DE2152620C3 - Mutanase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents
Mutanase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre VerwendungInfo
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Description
werden, deren wesentliches gemeinsames Merkmal ihre Fähigkeit ist, die a-1 ^-verketteten Polysaccharide,
also Mutan, die auch im Zahnbelag vorhanden sind, anzugreifen. Dementsprechend kann Mutan als
eine Klasse von Glucanen mit unterschiedlichen Graden der Wasserlöslichkeit angesehen werden. Diese
Unlöslichkeit ergibt sich als direkte Folge des Gehaltes an a-1,3-Bindungen. Die Zahnbelag-Matrix enthält
eine Reihe derartiger Glucane mit unterschiedlichen Anteilen an dieser kritischen Bindung. Mutan
wird somit definiert als eine Klassenbezeichnung für Glucane, die durch Streptokokken erzeugt werden
und mehr als 50% a-l^-Glucosid-Bindungen enthalten.
In einer Veröffentlichung von Hasegawa et al in Journal of Biol. Chem., VoI. 244, 5460-5470, 1969,
ist eine endo-a-D-(l —>3)-GIucanase beschrieben
worden, die aus Trichodermaviride hergestellt wurde. Diese Glucanase ist jedoch nicht in der Lage, Mutan
aufzubrechen. Demgegenüber ist jedoch Mutanase in der Lage, Pseudonigeran, ein Zellwand-GIucan di;s
Apsergillus-nigcr aufzubrechen, das vorwiegend ci-1,3-verkettet
ist. Der von Hasegawa verwendeite Mikroorganismus erzeugt jedoch keine Mutanase,
selbst dann nicht, wenn in dem Kulturmedium Mutain als Teil der Kohlenstoffquelle anstelle des Pseudonigerans
verwendet wird.
Die anfänglichen Screeningverfahren zur Auffindung von Mutanase produzierenden Mikroorganismen
können selbstverständlich mit allen Arten von Mikroorganismen enthaltendem Material durchgeführt
werden, so z. B. auch unter Heranziehung von aus Zahnabschabungen erhaltenem Zahnbclag zur
Verwendung als Substrat und Kohlenstoffquelle. Für dieses Screening, ganz zu schweigen für eine Produktion
in großem Maßstab, ist jedoch ein Mutan wesentlich günstiger, das speziell durch Kultivierung eines
Mutan produzierenden Mikroorganismus erhallen werden kann. So läßt sich speziell Mutan durch Kultivierung
eines Baktcriums der Gattung Streptococcus, ζ. B. Streptococcus mutans oder Streptococcus sanguis
und insbesondere mit dem als OMZ 176 identifizierbaren
Stamm Streptococcus mutans erzeugen. Dieser Stamm ist unter der Nummer 350.71 beim CBS
(Centraalburcau voorSchimmelcultures, Baarn, Holland) hinterlegt worden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Einzympräparat
zur Verfügung zu stellen, mit dem sich Polysaccharide mit einem Anteil von mehr als 50%
an α-1,3-Glucosid-Bindungen enzymatisch abbauen lassen, so daß ein solches Präparat auch zur Entfernung
von Zahnstein und zur Verhinderung von ZaImstcinbildung einsetzbar ist.
Die Lösung der Erfindungsaufgabe besteht in der Bereitstellung einer Mutanase in Form eines α-1,3-Glucanase-Präparats,
das erhältlich ist durch Kultivierung eines Mutanase produzierenden Mikroorganismus
auf einem Medium, dessen vorwiegende KohlenstoffquellQ ein aus einem Streptococcus produziertes
Mutan ist und in welchem während der KuI-tivierungeinpH-Wertzwi· chenetwa 2 und 9 und eine
Temperatur zwischen 10 und 45° C eingehalten wird, und durch anschließende Gewinnung der erzeugten
Mutanase aus der Fennentationslüsung.
Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mutanase als Bestandteil des Kultivierungsmediums benötigte
Mutan wird zweckmüßig durch Kultivierung des bereits erwähnten Stammes Streptococcus mutans
CBS 350,71 gewonnen.
Um die in dem eingesetzten Mutan vorhandenen a-1,6-Glucosid-Bindungen zu zerstören und folglich
ein Mutan zu erhalten, das ausschließlich oder nahezu Ί ausschließlich a-l.S-GIucosid-Bindungen enthält, ist
bei einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemnßen
Mutanase vorgesehen, daß das Mutan vor seiner Weiterverwendung oxidiert und anschließend reduziert
K) wird. Dabei kann die Oxidation mit Perjodat durchgeführt werden.
