DE2214442B2 - Verfahren zur Überführung von Glucose in Gluconsäure - Google Patents

Verfahren zur Überführung von Glucose in Gluconsäure

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Description

D-Glucose + H2O + O2
GOD1
Gluconat + H2O2
Der Einsatz der gelösten GOD für die oben genannte Reaktion ist technisch untragbar, da das kostspielige Enzym nur für einen einzigen Reaktionsansatz verwen det werden kann und bei präparat!ven Ansätzen zudem eine Abtrennung des Enzymeiweißes notwendig ist Theoretisch könnten diese Schwierigkeiten zwar dadurch beseitigt werden, daß GOD auf einem unlöslichen Träger gebunden angewendet wird. Es hat sich jedoch herausgestellt daß dies in der Praxis undurchführbar ist, da die trägergebundene GOD zwar leicht abgetrennt werden kann, aber innerhalb kürzester
Zeit inaktiviert wird. Ausgehend von der Annahme, daß für diese
Inaktivierung mindestens teilweise das gebildete Wasserstoffperoxid verantwortlich ist wurde daher versucht diese Schwierigkeit durch Zusatz des Enzyms Katalase zum Reaktionsansatz zu beseitigen. Katalase zersetzt Peroxid katalytisch unter Bildung von Sauer stoff und Wasser gemäß nachstehender Gleichung:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überführung von Glucose in Gluconsäure durch Oxidation von Glucose in Gegenwart eines Katalysators.
Die Überführung von Glucose in Gluconsäure ist für viele technische Zwecke von großem Interesse. Hauptsächlich handelt es sich hierbei um Probleme bei der Abtrennung und Entfernung von Glucose aus glucosehaltigen Gemischen mit anderen Substanzen, insbesondere weiteren Zuckern wie Fructose und andererseits um die präparative Herstellung von Gluconsäure. Die Abtrennung von Glucose ist ein besonderes Problem, beispielsweise bei Zuckern, die noch geringere Glucosemengen enthalten, die sich äußerst schwierig entfernen lassen. Ein typischer derartiger Fall ist die Herstellung von Fructose für diätetische Zwecke und Arzneimittel, wobei es vielfach äußerst schwierig ist, den Glucosegehalt so weit zu senken, wie es die gesetzlichen Vorschriften erfordern. Ähnliche Probleme treten bei Nahrungsmitteln, insbesondere solchen für Diabetiker auf, beispielsweise bei Fruchtsäften, Bier und Wein, bei denen großer Bedarf für einfache Methoden zur Entfernung des darin enthaltenen Zuckers besteht. Es ist bekannt, daß Glucose durch Oxidation mit Sauerstoff in wäßriger Lösung in Gluconsäure unter der katalytischen Wirkung des Enzyms Glucoseoxydase umgewandelt werden kann. Dieses Verfahren eignet sich jedoch nicht zur technischen Anwendung, da das Enzym Glycoseoxydase hierbei sehr rasch seine Aktivität verliert und so teuer ist, daß ein Einsatz der benötigten großen Mengen praktisch ausgeschlossen ist.
Aufgabe der Erfindung ist es, die oben beschriebenen Schwierigkeiten zu beseitigen und ein einfaches Verfahren zur Überführung von Glucose in Gluconsäure zu schaffen, welches die Nachteile des bekannten Verfahrens vermeidet.
Gelöst wird dieses Problem erfindungsgemäß durch das in den Patentansprüchen definierte Verfahren.
Die enzymatische Überführung der Glucose in Gluconsäure durch Oxidation mit Sauerstoff in Gegen- ίο Die durchgeführten Versuche zeigten jedoch, daß auch bei Gegenwart von Katalase die rasche Inaktivierung der GOD nicht vermieden werden kann.
Es wurde daher versucht neben trägergebundener GOD trägergebundene Katalase in Mischung mit der trägergebundenen GOD einzusetzen. Um eine möglichst innige Berührung und damit eine sofortige Beseitigung neu gebildeten Wasserstoffperoxids zu erreichen, wurden die Enzyme jeweils an feintsiliges Trägermaterial fixiert und die erhaltenen feinteiligen Träger miteinander gemischt eingesetzt Aber auch auf diese Weise konnten die geschilderten Schwierigkeiten nicht beseitigt werden, so daß angenommen werden mußte, daß der Wasserstoffperoxidbildung keine entscheidende Bedeutung für die festgestellte rasche
Inaktivierung der GOD zukommt.
