DE2265327C3

DE2265327C3 - Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbelag

Info

Publication number: DE2265327C3
Application number: DE2265327A
Authority: DE
Inventors: Karl Heinz Clark Nollstadt; Thomas Henry Westfield Stoudt
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1971-08-10
Filing date: 1972-08-09
Publication date: 1980-03-13
Also published as: RO84249B; FR2150754A1; AU462230B2; CA1001573A; DD97897A5; BG25658A3; CS191162B2; DE2239252C3; JPS4826973A; NO139590C; JPS54147938A; DE2239252A1; FI49677C; LU65867A1; NO138411B; AT333967B; IL40036A; CH587657A5; DE2265327A1; AR198389A1

Description

Zahnbelag haftet an den Zähnen und dem Zahnfleischgewebe an und behält seinen Zusammenhalt mindestens teilweise infolge der Wirkung von Polysacchariden und Proteinen. Eines dieser Polysaccharide, ein Glucan, ist bereits als Dextran erkannt worden, das sich durch Dextranasen hydrolysieren IaBt Die Verwendung von Zahnbelag dispergierenden Proteasen für die Mundhygiene ist von Molle in »Journ. So. Calif. Dent Assn.«, Band 35 (1967), Seite 391, und von S h a ν e r und Mitarbeitern in »Journ. Periodontology«, Band 41 (1970), Seite 33, empfohlen worden. Zahnbelag enthält in etwa ebenso großen Mengen wie Dextran noch ein anderes Glucan, das gegen die hydrolytische Wirkung von Dextranase widerstandsfähig ist, und für das die Bezeichnung Cariogenan geprägt worden ist

Aus der AT-PS 87 896 sind Zahnreinigungsmittel bekannt, die Diastase und Maltese enthalten. Somit sind diese Mitte! zur Beseitigung des Cariogenan-Anteils im Mundbelag nicht geeignet.

In der US-PS 25 26 614 sind Zahnbehandlungsmittel beschrieben, die Harnstoff und eine Substanz mit Ureaseaktivität enthalten. Beim Kontakt mit der Feuchtigkeit im Mund wird aus dem Harnstoff durch die Wirkung der Urease Ammoniak freigesetzt, der das Wachstum von Lactobacillus acidophilus und Hefen hemmen soll. Gemäß Spalte 2, Zeilen 36 bis 39 dieser Druckschrift sollen sich mit diesem Präparat die Bildung von Mucinbelägen verhindern und bereits vorhandene Mucinbeläge auflösen lassen. An keiner Stelle dieser Druckschrift wird aber ein Hinweis darauf gegeben, daß Zahnbeläge mit einem Gehalt afi Polysacchariden aufgelöst werden können. Dies ist auch nicht zu erwarten, da weder das Enzym Urease noch der freigesetzte Ammoniak in der Lage sind, Polysaccharide zu spalten.

Die Präparate der US-PS 34 27 380 enthalten als Wirkstoff p-Aminobenzoesäure, die die Verkapselung von Mikroorganismen auf den Zähnen verhindern und somit die Zahnbelagbildung verzögern soll. Auch in dieser Druckschrift findet sich kein Anhaltspunkt dafür, daß bereits bestehende Zahnbeläge mit einem Gehalt an Polysacchariden aufgelöst werden können.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mundpräparat zur Verfugung zu stellen, das Dextran, Cariogenan und gegebenenfalls Proteine in bereits vorhandenem Zahnbelag enzymatisch abbaut.

Diese Aufgabe wird durch das im Patentanspruch angegebene Mundpräparat gelöst.

Die Mundpräparate sollen so zusammengesetzt sein, daß durch eine einzige Mundbehandlung etwa 100 bis 200 000 Dextranaseeinheitcn, etwa 10 bis 20 000 Cariogenanaseeinheiten und gegebenenfalls etwa 0,4 bis 200 Azocaseineinheiten von Zahnbelag dispergieronder Protease auf den Mund zur Einwirkung gelangen.

Das in dem erfindungsgemäßen Mittel enthaltene, Cariogenan abbauende Enzym wird erhalten, indem man

(a) ein halbfestes Nährmedium, das Cariogenan als Kohlehydratquelle suspendiert enthält, der Einwirkung von Mikroorganismen aussetzt, bis ein gewisses Klarwerden des suspendierten Cariogenans beobachtet wird,

ίο (b) von diesen Stellen des Nährmediums einen Cariogenan abbauenden Mikroorganismus isoliert,

(c) diesen isolierten Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium züchtet,

(d) die unlöslichen Stoffe aus der Kulturflüssigkeit entfernt und

(e) das Cariogenan abbauende Enzym aus der geklärten Kulturflüssigkeit isoliert

Als Mikroorganismus verwendet man insbesondere

μ einen Mikroorganismus aus der Gruppe NRRL Nr. 5305, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5306, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5307, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5308, Streptomyces sp. NRRL Nr. 5309, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5300, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5301, Bacillus sp.

