DE2215539A1

DE2215539A1 - Neue wasserunloesliche proteinpraeparate

Info

Publication number: DE2215539A1
Application number: DE2215539A
Authority: DE
Inventors: Herbert Dr Bartl; Bruno Dr Boemer; Fritz Dr Hueper; Erich Dr Rauenbusch; Guenter Dr Schmidt-Kastner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1972-03-30
Filing date: 1972-03-30
Publication date: 1973-10-18
Also published as: DK137800B; ZA732180B; DD108099A5; IE37474B1; IT1030795B; PL91817B1; AR199202A1; GB1413381A; AT324264B; SU589930A3; TR17150A; BE797501A; FI52732C; AU5367173A; BG25230A3; IT1003075B; IE37474L; EG10983A; LU67317A1; FR2186479A1

Description

FARBENFABRIKEN BAYER AG

LEVERKU S EN-Bayenverk Zentralbercich Patente, Marken und Lizenzen

29. März 1972

Neue wasserunlösliche Proteinpräparate

Die Erfindung betrifft neue wasserunlösliche Proteinpräparäte, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um Proteine handelt,welche an neue, vernetzte, quellfähige Copolymerisate fixiert sind. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen wasserunlöslichen Proteinpräparate und die Verwendung von neuen wasserunlöslichen Enzympräparaten zur Durchführung von durch Enzyme katalysierbaren Reaktionen.

Die covalente Bindung von Substanzen an unlösliche polymere Träger hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Besondere Vorteile bietet die Fixierung von katalytisch wirksamen Verbindungen, z.B. Enzymen, da sie in dieser Form nach beendeter Umsetzung leicht abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden können.

Als Träger mit reaktiven Gruppen wurden bereits mehrfach Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Vinylverbindungen vorgeschlagen. Copolymere des Maleirisäureanhydrids mit Äthylen und Monovinylverbindungen werden jedoch bei der Umsetzung mit wäßrigen Enzymlösungen mehr oder weniger wasserlöslich, so daß vor oder während, der Umsetzung

Le A 14 35

309842/1201

zweckmäßig ein zusätzlicher Vernetzer z.B. ein Diamin zugesetzt wird. So erhaltene Enzympräparate sind relativ schlecht filtrierbar und besitzen lösliche Anteile, was zu Verlusten an gebundenem Enzym führt (vergl. E. Katchalski, Biochemistry 3,(1964),Seiten 1905-1919).

Ferner wurden Copolymerisate aus Acrylamid und Maleinsäure beschrieben, die durch nachträgliches Erhitzen in die Anhydridform überführt werden. Diese Produkte sind·relativ schwach vernetzt, quellen sehr stark in Wasser und besitzen eine nur mäßige mechanische Stabilität, was zu Abriebsverlusten bei der Anwendung dieser Harze führt (vergl. deutsche Offenlegungsschrift 1 9ⁿS 290).

Außerdem wurden stark vernetzte Trägerpolymere durch Copolymerisation von Maleinsäureanhydrid mit Divinyläthern hergestellt. Aufgrund der alternierenden Copolymerisationsart der Monomeren enthalten diese Polymeren einen sehr hohen Anteil an Anhydridgruppen - in den angegebenen Beispielen jeweils über 50 Gew.-% Maleinsäureanhydrid -, der durch das Molekulargewicht des Vinyläthermonomeren bestimmt wird und daher nur in relativ engen Grenzen dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßt werden kann (vergl. deutsche Offenlegungsschrift 2 008 996).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Umsetzungsprodukte von Proteinen und Peptiden mit neuen stark vernetzten, in Wasser quellfähigen Co'polymerisaten mit stark variierbarem Gehalt an cyclischen Dicarbonsäureanhydridgruppen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden. Die neuen Umsetzungsprodukte von Proteinen und Peptiden mit den neuen Copolyraerisaten sollten die Nachteile der bisher bekannten Proteinpräparate nicht bzw. nur in geringerem Maße aufweisen.

"²- 309842/1201

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst; daß nach den Methoden der Perl- oder Fällungspolymerisation Anhydride^, ß-monoelefinisch ungesättigter Dicarbonsäuren und Di-, oder Poly-(Meth)Acrylate von Di- oder Polyolen zu statistisch aufgebauten Copolymeri¹-saten polymerisiert und diese erfindungsgemäßen Copolymerisate mit wässrigen Proteinlösungen zu Proteinpräparaten umgesetzt wurden.

Gegenstand der Erfindung sind somit Proteine, die an vernetzte Copolymerisate bestehend aus copolymerisierten Einheiten "von

A 0.1 - 50 Gew.-%, vorzugsweise 2-20 Gew.-%

Ot, ß-monoolefinisch ungesättigten . Dicarbonsäureanhydriden mit 4-9 Kohlenstoffatomen und

B 99.9 - 50 Gew.-%, vorzugsweise 80-98 Gew.-96

Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylaten von Di- und/oder Polyolen,fixiert sind. ·

Die vernetzten Copolymerisate besitzen Schüttvolumina von 2- · 20 ml/g, spezifische Oberflächen von 1-400 m /g und enthalten nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0,02-10 Milliäquivalente Säure pro Gramm.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Proteinpräparate, dadurch gekennzeichnet, daß man - bezogen auf Gesamtmonomere - ·

A 0.1-70 Gew.-%, vorzugsweise 2-35 Gew.-%

<X,ß-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4-9 Kohlenstoffatomen und

^{Le A 1}^ ^{345 3} 30984271201

B 99.9-30 Gew. -%, vorzugsweise 98-65 Gew.-#

Di- und/oder Poly(Meth)Acrylate von Di- und/oder Polyolen

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 2O-2OO°C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert, und die so erhaltenen Copolymerisate mit Proteinlösungen unter Bildung der erfindungsgemäßen Proteinpräparate umsetzt.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Verwendung von erfindungsgemäß erhaltenen Wasserunlöslichen Enzympräparaten zur Durchführung von durch Enzyme katalysierbaren Reaktionen.

Über die Darstellung der als Ausgangsprodukte für die Synthese der Proteinpräparate benötigten Copolymerisate ist folgendes zu sagen.

