DE2246695A1 - Enzympraeparation, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur untersuchung auf cholesterin - Google Patents

Enzympraeparation, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur untersuchung auf cholesterin

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DE2246695A1 DE19722246695 DE2246695A DE2246695A1 DE 2246695 A1 DE2246695 A1 DE 2246695A1 DE 19722246695 DE19722246695 DE 19722246695 DE 2246695 A DE2246695 A DE 2246695A DE 2246695 A1 DE2246695 A1 DE 2246695A1
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Description

DR. M^LER-BORe DlFL-FtJVS. DR.-MAHITZ DIPL.-CHEM. DR. DEUFEL DIPL-ING. FINSTERWALD DIPL.-ING. .GRXMKOW
München,- den Lo/th - Mf 1034
MTIOiTAL EESEAECH DEVELOPHlIiE GOEPOHASflOl" P.O. Box 236, Kingsgate House,- 66/74 Victoria Street London SW1E 6SL / England
Enzympräparation, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Untersuchung auf Cholesterin
Prioritäten» Großbritannien vom 22. 9. 1971 Hr0 44095/71 Großbritannien vom 19. 6» 1972 Ir. 28650/72
Die Erfindung betrifft die Untersuchung auf Cholesterin in Flüssigkeiten und insbesondere in biologischen Flüssigkeiten wie Seren.
Die Untersuchung auf Gesamtcholesterin in seiner Holle als Indikator für Arteriosklerose und beginnende Herzkranzgefäßleiden stellt derzeit etwa 3 % der Gesamtzahl von durchgeführten Untersuchungen in klinisch-chemischen Laboratorien dar» Für Großbritannien bedeutet dies derzeit etwa 1,5 Millionen Cholesterinuntersuchungen pro Jahr.
309 813/112.4
Cholesterin wird häufig nach der Liebermann-Burchard-Reaktion ■bestimmt, welche die Verwendung von stark korrodierenden und viskosen Reagentien mit sich bringt und daher für eine Automatisierung viele Hindernisse bietet. .
Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel zur Cholesterinuntersuchung zu schaffen, welche nicht die Nachteile der Liebermann-Burchard-Beaktion aufweisen and die in einfacher Weise eine Automatisierung ermöglichen·
Viele Arten von Nocardia können Cholesterin metabolisieren und insbesondere wurde von Stadtman et al, J. Biol. Chem. 206 (195^) S, 511 - 523 gefunden, daß eine Mycobacteriumerde befähigt ist,
Ii.
Cholesterin zu Δ -Cholestenon zu oxidieren. Die für diese Reaktion verantwortliche, sogenannte "Cholesterindehydrogenase" kann in zellfreier From mit niedriger Aktivität erhalten werden. Die Herstellung dieser Cholesterindehydrogenase aus Mycobacteriumerde als etwas reinere, lösliche Enzympräparation und die Bestimmung der Aktivität des Enzyms ist von Stadtman in Methods in Enzymology 1. (1955) 1 S. 678 - 681 beschrieben worden, jedoch ist das lösliche Enzym noch von β©· geringer Aktivität und es wurde auch keine wesentliche Reinigung erreicht.
Es wurde nun gefunden, daß zwei als Nocardia-Arten identifizierte Mikroorganismen, welche zur sogenannten Mycobacterium rhodocrous-Gruppe gehören, eine Cholesterinoxidaseaktivität besitzen, d. h. daß sie Cholesterin in Δ -Cholestenon und Wasserstoffperoxid umwandeln, und daß üfciesdie Grundlage für die enzymatische Bestimmung von Cholesterin liefert, welche in einfacher Weise automatisiert werden kann und bei welcher die Schwierigkeiten der Liebermann-Burchard-Reaktion vermieden werden.
Diese zwei Mikroorganismen werden als "rauhe" und "glatte" Stämme bezeichnet und haben die Bezeichnung NCIB 1055^ und NCIB
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der National Collection of Industrial Bacteria, lorry Eesearch Station, Aberdeen erhalten. Die zwei Mikroorganismen wurden ebenfalls beim Agricultural Eesearch Service des United States Department of Agriculture beim AES Culture Collection Investigations Fermentation Laboratory, Peoria, Illinois, U.S.A.
hinterlegt, wo sie die Bezeichnungen HEEL 5635 bzw. HEEL· 5656
erhielten. .
Die vollständigen Einzelheiten der Organismen sind folgende: Eauhe Kolonie UCIB 10554 (HEEL 5635)
Morphologie (Nähragar. 50 0C)
Grampositiv, Koryneorganismen. Kein gut entwickeltes My eel, gedoch rudimentäre Verästelung vorhandene Beim Altern der Kultur erscheinen kokkenähnliche Formen, !ficht frei beweglich.
Morphologie der Kolonie (Hähragar,. 5 2?ap;e« 50 0C) Kreisförmige, flache, vollständig trockene, opake, kremigorange Kolonien. 1,5 - 3 mm Durchmesser.
Hefe-Dextroseagar, 5 Tage« 30 0C
Kreisförmige, hochstehende, ganze j opake, schwachrosa Kolonien· Trockene verkrustete Oberfläche. 1 mm Durchmesser.
Gelatineagar
Unregelmäßxge Koloniekante, hochgestellt, stumpfe, verkrustete Oberfläche, opake, schwachweiße Farbe.
Eigelb-Agarplatten
Unregelmäßige Koloniekante, hochgestellt, akimpe, rauhe Oberfläche, opak, lederfarben.
Eigenschaften in flüssiger Kultur
Weiße Oberflächenhaut, weißer, flockenförmiger Niederschlag, der sich beim Schütteln nicht vollständig dispergiert, keine Trübung.
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Physiologie
Vollständig aerob
Gelatinehydrolyse ♦
Caseinhydrolyse
Stärkehydrolyse -
Kovacsoxidase
Katalase +
Urease +
Vugue-Proskauer (V-P)-Test -
Methylrot
Entaminierung von Phenylalanin -
Hxppurathydrolyse -
Lackmusmilch alkalisch
Anwendung von Verbindungen als einzige Kohlenstoffquellen
Citrat +
Lactat +
Malat +
Succinat +
Kohlehydrate (sauer)
In Peptonwasserzuckern war keine Säure nachweisbar Zucker auf Ammoniumbasis
Fructose +
Glucose +
Saccharose +
Maltose +
Glycerin +
Sorbit +
Trehalose 4-
Raffinose +
Dulcit +
Lactose -
Mannit
Stärke -
Arabinose -
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Glatte Kolonie. NCIB 10555 (KRHL 5636)
!■■aaiBBHMSxsaticBsaiKaiBBseasis = = = =: = =:==:===.· = =
Morphologie (Nähragar, 50 0C)
Grampositiv, Koryreorganismen. Kein gut entwickeltes Mycel, jedoch rudimentäre Verästelung vorhanden. Beim Altern der Kultur erscheinen kokkenähnliche Formen. Nicht frei beweglich.
Morphologie der Kolonie (Nähragar, 5 Tage, 3,0 0C 1 ) Kreisförmige, ganze, konvexe, halbschleimige, opake-kremige, schwachweiße Kolonien, 0,5 - 2 mm Durchmesser.
Hefedextroeeagar, 5 Tage, 30 0C
Konvexe, ganze, glatt scheinende, halbschleimige, blaßrose Kolonien.
Gelatineagar
Konvexe, ganze, glatt scheinende, blaßweiße, opake Kolonien.
Eigelb-Agarplatten
Konvexe, ganze, opake, glatt scheinende Kolonien. Feuchte Oberfläche. 1 - 3 mm Durchmesser.
Eigenschaften in flüssiger Kultur
Weiße Oberflächenhaut, weißer flockenförmiger Niederschlag, der sich beim Schütteln nicht vollständig dispergiert.
Physiologie
vollständig aerob
Gelabinehydrolyse h
Caseinhydrolyse
Sbärkehydrolyse
Kovacsoxidase . '
Katalase - l· ■
Iiidol
1 ü 9 I) 1 3 / I 1 2 k BAD
Voges-Proskauer (V-P)-Test -
Methylrot
Entaminierung von Phenylalanin -
Hippurathydrolyse -
Lackmusmilch. alkalisch
Anwendung von Verbindungen als einzige Kohlenstoffquellen
Citrat +
Lactat +
Malat +
Succinat +
Kohlehydrate (sauer)
In Peptonwasserzuckern war keine Säure nachweisbar Zucker auf Ammoniumbasis
Fructose -
Glucose -
Saccharose -
Maltose +
Glycerin +
Sorbit +
Trehalose
Raffinose +
Dulcit +
Xylose . +
Arabinose +
Mannit
Stärke
Die Erfindung liefert eine Enzympräparation, die aus Nocardia species NGIB 10554 oder NCIB 10555 abstammt, und die eine spezifische Aktivität an Cholesterinoxidase von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff aufweist.
Die Präparation kann in fLüssiger oder in fester Form, ■-,, D-in gefriergetrockneter Ponn vorlLegen. Wenn die Präparation
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BAD ORIGINAL
in fester IPorm vorliegt, muß sie mit einer Pufferlösung in die flüssige Form überführt werden, bevor sie bei einer Untersuchung verwendet werden kann.
