DE3425957C2 - - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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Description
Die Erfindung betrifft eine neue Typ II-Restriktionsendonuklease,
ein Verfahren zu ihrer Gewinnung und
ihre Verwendung (vgl. die Patentansprüche 1, 3 und 7).
Typ II-Restriktionsendonukleasen sind Endodesoxyribonukleasen,
welche bestimmte DNA-Sequenzen zu erkennen und
zu spalten vermögen. Dabei werden Phosphodiesterbrücken
in der Zielsequenz hydrolysiert, und zwar in jedem
Polynukleotidstrang eine. Typ II-Restriktionsendonukleasen
sind daher wertvoll für die Analyse von DNA-Molekülen.
Es sind zwar bereits für zahlreiche DNA-Sequenzen
spezifische Typ II-Restriktionsendonukleasen bekannt,
jedoch besteht immer noch Bedarf an der Schaffung
weiterer Typ II-Restriktionsendonukleasen, die für
DNA-Sequenzen spezifisch sind, die bisher von keiner
der bekannten Restriktionsendonukleasen erkannt werden.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine
neue Restriktionsendonuklease zur Verfügung zu stellen,
welche eine bisher von keinem derartigen Enzym erkannte
Sequenz spezifisch zu erkennen und zu spalten vermag.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch eine
Typ II-Restriktionsendonuklease, welche gekennzeichnet
ist durch die palindrome Erkennungssequenz
Vorzugsweise weist dieses Enzym die durch den Pfeil
definierte Spaltungsstelle auf:
Auch andere Spaltstellen innerhalb dieser Sequenz sind
möglich.
Die erfindungsgemäße neue Typ-II-Restriktionsendonuklease,
die im folgenden als Dra III bezeichnet wird, besitzt
ein Temperaturoptimum bei 37°C und ein pH-Optimum bei
8,4. Weitere optimale Reaktionsparameter sind 75 bis
150 mM NaCl, 8 mM Mg2+ und 6 mM β-Merkaptoethanol. Die
Anwesenheit von Mg2+ ist für die Aktivität des Enzyms
notwendig.
Ein zu Dra III isoschizomeres Enzym ist nicht bekannt.
Das Enzym wirkt, wie oben erwähnt, an palindromischen
Strukturen, es erkennt also eine selbstkomplementäre
Nukleinsäuresequenz, bei der der Komplementärstrang des
Doppelstrangs die identische Sequenz in gegenläufiger
Richtung aufweist.
Die Erkennungssequenz läßt sich durch vollständigen
Verdau der DNAs des Virus SV40 und der Phagen Lambda,
fd 109, X174 und M13mp7 mit Dra III bestätigen.
Dra III spaltet Lambda-DNA an den Positionen 2959,
5618, 6640, 9004, 14482, 30370, 31914, 41484, 47317 und
48439. Dadurch entstehen Fragmente der Länge 2959,
2659, 1022, 2364, 5478, 15888, 1544, 9570, 5833, 1122
und 63 Basenpaare (bp).
Dra III spaltet SV40-DNA an Position 2721, fd109RF-DNA
an Position 7598, X174RF-DNA an Position 5815 und
M13mp7-DNA an Position 5721.
Die durch Dra III-Verdau der analysierten DNAs spezifisch
erhaltenen und in Agarose- und Polyacrylamidgelen
eindeutig nachgewiesenen Fragmente zeigen, daß Dra III
die Spaltstelle 5′-CACNNNGTG-3′ erkennt.
Die Schnittstelle innerhalb der Erkennungssequenz des
Enzyms läßt sich wie folgt feststellen:
Die DNA des modifizierten Phagen fd109RF wird mit Bam
HI durch Spaltungen an den Positionen 2220 und 7521
(Positionen bezogen auf den (+)-Strang) in zwei Fragmente
gespalten. Beide Stränge des kleineren 2983 bp
langen Fragmentes werden in zwei parallelen unterschiedlichen
Reaktionen terminal markiert. Der (+)-Strang wird
am 5′ Ende an Position 7522 mit gamma (³²P)ATP und T4
Polynucleotidkinase phosphoryliert. In der zweiten
Reaktion wird der komplementäre (-)-Strang am 3′ Ende,
an Position 7526 mit alpha (³²P) dGTP und Klenow-Polymerase
um 1 Nucleotid verlängert. Der verlängerte
(-)-Strang endet somit an Position 7525. Beide unterschiedlich
markierten DNA's werden anschließend jeweils
mit Acc I an Position 7968 nachgespalten.