Bereits aufgefundene Mutanase produzierende Mikroorganismen stammen aus den Gruppen Trichoderrna
harzianum, Penicillium lilacinum, Penidllium
ι ί funiculosum, Penicillium melinii und Penicillium janthinellum.
Aus diesen Spezies seien beispielsweise die schon früher verfügbaren Stämme Penicillium lilacinum
NRRL 896, Penicillium funiculosum NRRL 1132 und NRRL 1768 sowie Penicillium melinii
ji NRRL 1931 genannt. Weiterhin seien in diesem Zusammenhang
die erst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung hinterlegten Stämme Trichoderma
Harzianum CBS 243.7 und Penidllium lilacinum CBS 595.71 erwähnt.
r> Bei der Verwendung des erfindungsgernäßen Mutanase-Präparats
kann die Mutanase in einem nichttoxischen Träger (z. B. Wasser), dispcrgiert werden.
Für die Behandlung des Zahnsteins auf lebenden Zähnen wird die Mutanase in ein oral applizicrbarcs
ίο Präparat eingebracht, z. B. in eine Zahnpasta, ein
Mundwasser, ein Mundspray oder in einen Kaugummi. Es besteht aber auch die Möglichkeit, daß die
Mutanase in einem verzehrbaren Präparat, beispielsweise einem Schokoladepräparat, einem Getränk, in
r, Drops oder Pastillen vorliegt. Bevorzugt werden länger
in der Mundhöhle verbleibende Präparate wie Drops, Kaugummi oder Pastillen. Diese können so
aufgebaut sein, daß sie die Mutanase nur allmählich freigeben und somit dem Enzym eine ausreichende
in Zeit zum Angriff des Zahnbelags zur Verfugung steht.
Eine weitere Verwendung für die erfindungsgemäße Mutanase ist die Behandlung künstlicher Zähne
(Zahnprothesen), bei denen sich ebenfalls Zahnbclag bildet, der sich mit der Mutanase entfernen läßt. Zu
r> diesem Zwecke kann die Mutanase in ein Einweichoder Reinigungspräparat, z. B. in eine Gebiß-Behandlungslösung,
eingebracht sein.
Als weitere orale Applikationsformen für die Mutanase seien solche Präparatestücke in Festform wie
-,(i beispielsweise Tabletten, Bonbons oder Toffees gcnann*,
die in der Mundhöhle in eine an den Zähnen haftende Position gebracht werden können. Auf diese
Weise wird ein Langdauereffekt erzielt.
Um bei den vorerwähnten oral anwendbaren Prä-
-,-> paraten eine für die Vermeidung einer Zahnstcinbildung
oder für die Entfernung gebildeten Zahnsteins ausreichende Enzymaktivität zu erzielen, sollte eine
Konzentration zwischen 0,02 und KH)O Mutanase Einheiten pro Gramm Präparat angewendet werden.
mi Für viele Zwecke hat sich eine Aktivität von 0,1 bis
500 Mutanase-Einheiten und innerhalb dieses Bereichs eine solche von 0,2 bis 100 Mutanase-Einheiten
pro Gramm Präparat als zweckmäßig erwiesen.
Die Mutanase enthaltenden Zusammensetzungen
Die Mutanase enthaltenden Zusammensetzungen
h-, können selbstverständlich auch andere Enzyme,/. B.
Dextranase, enthalten. Da sich gezeigt hat, daß die vollständige Auflösung der in der Zahnbelagsmatrix
vorliegenden Verbindungen in einem gewissen Maße
auch von einem Gehalt an Nicht-KohlehydnU-Swbstanzeii in dieser Matrix abhängt, kann sich eine Zugabe von Lipase und Protease zu dem Präparat zur
Ergänzung der von der Mutanase entfalteten Enzymwirkung als vorteilhaft erweisen.
Die in einem Präparat enthaltene Mutanase-Aktivität kann in der von Tsuchiya, et al, J. Bacterial.
64, 513-519 (1952) beschriebenen Methode bestimmt werden, wobei anstelle von Dextran Mutan
verwendet wird.