Überraschenderweise wurde nunmehr gefunden, daß das geschilderte Problem überwunden werden kann, indem wie oben angegeben Glucoseoxydase und Katalase in unmittelbarer Nachbarschaft gewisserma- Ben in molekülnachbarlicher Anordnung auf einem geeigneten Träger gebunden verwendet werden. Dieses erfindungswesentliche Merkmal bedeutet, daß in grober Annäherung am Träger sozusagen ein GOD-Molekül neben einem Katalasemolekül gebunden vorliegt. Es wird angenommen, daß hierbei im molekularen Bereich eine Art Kreislaufreaktion stattfindet bei der von GOD gebildetes H2O2 von in unmittelbarer Nachbarschaft befindlicher Katalase wieder zerlegt wird, ehe das H2O2 auf ein weiteres GOD-Molekül einwirken kann.
bo Aus den oben angegebenen Formeln ist ersichtlich, daß beim Verfahren der Erfindung nur bei höheren Glucosekonzentrationen zusätzlicher Sauerstoff erforderlich ist, da der zunächst eingesetzte Sauerstoff stets zurückgebildet wird. Es hat sich jedoch als vorteilhaft herausgestellt, zusätzlichen Sauerstoff zuzuführen, auch wenn der Glucosegehalt in der zu behandelnden Lösung den durch die Temperatur der Lösung bedingten Sauerstoffgehalt der Lösung auf molarer Basis nicht
wesentlich überschreitet, da in jedem Fall durch Sauerstoffzugabe zur Lösung eine erhebliche Beschleunigung der Umsetzung bewirkt wird.
Die Zufuhr von Sauerstoff kann in Form von reinem Sauerstoff oder von Sauerstoff enthaltenden Mitteln, insbesondere Gasen, wie Luft, erfolgen. Bevorzugt wird die Zugabe von Sauerstoff ohne größere Beimengungen an Fremdgasen.
Das Verfahren der Erfindung muß bei pH-Werten durchgeführt werden, in denen die Enzyme Glucoseoxidase und Kataiase aktiv sind, nämlich zwischen 3,5 und 8. Besonders gute Ergebnisse werden im pH-Wertbereich zwischen 4,5 und 7 erzielt Die maximale Aktivität wurde in vielen Versuchen bei pH-Weiten zwischen 5 und 5,5 gemessen. Der pH-Wert der maximalen Aktivität ist auch von der Herkunft der Enzyme abhängig, z. B. ob fine Kataiase aus Schimmelpilzen, die bevorzugt wird, oder Säugetierleberkatalase verwendet wird.
Die Aufrechterhaltung des gewünschten pH-Wertbereichs kann nach den für die pH-Wertregelung üblichen Methoden der Chemie erfolgen, soweit hierdurch die Aktivität der Enzyme nicht nachteilig verändert wird. Gute Ergebnisse wurden durch Zusatz von Laugen, wie insbesondere der alkalisch reagierenden Verbindungen der Alkalimetalle wie z. B. Natronlauge, Natriumcarbonat oder Kalilauge erhalten. Auch organische Basen erwiesen sich in gleicher Weise für die pH-Werteinstellung geeignet
Als besonders zweckmäßig hat sich eine Konstanthaltung des pH-Wertes innerhalb des bevorzugten pH-Wertbereiches erwiesen. Eine solche Konstanthaltung kann beispielsweise durch automatische Titration unter Verwendung einer Glaselektrode und eines pH-Staten erfolgen. Durch die Meßergebnisse der pH-Elektrode öffnet der pH-Stat ein Ventil, welches den Auslauf einer Lauge wie z.B. Natronlauge in das Reaktionsgefäß kontrolliert
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bei Temperaturen durchgeführt, bei denen die Aktivität der Enzyme in einer technisch brauchbaren Größenordnung liegt, nämlich zwischen 10 und 600C. Bei höheren Temperaturen erfolgt eine merkliche Denaturierung der Enzyme, bei niedrigeren Temperaturen wird die Umsetzungsgeschwindigkeit zu langsam. Vorzugsweise wird bei Temperaturen zwischen 25 und 50° C gearbeitet.