Als cC ,ß-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4-9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4-5 Kohlenstoffatomen die für die Herstellung der Copolymerisate benötigt werden,seien namentlich genannt: Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid, insbesondere Maleinsäureanhydrid. Für die Copolymerisation können auch Mischungen dieser Anhydride eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/oder Polymethacrylate bzw. Di- und/oder Polyacrylate von Di- und/oder Polyolen leiten sich von Verbindungen mit mindestens 2 alkoholischen oder phenolischen, vorzugsweise alkoholischen

Le A 14 345 - 4 -

309842/ 1 201

OH-Gruppen bzw. deren Umsetzungsprodukten mit Alkylenoxiden mit 2-8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2-4 Kohlenstoffatomen oder Gemischen dieser Alkylenoxide ab, wobei an 1 Mol der Hydroxylgruppen tragenden Verbindung 1-10 , bevorzugt 1-20 Alkylenoxidbausteine anpolymerisiert sind. Beispielhaft seien Alkylenoxide, Äthylenoxid, Propylenoxid, Butylenoxid, Trimethylenoxid, Tetramethylenoxid, Bis-chlormethyl-oxacyolobutan, Styroloxid, vorzugsweise Äthylenoxid und Propylenoxid genannt. Es ist auch durchaus möglich, Umsetzungsprodukte von Verbindungen mit mindestens 2 Zerewitinoff-aktiven Wasserstoffatomen, die sich nicht von Alkoholen oder Phenolen ableiten, mit den obengenannten Alkylenoxiden zur Herstellung der Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylate zu Verwenden.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Di- und Poly<Meth)Acrylate von Di- und Polyolen werden nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung,der Di- und/oder Polyole mit (Meth)Acrylsäurechlorid in Gegenwart von in etwa äquimolaren

Mengen, bezogen auf Säurechlorid, an tert. Aminen wie Triäthylamin, bei Temperaturen unter 20⁰C, in Anwesenheit von Benzol gewonnen (vergl. deutsche Offenlegungsschrift 1 907 666)

Als Di- bzw. Polyole mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2-12 Kohlenstoffatomen kommen z.B. infrage: Äthylenglykol, Propandiol-1,2, Propandiol-1,3, Butandiole insbesondere Butandiol-1,4, Hexandiole, Dekandiole, Glyzerin, Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Sorbit, Sucrose und deren Umsetzungsprodukte mit Alkylenoxiden, wie vorstehend angegeben. Auch Poly- bis-chlormethyl-oxacyclobutan oder Polystyroloxid sind geeignet. Es können auch Gemische aus Di- und Polyolen eingesetzt werden.

⁵ V 309842/1201

Vorzugsweise werden Diacrylate bzw. Dimethacrylate von * Diolen mit 2-4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1-20 Molen Alkylenoxid mit 2-4 Kohlenstoffatomen bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet.

Besonders vorteilhaft sind die Dimethacrylate von Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol, Tetraäthylenglykol oder höheren Polyalkylglykolen mit Molgewichten bis 1000 oder deren Gemische.

Falls gewünscht, könnten neben den erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/od■- Poly-(Meth)Acrylaten auch üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel mit mindestens 2 nichtkonjugierten Doppelbindungen, etwa Divinyladipat, Methylenbisacrylamid, Triacrylformal oder Triallylcyanurat in Mengen von etwa 0,01 - 30 Gew.-Ji der Monomerenmischung zugesetzt werden.

Aufgrund der möglichen Variationsbreite in der Zusammensetzung der Monomerenmischungen können innerhalb eines sehr weiten Bereiches Hydrophilie, Vernetzungsdichte, Quellbarkeit und Anhydridgruppengehalt der erfindungsgemäßen Copolymerisate dem Jeweiligen Verwendungszweck angepaßt werden.

Die Polymerisation kann z.B. in einem organischen Lösungsmittel als Fällungspolymerisation durchgeführt werden, wobei die Polymeren bereits kurz nach dem Einsetzen der Polymerisation auszufallen beginnen. An sich sind alle gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel geeignet. Besonders günstige Lösungsmittel sind aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, sowie halogensubstituierte Kohlenwasserstoffe, Alkylaromaten und Carbonsäureester.

Le A 14 3^5 - 6 -

30 9 842/1201

Beispielhaft seien genannt: Heptan, Octan, Isooctan, Benzinfraktionen mit Siedepunkten von etwa 60 bis.200⁰C, Cyclohexan, Benzol, Toluol, Xylole, Chlorbenzol, Dichlorbenzole, Äthylacetat, Butylacetat.

Die Lösungsmittel sollen vorzugsweise einen Siedepunkt von mindestens 60 C besitzen und im Vakuum gut aus dem Fällungspolymerisat entfernbar sein. Für.l Teil der Monomerenmischung verwendet man etwa 2-50, bevorzugt 5 - 20 Gew.-TIe, des Lösungsmittels. Die Eigenschaften der Copolymerisate, besonders das Schüttgewicht und die spezifische Oberfläche werden durch Art und Menge des Lösungsmittels wesentlich beeinflußt. . '

In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Gemische der obengenannten Lösungsmittel zu verwenden, oder die Polymerisation in einem Lösungsmittel für das Polymere zu beginnen und im Verlauf der Polymerisation kontinuierlich ein Fällungsmittel für das Polymere zuzugeben. Das Fällungsmittel kann auch zu bestimmten Zeitpunkten in einer oder mehreren Portionen zugegeben werden. Außerdem kann die Monomerenmischung zusammen mit einem geeigneten Initiator als Lösung .oder ohne Lösungsmittel in eine vorgelegte Lösungsmittelmenge eingespeist werden, so daß während der Polymerisation eine gleichmäßige, geringe Monomerkonzentration aufrecht erhalten wird. Durch Verwendung von (Meth)-Acrylmonomeren unterschiedlicher Hydrophilie und Variation der Polymerisationsbedingungen lassen sich innerhalb eines sehr weiten Bereiches Produkte mit dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßter Quellbarkeit, Dichte und spezifischer. Oberfläche bei guter mechanischer Stabilität herstellen.

Die erfindungsgemäßen Copolymerisate können auch durch Suspensionspolymerisation hergestellt werden. Die ge-

309842/1201

bräuchlichste Art der Perlpolymerisation, bei der die Monomeren, ggf. unter Zusatz eines organischen Lösungsmittels, in Wasser suspendiert werden, läßt sich in diesem Fall nur mit geringem Erfolg anwenden, da das Anhydrid sehr rasch hydrolysiert, die entstehende Dicarbonsäure hauptsächlich in die Wasserphase übergeht und nur in geringer Menge in das Polymere eingebaut wird. Daher wird die Suspensionspolymerisation zweckmäßig in organischem Medium durchgeführt. Die Monomeren und der Initiator werden in einem mit Paraffinen nicht mischbaren, gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel wie z.B. Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid gelöst und meistens unter Zusatz von Dispergatoren in der zusammenhängenden Phase verteilt. Als zusammenhängende Phase eignen sich besonders Paraffinkohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Octan und höhere Homologe, Cycloaliphaten wie Cyclohexan, sowie Paraffingemische wie Benzinfraktionen oder Paraffinöl. Das Volumenverhältnis, zusammenhängende Phase: Monomerphase beträgt 1:1 bis 10:1, vorzugsweise 2:1 bis 5:1.