Von den zwei Mikroorganismen ist die Nocardia-Art NCIB 10554-(der "rauhe" Stamm) wegen der größeren Fähigkeit der Zellen dieses Stammes, Cholesterin zu Δ -Cholestenon und Wasserstoffperoxid zu oxidieren, bevorzugt.
Die minimale Aktivität der flüssigen Cholesterinoxidasepräparation hängt von der Untersuchungsmethode, bei welcher sie angewandt werden soll, ab. So muß die Aktivität im Fall einer Präparation, welche bei der Untersuchung auf Cholesterin nach der fluorimetrischen Bestimmung des erzeugten Wasserstoffperoxids verwendet werden soll, nur relativ klein sein, wobei eine Aktivität von ■
ist.
von 10" Einheiten/ml der flüssigen Präparation ausreichend
Die Cholesterinuntersuchung kann auch unter Anwendung von nichtfluorimetrischen Methoden zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid, z. B. colorimetrisehen Methoden, oder durch Messung
ix. ,in
der Menge, in welcher Δ -Choiestenon/der Cholesterinoxidasereaktion gebildet oder Sauerstoff verbraucht wird, durchgeführt werden. In diesem Fall sollte die Aktivität der Cholesterinoxidase in der flüssigen Präparation wenigstens 10 Einheiten/ml betragen.
Insbesondere bei der Anwendung bei einer automatisierten Analyse wird es vorgezogen, daß die Enzympräparation eine spezifische Cliolesterinoxidaseaktivität von wenigstens ,1 Einheit pro 50/ug Proteinstickstoff und bei dem Ansetzen in flüssiger Form eine Aktivität von wenigstens 0,5 Einheiten/ml besitzt.
Wenn die Untersuchung von der Feststellung von Wasserstoffperoxid abhängig ist, vermindert das Vorhandensein von Katalase
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in der Enzympräparat ion die Empfindlichkeit der Untersuchung. Im allgemeinen ist eine Katalaseaktivität von weniger als 10 % der Cholesterinoxidaseaktivität, d. h. weniger nie 10 Einheiten Katalaseaktivität pro Einheit der Choleßterinoxidaseaktivität zulässig, vorzugsweise sollte die Präparation jedoch eine Katalaseaktivität von weniger als 1 % der Cholesterinoxidaeeaktivität besitzen, d. h. weniger als 10 Iiiih#it#ii Katalaseaktivität pro Einheit Cholesterinoxidaseaktivität*
Sie Katalaseaktivität der Enzympräparation hängt von der Methode ab, nach welcher sie hergestellt wurde, und wenn das im folgen· den beschriebene, bevorzugte Verfahren angewandt wird, enthält die Präparation nur kleine Mengen von Katalase, welche die Empfindlichkeit der Untersuchung nicht schmälern, falls jedoch andere Verfahrensweisen angewandt werden, und die Präparation Katalase enthält, kann diese entweder in der Reinigungsstufe entfernt oder mit einem Katalaseinhibitor wie eines Azid, z.B. Natriumazid, inhibiert werden·
In der Beschreibung ist eine Einheit Cholesterinoxidaseaktivität als die Aktivität definiert, die 1 iiMol (10*6 Mol) Cholesterin zu Δ -Cholestenon und Wasserstoffperoxid pro Minute 'bei 30 0C und einem pH-Wert von 7 oxidiert. Eine Einheit Katalaseaktivität ist als die Aktivität definiert, die 1/uMol Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff pro Minute bei 25 °C und eine« pH-Wert von 7 umwandelt.
Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Enzympräparationen hergestellt, indem Nocardia species ICIB 1055* Uü4 NCIB 10555 gezüchtet werden und hieraus eine Enzympräparation gewonnen wird, die eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff besitzt.
Die Herstellung der Enzympräparation kann im allgemeinen die folgenden Stufen umfassen»
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(1) Wachsenlassen des Organismus und Ernte der Zellenj
(2) Extraktion der Cholesterinoxidaseaktivität aus, den Zellen} und
(3) Reinigung und Konzentration der Präparation mit Cholesterinoxidaseafctivität.
Der Mikroorganismus kann auf einem beliebigen, geeigneten Medium gezüchtet und die Zellen geerntet werden. Vorzugsweise wird der Organismus in einem Kulturmedium gezüchtet, welches Glycerin als eine Kohlenstoffquelle umfaßt. Ein Beispiel eines geeigneten Mediums ist:
0,2
CaOl2.2H2O 0,001
O 0,001
0,2
MgSO4.7H2O 0,02
Glycerin 0,5
Hefeextrakt 2,0
Um die Ausfällung von gering löslichen Salzen zu vermeiden, werden die oben angegebenen Bestandteile getrennt aufgelöst und dann zu einem geeignet großen Volumen von destilliertem Wasser in der gezeigten Reihenfolge hinzugegeben. Bas Medium wird dann auf das gewünschte Volumen aufgefüllt. Die bevorzugte Inkubationstemperatur beträgt etwa 29 0O» und der optimale pH-Wert liegt zwischen 6,0 und 7»6. Vorzugsweise wird der pH-Wert auf etwa pH « 6,7 eingeregelt.
Gesteigerte Ausbeuten an Zellen können durch Belüftung und Inbewegunghalten erhalten werden, jedoch besitzt die Kultur die Neigung zum Schäumen und hohe Raten einer Luftströmung und eines Rührens können im allgemeinen wegen eines übermäßigen
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Schäumens nicht angewandt werden. Eine Luftströmungsrate von 0,2 V/V/min und eine fiührergeschwindigkeit von 760 Upm ergaben ein rasches Wachstum ohne übermäßiges Schäumen. lerner wird bevorzugt ein Antischaummittel wie Polypropylenglykol zur Steuerung des Schäumens angewandt.
Falls die Anfangsimpfung des Mikroorganismus in das Kulturmedium gering ist, kann eine Verzögerungsphase von bis zu 16 Stunden auftreten. Die Verzögerungsphase ist eine Funktion der Größe der eingeimpften Menge und es wird keine Verzögerung erhalten, falls eine Impfungsmenge von mehr als 2 %, bezogen auf das Zellengewicht am Schluß, verwendet wird.
Die erforderliche Gesamtinkubationszeit beträgt allgemein etwa 18 bis 24 Stunden. Unter optimalen Bedingungen beträgt die Verdoppelungszeit der Kultur etwa 2 Stunden und eine Zellenernte am Schluß von wenigstens 25 g (Naßgewicht) pro 1 der Zellen (5 g Trockengewicht) kann erhalten werden. Die Kultur kann in einem kleinen Umfang in 5 1 oder 10 1 Behältern durchgeführt werden, jedoch wurden auch ausgezeichnete Ergebnisse bei größeren Ansätzen in 100 1 und 1000 1 Behältern erhalten, wobei im letzteren Fall ein 500 1 Ansatz verwendet wurde.
Die Erzeugung von Cholesterinoxidase ist mit einer Verzögerung hinter dem Zellenwachstum verbunden. Der Enzympegel steigt für wenigstens 2 Stunden nach dem Aufhören des Wachstums der Zellen noch weiter an. Obwohl das Enzymphblesterinoxidase bei Abwesenheit eines Induktionsmittels erzeugt wird, kann die Enzymausbeute durch Induktion mit Cholesterin erhöht werden. Kleine Mengen Cholesterin können zu der Kultur als gesättigte Lösung in Aceton zugesetzt werden, bei größeren Mengen wird Cholesterin jedoch bevorzugt als Aufschlämmung in Wasser und
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einem Netzmittel, z.'B. Polyoxyätnylenderivaten von Sorbitanhydriden, die teilweise mit Fettsäure verestert sind (Tween 80) hergestellt, und die .erhaltene Aufschlämmung wird zum Aufbrechen der Cholesterinteilchen zu einer feinen Suspension vor der Zugabe zu der Kultur mit Schall behandelt.
Als Beispiele für die Wirkung des Induktionsmittels sei angeführt, daß 0,2 g/l Cholesterin, welche bei einer Zellkonsentration von 5 g (Naßgewicht)/l zugegeben wurden, eine Steigerung der Enzymproduktion bei dem "rauhen" Stamm NCIB 10 554- in der Größenordnung vom 4-fachen und 1,5 g/l Cholesterin, bei derselben Zellkonzentration zugegeben, eine Steigerung der Enzymproduktion in der Größenordnung vom 30-faehen ergaben.
Die Zellen können durch Zentrifugieren geerntet, d. h. gewonnen werden. Es kann gezeigt werden, daß die Zellen in dieser Stufe selbst eine Cholesterinoxidaseaktivität mit einer typischen, spezifischen Aktivität der Zellen des "rauhen" Stammes von etwa 0,5/^Mol/mg/Stunde besitzen«
Die Cholesterinoxidaseaktivität kann durch Aufbrechen der Zellen und anschließendes Entfernen der Zellbruchstücke extrahiert werden. Elektronenmikroskopisch wurde gezeigt, daß die beim Mahlen und bei der Beschallung ausgeübten Kräfte ein Zerbrechen ohne sekundäre Beschädigung der Zellwand hervorbringen. Bei den Aufbrecharbeitsweisen, welche eine wirksamere Freisetzung der Cholesterinoxidaseaktivität ergeben, tritt eine geringe Bruchstückbildung auf, jedoch ist die Beschädigung der Zellwand sehr stark. Das Leistungsvermögen einer Anzahl von Arbeitsweisen zum Zerbrechen der Zellen ist im folgenden aufgeführt:
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Methode % Gesamtaktivität
des gewonnen im gewonnen als 18*·*
Aufbrechens Homogenat liches Enzym
Vermählen mit Trockeneis 95 % 8,0 #
Ultraschall 28 % 7,0 %
Aceton-Pulver 52 % 12,5 %
Mickle-Apparatur 33 % 22,0 %
LKB X-Presse 95 % 65,0 %
Die bevorzugte Methode sum Zerbrechen der Zellen besteht in der Anwendung einer X-Presse.