Das Verfahren der Erfindung kann ansatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Die ansatzweise Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich besonders einfach so durchführen, daß einem geeigneten Reaktionsbehälter, der die glucosehaltige wäßrige Lösung enthält, der erfindungsgemäß verwendete Katalysator zugegeben und solange in der Lösung belassen wird, bis die gewünschte Umsetzung abgelaufen ist. Zweckmäßig wird die Lösung dabei in üblicher Weise bewegt, wobei Sauerstoff cingeblasen wird, was einerseits die gewünschte Anreicherung mit Sauerstoff und anderersetis das Umwälzen der Lösung bewirkt. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator entfernt, beispielsweise durch Abzentrifugieren oder Dekantieren. Der Katalysator kann dann ohne weitere Maßnahmen wieder verwendet werden und auch die behandelte Lösung selbst kann als solche weiter verwendet werden, beispielsweise wenn es sich um glucosehaltige Säfte handelt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Umsetzung im Kreislauf. Dies ermöglicht eine besonders einfache Steuerung des Verfahrens. Außerdem läßt sich auf diese Weise die gebildete Gluconsäure abtrennen und damit aus dem Gleichgewicht entfernen, so daß die Umsetzung besonders rasch und quantitativ abläuft Die Abtrennung der Gluconsäure kann nach üblichen Methoden erfolgen, beispielsweise durch Bindung an einen Anionenaustauscher, Überführung in ein schwer lösliches Salz oder sonstiges Derivat oder Abtrennung nach anderen bekannten physikalischen oder chemi sehen Methoden.
Besonders zweckmäßig bei dieser Ausführungsform ist die Entfernung der Gluconsäure durch Anionenaustauscherpassage. Da bei der kontinuierlichen Umsetzung im Kreislauf der erfindungsgemäß verwendete
ι s Katalysator ebenfalls zweckmäßig in Säulen angewendet wird, die von der zu behandelnden Lösung durchströmt werden, kann das Verfahren durch einfache Hintereinanderschaltung von wenigstens zwei Säulen durchgeführt werden, wobei die erste Säule den erfindungsgemäßen Katalysator und die zweite Säule das Anionenaustauscherharz enthält
Der erfindungsgemäß verwendete Katalysator läßt sich erhalten, indem GOD und Kataiase gemischt aus wäßriger Lösung an einen geeigneten Träger fixiert werden. Geeignete Träger und Fixierungsmethoden sind beispielsweise in der DE-OS 19 08 290 und der DE-PS 21 28 743 beschrieben. Die Art des jeweils verwendeten Trägers ist hierbei nicht kritisch, solange nur GOD und Katalysator in unmittelbarer Nachbar-
jo schaft gemeinsam am Träger gebunden vorliegen.
Das Verhältnis der Aktivitäten von GOD zu Kataiase am Träger sollte zweckmäßig 1 :1 nicht überschreiten. Vorzugsweise sollte das Verhältnis 1:10 oder größer sein. Sehr gute Ergebnisse wurden mit Aktivitätsver hältnissen bis 1 :200 erzielt Es ist jedoch anzunehmen, daß noch wesentlich höhere Aktivitätsverhältnisse ebenfalls ausgezeichnete Ergebnisse liefern. Ein besonderer Vorzug der hohen Aktivitätsverhältnisse, d.h. einer hohen gebundenen Katalaseaktivität im Verhält nis zur GOD-Aktivität besteht darin, daß der Sauer stoffbedarf hierdurch wesentlich herabgesetzt wird. Diese Verringerung des Sauerstoffbedarfs beruht auf der unverzüglichen Neubildung von Sauerstoff aus H2O2 gemäß Gleichung (2).
Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber bekannten chemischen Verfahren zur Überführung von Glucose in Gluconsäure und zur Abtrennung von Glucose aus dieses enthaltenden wäßrigen Lösungen den Vorteil der absoluten Spezifität und außerordentli chen Einfachheit. Auch in Gegenwart sehr großer Mengen chemisch ähnlicher Substanzen kann das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden. So ermöglicht es die Entfernung kleiner Glucosemengen bei Gegenwart anderer Zucker, wie z. B. Fructose in weit überwiegenden Mengen. Durch das Verfahren der Erfindung werden damit Aufgaben lösbar, die mit den bisher bekannten chemischen und physikalisch-chemischen Methoden nicht lösbar waren. Die Anwendungsmöglichkeit des Verfahrens der Erfindung ist außeror- dentlich vielfältig und reicht von der Glucoseentfernung aus Lebensmitteln und Getränken bis zur Herstellung von glucosefreien Präparaten für die Arzneimittelindustrie und bis zur technischen Herstellung von Gluconsäure. Ein besonderer Vorzug des Verfahrens bei
t>5 Anwendung auf Getränke wie Fruchtsäfte, Bier und Wein liegt darin, daß die gebildete Gluconsäure zwar leicht entfernt werden kann, aber nicht entfernt werden muß, da sie selbst ein Geschmacksträger ist, welcher die
Geschmackseigenschaften der behandelten Getränke vorteilhaft abrundet
Im folgenden wird die Herstellung von trägergebundener GOD-Katalase für das Verfahren der Erfindung beschrieben.