Zur Stabilisierung der Suspension können beispielsweise Glycerin-mono- und dioleate, sowie Gemische dieser Verbindungen, Sorbitan-mono- und trioleate bzw. -stearate, Polyäthylenglykolmonoäther mit Stearyl- bzw. Laurylalkohol oder Nonylphenol, Polyäthylenglykolmonoester mit Ölsäure, Stearinsäure und anderen Fettsäuren mit mehr als 10 C-Atomen, sowie das Na-SaIz des Sulfobernsteinsäuredioctylesters verwendet werden. Diese Stoffe werden in Mengen von vorzugsweise 0,1 - 10%, bezogen auf die Monomerenmischung, eingesetzt und im allgemeinen in der Kohlenwasserstoffphase gelöst. Die Partikelgröße der Suspensionspolymerisate kann außer durch Vergrößerung der Rührgeschwindigkeit durch Zugabe von 0,1 - 2%, bezogen auf Monomere, einer weiteren

Le A 13 3^5 - 8 -

309842/1201

oberflächenaktiven Substanz, z.B. eines Alkylsulfonates verringert werden.

Die Polymerisation wird durch radikalische Initiatoren ausgelöst. Geeignete Initiatoren sind z.B. Azoverbindungen oder. Perverbindungen. Die zur Polymerisationsauslösung gebräuchlichste Azoverbindung ist das Azoisobuttersäurenitril. Als Perverbindungen kommen hauptsächlich Diacylperoxide wie Dibenzoylperoxid oder Percarbonate wie Diisopropyl- und Dicyclohexylpercarbonat infrage,*es können jedoch auch Diacylperoxide, Hydroperoxide und in organischen Lösungsmitteln wirksame Redoxsysteme zur Initiierung verwendet

werden. * _

Die Initiatoren werden in Mengen von 0,01 - 105Ki, vorzugsweise 0,1 - 3%, bezogen auf die Gewichtsmenge der Monomermischung zugesetzt. '

Die Polymerisation wird bei Temperaturen von etwa 20 - 200⁰C, vorzugsweise 50 - 100⁰C in Abhängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolymerisationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen

durchgeführt. Außerdem ist es in der Regel vorteilhaft, in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren. -

Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulvrige Substanzenmit Schüttvolumina von 1,5 - 30 ml/g, vorzugsweise 2 - 20 ml/g und spezifischen Oberflächen von 0,1 - 500 m /g, bevorzugt 1 - 400 m /g. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen liegt bei . 0,02 - 10 mÄquiv/g, vorzugsweise bei 0,4 - 4 mA'quiv/g.

309842/1201

Die Suspensionspolymerisate sind weiße oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmäßig geformt sein können und einen Durchmesser von 0,03 - 1 mm, vorzugsweise 0,05 - 0,5 nun und Schüttvolumina von etwa 1,4-8 ml/g, vorzugsweise 1,4-5 ml/g, besitzen. Ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxylgruppengehalt beträgt 0,02 - 10 mÄquiv/g, vorzugsweise 0,4 - 4 m/Äquiv/g.

Die erfindungsgemäßen Copolymerisate enthalten die copolymerisierten Einheiten statistisch verteilt. Aufgrund ihrer hohen Vernetzungsdichte sind die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich. Molekulargewichte sind daher nicht bestimmbar.

Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1,1-bis 2,5-fache ihres Schüttvolumens quellen. Sie eignen sich vorzüglich als Trägerharze zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren können.

Die Trägerharze werden bei Temperaturen zwischen 0 und 30⁰C direkt in die wäßrige Lösung des zu bindenden Stoffes, vorzugsweise in die wäßrige Lösung eines Proteins eingetragen, wobei der pH-Wert konstant zu halten ist.

Sollen Proteine an die erfindungsgemäßen Copolymerisate gebunden werden, so arbeitet man zweckmäßigerweise mit einem pH-Staten in einem pH-Bereich von 3 bis 10, vorzugsweise von pH 5,5 bis pH 9,0. Wird als Protein Penicillinacylase eingesetzt, so arbeitet man zweckmäßigerweise zwischen pH 5,7 und pH 6,8. Während der Bindungsreaktion muß zur Konstanthaltung des pH-Bereiches ständig eine Base zugesetzt werden. Dabei kommen anorganische Basen (beispielsweise

Le A 13 3*15 - 10 -

309842/1201

Alkalilaugen) und organische Basen (beispielsweise tertiäre organische Amine) infrage.

Im Gegensatz zu den Erfahrungen der Literatur mit anderen Harzen, nach denen die Umsetzung in gepufferten Lösungen durchgeführt wird, waren die Ausbeuten an gebundenem Enzym mit den oben beschriebenen Harzen umso besser, je niedriger der Salzgehalt der Lösungen war.

Das Gewichtsverhältnis von gebundener Substanz, beispielsweise Protein bzw. Peptid zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem späteren Verwendungszweck angepaßt werden. Gute Ausbeuten erhält man bei einem Verhältnis von 1 Gew.-Teil Protein zu 4 bis 10 Gew..-Teilen polymerem Träger. Die optimalen Verhältnisse sind jedoch sowohl von der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren als auch von der Art des Proteins abhängig. Bei zahlreichen Enzymen ist es zweckmäßig, Stabilisatoren der Enzymlösung zuzusetzen.

Als solche kommen Polyäthylenglykole oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung der Denaturierung an Oberflächen infrage, sowie die bekannten SH-Reagentien oder

Metallionen bei speziellen Enzymen.

Die notwendige Reaktionszeit ist abhängig von der Art des Polymeren. Im Normalfall ist die Reaktion nach 20 h bei Raumtemperatur abgeschlossen. Bei 4⁰C läuft die Reaktion besser noch etwas länger. Bei präparativen Ansätzen wird der Ansatz nicht früher als 2 Stunden nach Beendigung der Alkalizugabe durch den pH-Staten abgebrochen. Das Polymere mit dem gebundenen Protein wird hierauf abgesaugt oder abzentrifugiert und der Rückstand mit Salzlösungen hoher ,Ionenstärke,beispielsweise 1 M-Natriumchlorid-

Le A 13 3^5 ~ ^1Oa ~

309842/120

lösung ,und anschließend mit einem Puffer gewaschen, in dem 'das Enzym stabil ist. Schließlich wird mit einer Lösung hoher Salzkonzentration gewaschen, wobei sich ionogen gebundenes Protein vom Träger löst.

Zur Beurteilung des Erfolges der Proteinbindung wurde bei Enzymen die enzymatische Aktivität sowohl im Polymeren als auch in der Restlösung und in den Waschwassern bestimmt. Bei Proteinen ohne spezifische Wirkung wurde der Stickstoffgehalt im Polymeren nach Kjeldahl bestimmt. Die Ausbeuten bei der Proteinbindung liegen zwischen 10 und über 90%. Betrachtet man die enzymatische Aktivität, so ist es in einigen Fällen vorteilhaft, keinen zu großen Überschuß an Polymermaterial zu verwenden, da sonst zwar das Protein vollständig gebunden wird, die Aktivität Jedoch darunter leidet.

Die Trägerharze sind geeignet, alle Substanzen zu binden, die eine funktioneile Gruppe tragen, die befähigt ist, mit der .Anhydridgruppe des Polymeren zu reagieren. Bei den Proteinen und Peptiden sind dies vor allem die endständigen Aminogruppen des Lysins und die freien Aminogruppen der Peptidkettenenden.