Obwohl die Cholesterinoxidaseaktivität durch Zerbrechen der Zellen und Gewinnen des Enzyms in einer zellfreien, überstehenden Flüssigkeit gewonnen werden kann, wurde gefunden, daß da· Enzym ohne Zerbrechen der Zellen extrahiert werden kann. Is gibt in der Tat Anzeichen, daß sich die GholesterinoxLdase auf der Oberfläche des Organismus befindet, und es wurde gefunden, IaB sie mit guter Ausbeute der Aktivität unter Verwendung eine* grenzflächenaktiven Mittels gewonnen werden kann. Nicht ionische, grenzflächenaktive Mittel haben sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, und sehr gute Ergebnisse wurden mit Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol, welches etwa 10 Hol Ithylenoxid enthält (Warenbezeichnung Triton X-100) erhalten. Im folgenden
ίIgSe s
Booctylphenoxypolyäthoxyäthanol auch mit IOF bezeichnet·
Zur Entfernung der ChoLesterinoxidase werden die Zellen in einer Lösung des grenzflächenaktiven Mittels, welche auf einen geeigneten pH-Wert gepuffert ist, suspendiert,, und die Suspension wird beispielsweise bei Zimmertemperatur heftig gerührt. Die Cholesterinoxidase wird in der überstehenden flüssigkeit durch Entfernen der Zellen, beispielsweise durch Zentrifugieren, gewonnen. Da die Zellen bei diesem Verfahren nicht «erbrochen
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werden, ist die Freisetzung von Protein niedrig, z. B. etwa 100/ug/ml.
Bei Versuchen zur Extraktion mit IOP wurden 5,6 (Naßgewicht) Zellen des "rauhen" Stammes in 4-5 ml 0,5M Tris/jHCl-Puffer "bei einem pH von 8,0 suspendiert, der Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol in Konzentrationen von 1 %, 3 % und 5 % enthielt. Die Suspension wurde heftig bei Zimmertemperatur gerührt und es wurden gleiche Anteile von 10 ml in Zeitabschnitten von 15 Minut.en entnommen. Nach dem Entnehmen eines "jeden Anteiles wurde sofort mit 3500 Upm in einer Zentrifuge (Histral 6L-Zentrifuge) zentrifugiert. Die Extrakte wurden dann auf die Cholesterinoxidaseaktivität untersucht, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden.
*) Iris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Tabelle I
Extraktionszeit yug Cholesterin % gewonnenes Produkt (min) - oxidiert/50,yül/15 min in der überstehenden
/ Flüssigkeit
1 % IOP (Triton 2-100)
15 30,0 56,0
30 . 35,0 65,5
4-5 35,0 ' 65,5
60 - 37,5 70,0
120 36,5 68,3
ganze Zellen 53,5 -
3 % IOP (Triton X-100) . ■>' "
15 36,0 68,5
30 35,5 ' 67,5
45 38,5 73,5
• 60 ,. 38,5 73,5
120 4-1,0 78,0
ganze Zellen 52,5 -
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Fortsetzung Tabelle I
Extraktionszeit /ug Cholesterin % gewonnenes Produkt
(min) oxidiert/50 Ail/15 min in der überstehenden
_J_ Flüssigkeit
5 % IOP (Triton X-100)
15 34,0 62,5
30 37,5 69,0
45 38,5 71,0
60 38,0 70,0
120 41,0 75,0
ganze Zellen 54-, 5
Dies bedeutet, daß 70 % der Aktivität der ganzen Zellen bei 1 % IOP und bis zu 78 % bei 3 % IOP gewonnen werden können. Bas grenzflächenaktive Mittel bleibt jedoch in der Choleeterinoxidaselösung zurück. Bei der im folgenden beschriebenen Untersuchungsmethode hat sich herausgestellt, daß die Anwesenheit von iBooctylphenoxypolyäthoxyäthanol (Warenbezeichnung Triton X-100) vorteilhaft sein kann, daß die optimale Konaentration in dem Untersuchungsgemisch jedoch 0,25 % beträgt, wobei höhere Konzentrationen hemmend wirken. Sie Enzympräparation sollte daher keinen höheren Gehalt an grenzflächenaktivem Mittel besitzen als einem annehmbaren Gehalt in dem Untersuchungsgemisch entspricht. Obwohl daher die beste Freisetzung bzw. Entfernung von Enzym bei 3 % IOP (Trition X-100) erzielt werden kann, ist es besonders bevorzugt, bei einer niedrigeren Konzentration zu arbeiten, z. B. mit 1 % IOP. Es kann jedoch erforderlich sein, das grenzflächenaktive Mittel zu entfernen, z. B. mittels Dialyse, oder Gelfiltration, oder alternativ durch Ausfällen des Proteins (Enzyms) aus der Lösung des grenzflächenaktiven Mittels.
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Obwohl die durch Extraktion der Zellen mit einem grenzflächenaktiven Mittel hergestellte Cholesterinoxidasepräparation in einigen Fällen eine spezifische Aktivität und eine Wirkung haben kann, die zur Durchführung der Untersuchung ausreichend ist, ist es in den meisten lallen erforderlich, den Extrakt zu reinigen und zu konzentrieren, bevor er praktisch bei einer ChoIesterinuntersuchung angewandt werden kann. Im Falle einer fluorimetrisehen Bestimmung von Wasserstoffperoxid sollte die
•-2 Enzympräparation eine Wirkung von wenigstens 10 Einheiten/ml besitzen, um ein Ergebnis in einer für die praktische Anwendung ausreichend kurzen Zeitspanne für einen Versuch zu liefern und insbesondere sollte die Präparation, wenn die Analyse automatisch durchgeführt wird, eine Wirkung bzw. Aktivität von wenigstens 10 und vorzugsweise 0,5 Einheiten/ml besitzen.
Im lalle der nicht fluorimetri sehen Untersuchung sollte die Präparation eine Wirkung bzw. Aktivität von wenigstens 10 Einheiten/ml und für eine automatisierte Analyse von wenigstens 0,5 Einheiten/ml besitzen. Die Präparation kann mit einer höheren Aktivität, z. B. 5 Einheiten/ml oder mehr, hergestellt werden, jedoch wird bei höheren Werten der Aktivität bzw. Wirkung im allgemeinen mit einem Puffer vor der Verwendung in einem Test verdünnt.
In allen lallen muß die Präparation eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens-1 Einheit pro 5 nag Proteinstickstoff aufweisen. Bei höheren Werten von Proteinstickstoff kann die vorhandene Proteinmenge die Untersuchungslösung zu viskos machen oder bei der Untersuchung stören. Eine spezifische Aktivität von wenigstens 1 Einheit pro 50yug Proteinstickstoff ist bevorzugt. Als besonders vorteilhafte Enzympräparation hat sich eine wäßrige Präparation mit einer spezifischen Aktivität von 1 Einheit Cholesterinoxidaseaktivität pro 28yug Proteinstickstoff , einer Wirkung von 5 Einheiten/ml, welche 3 °/o ψ V IOP
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(Triton X-100) enthält, herausgestellt. Diese Präparation kann zur Verwendung in einer Untersuchung beispielsweise mit 0,01M Phosphatpuffer verdünnt werden, so daß sie fix ein· automatisierte Analyse 0,5 Einheiten/ml oder für aiii· manuelle Analyse 0,1 Einheiten/ml enthält.
Die Cholesterinoxidaaeaktivität aufweisende Enzympräparation muß nicht in wäßriger Torrn vorliegen, und sie kann beispielsweise in form eine» gefriergetrockneten Pulvers vorliegen· Zusätzlich zu der Präparation eines löslichen, lyophilieierten Pulvere kann das Enzym in einer konzentrierten, gepufferten Lösung oder in Suspension mit Ammoniumsulfat mit oder ohne zugesetztem Puffer vorliegen·
Obwohl mit der Cholesterinozidase sehr wenig Protein extrahiert wird, ist im allgemeinen in dem Extrakt mit dem grenzflächenaktiven Mittel eine gewisse Katalaseaktivität vorhanden. Der Betrag der Katalaseaktivität, der in der fertigen Enzympräparation toleriert werden kann, hängt von der zu verwendenden Untersuchungsmethode ab, wobei die Katalaseaktivität der Präparation wichtig ist, wenn die Untersuchung eine Messung der erzeugten HoOg-Henge umfaßt. Wie im folgenden noch mehr ins einzelne gehend beschrieben wird, verwenden einige Untersuchungsmethode, bei den/HoOp bestimmt wird, die Verwendung von Peroxidase, und es ist in einigen Fällen möglich, begrenzt· Katalasemengen mit Peroxidase auszuschalten. Zusätzlich ist es möglich, eine beliebige Konzentration an Katalaee, welche wahrscheinlich in dem Extrakt mit dem grenzflächenaktiven Mittel gefunden werden kann, mit einem Inhibitor zu hemmen, z. B. mit latriumazid.