Polysaccharide vom Typ der Mutane können auch in der Industrie, beispielsweise in Rohrleitungen oder
Vorratsgefäßen auftreten, die mit wässerigen Zuckcr-Iösungcn,z. B. Melasse, in Berührung kommen, wenn
in die Anlage Polysacclmrid produzierende Mikroorganismen gelangen. Für diesen Zweck kann die crfindungsgcmäße Mutanasc in Einweich- oder Reinigung>präparaten enthalten sein und dazu dienen,
durch die Mutane verursachte Verstopfungen und Waridbelägc zu beseitigen.
Das bei den nachfolgenden Ausführ.ngsbeisielcn verwendete Mutan kann durch Kultivierung von
Streptococcus mutans OMZ 176 (CBS Nr. 350.71) in einer Hirn-Herz-Infusion (Difco) während einer
Zeitdauer von 12 Stunden erzeugt werden. Die hierbei erhaltene Nährbrühe wird in einen Fermentator eingeimpft, derein Substrat folgender Zusammensetzung
enthält:
Dialysicrbarc Teile von Bacto Tryptose 30 g/l Dialysicrbarc Teile von Bacto Hefeextrakt 15 g/l
Bacto-Casamino-Säuren 7,5 g/l
K2HPO4 12 g/I
Glukose 12,5 g/l
Eine in einer Schüttclflaschc befindliche Salzlösung
(Mandels et al, J. Bact. 83, 400-408, 1962) wird mit Trichodcrma harzianum CBS Nr. 243.71 beimpft
und 96 .stunden lang geschüttelt. Die Kohlenstoffquellc besteht aus 0,2% Glucose und 0,2% Mutan.
Diese Kühlflüssigkeit wird in einen Fermentator eingebracht, der ein Substrat derselben Zusammensetzungenthält. In den Fermentator wird Luft in einer
Menge von 1 Liter pro Minute und pro Liter Kühlflüssigkeit eingeführt. Die Temperatur der Kulturflüssigkcit beträgt 28° C und die Drehgeschwindigkeit
des Rührwerkes 300 Umdrehungen pro Minute. Der pH-Wert stellt sich automatisch auf 6,0 ein. Nach 160
Stunden beträgt die Niutanase-Aktivität 2,5 Einheiten pro Milliliter Kühlflüssigkeit.
Es wird ein Mutan eingesetzt, dessen cc-l,6-Bindungcn aufgebrochen sind. Zu diesem Zweck wird das
Mutan in einer Perjodatlösung (4 Mol Perjodat pro Mol Anhydroglukose) oxidiert. Die Molarität des
Perjodats wird unter 0,05 gehalten. Die Oxidation wird während einer Zeitdauer von 144 Stunden im
■Γι
Dunkcfn bei 4° C durchgeführt. Anschließend wird
das Mutan abzentrifugiert und über Nacht gegen fließendes Leitungswasser dialysicrt. Die Reduktion erfolgt bei Zimmertemperatur in einer wäßrigen Natrium-Borhydrid-Lösung(2 g Natrium-Borhydrid pro
Gramm Mutan). 24 Stunden später wird die Mischung mit 32%iger Salzsäure neutralisiert. Das so modifizierte Mutan wird gewaschen und lyophilisier . D e
nachfolgende Herstellung der Mutanase wird ents irechend Beispiel 1 ausgeführt, mit der Maßgabe, daß
anstelle des in Beispiel 1 eingesetzten Mutans das vorstehend erzeugte Mutan und statt des Stammes Trichoderma harzianum CBS Nr. 243.71 nunmehr er
Stamm Penicillium lilacinum CBS 595.71 für die KuI-tivierung verwendet wird. Nach 184stündiger Kultivierung erhält man eine Ausbeute von 0,26 Mutanase-Einheiten pro Milliliter Kulturfiltrat. Die Dcxtranase-Aktivität beträgt weniger als 0,02 Dextranase-Einheiten pro Milliliter K?:?turfiltrat. Ähnliche
Resultate wurden bei Verwendung von Penicillium funiculosum erhalten.