An Träger gebundene Peptide und Proteine sind von großer wissenschaftlicher und technischer Bedeutung. Die in den meisten Fällen teuren und instabilen Enzyme werden durch die Bindung an das Harz wesentlich stabilisiert. Außerdem gestattet die leichte und vollständige Rückgewinnung des Enzymharzes eine vielfache Anwendung über lange Zeitspannen.

Folgende Substanzen können beispielsweise an die erfindungsgemäßen Copolymerisate fixiert werden:

Le A 14 3**5 - 11 -

309842/1201

Enzyme: Hydrolasen wie Proteasen, beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase; Amidasen, beispielsweise Asparaginase, Glutaminase, Urease; Acyltransferasen, beispielsweise Penicillinacylase; Lyasen, beispielsweise Hyaluronidase.

Andere Proteine, wie Plasmabestandteile, Globuline (Antikörper).

Polypeptide, wie Kallikrein-Inhibitor oder Insulin. Aminosäuren wie Lysin oder Alanin.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Proteine werden im allgemeinen aus Bakterien, Pilzen, Aktinomyceten oder aus tierischem Material gewonnen. ·

Einige Beispiele für technisch wichtige Umsetzungen mit gebundenen Enzymen sind der· hydrolytische Abbau der Stärke durch covalent gebundene Amylase, die Klärung von Fruchtsäften u.a. durch gebundene Pektinase, die Herstellung enzymatisch abgebauter Eiweißhydrolysate, die Hydrolyse von Penicillinen zur 6-Aminopenicillansäure. Außerdem wurden auch gebundene Enzyme, Peptide u.a. zur Isolierung von Inhibitoren durch AffinitätsChromatographie und umgekehrt gebundene Inhibitoren zur Isolierung von Enzymen verwendet. Andere Anwendungen liegen im Gebiet der Medizin. Ein Beispiel ist die Verwendung von gebundener !.-Asparaginase oder Urease in einem extrakorporalen Kreislauf zur Erniedrigung des Asparagin- bzw. Harnstoffspiegeis im Blut.

Die Siedepunkte in den Beispielen wurden bei Normaldruck bestimmt.

Diese und zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten sind in

Le A m 345 - 12 -

309842/1201

der Literatur beschrieben worden. Siehe dazu z.B. die Zusammenfassungen in Chem. Eng. News v. 15.2.1971, Seite 86 und Rev. Pure a. Appl. Chem. 21., 83 (1971).

Ein wichtiges Beispiel für die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteinpräparate stellt die Spaltung von Penicillinen mit Hilfe von Penicillinacylase dar, welche an die erfindungsgemäßen Copolymerisate gebunden ist.

Zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6ÄPS) 'können Penicilline mit Hilfe von Acylasen aus Mikroorganismen wie zum Beispiel Bakterien, insbesondere E. coli, Erwinia oder Actinomyceten wie Streptomyces, Micromonospora, Nocardia und Pilzen wie Pusarium und Hefen gespalten werden.

Gemäß dem Verfahren der Deutschen Patentschrift 1 111 778 zur Herstellung von 6-APS wird ejine Penicillin G-Lösung mit einem Bakterienschlamm versetzt, der das Enzym Penicillinacylase (E.C. 3·5·1·11) enthält. Durch die Einwirkung des Enzyms.wird die seitenständige Carbonamidgruppierung des Penicillins abgespalten, ohne daß der ß-Lactamring geöffnet wird.

Die Verwendung von Suspensionen von Mikroorganismen hat folgende Nachteile:

a. Die Suspension von Mikroorganismen enthält außer der intracellulären Penicillinacylase weitere Proteine und Enzyme, sowie Bestandteile aus dem Nährmedium oder deren Umwandlungsprodukte, die bei der Fermentation entstanden sind. Diese Verunreinigungen lassen sich bei der Aufarbeitung nicht vollständig aus der kristallisierten 6-APS auswaschen.

b. Die Suspension von Mikroorganismen kann "wirtschaftlich zweckmäßig nur einmal eingesetzt werden.

Le A 14 3^5 - 13 -

309842/1201

c. Die Suspension von Mikroorganismen enthält Verunreinigungen und andere Enzyme, die Penicillin und/oder 6-APS durch öffnung des ß-Lactamringes inaktivieren.

d. Die Suspension enthält nur kleine Mengen an Penicillinacylase. Der Einsatz von mehr Enzymmaterial, z.B. zur Erzielung kurzer Reaktionszeiten und damit besserer 6-APS-Ausbeuten bei geringerem Gehalt von Fremdprodukten ist praktisch nicht möglich.

e. Die Betriebsausbeuten an 6-APS hängen von der schwankenden Penicillinacylase-Bildung in den jeweiligen Fermentationsansätζ-en ab.

f. Die vollständige Abtrennung suspendierter Mikroorganismen erfordert bei der Aufarbeitung der 6-APS-Ansätze einen zusätzlichen Arbeitsvorgang, der Ausbeuteeinbußen bedingt. Zur Entfernung von proteinartigen Verunreinigungen, die allergene Reaktionen hervorrufen können, sind weitere Reinigungsschritte nötig (Britische Patente I.169.696; 1.078.847; 1.114.3H). :*

Alle genannten Nachteile werden vermieden, wenn man anstelle einer Suspension von Mikroorganismen eine Penicillinacylase verwendet, die durch kovalente Bindung an einen wasserunlöslichen Träger erhalten wird. '

Versuche, 6-APS durch enzymatisehe Spaltung von Penicillinen mit trägergebundener Penicillinacylase herzustellen,⁴sind zwar bekannt, (siehe dazu DOS 1 917 057, DOS 1 907 365), konnten jedoch nicht in einen technischen Maßstab übergeführt werden. Die Gründe dafür liegen einmal bei den mechanischen Eigenschaften des verwendeten Trägermaterials, das zu hohem Abrieb

Le A 14 345 - 14 -

309842/1201

führt, zum anderen konnten bei mäßigen Verfahrensausbeuten nur geringe spezifische Aktivitäten an trägergebundener Penicillinacylase erreicht werden.

Auch das in der Deutschen Patentanmeldung P 21 57 970.4 (DBP .) verwendete unlösliche Enzym, das durch kovalente Bindung der Penicillinacylase an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, N,N¹-Methylenbisacrylamid und Maleinsäureanhydrid gewonnen wurde, hat für die Spaltung von Penicillin im technischen Maßstab Nachteile, da es stark quillt und mechanisch nicht stabil ist. Diese Nachteile beeinträchtigen die mehrmalige Wiederverwendung des so hergestellten Harzes im technischen Maßstab.

Es wurde nun gefunden, daß die genannten Nachteile vermieden werden, wenn eine an einen erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Träger gebundene Penicillinacylase zur Spaltung von Penicillinen verwendet wird.