Die Wirkung dor Iiatalase auf die Empfindlichkeit bei einer Untersuchung kanu wie folgt gezeigt werden.
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224669
Es wurde eine Katalaselösung hergestellt, indem 20 ill einer kristallinen Suspension von Katalase in 50 ml 0,05M PÜosphatpuffer von pH »7,0 aufgelöst wurden.
Es wurde gefunden, daß 0,5 ml dieser Katalaselösung 7,04/jM HgOg bei einem letztlichen Volumen von 2,5 ml in 2,0 Minuten zersetzten. Hieraus läßt sich errechnen, daß die Katalaseaktivität der Lösung 7»04 Einheiten pro ml bei einem pH von 7,0 und 25 0C betrug.
Unterschiedliche Mengen dieser Katalaselösung wurden in ein Cholesterinuntersuchungssystem eingegeben, welches 0,5 Einheiten Cholesterinoxidase in 2,0 ml enthielt, und die Verminderung der Empfindlichkeit der Untersuchung beobachtet. Die Ergebnisse waren die folgenden;
zugesetzte Katalaseeinheiten % Verminderung der
Empfindlichkeit
0,704 95
0,352 66,4
0,074 34,3
Die Zugabe von 0,1 % Natriumazid zu dem Reaktionsgemisch hemmte jedoch vollständig selbst die höchsten Gehalte von Katalase, wodurch eine 100 #ige Empfindlichkeit selbst bei Anwesenheit von Katalase erzielt wurde.
Im allgemeinen sollte die Katalase jedoch aus der Präparation entfernt oder zumindest in starkem Maße reduziert werden, beispielsweise mittels Chromatographie auf DEAE-Cellulose.
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Geeignete Arbeiteweisen zur Reinigung der mittels Extraktion mit grenzflächenaktivem Mittel erhaltenen Enzympräparation und zur eventuellen Katalaseentfernung umfassen die Ausfällung mit Ammoniumsulfat und/oder Chromatograph!sehe Methoden und/oder Eindampfen unter vermindertem Druck. Beispielsweise kann die Präparation durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat oder Polyäthylenglykol konzentriert, auf einer Säule eines dreidimensional vernetzten Polysaccharide (Warenbezeichnung Sephadex) entsalzt und dann einer Ionenaustauscherchromatographie unterworfen werden. In dieser Stufe kann es erforderlich sein, die Aktivität der Präparation um etwa das 15- "bis 40-fache anzuheften·
Die Konzentrierung und Reinigung kann beispielsweise durch Substrataffinität-Chromatographie durchgeführt werden. Durch Hydroxypropylierung von G-25 hergestelltes dreidimensional vernetzes Polysaccharid (Sephadex LH-20) besitzt sowohl hydrophile als auch lipophile Eigenschaften und kann in polaren, organischen Lösungsmitteln, Wasser, oder Gemischen hiervon gequellt werden. Das dreidimensional vernetze Polysaccharid LH-20 kann in mit Cholesterin gesättigtem (z. B. etwa 4,0 g %) Äthanol gequollen werden, und eine Säule kann mit auf diese Weise präparierten LH-20 gefüllt werden. Durch Waschen der Säule mit destilliertem Wasser kann das Cholesterin gleichförmig in dem Gel verteilt werden, und die Säule kann, schließlich mit 0,05M Kaliumphosphatpuffer bei pH « 7»5 ins Gleichgewicht gesetzt werden. Eine wesentliche Reinigung der Enzympräparation kann unter Verwendung einer solchen Säule erzielt werden.
Vorzugsweise wird die Enzympräparation zuerst einer Ionenaustauscher-Chromatographie oder einer Substrataffinität-Chromatographie, vorzugsweise einer Chromatographie mit Hilfe von DEAE-Cellulose (schwach basische Anionenaustauscher mit Diäthylaminoäthyl als funktioneller Gruppe eines dreidimensional vernetzten
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Polysaccharids) unterworfen werden und dann weiter durch Ultrafiltration oder Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert werden.
Die Erfindung liefert ebenfalls Verfahren zur Untersuchung auf Cholesterin in einer Flüssigkeit, insbesondere einer biologischen Flüssigkeit wie einem Serum oder einem Plasma. Die beschriebenen Untersuchungsmethoden sind jedoch nicht auf biologische Flüssigkeiten beschränkt und sie können ganz allgemein zur Bestimmung der Cholesterinmenge verwendet werden, die in einem beliebigen technischen Produkt oder Lebensmitteiprodukt oder bei einem beliebigen, technischen Verfahren vorliegt, bei welchem die Cholesterinuntersuchung erforderlich oder wünschenswert ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Cholesterinestimmung in einer Flüssigkeit zeichnet sich dadurch aus, daß die Flüssigkeit mit einer Enzympräparation inkubiert wird, welche Cholesterin
a Ii kann
zu Δ -Cholestenon und Wasserstoffperoxid oxidieren/und die vorhandene Cholesterinmenge durch Messung der erzeugten Wasserstoffperoxidmenge bestimmen wird.
Die Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Cholesterinbestimmung in einer Flüssigkeit, das sich dadurch auszeichnet, daß die Flüssigkeit mit einer flüssigen Enzympräparation, welche von Nocardia species NCIB 10554- oder KCIB 10555 abstammt, inkubiert wird, wobei die Enzympräparation eine Cholesterinoxidaseaktivität aufweist, und wobei die Menge bestimmt wird, in der eines der Produkte der Cholesterinoxidasereaktion gebildet wird, oder die Menge, in der Sauerstoff bei der Cholesterinoxidasereaktion verbraucht wird.
Das erfindungßgemäße Verfahren kann zur Untersuchung (Ie;:. freien Chclejrterins oder des Gesaintcholesterins im ßcruiü verwendet
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BAD ORiGINAL
werden. Cholesterin liegt natürlich niemale frei im eigentlichen Sinne im Plasma vor, da es immer mit Phospholipidtn, Proteinen und Triglyceriden in löslichem Lipoproteinkomplexen gebunden ist. Das Einbringen eines grenzflächenaktiven Mittels in das Untersuchungsgemisch bewirkt jedoch die Auflösung dieser Komplexe unter sanften Bedingungen, wodurch es möglich ist, das gesamte freie Cholesterin enzymatisch zu oxidieren. Die Abschätzung des freien Cholesterin· kann für Reihenuntersuchungen vorteilhaft sein und die Notwendigkeit zur Messung des Gesamtcholesterins vermeiden.
Cholesterin tritt ebenfalle im Serum in form von Estern auf, und falls das Gesamtcholesterin untersucht werden soll, muß das auf diese Weise gebundene Cholesterin zuerst in eine Form, in welcher es durch Cholesterinoxidase angegriffen werden kann, durch Verseifung der Ester überführt werden, z. B. durch Reaktion mit Alkoholischem Kaliumhydroxid. Die Reaktion mit 1,ON KOH bei 75 0C ergibt eine rasche Verseifung ohne Koagulierung von Protein.
Zur Durchführung der Untersuchung wird die wahlweise verBöift;e Flüssigkeit dann mit Cholesterinoxidase inkubiert und die Reaktion
Cholesterinoxidaee
Cholesterin ♦ O2 ' Chole»t-4-«ti-3-on ♦ Ho^2
wird vorzugsweise zum Abschluß gebracht. Die vorhandene Cholesterinmenge wird durch Messung der Sauerstoffaufnahm« oder durch Messung der Menge, in der wenigstens eines der Produkte gebildet wird, bestimmt. Unter geeigneten, standardisierten Bedingungen iet es möglich, die vorhanden* Cholesterin- ' menge aus der Menge eines gebildeten Produkte« odtr der Menge
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von verbrauchtem Sauerstoff in einer vorgegebenen Zeit zu "bestimmen, selbst wenn, die Reaktion nicht bis zu ihren Abschluß ablaufen gelassen wurde.
Bei einem bevorzugten Verfahren wird das erzeugte Wasserstoffperoxid mittels vierwertigem Titan und XyIenol-orange gemessen, welche unter Bildung einer stabilen, roten Färbung mit Wasserstoffperoxid reagieren, siehe Taurnes und Nordschow, Amer. .J. Clin. Path. 4£ (1968), S. 613. Die erzeugte Wasserstoffperoxidmenge wird über die Intensität der färbung gemessen.
Bei einer weiteren bevorzugten Methode wird die vorhandene Cholesterinmenge durch Messung der erzeugten Wasserstoffperoxidmenge mit Hilfe der Reaktion mit 4-Aminophenazon in Anwesenheit von überschüssigem Phenol und Peroxidase gemessen, diese Reaktion läuft wie folgt ab:
OH
HxC-N^ C-O
H_C-C
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Daher wird der vorzugsweise verseifte Extrakt mit Cholesterinoxidase in Anwesenheit von Peroxidase, 4-Aminoph.enazon und Phenol umgesetzt, und die optische Dichte wird bei 510 run gemessen. Es kann gezeigt werden, daß eine lineare Besiehung zwischen dem Wert Δ OD (Differenz der optischen Dichte) zwischen einer Testlösung und einer Kontroilösung, die kein Cholesterin enthält, und der Menge an erzeugtem Cholestenon besteht. Cholest er inoxidase, Peroxidase, 4-Aminophenazon und Phenol können zu einem einzigen Reagens zusammengegeben und in dieser Form angewandt werden.