Aus den jeweils entstehenden 5′- und 3′-terminal markierten
Fragmenten (447(5′)/446(3′) und 2536(5′)/2535(3′);
Länge der markierten Einzelstränge) wird das 447(5′)
bzw. 446(3′) Fragment (Position 7522 bis einschließlich
Position 7968(5′), Position 7525 bis einschließlich
7970 (3′) isoliert. Das 3′-terminal markierte Fragment
wird sequenziert. Zusätzlich wird jeweils ein Aliquot
der isolierten 447(5′) bzw. 446(3′) Fragmente mit dem
erfindungsgemäßen Enzym gespalten und die Länge der 5′-
bzw. 3′-markierten Einzelstränge in dem Sequenzgel
durch Vergleich mit der 3′ Sequenzleiter bestimmt.
Dabei ergibt sich auf dem 5′-terminal markierten Strang
die Spaltposition 7595 und auf dem 3′-terminal
markierten Strang die Spaltposition 7599.
Die Längenbestimmung des 5′-markierten (+)-Einzelstranges
des Bam HI-Dra III-Fragmentes erfolgt folgendermaßen:
Der an Position 7522 5′ markierte (+)-Einzelstrang
läuft identisch mit dem C an Position 7602 der
3′ Sequenzleiter, welches dem ersten Nucleotid 5′
ständig neben der Erkennungssequenz 3′-GTGCATCACC-5′
entspricht. Der 5′-markierte Einzelstrang endet deshalb
mit dem Nucleotid A des (+)-Stranges an Position 7598
(entspricht dem 3′-ständigen N innerhalb der Erkennungssequenz
5′-CACNNNGTG-3′). Die Schnittstelle von Dra III
auf dem 5′-markierten (+)-Strang ist also zwischen den
Nucleotiden A an Position 7598 und G an Position 7599.
Analog wird die Länge des komplementären 3′-markierten
(-)-Einzelstranges des Bam HI-Dra III-Fragmentes
bestimmt. Der an Position 7523 3′-markierte (-)-Einzelstrang
läuft identisch mit dem Nucleotid C an Positiion
7596 der 3′Sequenzleiter innerhalb der Erkennungssequenz
3′-GTGCATCAC-5′ (entspricht dem 3′-ständigen N innerhalb
der Erkennungssequenz 3′-GTGNNNCAC-5′. Der 3′-markierte
Einzelstrang endet deshalb mit dem Nucleotid G des
(-)-Stranges an Position 7595 der Erkennungssequenz. Die
Schnittstelle von Dra III auf dem 3′ markierten (-)-Strang
ist also zwischen den Nucleotiden G an Position 7595
und C an Position 7596.
Erfindungsgemäß wird Dra III gewonnen, indem man Deinococcus
radiophilus DSM 20551 züchtet und das Enzym aus
den Zellen gewinnt. Zur Gewinnung werden die üblichen
biochemischen Aufreinigungsmethoden verwendet,
wobei in den jeweils erhaltenen Fraktionen das Vorhandensein
des Enzyms anhand der Spaltung seiner Erkennungssequenz
leicht nachgewiesen werden kann. Als Substrat
eignet sich beispielsweise Lambda DNA. Die erhaltenen
DNA-Fragmente werden in Agarosegelen in den für die
Fragmentauftrennung üblichen Puffersystemen in Gegenwart
von Ethidiumbromid elektrophoretisch aufgetrennt.
Der für die Gewinnung des Enzyms verwendete Mikroorganismus
Deinococcus radiophilus DSM 20551 wächst aerob
im TGYM-Medium ATCC 679. Die Zellen kommen einzeln oder
paarweise, in uneinheitlichen Tetraedern oder kubischen
Verbänden in mehr als einer Ebene vor. Der Durchmesser
der Zellen liegt bei 1,0 bis 2,5 μm. Auf Agar werden
rosa bis rote, glatte, schwach konvexe Kolonien mit
gleichmäßigem Rand gebildeet. Der Organismus ist grampositiv.