Die Spaltung von Penicillinen mit erfiridüngsgemäßer trägergebundener Penicillinacylase, läßt sich einfach und auch im großtechnischen Maßstab durchführen. Das trägergebundene unlösliche Enzym wird in einer Lösung mit 75000 -r 150000 IU/ml Penicillin, z.B. Penicillin G oder Penicillin V suspendiert. Die enzymatisch^ Spaltung wird bei konstantem pH-Wert im Bereich von 6-9 vornehmlich im Bereich des pH-Optimums der jeweils gebundenen Penicillinacylase z.B. bei pH 7,8 durchgeführt. Zur Neutralisation des abgespaltenen Acylrestes z.B. der Phenylessigsäure oder der Phenoxyessigsäure verwendet man wässrige Alkalilösungen z.B. Kali- oder Natronlauge oder organische Amine, vorzugsweise Triäthylamin. Aus dem Verbrauch der Base ist die Reaktionsgeschwindigkeit und die Beendigung der Spaltung zu ersehen. Die Penicillinacylase katalysiert

Le A 14 345 - 15 -

309842/1201

sowohl die Spaltung von Penicillin zur 6-APS als auch die Resynthese der Penicilline aus den Spaltprodukten. Das Gleichgewicht ist abhängig vom pH-Wert des Mediums. Bei kleineren pH-Werten verschiebt sich das Gleichgewicht zugunsten des Ausgangsproduktes Penicillin. Dies kann zur Umacylierung von Penicillinen in Gegenwart anderer AcyIreste oder zur Synthese von Penicillinen aus 6-APS ausgenutzt werden.

Die Reaktionstemperatur der enzymatischen Spaltung beträgt vorzugsweise 38⁰C. Bei niedrigeren Temperaturen nimmt die Aktivität des Enzyms ab. Wird die Spaltung z.B. bei 25°C durchgeführt, muß doppelt soviel Enzym wie bei 38 C eingesetzt werden, wenn gleiche Reaktionszeiten erzielt werden sollen.

Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt bei gegebener Temperatur von der spezifischen Aktivität und der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase ab. Außerdem ist die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von dem Verhältnis der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase zur Konzentration des Penicillins. Ein Spaltungsansatz mit einer Konzentration von 100.000 IU/ml Penicillin G-Kalium ist nach 10 Std. bei pH 7,8 und 38⁰ C vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert, wenn pro Einheit Penicillinacylase 10^ Einheiten Penicillin G eingesetzt werden (eine Enzymeinheit (E) ist definiert als die Aktivität, die 1 u, Mol Penicillin G pro Minute bei 37° C zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert). Der Anteil an trockenem Enzymharz beträgt nur 0,5 - 1 % des Reaktionsgemisches. Werden pro 10^ IU Penicillin 6, 5 Einheiten Penicillinacylase eingesetzt, so dauert die vollständige Spaltung nur zwei Stunden. Es sind auch noch kürzere Reaktionszeiten bei Einsatz von noch mehr gebundener Penicillinacylase,

Le A 14 345 - 16 -

309842/1201

bei Verwendung ζ.B₁ von trägergebundener Penicillinacylase aus kristallisiertem Enzym, möglich.

Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene Penicillinacylase ist perlförmig, zeichnet sich durch eine hohe mechanische Stabilität und ein vergleichsweise hohes spezifisches Gewicht aus. Diese Eigenschaften ermöglichen bei vielfachem Einsatz eine Verwendung über lange Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen ferner bei Batch-Prozessen eine intensive Rührung und eine einfache Abtrennung durch Zentrifugieren ohne Verlust durch mechanische Beanspruchung z.B. durch Abrieb. Somit werden in Batch-Prozessen klare Filtrate erhalten, die ohne zusätzliche Filtration zur Gewinnung des Endproduktes, der 6-APS, weiterverarbeitet werden können. Die erfindungsgemäß hergestellte träge.rgebundene Penicillinacylase erlaubt ebenso eine schnelle und einfache Filtration, da durch die mechanische Stabilität keine die Filterfläche verstopfenden Feinstanteile entstehen. Weitere Vorteile bietet das Harz im Batch-Prozeß wegen des vergleichsweise hohen spezifischen Gewichts, das ein schnelles Absetzen des Harzes bedingt, so daß nach Beendigung des Prozesses die überstehende Lösung leicht abgehebert werden kann. Daraus ergibt sich eine Vereinfachung der Verfahrens führung,· da das Harz teim Batch-Prozeß im Reaktionsgefäß verbleiben und direkt für die nächste Spaltung verwendet werden kann.

Die Eigenschaften des Polymerisates ermöglichen ferner die Verwendung der trägergebundenen Penicillinacylase nicht nur in Batch-Prozessen, sondern auch in kontinuierlichen -Verfahren z.B. in Reaktionssäulen, wobei die Perlform die erforderliche, hoch Durchflußgeschwindigkeit erlaubt.

Die bei der enzymatischen Spaltung gebildete 6-APS wird nach

Le A IH 3J45 - 17 -

309842/1201

Abtrennung des Enzymharzes aus der Reaktionslösung nach bekannten Verfahren gewonnen (siehe z.B. Deutsche Patentschrift 1 111 778) und bei pH 4,3 kristallisiert. Bei der erfindungsgemäßen Spaltung von Penicillin mit der erfindungsgemäß hergestellten trägergebundenen Penicillinacylase werden wesentlich höhere Ausbeuten an,6-APS erhalten als bei Verwendung von E. coli-Schlamm aber auch höhere Ausbeuten, als bei der Verwendung des Enzymharzes nach der Deutschen Patentanmeldung P 21 57 970.4. So wurde, wie in den Beispielen 8 und 9 gezeigt wird, 6-APS in einer Ausbeute von ca 90 % d. Th. isoliert. Die so hergestellte 6-APS enthält keine Proteine als Verunreinigung. Die so hergestellte 6-APS enthält auch praktisch keine Polymeren, die bei anderen Verfahrensweisen entstehen können. Allergene Nebenwirkungen, die auf Proteine oder Polymere zurückgeführt werden, sind bei der erfindungsgemäß hergestellten 6-APS ausgeschlossen.

Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene Penicillinacylase gestattet einen vielfachen Einsatz über einen langen Zeitraum. Auch hiernach ist die.Enzymaktivität noch praktisch vollständig erhalten.