NRRL Nr. B-5302, Bacillus sp. NRRL Nr. B-5303 und Corynebacterium sp. NRRL Nr. B-5310.

Als Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbelag kommen beispielsweise in Frage Zahnpasten, Mundwässer, Salben, Kaugummi, Tabletten, zerkaubare

μ Tabletten, Nahrungsmittel, Getränke oder auch Formulierungen, bei denen das Enzym mit Hilfe von starken Wasserstrahlen in der Mundhöhle versprüht wird.

Der Begriff- der Azocaseineinheiten wird in Journ. Biol. Chem. 171, Seite 501 (1947) erläutert Er dient als Einheit für die Bestimmung der Proteaseaktivität

Cariogenan kann zusammen mit Dextran in vitro durch Streptococcus mutans SL-I (NRRL Nr. B-5304) erzeugt werden, wenn dieser in einem Medium gezüchtet wird, das Saccharose als Kohlehydratquelle enthält, und es entsteht auch, wenn eine zellfreie Fermentationsflüssigkeit von Streptococcus mutans, die extrazelluläre Enzyme enthält, mit einer Saccharoselösung inkubiert wird.
Das Cariogenan wird von dem begleitenden Dextran durch Inkubieren mit Dextranase getrennt. Das Cariogenan wird von Proteinen nach herkömmlichen Verfahren befreit.

Die Struktur des Cariogenans wurde nach herkömmlichen Verfahren bestimmt, nämlich durch saure Teilhydrolyse und anschließende qualitative und quantitative Analyse der dabei entstehenden Oligosaccharidfraktionen sowie durch Untersuchungen mit Hilfe der Oxydation mit Perjodat und der Reduktion mit Borhydrid. So wurde die Struktur des Cariogenans als diejenige eines unverzweigten Glucans bestimmt, welches «-(!-«■ 3)- und «-(!-► 2)-Bindungen in einem Verhältnis von etwa 3 :1 aufweist.

Mikroorganismen, die imstande sind, Cariogenan enzymatisch zu hydrolysieren, werden aus in der Luft

Mi vorkommenden Bakterien isoliert, indem man Agarplatten, die ein geeignetes Nährmedium mit Cariogenan als Kohlehydratquellc enthalten, der Luft aussetzt und die so entstehenden Kulturen bei einer geeigneten Temperatur, gewöhnlich bei 28 bis 37°C, für Zeiträume bis zu

b5 etwa 10 Tagen inkubiert. Von den sich als aktiv erweisenden Mikroorganismen werden Zweitkulturen auf ähnlichen Agarplatten zum Zwecke der Isolierung angelegt.

Das extrazelluläre Enzym Cariogenanase wird in isolierbarer Menge hergestellt, indem man eine Kultur eines Cariogenanase erzeugenden Mikroorganismus bei einer geeigneten Temperatur, gewöhnlich von 28 bis 37°C in einem Nährmedium in Schottelkolben inkubiert, bis eine zufriedenstellende Konzentration an Cariogenanaseaktivität erreicht ist was gewöhnlich etwa 72 bis 96 Stunden dauert Im allgemeinen benötigen die Mikroorganismen kein Cariogenan als Kohlehydratquelle in dem Nährmedium für die Erzeugung von Cariogenanase. Einer der verwendeten Mikroorganismen, nämlich Bacillus sp. MB-2665 (NRRL Nr. B-5300), benötigte jedoch Cariogenan als Nährstoff. Nach herkömmlichen Mutationsmethoden läßt sich jedoch eine konstitutive Mutante erzeugen, die kein Cariogenan im Nährmedium benötigt

Das Enzym wird aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert, indem man den Zellenabfall und andere unlösliche Stoffe abzentrifugiert oder abfiltriert das Zentrifugat im Vakuum auf die etwa 5- bis 15fache, vorzugsweise etwa die 1Ofache Konzentration, einengt und das Protein nach herkömmlichen Verfahren, z. B. mit einem organischen Lösungsmittel, durch Komplexbildung mit Metallen oder durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder dergleichen, ausfällt Vorzugsweise wird die Ausfällung mehrmals wiederholt der Niederschlag zwisphen den einzelnen Ausfällungen in einer Pufferlösung gelöst und die Lösung filtriert oder zentrifugiert Die letzte Ausfällung in wäßriger Lösung wird dann dialysiert und entweder als kalte Lösung oder in gefriergetrockneter Form aufbewahrt

Es wurde gefunden, daß das so erzeugte Enzym für eine «-(1->-3)-Glucosidbindung mit einer vizinalen a-(1—2)-Glucosidbindung spezifisch ist Es hat einen isoelektrischen Einstellpunkt von 5,1. Es weist einen weiten optimalen pH-Bereich mit einer maximalen Aktivität bei einem pH-Wert von 6,0 auf. Durch diese Eigenschaften unterscheidet sich Cariogenanase deutlich von den bisher bekannten Polysaccharasen.