Bei einer typischen Untersuchungsmethode gemäß diesem Verfahren können 0,1 ml Serum zu 1,0 ml alkoholischer EOH (1N) hinzugegeben und 5 Minuten bei 75 0C inkubiert werden. 0,1 ml des verseiften Extraktes können dann zu 2,5 ml eines Reagens aus Cholesterinoxidase/Peroxidase/4—Aminophenazon/Phenol gegeben werden und das Gemisch bei 30 bis 3? 0C während 5 Minuten inkubiert und dann die Färbung bei 510 nm abgelesen werden.
Bei diesem Test kann eine 0,1 %ige Cholesterinlösung bei der Zugabe zu dem Enzymreagens eine Trübung erzeugen, die eine optische Dichte von 0,05 ergibt. Eine 0,1 %ige Lösung von Cholestenon, die in derselben Weise behandelt wurde, kann ebenfalls eine Trübung erzeugen, die eine optische Dichte von etwa 0,08 ergibt. Diese Bedingungen würden Jedoch nur in einem extrem anormalen Serum auftreten, welches 1 000 mg % Cholesterin enthält, Jedoch verhindert die Anwesenheit eines grenzflächenaktiven Mittels wie beispielsweise von 0,1 % IOP (Triton X-100) in dem Enzymreagens diese Trübung, d. h. weder das Substrat noch das Produkt bilden während der Reaktion eine kolloidale Suspension, welche die spektrophotometrische Messung stören würde.
Eine beliebige andere, geeignete Reaktion von Wasserstoffperoxid kann zur Messung der erzeugten Menge und damit zur Cholesterinmenge
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in dem Serum herangezogen werden. Beispiele solcher Reaktionen sind unter Angabe der sie näher "beschreibenden Literaturstellen im folgenden aufgeführt:
1) 2,6-Dichlorphenolindophenol kann als Sauerstoffakzeptor anstelle von 4-Aminophenazon in einer gekoppelten Peroxidasereaktion verwendet werden, siehe Clark und Timms, Proc. Assoc. Clin. Biöchem; jj, (1968), S. 61·,
2)Wasserstoffperoxid kann mit Gujakharz in Anwesenheit von Peroxidase unter Bildung eines blauen Produktes umgesetzt werden, siehe Morley, Dawson und Marks, Proc· Assoc· Clin. Biochem. £, (1968), S» 42|
3) Aus Kaliumiodid wird Jod bei der Reaktion mit Wasserstoffperoxid freigesetzt, und das freigesetzte Jod kann dann unter Bildung einer rosa Färbung mit Diäthyl-p-phenylendiämin umgesetzt werden, siehe Thompson, Clin. Chim. Acta. 25, (1969), S.
4) Aus Jodid wird Jod bei der Reaktion mit Wasserstoffperoxid freigesetzt, und Polyvinylpyrrolidin wird zur Verschiebung der Absorption von Jod aus dem nahen UV in das Sichtbare verwendet, wobei die Absorption bei 4?0 nm abgelesen werden kann, siehe Wate und Marbach, Clin. Chem. 14, (1968), S. 548j
5) Unter der Einwirkung von Peroxidase oxidiert Wasserstoffperoxid Homovanillinsäure zu einem stark fluoreszierenden Produkt in alkalischer Lösung, wobei Protein diese Reaktion bei einer 40-fachen Verdünnung des Plasmas nicht stört. Das Produkt kann fluorometrisch ausgemessen werden, siehe Phillips und Elevitch, Amer. J. Clin. Path. -4^, (1968), S. 622;
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6) Wasserstoffperoxid reagiert mit Jod in Anwesenheit eines Holybdän(IV)-katalysators. Falls ein bekannter Überschuß von Thiosulfat zur Heduktion des Jods beiseiner Entstehung verwendet wird, kann das restliche Thiosulfat mit Jod colorimetrisch titriert werden, siehe Simon, Christian und Purdy, Clin, Chem. 14., (1968), S. 463.
Obwohl die Messung des erzeugten Wasserstoffperoxids die bevorzugte Methode zur Bestimmung der in der zu untersuchenden, biologischen Flüssigkeit vorhandenen Cholesterinmenge ist, ist es auch möglich, andere Arbeitsweisen zur Erhaltung des gewünschten Untersuchungsergebnisses anzuwenden. Beispielsweise kann die Sauerstoffaufnahme bei der Cholesterinoxidasereaktion gemessen werden, wobei eine Sauerstoffelektrode entsprechend der von Updike und Hicks in Nature, Lond. 214, (1967), S. 986 und Makin und Warren in Clin. Chim. Acta. 29« (1970), S. 493 beschriebenen Arbeitsweise verwendet wird.
« 4
Alternativ kann dae Oxidationsprodukt, /\ -Cholestenon, gemessen werden, beispielsweise in Form des 2,4-Diphenylhydrazons oder Isonicotinsäurehydrazons, oder als ein ausreichend reines Enzym in einer Konzentration verwendet wird, das eine niedrige Absorption bei 240 nm aufweist, oder falle das Enzym unschädlich gemacht wird, kann das Cholesterin durch die Zunahme der Absorption bei 240 nm aufgrund des bei der enzymatischen Oxidation g ebildeten Δ -Cholestenons bestimmt werden.
Wie zuror beschrieben, kann die Cholesterinuntersuchung entweder automatisch durchgeführt werden, falls eine große Anzahl von Untersuchungen aufeinanderfolgend durchgeführt werden müssen, oder es kann eine kleine Anzahl von Proben einzeln analysiert werden. Die für die Untersuchung erforderlichen Beagentien hängen von der besonderen Arbeitsweise ab, wenn jedoch eine H2O2-Bestimmung als Grundlage für die Untersuchung verwendet
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wird, umfassen die Heagentien im allgemeinen 1) die Cholesterinoxidasepräparation und 2) ein anderes oder mehrere andere Reagentien, welche zur Bestimmung der erzeugten HpOp-Menge erforderlich sind. Einige der anderen Reagentien können mit der Cholesterinoxidase verträglich sein und sie können zu der Enzympräparation zugegeben werden, um ein Kombinationsreagens zu erhalten. Im Falle von Untersuchungsmethoden, welche die Anwesenheit von Peroxidase erfordern, kann diese mit der Cholesterinoxidase zur Bildung einer kombinierten, flüssigen oder gefriergetrockneten Enzympräparation vereinigt werden. Im Falle einer gefriergetrockneten Präparation wird diese vor der Anwendung durch Zugabe eines Puffers in gebrauchsfähige Form überführt. In allen Fällen werden die Reagentien im allgemeinen in konzentrierter Form angeliefert und urimittelbar vor der Anwendung verdünnt. Ein Reagens wie alkoholisches Kaliumhydroxid zur Verseifung der biologischen Flüssigkeit ist ebenfalls erforderlich, wenn das Gesamtcholesterin gemessen werden soll, dieses wird im allgemeinen Jedoch von dem Benutzer angeliefert, ebenso wie der Puffer und die anderen zur Verdiinnung erforderlichen Reagentien.
Für eine automatisierte Analyse wird die Cholesberinoxidasepräparation entweder in konzentrierter oder gefriergetrockneter Form angeliefert, welche vor der Anwendung verdünnt oder gebrauchsfähig gemacht werden muß. Falls es die Analyse erfordert, kann die Präparation ebenfalls Peroxidase enthalten. Die anderen Reagentien werden im allgemeinen vom Benutzer bereitgestellt.
Bei der Durchführung individueller Untersuchungen, können Reagentiensätze angeliefert werden.
Die Erfindung liefert daher ebenfalls eine Ausstattung, um die Choleoterlnmenge in einer Flüssigkeit zu untersuchen, welche umfaßt!
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1) eine Enzympräparation, die von Nocardia species NCIB 10554 oder NCIB 10555 abstammt und die eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff enthält und
2) wenigstens ein Reagens, welches bei der Bestimmung der Menge angewandt werden kann, in welcher ein Produkt bei der Cholesterinoxidasereaktion gebildet wird.
Die Komponente 1) besteht daher aus der Enzympräparation, im allgemeinen in einer konzentrierteren Form als sie bei dem Test erforderlich ist, die von dem Benutzer mit einem Puffer verdünnt werden muß. Die Enzympräparation kann in gefriergetrockneter oder in konzentrierter, flüssiger Form vorliegen. Die Enzympräparation kann Peroxidase, falls dies für den Test erforderlich ist, oder ein beliebiges, anderes Reagens, welches bei der Durchführung der Untersuchung erforderlich ist, und mit Cholesterinoxidase verträglich ist, enthalten.
Die Ausrüstung enthält natürlich jede der Komponenten in der erforderlichen Menge für die gleiche, definierte Anzahl von Untersuchungen. Beispielsweise kann eine solche Ausrüstung ausreichend Enzym und andere Reagentien für beispielsweise 12 Untersuchungen enthalten. Jedes Reagens kann in einer einzelnen Menge, z. B. in einer Flasche, vorliegen, wobei die erforderliche Menge für einen einzelnen Test aus dieser Einzelmenge entnommen wird.