Le A IH 345 ' - 13 -

309842/1201

Beispiel 1 a QO

80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 1 1 Benzol ge löst und unter Rühren U Stunden auf 60° C erwärmt. Dann gibt man 1 g Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Benzin (Kp 100 140° C) zu und polymerisiert weitere 5 Stunden bei 70° C. Das pulvrige Polymere wird abgesaugt, einmal in Benzol und dreimal in Petroläther (Kp 30 - 50° C) aufgeschlämmt und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 9^ g ·
Schüttvolumen: 3,5 ml/g
Quellvolumen in "Wasser: k,7 ml/g

spez. Oberfläche: 5 m /g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 3,5 mÄquiv/g

Beispiel 1 b

Vg des nach Beispiel 1 a hergestellten Trägerharzes wird in 30 ml einer wässrigen Lösung von 120 U Penicillinacylase (spez. Aktivität 1 U/mg Protein (Biuret) ) suspendiert. Unter Konstanthaltung des pH-Wertes auf 6,3 durch Zugabe von 1 N-Natronlauge mit einem pH-Staten wird die Suspension 20 Stunden bei 25° C gerührt. Anschließend saugt man über eine Glasfritte. G3 ab und wäscht das Harz mit Je 50 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5, der 1 M-Natriumchlorid enthält und mit" dem selben Puffer ohne Natriumchlorid. Durch weiteres Waschen wird die Aktivität des Harzes nicht mehr verändert.

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)

Ausgangslösung: 132 U

überstand + Waschwasser: 12 U ·

' Le A 14 3^5 - 19 -

309842/1201

Harz nach der Umsetzung: 86 U- '

das sind 65 % der Ausgangsaktivität,

Die enzymatische Aktivität der Penicillin-Acylase wurde colorimetrisc-h oder titrimetrisch mit 0,002 M-6-Nitro-3-C.N-phenylacetyl)-aminobenzoesäu"re (NlPAB) als Substrat bei pH 7,5 und 25° C gemessen. Der .molare Extinktionskoeffizient der.

entstehenden 6-Nitro-3-arainobenzoesäure beträgt E405 nm⁼^⁰^°*

1 Einheit (U) entspricht dem Umsatz von 1/uMol Substrat pro Minute.

Beispiel 2 a ■

Eine Lösung von 90 g Athylenglykoldimethacrylat, 10 g Maleinsäureanhydrid und Ί g Azoisobuttersaurenitr.il in 1 1 Benzol wird unter Rühren zunächst bei 60° C polymerisiert. Nach 4 Stunden gibt man 200 ml Benzin (Kp 100 - 14O°) und 1 g Azoisobuttersäurenitril zu und polymerisiert 2 Stunden bei 70° und

2 Stunden bei 80"° C weiter. . Anschließend saugt man das Polymere ab, wäscht gründlich mit Petroläther (Kp 30 - 50°C) und trocknet im Vakuum."

Ausbeute: 97 g

Schüttvolumen: 6,4 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 8,0 ml/g .x=*"

spez. Oberfläche: 298 m²/g \,—^*""' Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 1,5 mÄquiv/g

Beispiel 2 b ^l ,

6 g des nach Beispiel 2 a erhaltenen Trägerharzes wurden analog zu Beispiel 1 b mit 590 U Penicillin-Acylase in 165 ml Wasser umgesetzt.

* Le A 14 345 - 20 -

309842/1201

Ergebnis:

Enzymatisch Aktivitäten (NIPAB-Test) Ausgangslösung: 590 u überstand + Waschwasser: 26 U Trägerharz nach der Umsetzung: 325 ü das sind 60 % der Ausgangsaktivität.

Beispiel 2 c

1 g des nach Beispiel 2 a erhaltenen Trägerharzes wurde analog zu Beispiel 1 b mit 100 mg Asparaginase umgesetzt.

Enzymatische Aktivitäten (Asparagin-Hydrolyse)

Ausgangslösung: 21000 U

überstand nach der Umsetzung: 3360 U Trägerharz nach der Umsetzung: 3910 U das sind 19 % der Ausgangsaktivität. ·

Beispiel 3 a

Die Copolymerisation von 90 g Diäthylenglykoldimethacrylat mit 10 g Maleinsäureanhydrid unter den Bedingungen von Beispiel 2 a ergibt:

Ausbeute: 96 g

Schüttvolumen: 5,5 ml/g · Quellvolumen in Wasser: 6,7 ml/g spez. Oberfläche: 9,2 m /g Säuregehalt nach Verseifung der Arihydridgruppen: 1,9 mÄquiv/g

* Le A 14 34.5. - 21 - ^;

309842/1201

» 2215533

Beispiel 3 b

1 g des nach Beispiel 3 a hergestellten Trägerharzes wurden zu eirer Lösvzig von 50 arg- unspsziilseher Elastase rät «±ner enzymatischen Aktivität von 139 U in 32 ml Wasser gegeben. Der Ansatz wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei das pH auf 5,8 konstant gehalten wurde. Nach der Umsetzung wurde das Harz abgesaugt und mit 50 ml 1 N-Natriumchloridlösung in 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5 und anschließend mit 50 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5 gewaschen.

Ergebnis: '

Ausgangslösung: '" 139 E

Überstand und Waschlösungen: 51 E

am Trägerharz gebunden: 15 E

das sind 11 % der Ausgangsaktivität. .

Hierbei wurde die enzymatische Aktivität titr!metrisch mit Casein als Substrat (Konzentration 11*9 mg/ml) bei pH,8,0 und 25° C bestimmt. 1 Einheit (E) entspricht einem Verbrauch von 1/uMol. Kalilauge pro Minute» ·

Beispiel 3 c

1 g des nach Beispiel 3 a hergestellten Trägerharzes wurde zu einer Lösung von 50 mg Urease kristallisiert(Merck) in 32 ml Wasser gegeben. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden gerührt, wobei das pH auf 6,3 konstant gehalten wurde. Die Aufarbeitung erfolgte wie in Beispiel 2 d angegeben. '

Ergebnis:

Ausgangslösung: 5013 U

Überstand und Waschlösungen: 1397 U

Le A 14 3^5 - 22 -

309842/1201

am Trägerharz gebunden: 1405 U das sind 28 % der Ausgangsaktivität.

Die enzymatische Aktivität der Urease wurde titrimetrisch mit 0,17 M-Harnstoff als Substrat, 25° C und pH 6,1 bestimmt. 1 Einheit (ü) entspricht der Enzymmenge, die 1 /uMol Harnstoff pro Minute spaltet. . -

Beispiel 5 d

0,4 g des nach Beispiel 3 a erhaltenen Trägerharzes wurden mit 40 mg Glutathion in 32 ml Wasser 16 Stunden bei einem, konstanten pH-Wert von 6,3 bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Harz wurde abgesaugt und'mit einer Lösung von 1 N-Natriumchlorid in 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5 und anschließend mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen des Harzes -im Vakuum bei 100° C über Phosphorpentoxid wurden 0,47 g erhalten. Die Stickstoffbestimmung nach Dumas ergab einen Wert von 1,1 % N der einem Gehalt von 8,04 % oder 37,8 mg Glutathion entspricht. Das sind 94 % der eingesetzten Menge an Glutathion.

Beispiel 4 a

80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Porofor N werden in 1 1 Benzol gelöst und unter langsamem Rühren 16 Stunden bei 80° C polymerisiert. Das Polymere wird analog zu Beispiel 1 a aufgearbeitet.