Aus HeIv. Odont Acta, Band 14 (1970), Seiten 89—108 ist ein Ferment bekannt welches Mutanase genannt wird und ein «-Glucan angreift das Mutan genannt wird. Mutan ist zwar ebenso wie Cariogenan ein unlösliches «Glucan, jedoch sind Cariogenan und Mutan unterschiedliche Produkte; denn Cariogenan weist 1,3- und 1,2-Bindungen auf, Mutan dagegen 1,3- und 1,6-Bindungen. Ebenso sind das in der Literaturstelle genannte Enzym Mutanase und das Enzym Cariogenanase unterschiedliche Enzyme; denn Cariogenanase greift 1,6-Bindungen nicht an, dagegen greift Mutanase solche Bindungen an. Auch die Abbauprodukte der beiden Enzyme sind unterschiedlich. Das Hauptprodukt der Hydrolyse mit Cariogenanase sind Oligoglucane mit etwa 6 Glucose-Einheiten. Dagegen liefert Mutanase Glucose als das hauptsächliche Hydrolyse-Produkt Der isoelektrische Punkt von Cariogenanase liegt bei 5,1, derjenige von Mutanase bei 4,17.

Da die hergestellte Cariogenanase besonders gut bei einem pH-Wert von 6,0 wirkt, während Mutanase am bo besten bei einem pH-Wert von 4,5 wirkt und der durchschnittliche pH-Wert der Mundhöhle etwa 6,5 beträgt, liegt der pH-Wert, bei welchem Cariogenanase am besten ihre Wirkung entfallet, näher dem pH-Wert der Mundhöhle als der optimale pH-Wert für die Wirkung von Mutanase.

Nachstehend werden verschiedene Verfahren zum Isolieren und Kennzeichnen von in vivo und in vitro hergestelltem Cariogenan beschrieben und Beispiele für die Herstellung und Kennzeichnung der Cariogenanasen .gegeben.

Isolierung von Cariogenan aus menschlichem Zahnbelag

Frischer Zahnbelag wird Personen entnommen, die während eines zur Ausbildung des Zahnbelages dienenden Zeitraums von 4 bis 6 Tagen keinerlei Mundhygiene angewandt haben. Zum Abschaben und Sammeln des Zahnbelages von allen erreichbaren Zahnoberflächen wird ein kleiner Spatel verwendet Der feuchte Zahnbelag, der gewöhnlich die Größe einer Erbse hat wird in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension wird 20 Minuten in ein siedendes Wasserbad eingesetzt um die Enzyme zu inaktivieren. Die unlöslichen Stoffe werden abzentrifugiert wieder in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert und gefriergetrocknet Gewöhnlich erhält man von einer Person auf diese Weise 6 bis 15 mg Zahnbelag (Trockengewicht).

Das Cariogenan wird aus dem Zahnbelag folgendermaßen isoliert:

10 g Polysaccharide werden bei Raumtemperatur 30 Minuten unter ständigem Rühren mit 11 0,5molarer Natronlauge extrahiert Das Unlösliche wird abzentrifugiert und verworfen. Die etwas undurchsichtige überstehende Flüssigkeit wird mit 2normaler Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,1 gebracht wobei sich ein schweres Gel bildet Man verzeichnet das Volumen der sehr zähflüssigen Suspension und setzt je ml 200 Einheiten Dextranase zu. Die Suspension wird bei 37° C inkubiert bis die anthron-positiven Zucker, löslich gemacht durch die Dextranase, eine maximale Konzentration erreicht haben. Dies erfordert gewöhnlich 6 bis 8 Stunden. Das Dextranase-Aufschlußprodukt, das weniger zähflüssig geworden ist, wird zentrifugiert um das nicht aufgeschlossene Material zu sammeln. Das pillenförmige Material wird zweimal mit 10 Raumteilen destilliertem Wasser gewaschen. Dann wird es in 5 Raumteilen 0,5normaler Natronlauge löslich gemacht und durch 15 Minuten langes Behandeln mit dem gleichen Volumen eines Gemisches aus 9 Raumteilen Chloroform und 1 Raumteil Butanol in einem Mischer bei niedriger Umlaufgeschwindigkeit von Proteinen befreit Die Chloroform-P'rotein-Komplexverbindung wird durch Phasentrennung in der Zentrifuge entfernt. Die klare wäßrige Schicht wird durch Abhebern gewonnen und die Verfahrensstufe der Entproteinisierung wiederholt, bis die Chloroform-Protein-Komplexverbindung als dünne Haut erscheint, die die Grenzfläche zwischen den Phasen teilweise bedeckt. Die klare und fast farblose wäßrige Phase wird über Nacht gegen laufendes entmineralisiertes Wasser dialysiert Beim Verschwinden der alkalischen Reaktion setzt sich Cariogenan als weißes, durchscheinendes Gel ab, das aus flachen, hellen Teilchen besteht. Das Gel wird durch Gefriertrocknung in ein lockeres, helles Pulver übergeführt, dessen Menge etwa 25 Gewichtsprozent des rohen Ausgangspolysaccharids beträgt.