Alternativ kann die Ausrüstung Einheitsdosen der Enzymkomponente umfassen, wobei jede wenigstens 0,05 Einheiten Cholesterinoxidaseakbivität, d. h. ausreichend für eine einzige Untersuchung, enthält. Beispielsweise können die ELriheitiidosen der Enzympräparat; Lon in gefriergetrockneter oder konzentrierter Form in
ι η ii u ι ι / μ 2 /.
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individuellen Behältern angeliefert werden, wobei sie vor jedem Test mit Puffer in gebrauchsfähige Form überführt werden müssen.
Die Komponente 2) der Ausrüstung ist für gewöhnlich, wenn Wasserstoffperoxid colorimefcrisch bestimmt werden soll, ein Sauerstoffakzeptor wie 4-Aminophenazon und Phenol oder Xylenolorange und vierwertiges Titan. Diese anderen Reagentien können in Flaschen entweder fertig für die Verwendung oder in konzentrierter Form, wobei sie von dem Benutzer verdünnt werden, angeliefert werden.
Im allgemeinen liefert der Benutzer den zur Verdünnung erforderlichen Puffer, das für die Verseifung erforderliche Alkali wenn das Gesamtcholesterin bestimmt werden soll - und alle, anderen, üblichen Reagentien, welche als Lösungsmittel für die Extraktion oder Verdünnung erforderlich sein können. Wenn die Bestimmung auf Gesamtcholesterin durchgeführt werden soll, ist ein saures Reagens, z. B. verdünnte HCl oder HpSCK, zur Neutralisation des für die Verseifung verwendeten Reagens eri'orderlich, und dieses saure Reagens kann in der Ausrüstung enthalten sein. Falls >4 -Cholestenon direkt durch die Carbonylabsorption bestimmt wird und kein Farbreagens vorliegt, kann dieses saure Reagens die einzige andere Komponente der Ausrüstung außer der Enzympräparation sein. Gegebenenfalls kann die Ausrüstung eine oder mehrere Standardcholesterinlösungen zur Standardisierung der Bestimmung enthalten.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1 - Herstellung von Cholesterinoxidase 500 1 eines sterilen Wachstumsiaediums wurden mit 1 1 einer Inpfkultur von Nocardia sp. KCIB 10554- beimpft. Dae Wachstumsmedium sowohl für die Impfkultur als auch die Kultur für die Herstellung bestand aus;
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g/l
^24 2,0
CaCl2.2H2O O4OI
FeSO4.7H2O 0,01
K2KPO4 2,0
MgSO4.7H2O 0,2
Glyzerin 10
Hefeextrakt 20
pH 6,7
Die Kultur wurde 24 Stunden bei 30 0C sich vermehren gelassen« Die Kultur wurde durch einen Rührer in Bewegung gehalten, der mit drei Turbinenimpellern ausgerüstet war und bei 250 Upm lief, wobei sterile Luft durch ein Einleitungsrohr in einer Menge von I50 l/min zugeführt wurde. Das Schäumen wurde durch intermittierende Zugabe von Polypropylenglykolantischaummittel gesteuert. Nach etwa 14 Stunden, sobald die Kultur eine Konzentration von 1 bis 2 g Trockengewicht/l erreicht hatte, wurden 600 g in 2 1 eines Gemisches aus einem grenzflächenaktiven Mittel (Tween 80) und Wasser (0,03 * 1/V/V) suspendiertes Cholesterin zu der Kultur hinzugegeben. Während der Wachstums· phase betrug die maximale Verdopplungszeit des Wachstums etwa 2 Stunden. Nach 24 Stunden, als die Zellkonzentratinn etwa 6 bis 7 g Trockengewicht/l betrug, wurden die Mikroorganismen durch Durchleiten durch eine Scheibenzentrifuge mit intermit* tierender Entleerung bei 400 l/h gesammelt. Alternativ kann natürlich auch ein vorbeschichtetes Vakuumdrehfilter verwendet werden. Die Fermentierungsdauer kann durch Impfen mit einer größeren Menge einer Impfkultur verkürzt werden«
Die geernteten Zellen wurden in 0,01M Kaliumphosphatpuffer, pH m 7,0, der 0,5 % (V/V) IOP (Triton X-100) enthielt, bei 10 0C , so daß ein Endvolumen von 60 1 erhalten wurde, suspendiert. Nach sanftem Rühren während 2 Stunden - wobei kürzere
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Zeiten bei nur geringer Verminderung der Menge von extrahiertem Enzym angewandt werden können, wurden die extrahierten Zellen durch Durchleiten durch eine Röhrenzentrifuge (Modell 6P, Sharpies) entfernt. Die erhaltene, klare, überstehende sigkeit wurde durch eine Säule von 5 1 Fassungsvermögen bei 5 0C durchgeschickt, welche DE-52-Cellulose enthielt, welche zuvor mit O,O1M Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-von 7,0, der 0,5 % IOP (Triton X-100) enthielt, ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Die vorhandene Cholesterinoxidase und irgendwelche vorhandene Katalase wurden von der DE-52-Cellulose zurückgehalten. Die Cholesterinoxidase wurde durch stufenweise EIution mit Kaliumphosphatpuffer von pH ■ 7»0 mit zunehmenden Molgehalten, der 0,5 % IOP (Triton X-100) enthielt, bei 5°C freigesetzt. Irgendwelche, vorhandene Katalase blieb auf der Säule zurück.
Die an Cholesterinoxidase reichen, eluierten Fraktionen wurden durch Ultrafiltration bei 5 0C unter Verwendung einer PM-30-Membran weiter konzentriert. Die erhaltene, zurückbleibende Lösung von 3 1 besaß eine Cholesterinoxidaseaktivität von 5,5/iMol Cholesterin oxidiert/ml/min bei 37 0C. Die gesamte Ausbeute betrug etwa 20 %. Diese kann durch Waschen der verworfenen Feststoffe in der Extraktions-und durch Auffangen einer ■ größeren Fraktion in der Ionenaustauscherstufe erhöht werden. Die Enzymlösung wurde in flüssiger Form bei 5 0C aufbewahrt, wobei Azid als Konservationsmittel hinzugesetzt wurde. Die Lösung behielt ihre Gesamtaktivität praktisch für wenigstens zwei Monate.
Die Enzympräparation besaß eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von etwa 1 Einheit pro 28 ;ug Proteinstickstoff und eine Wirkung von etwa 5 Einheiten/ml. Die Präparation enthielt etwa 3 % V/V IOP (Triton X-100).
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Beispiel 2 - UnterBuchung auf freies Cholesterin in ßerum
Cholesterinoxidase oxidiert Cholesterin zu α -Choleetenon unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid. Das erzeugte Wasserstoffperoxid wird/Xylenol-orange und vierwertigem Titan in ein Chelat überführt. Die Absorption dieses rotgefärbten Komplexes wird bei 550 nm ausgemessen.
1. 0,01M Phosphatpuffer, pH - 7,0, der 0,10 g % Natriumazid enthält.
2. Cholesterinoxidaselösung, 5 E/ml (1 ml oxidiert ψΜ Cholesterin pro Minute bei pH - 7,0 und 30 0C), wiche etwa 3,0 % V/V IOP (Triton X-100) enthält.
3. Arbeits-Enzymlösung - 5 ml Cholesterinoxidaselösung werden zu 45 ml des 0,01M Phosphatpuffers hinzugegeben.
4. Schwefelsäure, 2N - 56 ml konzentrierte Schwefelsäure werden zu destilliertem Wasser hinzugegeben und auf 1 1 verdünnt.
5. Vorratstitanlösung, 0,001M - 0,08 g Titandioxid werden in einen 25 ml Erlenmeyerkolben gegeben und es werden 0,5 g Ammoniumsulfat und 2,5 ml konzentrierte Schwefelsäure hinzugegeben. Dieses Gemisch wird auf einer Heizplatte bis zur Auflösung und zum Farbloswerden der Substanzen erhitzt. Die Lösung wird abgekühlt und auf 1 1 mit destilliertem Wasser aufgefüllt.
6. Vorratslösung von XyIenol-orange 0,001M - 0,76 g Xylenolorange werden in destilliertem Wasser aufgelöst und auf 1 verdünnt. '
7. Kombiniertes Farbreagens - ein Volumenteil der Vorratstitanlösung werden zu 0,5 Volumenteilen der 2N Schwefelsäure gegeben und vermischt. Ein Volumenteil der Vorratsxylenol—orangelösung und 0,5 g Polyoxyäthylenlauryläther (Warenbezeichnung Brij-35)
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werden zu 1 1 des Reagens hinzugegeben·
8. Cholesterinstandardlösungen, welche bis zu 5»0 mM/1 enthielten, wurden durch Auflösen von trockenem, reinem Cholesterin (BDH Biochemical Standard) in Isopropylalkohol hergestellt.
Untersuchungsmethode
100yul Serum oder Standard werden zu 2,0 ml der Arbeits-Enzymlösung hinzugegeben und 5 Minuten bei 37 0C inkubiert. 1,0 ml des kombinierten Farbreagens wird dann hinzugegeben, und das Gemisch wird weitere 5 Minuten bei 37 0C inkubiert.