A. 50 mg eines handelsüblichen GOD-Präparates mit einer spezifischen Aktivität von 220 U/mg werden in ImI 0^m Triäthanolamin/HCl-Puffer pH 8,0 gelöst unter Einleiten von Stickstoff bei 30° C mit 0,25 ml Acrylsäure-23-epoxipropyIester versetzt und etwa 30 Minuten bei dieser Temperatur gerührt Anschließend wird auf 10° C abgekühlt Dann werden nacheinander 3,0 g Acrylamid, 0,1 g Ν,Ν'-MethyIen-bis-acrylamid und 300 mg eines Enzympräparates mit einer GOD-Aktivi- ·, tat von 20 U/mg und einer Katalaseaktivität von 260 U/mg nacheinander in 18 ml destilliertem Wasser gelöst und in das Reaktionsgefäß gebracht Dann wird die Polymerisationsreaktin durch Zusatz von 50 mg Benzoylperoxid und 0,5 ml 5%ige Ν,Ν-Dimethylamino- J0 propionitrillösung gestartet Nach Beendigung der Polymerisation (ca. 1 Stunde) wird etwa 12 bis 18 Stunden bei 4° C stehen gelassen. Dann wird das gebildete Polymerisat durch ein Sieb mit 4 mm Maschenweite gedrückt gewaschen und getrocknet. Die spezifische Aktivität der trägergebundenen Enzyme beträgt:
GOD 281 U/mg (photometrischer GOD-Test nach H. U. Bergmeyer »Methoden der enzymatischen Analyse«. Bd. I. S. 416 (1970). Katalase: 185 U/mg (manometrische Bestimmung des freigesetzten O2).
Das erhaltene Präparat wird im folgenden als GOD-Katalase A bezeichnet >-,
B. 1,5 g eines Enzympräparates mit einer GOD-Aktivität von 20 U/mg und einer Katalaseaktivität von 260 U/mg sowie 50 mg einer Katalase der spezifischen Aktivität 39 000 U/mg wurden in 15 ml destilliertem Wasser und 7,5 ml 1 m Triäthanolamin/HCl-Puffer pH 4(l 8,0 gelöst. Dann wurden 1,25 ml Acrylsäure-2,3-epoxypropylester unter Stickstoffatmosphäre bei 30° C zugegeben. Dann wird 30 Minuten bei dieser Temperatur leicht gerührt auf 10°C abgekühlt und mit 15 g Acrylamid und 0,75 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid in 4> 78 ml destilliertem Wasser versetzt Die Polymerisation wird durch Zusatz von 3 ml 5%ige Ammoniumperoxidisulfatlösung und 3 ml 5%ige Dimethylaminopropionitrillösung gestartet. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Versuch A. beschrieben.
Die spezifische Aktivität der erhaltenen GOD-Katalase beträgt:
GOD: 95 U/g (photometrisch).
Katalase: 4200 U/g (photometrisch nach H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Bd. 1, Seite 339 (1970)).
Dieses GOD-Katalase-Präparat wird im folgenden als GOD-Katalase B bezeichnet t,o
Beispiel 1
Ansatzweise Durchführung des Verfahrens
20 g (0,11 Mol) Fructose und 1,1g (0,0055 MoI) Glucosehydrat wurden mit Wasser auf 200 ml gelöst. Die Lösung wurde in ein thermostatisch geregeltes Reaktionsgefäß gegeben, mit dem eins Temperatur von
50
55 35°C eingestellt wurde. Im Reaktionsgefäß befand sich eine pH-Elektrode, die über einen pH-Stat mit einer mit 0,2 η NaOH-Lösung gefüllten Pürette verbunden war. Der pH-Weit von 5,5 wurde konstant gehalten, indem bei einem Absinken durch im Laufe der Reaktion gebildete Glueonsäure die entsprechende Menge NaOH automatisch zufließen gelaasen wurde.
Außerdem enthielt das Reaktionsgefäß ein Sauerstoffeinleitungsrohr mit Fritte, durch welches 101 Sauerstoff pro Stunde eingeleitet wurden.
Der Fructose-GIucose-Lösung wurden nun 250 mg einer trägergebundenen GOD mit einer spezifischen Aktivität von 300 U/g zugesetzt In Abständen von 50 Minuten wurde der Glucosegehalt der Lösung bestimmt Nach 100 Minuten waren 20% der eingesetzten Glucose in Glueonsäure umgewandelt
In einem weiteren Versuch wurde das oben beschriebene Verfahren wiederholt mit dem Unterschied, daß zusätzlich 2 mg einer Katalase mit einer spezifischen Aktivität von 40 000 U/mg der Lösung zugesetzt wurden. Nach 100 Minuten betrug der Glucoseumsatz 30%, nach 200 Minuten 40%. Bei noch längerer Reaktionsdauer wurde die GOD inaktiviert und konnte nicht mehr aktiviert werden.