Herstellung von Cariogenan in vitro mit Hilfe von Streptococcus mutatis

Has Ausgangsmaterial für die Isolierung von Cariogi ,,an wird in einem Medium der folgenden Zusammensetzung erzeugt: 5 g Hefeextrakt, 11 g Aufschlußprodukt von mit Trypsin behandeltem Casein, 60 g Saccharose, 1 g Na₂CO₃, 0,5 ml Salzlösung (800 mg

MgSO₄ - 7 H₂O,40 mg FeCl₃ - 6 H₂O und 18 mg MnCI₂ je 100 ml entmineralisierten Wassers), gelöst in 1 I 0,! molarer Phosphatpufferlösung (pH 73)- Das Medium wird mit Streptococcus mutans SLl (NRRL Nr. B-5304) beimpft und das unlösliche Material gewonnen, wenn der pH-Wert auf 5,2 abgesunken ist. Nach dem Zentrifugieren wird das Material zweimal mit 20 Raumteilen entmineralisierten Wassers gewaschen und gefriergetrocknet.

Das Cariogenan wird aus den gefriergetrockneten, in vitro hergestellten, unlöslichen rchen Polysacchariden nach dem gleichen Verfahren isoliert das oben für die Isolierung von Cariogenan aus menschlichem Zahnbelag beschrieben wurde.

Herstellung von Cariogenan

in vitro mit Hilfe von zellenfreier

Streptococcus mutans-Fermentationsflüssigkeit

Polysaccharide werden durch Zusatz von 5 ml einer bei einem pH-Wert von 5,2 gewonnenen, zellenfreien Streptococcus mutans SL-1-Fermentationsflüssigkeit zu 25 ml einer Lösung von 6 Gewichtsteilen Saccharose in 100 Raumteilen einer O.lOmolaren Phosphatpufferlösung (pH 7,0), Filtrieren des Gemisches durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,45 μ und 7 tätiges Inkubieren bei 37° C erzeugt Die Polysaccharide werden abzentrifugiert zweimal mit 12 ml destilliertem Wasser gewaschen, wieder in 2 ml destilliertem Wasser suspendiert und gefriergetrocknet

Das Cariogenan wird nach der oben beschriebenen Methode isoliert

Bestimmung der Struktur des Cariogenans
(a) Ultrarotspektroskopie

Das Ultrarotspektrum des Cariogenans in Nujol zeigt ein Maximum bei 840 cm-', was der «-Konfiguration der Glucosidbindungen entspricht. Ein vollkommenes Fehlen einer Absorption bei 890 cm-' zeigt an, daß keine /?-Glucosidbindungen vorhanden sind.

(b) Säurehydrolyse

Das Cariogenan wird 48 Stunden in 2normaler Schwefelsäure (in einer Konzentration von 10 mg/ml) hydrolysiert Durch Neutralisieren mit BaCOs und Zentrifugieren erhält man eine klare Lösung. Die Papier- und die Dünnschichtchromatographie der Lösung ergibt daß das einzige vorhandene Monosaccharid Glucose ist.

Die Dünnschichtchromatographie wird an Kieselsäuregel G-Platten in zwei Systemen durchgeführt:

System I: 4 Raumteile n-Butanol, 5 Paumteile Aceton und 1 Raumteil Wasser;

System II: 9 Raumteile n-Butanol, 6 Raumteile Essigsäure, 1 Raumteil Wasser und 3 Raumteile Äthyläther.

Die entwickelten Platten läßt man im Luftstrom trocknen. Der Rest von Butanol und Essigsäure wird entfernt, indem man die Platten 30 Minuten in den Vakuumexsikkator einbringt. Die Zucker werden festgestellt, indem man die entwickelte Platte entweder mit einer 5prozentigen Silbernitratlösung besprüht und 10 Minuten auf 110⁰C erhitzt oder mit Naphthol-Resorcin-Reagens besprüht und 15 Minuten auf 100⁰C erhitzt. Zur Bestimmung der Molekülgröße der durch die Einwirkung von Cariogenanase auf Cariogenan entstehenden Hydrolyseprodukte werden als Bezugs-Markierungssubstanzen ein Produkt des Aufschlusses vor linearem Dextran mit Dextranase sowie Dextrose und Raffinose verwendet.