.Jv

Ausbeute: 95 g ·

Schuttvolumen: 2,5 ml/g Quellvolumen: 3»0 ml/g . ■ ■

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 2,6 mlquiv/g

Le A 14 3^5 - 23 -

309842/1201

Beispiel 4 b

Die Umsetzung von 1 g des nach Beispiel '4 .a hergestellten Trägerharzes mit Penicillin-Acylase analog zu Beispiel 1 b liefert folgende Ergebnisse:

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)

Ausgangslösung: 123 U Überstand + WaschlÖsungen: 15 U Trägerharz nach der Umsetzung: 79 U das sind 64 % der Ausgangsaktivität.

Beispiel 4 c

0,4 g des nach Beispiel 4 a hergestellten Trägerhärzes wurden zu einer Lösung von 40 mg Trypsin in 32 ml 0,01 M^ Calciumchloridlösung gegeben und 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Konstanthaltung des pH-Wertes auf 6,3 gerührt«. Das Harz wurde abgesaugt und nach Beispiel 1 b gewaschen*

Enzymatische Aktivität

in der Ausgangslösung:" 44 U

in Überstand und WaschlÖsungen: 5,2 U

am Harz gebunden: 8,3 U

das sind 19 % der Ausgangsaktivität.

Die enzymatische Aktivität wurde colorimetrisch nach. Tup.py, Z. Physiol. Chem, 329 (1962) 278,mit Benzoyl^argihin-p-nitroanilid (BAPNA) als Substrat gemessen. 1 Einheit (U) entspricht der Spaltung von 1 .uMol Substrat bei 25⁰C und pH 7*8.

Le A 14 3^5 : - 24 -

309842/1201

ft 22Ί5539

Beispiel 4 d

1 g des nach Beispiel 4 a hergestellten Harzes wurden zu einer Lösung von 50 mg unspezifischer Elastase in 32 ml Wasser gegeben. Die Suspension wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Konstanthaltung des pH-Wertes auf 5>8 gerührt. Die Aufarbeitung und titrimetrische Bestimmung der Enzymaktivitäten mit Casein als Substrat wurde wie in Beispiel 3 b angegeben durchgeführt.

Enzymatisch^ Aktivität

in der Ausgangslösung: 139 U in Überstand und Waschlösungen: 32 U am Harz gebunden: 36 U

das sind 26 % der Ausgangsaktivität.-

Beispiel 5 a

In einem Rührgefäß werden 1 1 Benzin (Kp 100 - 14O°C) und 1 g Azoisobuttersäurenitril 1 Stunde auf 90° erwärmt. Dann . wird bei 80° C eine Lösung von 95 g Xthylenglykoldimethacrylat, 5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril innerhalb 3 Stunden zugetropft und weitere 2 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt.

Das Polymere wird abgesaugt, mehrmals mit Benzol und Petroläther (Kp 30 - 50° c) gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 96 g

Schüttvolumen: 14 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 18,2 ml/g

spez. Oberfläche: 70 m²/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 0,5 mÄquiv/g

Le A 14 345 - 25 -

309842/1201

BeisOiel 5 b " . ■ '

0,4 g des nach Beispiel 5 a hergestellten Harzes wurden mit 40 mg Glutathion in 32 ml Wasser 16 Stunden unter Konstanthaltung von pH 6,3 bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und nach Beispiel 3 d gewaschen und getrocknet. Es wurden 0,46 g Harz erhalten, das 0,9 % N nach Dumas enthielt. Dem entspricht ein Gehalt von 6,6 % oder 30,4 mg Glutathion, das sind 76 % der eingesetzten Menge. ·

Beispiel 6 a

ATt

Eine Lösung von 62,5 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 37,5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 150 ml Butylacetat und 1 1 Benzin (Kp 100 - i40 C) wird unter Rühren 2 Stunden bei 70° c, 2 Stunden bei 75° C und 1,5 Stunden bei 90° C polymerisiert. Das Polymere wird abgesaugt,

24 Stunden im Soxhlet-Extraktor mit Benzol extrahiert und im Vakuum getrocknet. ·-' ■ '

Ausbeute: 77 g "

Schüttvolumen: 7,3 ml/g . ' . · Quellvolumen in Wasser: 8,2 ml/g

spez. Oberfläche: 19,4 m²/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppent 4,0 mÄquiv/g.

Beispiel 6 b , .

Die Umsetzung von 1 g des nach Beispiel 6 a hergestellten Trägerhärzes mit Penicillin-Acylase analog zu Beispiel 1 b lieferte folgende Ergebnisse: .

Le A 14 345 · - 26 -

309842/1201

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)

Ausgangslösung: 107 U
überstand und Waschlösungen: 28 U Trägerharz nach der Umsetzung: 55 U das sind 51 % der Ausgangsaktivität.

Beispiel 7 a

Eine Lösung von 90 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat,10 g Maleinsäureanhydrid und 1,0 g Azoisobuttersäurenitril in 200 ml Acetonitril wird in 1000 ml Benzin (Kp 100-140⁰C), in dem 5 g eines Gemisches von Glycerin-mono- und -dioleat gelöst wurden, suspendiert. Das Reaktionsgemisch wird bis zur Bildung fester Perlen (ca. 2 Stunden) bei 60° C und anschließend 20 Stunden bei 65° C polymerisiert. Das Polymerisat wird abfiltriert, dreimal in Benzol und dreimal in Petroläther (Kp 30 - 50° C) aufgeschlämmt und im Vakuum bei 5O⁰C getrocknet.

"Ausbeute: 94 g ,

mittlerer Teilchendurchmesser: n/0,35 mm Schüttvolumen: 2,8 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 3,1 ml/g

spez. Oberfläche: 3,4 m /g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 1,5 mÄquiv/g.

Beispiel 7 b

Die Umsetzung von 1 g des nach Beispiel 7 a hergestellten Trägerharzes mit Penicillin-Acylase analog zu Beispiel 1 b lieferte folgende Ergebnisse:

Le A lit 345 - 27 -

309842/1201

AXZiv-LXaten (WZcAB-Tesrtf

k^Z?i^%V1te>JZi&ri -I'D? TJ .

Überstand und Waschlösungen:. 51 ü Trägerharz nach der Umsetzung: 19 U das sind 18 % der Ausgangsaktivität.