In einem weiteren Versuch wurde der erfindungsgemäßen Arbeitsweise gefolgt Es wurde wieder wie im vorhergehenden Versuch beschrieben vorgegangen, anstelle von trägergebundener GOD und gelöster Katalase wurde jedoch das oben beschriebene GOD-Katalase-Präparat A in einer Menge von 250 mg zugesetzt. Nach 100 Minuten betrug die Umsetzung etwa 50%, nach 200 Minuten 70% der eingesetzten Glucose. Eine Inaktivierung des Enzyms erfolgte nicht und bei fortdauernder Umsetzung konnte praktisch die gesamte Glucose in Gluconsäure umgewandelt werden.
Das oben beschriebene Verfahren wurde noch einmal wiederholt unter Verwendung des oben beschriebenen GOD-Katalase-Präparates B. Nach 100 Minuten waren etwa 40%, nach 200 Minuten 94% der Glucose in Gluconsäure überführt. Nach 220 Minuten waren mehr als 99% der Glucose umgesetzt.
Die oben beschriebenen Versuche zeigen, daß erfindungsgemäß trotz Einsatz wesentlich niedrigerer Enzymaktivitäten weitaus höhere Umsätze erzielt werden. Außerdem tritt erfindungsgemäß keine merkliche Inaktivierung des Katalysators ein, während bei den Vergleichsversuchen ohne Katalase und mit gelöster Katalase trotz hoher Enzymaktivitäten eine rasche irreversible Inaktivierung der Enzyme erfolgte.
Beispiel 2
Kontinuierliche Umsetzung
1 g des trägergebundenen GOD-Katalase-Präparates B wurden in destilliertem Wasser suspendiert und aufquellen gelassen. Anschließend wurden sie in eine Säule von 20 mm Innendurchmesser und 5 cm Länge gefüllt. Über diese Säule wurde eine Lösung von 50 g Fructose und 2,75 g Glucosehydrat in 500 ml Wasser, die bei 25° C von Luft durchperlt wurde, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,2 1 pro Stunde gegeben. Nach Durchlauf der Reaktionslösung wurde der pH-Wert mit 0,2 η Natronlauge wieder auf 6,5 eingestellt, Sauerstoff durchgeleitet und dann die Lösung wieder erneut im Kreislauf über die Säule gegeben. Pro Durchlauf wurden 100 bis 120 mgGlucose in Gluconsäure überführt. Nach 23 Durchläufen waren
Beispiel 3
Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch wurde der Enzymsäule eine Anionenaustauschersäule (Acetat-beladenes IMAC A 27) nachgeschaltet und die pH-Wertregulierung durch Natronlaugezusatz weggelassen. Die aus der Austauschersäule auslaufende Lösung enthielt nur noch 0,086% Gluconsäure, bezogen auf den Fructosegehalt.
Beispiel 4
Der nachstehend beschriebene Versuch zeigt, daß die Geschwindigkeit der Glucoseumwandlung abhängt vom Verhältnis Glucose : GOD-Katalase-Katalysator in der Lösung.
Es wurde wie in Beispiel I beschrieben im ansatzweisen Verfahren eine Lösung von 20 g Fructose und 1,1 g Glucose bei 4O0C, pH 5,5 und Durchleiten von Luft mit dem erfindungsgemäß verwendeten Katalysator A gemischt. Die nach jeweils 100 Minuten Reaktionsdauer mit verschiedenen Mengen Katalysator erhaltenen Ergebnisse zeigt nachstehende Tabelle:
Katalysalormcnge
Umgesetzte Glucose nach 100 Minuten
24% 69%

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Überführung von Glucose in Gluconsäure durch Oxidation mittels Sauerstoff in wäßriger Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man einer glucosehaltigen wäßrigen Lösung in Gegenwart eines Katalysators, der Glucoseoxidase und Katalase in molekülnachbarlicher Anordnung gemeinsam auf einem geeigneten Träger gebunden enthält, Sauerstoff zuführt und während der Umsetzung den pH-Wert zwischen 3,5 und 8 und die Temperatur zwischen 10 und 60° C hält
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert zwischen 4,5 und 7 hält
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Temperatur zwischen 25 und 500C hält
wart von Glucoseoxydase (GOD) verläuft nach folgender allgemeiner Formel:
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