Die Papierchromatographie der Produkte der enzymatischen Hydrolyse und der Säurehydrolyse wird auf Filterpapierblättern von etwa 20 χ 55 cm nach der absteigenden Methode durchgeführt Die Chromatogramme werden 2'/2 Tage mit einem System aus 6

ίο Raumteilen n-Butanol, 4 Raumteilen Pyridin und 3 Raumteilen Wasser entwickelt Die Zucker werden durch Anfärben mit Silbernitrat in Aceton sichtbar gemacht (vgL W.E Trevelyan und Mitarbeiter, »Nature«, Band 166 [19601 Seite 444).

(c) Saure Teilhydrolyse

300 g Cariogenan werden 15 Minuten bei Raumtemperatur in 3 ml 66prozentiger Schwefelsäure der Säurehydrolyse unterworfen. Das Hydrolysat wird mit Ba(OH)₂ neutralisiert und mit destilliertem Wasser auf 100 ml verdünnt Nach dem Entfernen des Bariumsulfats wird das überschüssige Bariumhydroxid als Bariumcarbonat ausgefällt indem man kleine Stücke festes Kohlendioxid zugibt Das Bariumcarbonat wird dann abzentrifugiert Die klare Lösung wird auf die !Ofache Konzentration eingeengt

Die Papier- und die Dünnschichtchromatographie des Konzentrats ergeben die Anwesenheit von

Nigerotriose(O-«-D-Glucopyranosyl-

(1-» 3)-0-a-D-glucopyranosyl-

(1-.· 3)-0-<x-D-glucopyranose),
Nigerose (O-«-D-Glucopyranosyl)-(1-*-3)-O-<x-D-glucopyranose),

Kojibiose (Ο-Λ-D-Glucopyranosyl-

(!-► 2)-O-a-D-glucopyranose) und
Glucose.

Es ist kein Anzeichen von Isomaltose oder Isomaltotriose (Oligosacchariden mit l-»6-Bindung) festzustellen.

(d) Oxydation mit Perjodat

Untersuchungen mit Hilfe der Perjodatoxydation werden nach einem abgeänderten Smith'schen Abbau durchgeführt, wie er von M i s a k i und Mitarbeitern in »Agr. Biol. Chem.«, Band 32 (1968), Seite 432, für Untersuchungen von Dextran beschrieben ist

Der Gesamtglucosegehalt des Cariogenans, bestimmt durch den Anthrontest, beträgt 534 μΜοΙ Anhydrogiucose je mg Polysaccharid. Es werden 1,53 μΜοΙ Perjodat je mg (5,54 μΜοΙ Anhydroglucose) verbraucht. Bei der Vervollständigung der Perjodatoxydation werden nur 0,05 μΜοΙ Ameisensäure je mg Trockengewicht in Freiheit gesetzt.

(e) Reduktion mit Borhydrid

_b0 Eine Suspension von Cariogenan wird einem teilweisen Smith'schen Abbau unterworfen. Der dabei entstehende Polyaldehyd liefert bei der Reduktion mit Natriumborhydrid keinen löslichen Polyalkohol.

Die Analyse des Polyalkohols auf Gesamtdextrose nach dem Anthrontest ergibt 3,8 μΜοΙ Glucose je mg Polyalkohol.

Bei der Hydrolyse des Polyalkohols wird kein Erythrit in Freiheit gesetzt jedoch bildet sich Glycerin.

(f) Schlußfolgerung

Aus den obigen Versuchen ergibt sich, daß Cariogenan ein lineares Glucan aus a-(1-+3)-Bindungen mit dazwischenliegenden ^v(I--2)-Bindungen in einem Verhältnis von etwa 3 : 1 ist.