Um die Abbauwirkung der erfindungsgemäßen Mutanase auf Mutan nachzuweisen, wird die durch
isoclcktrischc Fokussierung gereinigte Mutanasc auf einer Agar-Platte getestet. 45 mg Mutan, 225 mg
Agar und 15 ml 0,2 N Acetat-Puffer mit einem pH-Wert von 5,0 werden durchgerührt und bis zum Kochen erhitzt. Unmittelbar anschließend wird die
Mutan-Suspcnsion in einen Petri-Kolben eingegossen. Nach der Verfestigung werden in die mutanhaltige Agarplattc einige Löcher gebohrt. Diese Löcher
werden mit gereinigter Mutanasc (Aktivität etwa 2 Mutanasc-Einhcitcn[0,03 ml]) gefüllt und die Platten
über Nacht bei 37° C inkubiert. Das Mutan in der unmittelbaren Umgebung der Löcher ist nunmehr
vollständig hydrolysiert. Gereinigte Dextranase in einer Konzentration von 2(M) Dextranase-Einheiten pro
Milliliter zeigt dagegen überhaupt keine Abbauwirkung auf das Mutan.
Zum weiteren Nachweis für die Abbauwirkung der erfindungsgemäßen Mutanasc auf Mutan wurden
50 mg Iyophilisierter Zahnbclag, der von Schulkindern stammte, in 100 ml Wasser durch Ultraschall
suspendiert. Das Material wurde zentrifugiert und die Extraktion des Sediments zweimal mit Mengen von
10 ml doppelt destilliertem Wasser wiederholt. Der lösliche Teil wurde abgegossen. Der unlösliche Rückstand (38,5 mg) wurde in 10 ml Acetat-Puffer suspendiert und bis zum Kochen erhitzt. 1 ml der BelagSuspension wurde 4 Stunden lang mit 1 ml gereinigter
Mutanase, deren Aktivität 2,2 Mutanase-Einhciten betrug, inkubiert. Die Menge des freigesetzten reduzierenden Zuckers wurde kolorimetrisch bestimmt.
Dabei ergab sich, daß die Mutanase 0.12 mg rcduzierenden Zucker, der als Glukose bestimmt wurde, freigesetzt hatte. Eine Probe mit gereinigter Dextranase
anstelle von Mutanase (240 Dcxtranase-Einheiten je ml) zeigte keinerlei Freisetzung irgendeines reduzierenden Zuckers.
Claims (11)
1. Mutanase in Form eines ct-l,3-Glucanase-Präparats, das durch Hydrolyse Mutane mit einem
Gehaltvon mehr als 50% an a-l,3-GIucosid-Bindungen zersetzt, erhältlich durch Kultivierung eines Mutanase-produzierenden Mikroorganismus
auf einem Medium, dessen vorwiegende Kohlenstoffquelle ein aus einem Streptococcus produziertes Mutan ist und in welchem während der
Kultivierung ein pH-Wert zwischen etwa 2 und 9 und eine Temperatur zwischen 10 und 45° C
eingehalten wird, und durch anschließende Gewinnung der erzeugten Mutanase aus der Fermentationslösung.
2. Verfahren zur Herstellung einer Mutanase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Mutan durch Kultivierung des Streptococcusmutans CBS 350.71 hergestellt wird.
3. Verfahren zur Herstellung einer Mutanase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Mutan vor seiner Weiterverwendung oxidiert und reduziert wird, um seine α-1,6-Bindungen zu
zerstören.
4. Verfahren zur Herstellung einer Mutanase gemäß Anspruch 1, insbesondere nach einem oder
beiden der vorhergehenden Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Mutanase-produzierender Mikroorganismus ein Stamm von Trichoderma harzianum, Penicillium lilacinum, Peni-.rillium funiculosum, Penicillium melinii und
Penicillium janthinellum eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Stämme Trichoderma harzianum CBS 243.71 oder Penicillium lilacinum
CBS 595.71 oder Penicillium lilacinum NRRL896
oder Penicillium funiculosum NRRL 1931 eingesetzt werden.
6. Oral applizicrbarcs Präparat zur Zersetzung
von Mutan, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Mutanase gemäß Anspruch 1.
7. Extraoral applizierbares Präparat zur Zersetzung von Mutan, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Mutanase gemäß Anspruch 1.
8. Präparat nach Anspruch 6 zur Behandlung von Zahnbelag oder Gebissen, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat zwischen 0,02 und 1 (X)O
Mutanase-Einheiten pro Gramm enthält.
9. Präparat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutanase in einer Zahnpaste,
einem Mundwasser, einem Mundspray oder einem verzehrbaren Produkt, vorzugsweise in einem
Schokoladcpräparat oder einem Getränk, enthalten ist.