Die Zellwand besteht aus Galaktose, Glucose,
Mannose, Alanin, Glutaminsäure, Lysin, Glucosamin und
Muraminsäure. Der Hauptbestandteil ist ein Peptidoglycan.
Optimale Wachstumsbedingungen 10 bis 30°C, pH 7,0, die
Verdoppelungszeit beträgt etwa 2 Stunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden die Zellen aufgeschlossen, der
Extrakt wird bei 13 000 Upm für 45 Minuten zentrifugiert. Für
den Aufschluß eignen sich die üblichen mechanischen
Methoden, wie z. B. Hochdruckdispersion oder Ultraschall.
Fachreinigung der das neue Enzym enthaltenden Ammonsulfatfraktion
kann zweckmäßig durch Affinitätschromatographie,
Chromatographie an einem Molekularsieb und abschließende
Chromatographie über einen Kationenaustauscher erfolgen.
Für die Affinitätschromatographie hat sich besonders
trägerfixiertes Heparin bewährt, z. B. Heparin-Sepharose.
Als Molekularsiebmaterial hat sich Ultrogel ACA 54
(LKB), ein Acrylamid/Agarose Heteropolymerisat aus 5%
Acrylamid und 4% Agarose bewährt. Als Kationenaustauscher
eignen sich beispielsweise Phosphat- oder
Sulfonatgruppen enthaltende Kohlehydrate und Polystyrole,
beispielsweise Cellulosephosphat, Polystyrolsulfonat
und dergleichen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Deinococcus radiophilus DSM 20551 wird in TGYM-Medium
(ATCC 679) bei 30°C 20 Stunden gezüchtet und in der
späten Log- bzw. stationären Phase geerntet.
TGYM-Medium hat folgende Zusammensetzung: Trypton 5,0 g,
Glucose 1,0 g, Hefeextrakt 3,0 g, DL-Methionin 0,5 g ad
1 l mit H₂O dest. Ausbeute ca. 150 g Trockenmasse/100 l
Medium.
50 g Zellpaste werden in 100 ml Aufschlußpuffer
(= TEMG-Puffer: 40 mmol/l Tris/HCl, pH 8,0/4°C; 0,1
mmol/l EDTA, 7 mmol/1 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin)
suspendiert. Dann werden die Zellen mit Ultraschall
aufgeschlossen (OD₅₇₈-Abnahme ca. 40%). Aktivität etwa
50 000 U Dra III. Die Aufschlußsuspension wird anschließend
für 45 Minuten bei 13000 Upm und 4°C zentrifugiert.
Der Niederschlag wird verworfen. Das Enzym
befindet sich im Überstand.
Der nach Beispiel 1 erhaltene Überstand wird über eine
Heparin-Sepharose-Säule (3 × 10 cm) chromatographiert.
Nach Waschen mit 5 Volumina TEMG-Puffer wird das Enzym
mit einem linearen Gradienten mit 0 bis 1,0 mol/l NaCl
eluiert. Das Enzym erscheint in den Fraktionen mit 0,5
bis 0,65 mol/l NaCl. Die Fraktionen werden vereinigt
und mit festem Ammoniumsulfat (AS, Endkonzentration 80%
Sättigung/4°C) gefällt.
Nach Fällung über Nacht wird der AS-Niederschlag
abzentrifugiert (4°C, 1 Stunde bei 13 000 Upm) und in
ca. 5 ml TEMG-Puffer + 0,5 M NaCl aufgenommen.
Anschließend wird über eine Ultrogel ACA 54-Säule (2
× 100 cm) in TEMG + 0,5 M NaCl chromatographiert. Die
Fraktionen mit reiner Dra III-Aktivität (d. h. bei
einstündiger Inkubation tritt nur das Dra III-spezifische
Spaltmuster an Lambda-DNA auf) werden vereinigt
und gegen TEMG-Puffer dialysiert. Das Dialysat wird
über eine Phosphocellulosesäule (1 x 10 cm) chromatographiert.
Nach Waschen mit 5 Volumina TEMG-Puffer wird mit einem
linearen Gradienten mit 0 bis 0,1 mol/l NaCl eluiert.