Die Auswahl von Mikroorganismen, die Enzyme erzeugen, welche Cariogenan hydrolysieren, wird auf Agarplatten durchgeführt, die mit einem bestimmten Medium hergestellt werden, welches Cariogenan als Kohlehydratquelle enthält. Das Agarmedium ist folgendermaßen zusammengesetzt: 100 mg Aufschlußproduki; von mit Trypsin behandeltem Casein, 1,5 g Agar, 200 mg Cariogenan, 0,1 ml Salzlösung, wie oben für das Streptococcenmedium beschrieben, in 100 ml O.lmolarer Phosphatpufferlösung (pH 7,0). Das Medium wird 15 Minuten im Autoklav behandelt. Sobald das Oriogenan suspendiert ist, gießt man das Medium in Petrischalen (100 mm χ 20 mm) in Mengen von 10 ml je Schale. Nach der Einwirkung der in der Luft enthaltenen Mikroorganismen werden die Schalen 10 Tage bei 28° C aufbewahrt. Die Erzeugung eines hydrolytischen Enzyms läßt sich leicht daran feststellen, daß der Hin tergrund von in Agar suspendiertem Cariogenan um die Kultur herum klar wird. Mehrere Mikroorganismen erweisen sich als aktiv, wobei die Aktivität an dem Ausmaß des Klarwerdens des Hintergrundes des in Agar suspendierten Cariogenans bestimmt wird. Von diesen Mikroorganismen werden Zweitkulturen auf ähnlichen Agarplatten zum Zwecke der Isolierung angelegt. Hierbei fand man: einen nicht identifizierten Fungus (MF-4490) NRRL Nr. 5305; Streptomyces sp. (MA-4226, 4227, 4228 und 4229) NRRL Nr. 5306, 5307, 5308 bzw. 5309; Bacillus ps. (MB-2793, 2794, 2796 und 2665), NRRL Nr. B-5301, B-5302, B-5303 bzw. B-5300 und ein Corynebacterium sp. (MB-2795), NRRL Nr. Β-5.Π0. Die Kultur von Bacillus sp. MB-2665 ( = NRRL Nr. B-5300) wird als Mikroorganismus zur Erläuterung ausgewählt; man hätte jedoch ebensogut auch mit einem der anderen Mikroorganismen arbeiten können.

Bacillus sp. MB-2665 (= NRRL B-5300) wird in Zwcitkultur auf cariogenanhaltigen Agarplatten, die, wie oben beschrieben, hergestellt worden sind, zwecks loslierung und Herstellung von L-Rohren für die Lagerung gezüchtet.

Herstellung, Reinigung
und Aktivität von Cariogenanase

Die Herstellung von Cariogenanase mit der Kultur NRRL B-5300 erfolgt in 2-Liter-Kolben ohne Umlenkorgane, die je 400 ml eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthalten: 800 mg Nährflüssigkeit, 800 mg Hefeextrakt, 800 mg Aufschlußprodukt von mit Trypsin behandeltem Casein, 0,20 ml Salzlösung (wie oben beschrieben), 8 g Cariogenan in 400 ml 0,1 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,0). Nach 15 Minuten langer Behandlung im Autoklav bei 121 "C wird das Medium mit 1 ml einer 48 Stunden alten Saatkultur beimpft, die in 50 ml (in 250-ml-Schüttelkolben) Dextrosemedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet worden ist: 10 g Hefeautolysat, 10 g Dextrose, 180 mg KH₂PO₄, 190 mg Na₂HPO₄, 50 mg MgSO₄ - 7 H₂O, gelöst in 1 1 destilliertem Wasser. Die Erzeugungskultur wird bei 37° C in einer Schüttelmaschine bei 200 U/min mit einem Hub von 5 cm inkubiert Die Kultur wird geerntet wenn das suspendierte Cariogenan klar geworden ist. wa: gewöhnlich 72 bis 96 Stunden dauert.

Reinigung

Die Fermentationsflüssigkeit wird durch 20 Minuter langes Zentrifugieren bei 2°C mit einer Zenlrifugalkrafi von 16 000 g von Zellen und anderen unlöslichen Rückständen befreit. Die klare überstehende Flüssigkeil wird im Vakuum von 400 ml auf 40 ml eingeengt, und zu

lü dem Konzentrat setzt man im Eisbad unter Rührer Aceton von -60⁰C in Anteilen von 2 bis 3 ml zu, bis die Konzentration 60 Volumprozent beträgt. Der Niederschlag wird 10 Minuten bei -20⁰C mit einei Zentrifugalkraft von 1500 ■ g abzcntrifugicrt und sofor:

in 200 ml eiskalter 0.05molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert. Die Suspension wird 60 Minuter gerührt und dann durch 20 Minuten langes Zentrifugieren bei 2°C und 13 000-g von unlöslichen Stoffer befreit. Die klare, blaßgelbe überstehende Flüssigkeil wird mit Ammoniumsulfat gesättigt. Der Niederschlag wird 20 Minuten bei 2°C mit einer Zentrifugalkraft vor 13 000 · g abzentrifugiert und in 40 bis 60 ml eiskalten destilliertem Wasser gelöst und 24 Stunden dialysiert Die klare Lösung wird gefriergetrocknet. Das se erhaltene Material (Ausbeute 150 bis 200 mg) ergibt be der Analyse eine Cariogenanaseaktivität von 400 bis 55C Einheiten je mg.