10. Präparat nach Anspruchs, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutanase in einem festen
Stück, vorzugsweise in einer Tablette, einem Karamel oder einem Toffeestück, enthalten ist, das
in der Mundhöhle haftet.
11. Präparat nach Anspruchs, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutanase in einem Kaugummi, in Drops oder in Pastillen enthalten ist.
ΙΊ
Die Bildung von Zahnstein »teilt eine Erscheinung
dar, welche die Gesundheit der Zähne beeinträchtigt. Um die Gesundheit der Zähne zu erhalten, komm
es darauf an, die Zähne vom Zahnsteinbelag frei zu halten. Gebildeter Zahnstein muß also entfernt Würden. Bei der zahnärztlichen Untersuchung wird dies
üblicherweise durch Abkratzen des Zahnbelags van den Zähnen bewerkstelligt.
Es wurden aber auch bereits umfangreichere L ntersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, die Entstehung von Zahnstein von vornherein zu verhindern.
Hierfür war es zunächst erforderlich, die chemische Natur des Zahnbelags aufzuklären. Dabei zeigte sich,
daß der Zahnbelag wesentliche Anteile von Polysacchariden enthält. Man nimmt an, daß sie das unlösliche
Skelett oder die Matrix für den Zusammenhalt ces
Zahnbelags bilden. Ihre Entstehung hat man auf bakterielle Vorgänge zurückgeführt, bei denen einige cer
regelmäßig im Zahnbelag vorhandenen Bakterien gewisse dietäre Kohlehydrate in diese Polysaccharide
umwandeln. Hierbei soll der Einwirkung von Streptokokken auf dietäre Sucrose besondere Bedeutung zukommen.
Es ist bekannt, daß eine Reihe von Mikroorganismen Polysaccharide erzeugen. Hierzu gehört auch
Dextran. In der Literatur ist verschiedentlich Zahnstein sogar mit Dextran identifiziert worden. Dies r at
zu Vorschlägen geführt, den Zahnstein an Ort u id Stelle durch eine Behandlung mit Dextranase anzugreifen (GB-PS 202629). In vitro durchgeführte Untersuchungen haben aber gezeigt, daß zwar die löslichen Dextrane sich durch Dextranase abbauen lasst η,
die unlöslichen Polysaccharide jedoch lediglich in einem sehr begrenzten Ausmaß angegriffen werden. Es
konnte jedoch die Synthese eines unlöslichen Polysaccharids in einem System, das einen Polysaccharid erzeugenden Mikroorganismus enthielt, verhindert
werden, wenn Dextranase zugegen war. Bis heute Ii at
sich jedoch die Verwendung von Dextranase für οι al
verabreichbare Präparate zu dem Zweck, gebildeten Zahnstein zu entfernen oder auch nur die Zahnbclagbildung zu reduzieren, als nicht ausreichend wirksam
erwiesen. Die Gründe hierfür dürften in der besonderen chemischen Struktur der Zahnstein in einem wesentlichen Umfang mitbildenden Polysaccharide a\
sehen sein.
Man nimmt an, daß der wesentliche und kriti.se ic
Bestandteil des Zahnsteins aus Polysacchariden mit a-l,3-Glucosid-Bindungen besteht. Diese Polysaccharide sind in Wasser unlöslich. Sie werden au;h
nicht durch Dextranase angegriffen. Ihre Gegenwart im Zahnbelag scheint für die Resistenz des Zahnbelages gegenüber einem Angriff durch Dextranase von
Bedeutung zu sein. Ein solches Polysaccharid-Material, bei dem es sich um ein extrazellularcs Glucan
mit einem Anteil von mehr als 50% an a-1,3-Gluc:>-sid-Bindungcn handelt, ist unter der Bezeichnung
»Mutan« bekannt. Dementsprechend werden clic Eizyme, welche diese Polysaccharide über eine Hydrolyse und Solubilisierung angreifen, als Mutanate
bezeichnet. Lubnruntcrsuchungen über Mutan und
Mutanase sind in dem nachveröffentlichten Aufsatz. »Enzymatic Hydrolysis ami Structure of Water - Insoluble Glucan produced by Glucosyllransfcrascs
from a Strain of Streptococcus Mutans« in HeIv. Odon. Acta, Volume 14, Supplemcntum V, 89-UM;
1970, beschrieben.
Mutanase kann als cine Enzvniklasse aimeselu η
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