Blindproben werden hergestellt, indem Serum oder Standard direkt zu einem Gemisch von 2,0 ml Arbeits-Ehzymlösung und 1,0 ml kombiniertem Farbreagens hinzugesetzt werden.
Die optische Dichte der Testlösung wird gegen ihre Blindwerte bei 550 nm abgelesen.
Beispiel 3 - Untersuchung; auf Gesamtcholesterin in Serum Prinzig
Aus Lipoproteinkomplexen wird Cholesterin freigesetzt und von seinen Estern durch alkalische Hydrolyse hydrolysiert. Im An-Schluß an die Neutralisation des Hydrolysates wird das
λ4 * 4 -
Cholesterin enzymatisch zu Δ -Cholestenon oxidiert. Δ -Cholestenon wird dann aus dem Reaktionsgemisch extrahiert und seine Absorption bei 236 nm gemessen.
Reagentien
1. 0,05M Phosphatpuffer, pH * 7,0.
2. Cholesterinoxidase - Vorratsiösung, enthaltend 5»0 E/ml und 3,0 % V/V IOP (Triton X-1Q0).
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3. Arbeits-Enzym - 5*0 ml der Cholesterinoxidasevorratslösung werden zu 45 ml des 0,05M Phosphatpuffers mit pH ■« 7,0 (1) hinzugegeben.
4. Äthanolisches KOH, (1N) - eine fertige Ampulle zur Herstellung von 1 1 1N KOH wird mit 100 ml destilliertem Wasser
versetzt und mit absolutem Alkohol auf 1 1 gebracht.
5. 0,083N Salzsäure, welche 0,3 % V/V lOP (Triton X-100) enthält.
6. Cholesterin Standardibis zu 12,9 *»M (500 mg %), Sie werden hergestellt durch Auflösen von trockenem, reinem Cholesterin (BDH Ciochemical Standard) in Isopropylalkohol»
7. Cyclohexan
Methode
0,2 ml Serum oder Standard werden zu 1,0 ml äthanolischem KOH hinzugegeben und das Gemisch 5 Minuten bei 75 0C in verschlossenen Reagenzgläsern inkubiert.
0,1 ml des verseiften Extraktes werden dann zu 1,0 »1 Ö,O83N HCl, welche 0,3 % IOP (Triton X-100) enthalten, hinzugegeben. Die Lösung wird vor der Zugabe von 1,0 ml der Arbeits-Enzym-]ösung vermischt. Nach Zugabe der Choleßterinoxidäse wird das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei 37 0C inkubiert·
5,0 ml äthanolisches KOH werden dann hinzugegeben und das
während der Reaktion g
Cyclohexan extrahiert.
während der Reaktion gebildete Δ -Cholestenon wird in 3*0"
Blindwerte werden in ähnlicher Weise erhalten, lediglich dass die Arbeits-Enzymlösung erst nach Zugabe des äthanolischen KOH hinzugegeben wird.
Die optische Dichte eines ISxtraktes wird gegen "'die Blindprobe bei 236nm abgelesen.
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BAD QRieiNAL
Beispiel 4- - Ausrüstung für die Untersuchung von freiem
Cholesterin in Serum ■
Prinzig . ' '
Cholesterinoxidase oxidiert Cholesterin zu & -Choleatenon unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid. Das erzeugte Wasserstoffperoxid wird mit X,ylenol-orange und vierwertigem Titan in ein Chelat überführt. Die Absorption dieses rotgefärbten, Komplexes wird bei 550 mn gemessen.
Reagent ten
1. 0,01H Phosphatpuffer, pH - 7,0, welcher 0,10 g % Natriumaaid enthält, ·
2. Cholesterinoxidaselösung, 5 -Einheiten (1 ml oxidiert 5pN
v ο Cholesterin pro Minute bei pil ■ 7>0 und pO G) , welche 5,0 fo V/V iOP ('l'riton X-IOO) enthält.
3. Arbeits-liJizymlösung - 5 ml Cholesterinoxidaselösung werden zu 41 ml des 0-,01W Pho.sphatpuffers (1.) hinzugegeben.
4. Schwefelsäure, 2N - 56 ml konzentrierte Schwefelsäure werden au destilliertem Wasser hinzugegeben und auf 1 1 verdünnt.
5. Ausgangstitanlösung, O,OO1M - 0,08 g Titandioxid werden in einen 25 ml Erlenmeyerkolben gegeben und es werden 0,5 6 Ammoniumsulfat und 2,5 nil konzentrierte Schwefelsäure hinzugegeben. Dieses Gemisch wird auf einer Heizplatte erwärmt, bis alle Bestandteile aufgelöst sind und das Gemisch farblos ist. Die Lösung wird dann abgekühlt und mit destilliertem Wasser auf 1 1 aufgefüllt.
6. Ausgangsxylenol-orangelösung, 0,001M - 0,76. g Xylenol orange werden in destilliertem Wasser"-auf gelöst und. auf 1 1 verdünnt.
7. Kombiniertes JfTarbreagens - Ein Volumenteil der Ausgangstitanlösung werden zu 0,5 Volumenteile 2N Schwefelsäure hinzugegeben und vermischt. Ein Volumenteil der Ausgangsxylenolorangelösung und 0,5 g Polyoxyäthylenlauryläther (Warenbezeichnung Brij-35) prol Reagens werden dann hinzugegeben.
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BAD
8. Ein Cholesterin Standard, der bis zu 3,0 mM pro 1 enthält, wird durch Auflösen von trockenem, reinem Cholesterin (BDII Biochemical Standard) in Isopropylalkohol hergestellt.
Die Ausrüstung für 20 Untersuchungen umfaßt die beiden Reagentien A und B und eine Standard-Cholenterinlösung, die oben beschriebene ReagensLösung 8.
Reagens A - 80 iul Cholesterinoxidaselösung, hergestellt als dar, oben aufgeführte Reagens 3)·
Reagens B - ^O ml des kombinierben Farbreagens, hergestellt/ als das oben beschriebene Reagens '/).
helhode
100,Ul Serum oder Cholesterin-Standard werden zu 2,0 nil Reagens A hinzugegeben und 10 Minuten bei 37 0 inkubierb.
Dann v/erden 1,0 ml Reagens B zu dem Realetionsgemisch hinzugefügt, und die Inkubation bei"37 0^ Lü'1' weitere 5 Minuten fortgeführt.
Blindwerte werden erhalten, indem Seiiim oder Cholesterin-Suindard direkt zu einem Gemisch von 2 ml Reagens A und 1,0 ml Reagens B hinzugegeben werden und 5 Minuten bei 37 0C inkubiert wird.
Die optische Dichten der Testlösungen werden gegen die entsprechenden Blindproben bei 550 nm abgelesen.
Berechnung der Ergebnisse
mM Cholesterin für Lit er test - 3,0 X °%5q Test
OD550 - Standard
A'thanolisches KOH und Cyclohexan werden von dem Benutzer bereitgestellt, da ersteres instabil ist und beide in relativ großen Volumen erforderlich sind.
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Methode
0,2 ml Serum oder Standard werden zu 1,0 ml äthanolischem KOH hinzugegeben, und das Gemisch wird 5 Minuten bei 75 0C in verschlossenen Reagenzgläsern inkubiert.
0,1 ml des verseiften Extraktes werden dann zu 1,0 ml 0,085N HCl, welche 0,5 % IOP (Triton X-100) enthält, d. h. Reagens A, hinzugegeben. Die Lösung wird vor der Zugabe von 1,0 ml der Arbeits-Enzymlösung, d. h. dem Reagens B, vermischt. Nach Zugabe der Cholesterinoxidase wird das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei 57 G inkubiert.
5,0 ml äthanolisches EOH werden dann hinzugefügt, und das während der Reaktion gebildet Δ -Cholestenon wird in 4,0 ml Cyclohexan extrahiert.
Blindproben werden in ähnlicher Weise hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Arbeits-Enzymlösung erst nach Zugabe des äthanolischen KOH hinzugegeben wird.
Die optischen Dichten der Extrakte werden gegen die Blindproben bei 256 nrn abgelesen.
Die Erfindung umfaßt ferner eine fertige Ausrüstung zur Anwendung bei der Untersuchung der ChoIesterinmenge in einer . Flüssigkeit, die sich dadurch auszeichnet, daß sie i) eine von Nocardia species NCIB 1055^ oder NCIB 10555 stammende Enzympräparation, die eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff enthält, und ii) wenigstens ein Reagens, welches bei der Bestimmung der Menge, in welcher ein Produkt bei der Cholesterinoxidasereaktion gebildet wird, verwendet werden kann, enthält.
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Ferner kann bei der Ausrüstung die Enzympräparation (i) in flüssiger Form mit einer Wirkung von wenigstens 10 Einheit/ml vorliegen.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Ausrüstung umfaßt die Komponente (ii) wenigstens ein Reagens, das an einer Reaktion teilnimmt, mittels der Wasserstoffperoxid colorimetrisch oder flurometrisch bestimmt werden kann.
Bei einer weiteren Ausführungsform weist die Enzympräparation (i) eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 50/ug Proteinstickstoff auf und besitzt, falls sie in flüssiger Form vorliegt, eine Wirkung von wenigstens 0,5 Einheiten/ml.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Komponente (i) eine gefriergetrocknete Enzympräparation, die zu der erforderlichen, spezifischen Aktivität mit einem Puffer zu einer wässrigen Präparation aufgefüllt wird.