Das Enzym erscheint in den Fraktionen mit 0,35 bis 0,5
mol/l NaCl. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und
gegen 20 mmol/l Tris/HCl-Puffer pH 8,0, enthaltend 0,1
mmol/l EDTA, 10 mmol/l 2-Mercaptoethanol, 100 mmol/l
NaCl, 50% Glycerin, 0,01% Thesit, dialysiert.
Man erhält so ca. 5 000 U Dra III.
1 U Dra III spaltet 1 μg Lambda-DNA innerhalb 1 Stunde
bei 37°C in 25 μl vollständig.
In eine Mischung aus 13 μl Inkubationspuffer, enthaltend
0,02 mol/l Tris HCl pH 8,4/37°C, 0,02 MgCl₂, 0,2
mol/l NaCl und 0,012 mol/l 2-Mercaptoethanol, werden
7 μl H₂O und 5 μl Lambda-DNA (4 OD/ml Extinktion
(Optical Density) sowie 1 μl DraIII Lösung (1U/μl))
gegeben. Die Lösung wird eine Stunde bei 37°C gehalten,
auf Eis abgekühlt und mit 5 ml kalter Stoplösung,
enthaltend 7 mol/l Harnstoff, 20 Gew.-/V-% Saccharose,
0,06 mol/l EDTA und 0,01 Gew.-/Vol.-% Bromphenolblau,
versetzt. Dann wird auf 1%igem Agarosegel 3 bis 4
Stunden bei 100 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die
erhaltenen Banden werden gegenüber DNA-Längenstandard
identifiziert.
Claims (7)
1. Typ-II-Restriktionsendonuklease,
gekennzeichnet durch die palindrome Erkennungssequenz
2. Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1,
gekennzeichnet durch
die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle
3. Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuclease
des Anspruchs 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Deinococcus radiophilus DSM 20551 züchtet
und das Enzym aus den Zellen durch übliche biochemische
Aufreinigungsmethoden gewinnt, wobei in den
jeweils erhaltenen Fraktionen das Vorhandensein
des Enzyms anhand der Spaltung seiner Erkennungssequenz
nachweisbar ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Zellen aufschließt, den Extrakt bei
13 000 Upm für 45′ zentrifugiert und den Überstand
gewinnt.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Feinreinigung den Überstand einer
Affinitätschromatographie, einer Chromatographie
über Molekularsieb und einer abschließenden Chromatographie
über einen Kationenaustauscher unterzieht.
6. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Affinitätschromatographie trägerfixiertes
Heparin verwendet.
7. Verwendung der Restriktionsendonuklease nach
Anspruch 1 oder 2 zur Erkennung und Spaltung der
DNA-Sequenz 5′-CACNNNGTG-3′ bei Anwesenheit von
Mg2+.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19843425957 DE3425957A1 (de) | 1984-07-13 | 1984-07-13 | Restriktionsendonuklease dra iii, ihre gewinnung und verwendung |
US07/191,766 US4863858A (en) | 1984-07-13 | 1988-05-03 | Restriction endonucleas DRA III |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19843425957 DE3425957A1 (de) | 1984-07-13 | 1984-07-13 | Restriktionsendonuklease dra iii, ihre gewinnung und verwendung |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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DE3425957A1 DE3425957A1 (de) | 1986-01-16 |
DE3425957C2 true DE3425957C2 (de) | 1987-06-04 |
Family
ID=6240621
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19843425957 Granted DE3425957A1 (de) | 1984-07-13 | 1984-07-13 | Restriktionsendonuklease dra iii, ihre gewinnung und verwendung |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4863858A (de) |
DE (1) | DE3425957A1 (de) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU7145991A (en) * | 1989-12-22 | 1991-07-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Site-specific double stranded dna endonuclease |
US6048719A (en) * | 1999-01-22 | 2000-04-11 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the DraIII restriction endonuclease |
ITUB20155686A1 (it) * | 2015-11-18 | 2017-05-18 | Fondazione St Italiano Tecnologia | Procedimento di rivelazione di acidi nucleici e relativo kit. |
-
1984
- 1984-07-13 DE DE19843425957 patent/DE3425957A1/de active Granted
-
1988
- 1988-05-03 US US07/191,766 patent/US4863858A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US4863858A (en) | 1989-09-05 |
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