Einheitsaktivität von Cariogenanase

jo Die Einheitsaktivität von Cariogenanase wird auf die Beobachtung gegründet, daß für die Abhängigkeit der prozentualen Aufklärung einer Suspension von Cariogenan von dem Logarithmus der Zeit eine geradlinige Beziehung existiert. Wenn überschüssiges Substrat vorhanden ist, gibt die Steigung der geradlinigen Kurve die Aktivität des Enzyms an. Wenn man Verdünnungsreihen mit einem gegebenen Enzympräparat ansetzt, isl es möglich, eine Standardkurve zu zeichnen, indem man die Steigung in Abhängigkeit von einer willkürlich gewählten linearen Skala der Einheitsaktivität in ein Diagramm einträgt. Das Standardanalysensystem enthielt 3,25 mg suspendiertes Cariogenan (1,0 mg je ml in 0.05molarer Phosphatpufferlösung; pH 6,0) und 0,50 ml Enzym, verdünnt auf eine solche Aktivität, daß die Steigung im Verlaufe einer 5stündigen Inkubationsperiode 4 bis 22 betrug. Bei höheren Enzymkonzentrationen erreicht die Steigung eine Grenze. Die Inkubationen werden bei 37⁰C in mit Stopfen verschlossenen Küvetten in einem rotierenden Inkubator durchgeführt.

nhp; γπηπ die optische Dichte be

nach 0,3

und 5 Stunden abliest. In einem nicht-linearen Analysensystem entspricl.t z. B. eine Steigung von 5 einem Wert von 6 Einheiten/ml, eine Steigung von 10 einem Wert von 16 Einheiten/ml und eine Steigung von 20 einem Wert von 62 Einheiten/ml.

Günstigster pH-Wert
für die Cariogenanaseaktivität

Das pH-Optimum für Cariogenanase wird unter den üblichen Analysenbedingungen bestimmt indem man die prozentuale Dispergierung von in geeigneter Weise gepufferten Cariogenansuspensionen (0,1 molarer Sorensen-Puffer) in einem pH-Bereich von 4,9 bis 8,0 verzeichnet Die prozentuale Dispergierung wird in Abhängigkeit von dem Logarithmus der Zeit (in Minuten) in ein Diagramm eingetragen, und die Steigungen der so erhaltenen geradlinigen Kurven werden bestimmt

pH-Optimum von Cariogenanase

pH	Prozentuale	Dispergierung des	240 Min.	Steigung
	Substrats		35,0
	15 Min.	30 Min.	42,0
4,9	5,0	11,0	45,0	28,3
5,5	8,0	14,0	43,0 '	33,0
6,0	12,2	18,0	40,0	36,0
6,5	10,0	16,0	31,9	34,0
7,0	9,0	15,0	33,5
8,0	7,2	13,0	23,1

Cariogenanase hat einen weiten Bereich von optimalen pH-Werten mit einer maximalen Aktivität in der Nähe von pH 6,0.

Bindungsspezifilät von Cariogenanase

Die Bindungsspezifität des Enzyms wird durch Analyse der Hydrolyseprodukte bestimmt. Die mittlere Länge der Zuckermoleküle wird berechnet, indem man das Verhältnis der Gesamtdextrose vor der Reduktion zu der Gesamtdextrose nach der Reduktion mit Natriumborhydrid bestimmt. Die durch die Wirkung des Enzyms entstehende Glucose wird mit Glucoseoxidase bestimmt. So wird die mittlere Länge der Oligosaccharidmoleküle zu 6,42 Glucoseeinheiten ermittelt. Diese Bruchstücke müssen je nach der Spezifität des Enzyms entweder eine Anreicherung oder eine Verarmung an o:-(1— 2)-B.ndungen erfahren haben. Es wird bestimmt, daß die Perjodatempfindlichkeit der inneren Struktur (4,42 Glucoseeinheiten) von etwa 25 auf 45% zunimmt. Aus dieser Feststellung läßt sich herleiten, daß die Tt-(I-2)-Bindung intakt bleibt, und daß die a-(1— 3)-Bindung von dem Enzym angegriffen wird. Ferner wird festgestellt, daß ungefähr ebenso viele λ-(1— 3)-Bindungen hydrolysiert werden, wie das Glucanmolekül insgesamt <x-(1—2)-Bindungen enthält. Daher wird angenommen, daß die a-(l—► 2)-Bindung für die Spezifität des Enzyms auf dem Wege über das Erkennen der Angriffsstelle an eine λ-(1— 3)-Bindung eine Rolle spielt, da die Disaccharide Kojibiose und Nigerose Produkte der Säurehydrolyse sind, Nigerotriose ein Endprodukt der enzymatischen Hydrolyse ist und Nigerose sowie Nigeran keine Substrate für Cariogenanase darstellen.