Bei einer weiteren Ausführungeform der Ausrüstung enthält diese ,jede der Komponenten in einer solchen Menge, wie sie für die gleiche bestimmte Anzahl von Untersuchungen erforderlich ist.
Bei einer weiteren Ausführungsl'orm enthält sie eine Einzelmenge einer jeden Komponente, wobei die für eine Einzelunter sue hung erforderliche Menge aus diener Einzelmoiiße entnommen wird.
Bei einer weiteren Ausführmißuform (!«■ Au nrü nt.ung enthält; diese Einheit Dosen der EuiT.ymUompon«nte (i), wovon ,jede
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wenigstens 0,05 und insbesondere 0,5 Einheiten Cholesterinoxidaseaktivität enthält.
Bei einer weiteren Ausführungsform liegen die Einheitsdosen der Erizymkoniponente (i) in gefriergetrockneter oder konzentrierter Form in Einzelbehältern vor, welche mit Puffer vor jedem Test in gebrauchsfähige Form überführt werden.
Bei einer weiteren Auüführungsform der Ausrüstung für die Untersuchung auf Gesamtchoiesterin in Serum enthäit die Ausrüstung zusätzlich zu den Komponenten (i) (ii) eine weitere Komponente (Hi) in Form wenigstens eines sauren Reagens zur Neutralisation des verseiften Serums.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Ausrüstung enthält diese zusätzlich wenigstens eine standardisierte Cholesterin-Iosung.
"Pateritansprüche-
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Claims (1)

  1. Pa bentansprüche
    1. Enzympräparation, dadurch g e k e η η ζ e i c h ii e t, daß sie aus Nocardia species NCIB IO554 oder NCIB ΊΟ555 absbanmib und eine spezifische Oholesberinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheib pro 5 mg Probeinsticksboif'enthält.
    2. Eiizympräparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in flüssiger L'Orin vorliegt und
    —2
    eine Wirkung von wenigstens 10 Einheiten/nil, insbeson-
    —Ί
    clere Ί0~ Einheiten/ml, besitzt.
    3. Enzympräparation nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die spezifische Cholesterinoxidaseakbivibäb wenigstens 1 Einheib pro 50 mg ^es Probeinsticksboffs beträgt.
    4. Enzympräparation nach Anspruch 3> dadurch g e k e η η ζ e ichnet, daß sie in flüssiger iJ'orm vorliegt und eine Wirkung von wenigstens 0,5 Einheiten/ml besitzt.
    5. Knzymprüparation nach Anspruch 1 oder 3» dadurch g e k e η η ■ ζ e i c h η e t, daß sie in fester, insbesondere gefriergetrockneter I'Orm vorliegt.
    6. Enzyinpräparation nach einem der Ansprüche 1 bis lj} dadurch
    g e k e η η ζ e i c h η e t, daß sie eine Katalaseaktivibäb von weniger als 10 Einheiten und insbesondere von weniger
    -2
    als 10 Einheiten pro Einheit der Cholesterinoxidaseaktivität aufweist.
    309813/ ,m BADOR1C31NAl.
    7. Enzympräparation nach Anspruch 6, dadurch g e k e η η ζ eichnet, daß sie einen Katalaseinhibitor, insbesondere ein Azid, enthält.
    8. Enzympräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 7) dadurch gekennz eichnet, daß sie ferner eine Peroxidaseaktivität enthält.
    9· Enzympräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einer Einheitsdosisi'orm vorliegt, welche wenigstens 0,05, insbesondere wenigstens 0,5 Einheiten Cholesterinoxidaseaktivität aufweist.
    10. Verfahren zur Herstellung einer Enzympräparation, dadurch gekennz eichnet, daß Itfocardia species NCIB 10554 oder WCIB 10555 gezüchtet wird und eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff aufweisende Enzympräparation hieraus gewonnen wird. " " ■ .
    11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch g ek ennz e i c h n e t, daß die Enzympräparation durch Ernten der Zellen und Extraktion der Zellen mit einem grenzflächenaktiven Mittel gewonnen wird.
    12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gek ennz e i ohne t, daß als grenzflächenaktives Mittel ein nichtionisches, grenzflächenaktives Mittel, insbesondere Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol, welches etwa 10 MpI Ithylenoxid enthält, verwendet wird.
    12# Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennz'eichn e t, daß die Enzympräparation durch Ernten der Zellen, Zerbrechen der Zellen und Entfernen der Zellbruchstücke hergestellt wird«, ΑΑΛ
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    BAD ORIGINAL
    Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit Hilfe einer X-Presse zerkleinert werden.
    15· Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14-, dadurch gekennz eichnet, daß der Organismus in einem Medium, welches Glyzerin als Kohlenstoffquelle enthält, und insbesondere bei einem pH-Wert von 6 bis 8, gezüchtet wird.
    16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15» dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus in Anwesenheit von Cholesterin wachsengelassen wird.
    17· Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Cholesterinoxidaseaktivität aufweisende und von Zellen freie Flüssigkeit weiter durch Ionenaustauscherehromatographie, insbesondere auf DEAE-Cellulose, oder durch Substrataffinitätchromatographie gereinigt wird.
    18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die durch Chromatographie gereinigte Flüssigkeit weiter durch Ultrafiltration oder durch Eindampfen unter vermindertem Djijck konzentriert wird.
    19· Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch g e k e η η r. e i c h η e t, daß die eine Cholesterinoxidaseaktivität aufweisende Enzympräparation in feste, vorzugsweise gelriergetrocknete Form überführt wird.
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    20. Verwendung der Enzympräparat ion nach einem der Ansprüche
    1 bis 9 zur Bestimmung von Cholesterin in einer Flüssigkeit, wobei die Flüssigkeit mit der zur Oxidation des Cholesterins zu A -Cholestenon und Wasserstoffperoxid fähigen Enzympräparation inkubiert und die vorhandene Cholesterinmenge durch Messung der erzeugten Wasserstoffperoxidmenge
    bestimmt wird.
    21. Ausführungsform nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit eine biologische
    Flüssigkeit, insbesondere ein Serum, ist.
    22. Ausführungsform nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß das vorhandene Cholesterin durch
    Messung der Menge, in welcher eines der Produkte der
    Cholesterinoxidasereaktion gebildet wird, oder der Menge, in der Sauerstoff bei der Cholesterinoxidasereaktion
    verbraucht wird, bestimmt wird.
    23. Ausführungsform nach Anspruch 20 bis 22, dadurch g e k e η η ζ eichnet, daß die verwendete, flüssige Enzympräparation eine spezifische Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Proteinstickstoff und eine Wirkung von wenigstens 10" Einheiten/ml besitzt
    und die erzeugte Wasserstoffperoxidmenge durch eine fluorimetrische Methode bestimmt wird.
    Λ.Ausführungsform nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete, flüssige Enzympräparation eine Wirkung von wenigstens 10" Einheiten/ml
    besitzt und die erzeugte Wasserstoffperoxidmenge colorimetrisch gemessen oder die Sauerstoffaufnähme unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode bestimmt oder die erzeugte' ü -Cholestenonmengo entweder direkt oder über ihre Carbonyl-r absorption gemessen oder ein Derivat gebildet und dieses colorimetrisch besbimmt wird.
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    BAD
    25. Ausführungsform nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die erzeugte Wasserstoffperoxidmenge colorimetrisch nach Durchführung einer Farbbildungsreaktion gemessen wird.
    26. Ausführungsform nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennz eich net, daß das Serum vor der Inkubation mit der Enzympräparation zur Messung des Gesamtcholesterins in dem Serum verseift wird·
    27· Aue führung sfoacm nach einem der Ansprüche 20 Di s 26, dadurch gekennzeichnet, daß eine flüssige Enzympräparation mit einer spezifischen Cholesterinoxidaseaktivität von wenigstens 1 Einheit/50/ug Proteinstickstoff und einerWirkung von wenigstens 0,5 Einheiten/ml verwendet wird.
    28. Ausführungsform nach einem der Ansprüche 20 bis 271 dadurch gekennzeichnet, daß sie als Einzeltest an einer einzelnen Probe durchgeführt wird.
    29. Ausführungsform nach einem der Ansprüche 20 bis 28, dadurch gekennz eichnet, daß eine Vielzahl von Proben automatisch untersucht werden.
    30. Ausführungsform nach einem der Ansprüche 20 bis 29» dadurch gekennzeichne b, daß sie in i;'. im einer fertigen Ausrüstung verwendet wird, welche
    \) eine Enzympräparation nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit einer spezifischen Choleiiterinoxidaeeaktivibät von wenigstens 1 Einheit pro 5 mg Probeinr, tickstoff und
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    2) wenigstens ein Reagens enthält, welches bei der Bestimmung der Menge verwendet werden kann, in welcher ein Produkt bei der Cholesterinoxidasereaktiongebildet wird.
    31. Ausführungsform nach .Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzympräparation (1) in gefriergetrockneter Form verwendet und in eine wäßrige Präparation der gewünschten Wirkung mit einer Pufferlösung überführt wird.
    32. Ausführungsform nach Anspruch 30 oder 31» dadurch g e k e η η zeichnet, daß sie die Komponenten in der erforderlichen Anzahl für die gleicht Anzahl von Untersuchungen enthält.
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