Le A 14 3^5 - 28 -

, 309842/1201

Beispiele für die P.enicillinspaltung £ £ \ OO

Beispiel 8

79 'g feuchte trägergebundene Penicillinacylase mit einer Aktivität von 687U (NIPAB-Test) die durch .Bindung von Penicillinacylase an ein Copolymerisat aus Äthylenglykoldimethacrylat und Maleinsäureanhydrid nach Beispiel 2 dargestellt worden ist werden mit 129 g Penicillin G-Kalium in 2000 ml Wasser 9 Stunden bei 38 G gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird hierbei durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7,8 gehalten.. Die Aufnahme an Triäthylamin kommt mit Beendigung der Reaktion zum Stillstand. Die trägergebundene Penicillinacylase wird abzentrifugiert oder abgesaugt, mit jeweils 200 ml V/asser und 0,2 M-Phosphatpuffer pH 6,5 nachgewaschen; sie ist damit für einen neuen Ansatz bereit. Das Filtrat, einschließlich der Waschlösungen wird im Vakuum auf 300 ml eingeengt. Die 6-APS wird durch Zugabe von halbkonzentrierter Salzsäure am isoelektrischen Punkt bei pH 4,3 in Gegenwart von 200 ml Methylisobutylketon ausgefällt. Nach einer Stunde wird abgesaugt, mit 200 ml Wasser und dann mit 200 ml Aceton nachgewaschen. Die 6-APS wird im Vakuum bei HQ⁰C getrocknet; Schmelzpunkt 2O8°C. Die Ausbeute an 6-APS beträgt 67,8 g, das sind 90,5 % der Theorie. Die Reinheit beträgt 98$.

Beispiel 9

60 g feuchte, trägergebundene Penicillinacylase mit einer Aktivität von 673U (NIPAB-Test) die durch Bindung von Penir cillinacylase an ein Copolymerisat aus Tetraäthylenglykoldimethacrylat und Maleinsäureanhydrid gemäß Beispiel 1 hergestellt worden ist, werden mit 129 g Penicillin G-Kalium in

Le A 14 3^5 - 29 -

309842/1201

2000 ml Wasser 9 Stunden bei 38° C gerührt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von,Triäthylamin auf 7,8 konstant gehalten. Die weitere Aufarbeitung wird analog zu Beispiel. 1 durchgeführt. Die. Ausbeute an 6-APS beträgt 65,3 g, das sind 87 % der Theorie,

Le A 14 3^5 - - 30 -

3 0 9842/1201

Claims

3S

1) Wasserunlösliches Proteinpräparat,^: dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Protein handelt, welches an ein vernetztes Copolymerisat gebunden ist, das aus copolymerisierten Einheiten von '

A 0.1-50 Gew.-% <X,ß-monoolefinisch ungesättigten

Dicarbonsäureanhydriden mit 4-9 Kohlenstoffatomen und

B 99.9 - 50 Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylaten

von Di- und/oder Polyolen,

2-20 ml/g, spezifische Ocerfläcrjen von 1--T0 zi~/ ir ':5i::.£fr. und nach der Verseifunp; der Anhydridgruppen 0,02-10 Milliäquivalente Säure pro Gramm enthalten.

2) Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die copolymerisierten Einheiten der Komponente A des Copolymerisates aus Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid und die copolymerisierten Einheiten der Komponente B des Copolymerisates aus Di(Meth)Acrylaten von Diolen mit 2-4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1-20 Molen Alkylenoxid mit 2-4 Kohlenstoffatomen bzw. aus Trimethylolpropantrimethacrylat bestehen.

3) Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die copolymerisierten Einheiten der Komponente A des Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und die der Komponente B aus Dimethacrylaten von Xthylen-

Le A 14 345 - 31 -

309842/1201

BAD ORIGINAL

glykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol, Tetr α ei L h^ ten -glykol oder höheren Polyäthylenglykolen rait Molgewichten bis 1000 bestehen. ·

4) Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gebundenen Protein um ein Enzym handelt.

5) Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gebundenen Protein um einen Enzyminhibitor handelt.

6) Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gebundenen Protein um Penicillinacylase handelt.

Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Proteinpräparaten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man - bezogen auf Gesamtmonomere des Copolymerisate -

A 0.1-70 Gew.-% Qi, ß-monoolef inisch ungesättigte

Dicarbonsäureanhydride mit 4-9 Kohlenstoffatomen und

B 99,9-30 Gew.-% Di- und/oder Poly (Meth)Acrylate von

Di- und/oder Polyolen

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösüngsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, be'i Temperaturen von 20-200°C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert und anschließend das Copolymerisat in einer wäßrigen Suspension mit einer Proteinlösung zu wasserunlöslichen Proteinpräparaten umsetzt.

Le A 14 345 - 32 τ

309842/1201

2275539

ö) Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Penicillinacylasepräparates dadurch gekennzeichnet, daß man bezogen auf Gesamtmonomere des Copolymerisats -

DisarDonsaurearJiydriäe rJLz 4-9 Kohlenstoffator.en und

B 99.9-3Ο Gew.-55 Di- und/oder Poly (Meth)Acrylate von

Di- und/oder Polyolen

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgenisehen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20-200⁰C in Gegenwart Rakikale bildender Verbindungen polymerisiert und anschließend mit wäßriger, salzarmer Penicillinacylaselösung in einem pH-3ereich von 5,7 bis 6,8 zu einem wasserunlöslichen Penicillinacylasepräparat umsetzt.

9) Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Penicillinacylasepräparates gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Salzkonzentration des Reaktionsmediums zu Beginn der Umsetzungsreaktion des Copolymersates mit der Penicillinacylaselösung weniger als 0,02 Mol/l beträgt.

10) Verwendung eines wasserunlöslichen Enzympräparates gemäß Anspruch 4 ζμΓ Durchführung einer durch Enzyme katalysierbaren Reaktion.

' Le A 14 545 - 33 -

309842/1201

BAD

11) Verwendung eines wasserunlöslichen Enzympräparates gemäß Anspruch 4 zur hydrolytischen Spaltung von Substraten.

12) Verwendung von wasserunlöslicher Penicillinacylase gemäß .Anspruch 6 zur Spaltung von Penicillinen unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure.

. 7 3

Le A 1*4 3^5 - 3¹+ -

309842/1201

Le A 14 345 Anlage zur Eingabe vom 3//. Λ

Patentansprüche

13) Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Proteinpräparaten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man an ein vernetztes Copolymerisat, das aus copolymerisierten Einheiten von

A) 0,1 - 50 Gew.-%06,ß-monolefinisch ungesättigten Dicarbon-

säureanhydriden mit 4-9 Kohlenstoffatomen und

B) 99,9 - 50 Gew.-?6 Di- und/oder Poly(Meth)Acrylaten-von

Di- und/oder Polyolen besteht, in wäßriger Suspension mit einer Proteinlösung umsetzt.

14) Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Penicillinacylasepräparates, dadurch gekennzeichnet, daß man an ein vernetztes Copolymerisat, das aus copolymerisierten Einheiten von

A) 0,1 - 50 Gew.-%o(/,ß-monoolefinisch ungesättigten Dicarbon-

säureanhydriden mit 4-9 Kohlenstoffatomen und

B) 99,9 - 50 Gew.-% Di- und/oder Poly(Meth)Acrylaten von Di-

und/oder Polyolen

besteht, mit wäßriger, salzarmer Penicillinacylaselösung in einem pH-Bereich von 5,7 bis 6,8 umsetzt.

15) Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Penicillinacylasepräparates gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Salzkonzentration des Reaktionsmediums zu Beginn der Umsetzungsreaktion des Copolymerisates mit der Peniciilinacylaselösung weniger als 0,02 Mol/l beträgt.

3098Λ2/1201