Beispiel 1
Zahnpaste oder Zahnpulver

Bekannte Präparate dieser Art, die sich in Lehrbüchern oder im Handel finden, werden durch 5—10 000 Einheiten Cariogenanase und 50—100 000 Einheiten Dextranase je g des Präparats ergänzt Sie können dann in der normalen Weise auf einer Zahnbürste verwendet werden, wobei für jede Behandlung etwa 2 g Zahnpaste geeignet sind.

Beispiel 2
Einreibsalbe

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel anzutreffen sind, werden mit etwa 10—20 000 Einheiten Cariogenanase und 100—200 000 Einheiten Dextranase je g Präparat ergänzt Das Präparat kann mit den Fingern auf die Zähne aufgetragen werden.

Beispiel 3
Mundwasser

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel anzutreffen sind, werden durch Cariogenanasekonzentrationen von etwa 1,0—2000 Einheiten und 10—20 000 Einheiten Dextranase je ml des Präparats ergänzt. Dieses Mundwasser kann in der üblichen Weise im Mund umhergespült werden, wobei man im Mittel 20 bis 40 ml verwendet.

Beispiel 4
Kaugummi

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel zu finden sind, werden mit 2,5—5000 Einheiten Cariogenanase, 25—50 000 Einheiten Dextranase und 0,1—50 Azocaseineinheiten Protease je g Präparat ergänzt, da ein gewöhnlicher Kaugummistab etwa 4 g wiegt. Ein solcher Kaugummistab kann z. B. in der üblichen Weise gekaut werden. In ähnlicher Weise kann eine zerkaubare Tablette verwendet werden.

B e i s ρ i c I 5

Tablette

Bekannte Präparate dieser Art, die in Lehrbüchern oder im Handel zu finden sind, werden mit 10—20 000

j« Einheiten Cariogenanase und 100—200 000 Einheiten Dextranase je Tablette ergänzt. Die Tablette wird in der üblichen Weise langsam durch Lutschen im Munde in Lösung gebracht. Dies ist die besonders bevorzugte Form des Präparats, weil sie normalerweise die längste

υ Kontaktzeit zwischen dem aktiven Enzym und dem Zahnbelag herbeiführt.

Beispiel 6
Getränke

Das Enzym kann zu Trinkwasser oder Milch zugesetzt werden, ist jedoch von besonderem Wert in saccharosehaltigcn Getränken, wie Cola, Orangensaft und ähnlichen mit Geschmacksstoffen versetzten

4"> Getränken, die Saccharose und/oder künstliche Süßstoffe enthalten. Zu einem herkömmlichen Colagetränk wird das Enzym z. B. in Konzentrationen von etwa 1 bis 2000 Cariogenanaseeinheiten und 10—20 000 Einheiten Dextranase je ml zugesetzt. Hierbei erfolgt die

>o Behandlung des Gaumens und der Zähne beim Trinken.

Beispiel 7
Wasserstrahl-Zahnreiniger

Zu dem Wasser einer herkömmlichen Vorrichtung zum Reinigen der Zähne mit Hilfe eines starken Wasserstrahls wird Cariogenanase in Mengen von 10—20 000 Einheiten und 100—200 000 Einheiten Dextranase je ml Lösung zugesetzt

Versuchsbericht

Es wird die Wirkung von verschiedenen Präparaten auf zahnbelagähnliche Produkte, die in vitro erzeugt

werden, untersucht Der Belag wird an Boden und Wänden von 5 kleinen tarierten Kolben mit Hilfe von Streptococcus mutans (NRRL Nr. B-5304) gemäß dem

ersten Absatz auf Seite 10 der DE-OS 22 65 327 gebildet. Der Belag in den einzelnen Kolben wird sodann jeweils mit einem der folgenden Präparate behandelt:

(1) Wasser;

(2) Cariogenanase (250 U/ml);

(3) Dextranase (250 U/ml);

(4) Cariogenanase + Dextranase (250 + 250 U/ml); und

(5) Cariogenanase + Dextranase nach Behandlung in siedendem Wasser (250 + 250 U/ml).

Nach 3stündiger Inkubation unter leichtem Schütteln mit Drehbewegung wird der überstand dekantiert. Folgende Ergebnisse werden erhalten:

Behandlung

% Aufbrechen des Belags

(1) Wasser 18,3

(2) Cariogenanase 28,5

(3) Dextranase 24,8

(4) Cariogenanase + Dextranase 91,5

(5) Cariogenanase + Dextranase 14,7 (Siedebehandlung)

Bei gleichzeitiger Verwendung von Cariogenanase und Dextranase (4) ergibt sich ein überraschender t5 Synergismus, d. h., die Summe der Einzelwirkungeii der beiden Enzyme wird übertroffen.

Claims

Patentanspruch:

Mundpräparate zur Bekämpfung von Zahnbelag, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Cariogenanase und Dextranase, gegebenenfalls in Kombination mit einer Zahnbelag dispergierenden Protease.