurt/M), wobei der Ionenaustauscher mit 0,01 molarem Natriumphosphat pH 6,0 äquilibriert worden war. Die Glucoseoxidase wird mit einem Gradienten von 0 bis 0,3 molarem Natriumchlorid in 0,01 molarem Natriumphospuat pH 6,0 eluiert. In dem ersten Elutionspeak erscheint die Katalase, in dem zweiten Elutionspeak die Glucoseoxidase.
Die DEAE-Sephadex A-50-Chromatographie wird noch einmal wiederholt. Die Glukoseoxidasefraktion wird bis zu einem Proteingehalt von 2 % auf dem Ultrafilter konzentriert, gegen 0,02 molare Natriumphosphatlösung pH 6,0 dialysiert und lyophilisiert.
409837/091L
Die spezifische Glucoseoxidase-Aktivität des Endproduktes beträgt 255 E/mg Protein. Die Ausbeute an Aktivität beläuft sich auf iJ5 %. Die erfindungsgemäß gewonnene Glucoseoxidase enthält 0,08 E Katalase/mg Protein.
Ähnlich gute Ergebnisse werden erhalten, wenn die Adsorption und Elution des Enzyms an den Ionenaustauschern stufenweise im sogenannten batch-Verfahren durchgeführt werden. Falls erforderlich, läßt sich an die Reinigung eine Kristallisation der Glucoseoxidase anschließen.
Entsprechend dem im Beispiel beschriebenen Reinigungsverfahren läßt sich gleicherweise aus handelsüblichen Glucoseoxidase-Präparaten vom Penicillium notatum und anderen Schimmelpilzen katalasearme Glucoseoxidase gewinnen.
409837/091

Claims (4)

Patentansprüche
1. Katalasearme Glucoseoxidase, dadurch gekennzeichnet, daß sie an Glucoseoxidaseaktivxtät mehr als 250 E/mg Protein und an Katalaseaktivität weniger als 0,1 E/mg Protein besitzt.
2. Verfahren zur Gewinnung katalasearmer Glucoseoxidase, dadurch gekennzeichnet, daß man vorgereinigte Glucoseoxidase-Präparate mit wasserlöslichen Salzen von Acridinbasen vorzugsweise mit Diaminoäthoxiacridinlactat fällt und durch Chromatographie an Kationenaustauschern und Anionenaustauschern reinigt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial vorgereinigte Glucoseoxidase-Präparate von Schimmelpilzen, vorzugsweise von Aspergillus niger oder Peniei Ilium notatum verwendet.
4. Verfahren nach Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß Kationenaustauscher mit funktioneilen SuIfoäthylgruppen und Anionenaustauscher mit funktionellen Diäthy!aminogruppen verwendet werden. " , .
409837/091 k
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