DE2153479B2 - Verfahren zum Nachweisen einer weißen Blutzellenart - Google Patents
Verfahren zum Nachweisen einer weißen BlutzellenartInfo
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Description
5 6
Zähleinrichtung fälschlicherweise al« Zelle gezählt um diese Funktion durchzuführen, im Vergleich zu
werden könnten. Weiterhin besteht keine Gefahr, daß hohen Konzentrationen und hohen Temperaturen,
irgendwelche Niederschläge oder Ausfällungen den So benötigt beispielsweise eine 2°/oige Formaldehyd-Kanal
verstopfen könnten, durch den die Suspension konzentration in der Lösung bei 40C 12 Stunden,
mit den fixierten, gefärbten Zellen auf ihrem Weg zu 5 während eine 4°/0ige Konzentration bei 50°C 2 Mieiner
Zähleinrichtung strömt. nuten benötigt. Da man im allgemsinen gleiche
Das als Fixiermittel benutzte Monoaldehyd bewirkt Volumen der Körperflüssigkeit und der Monokeine
Ausfällung der löslichen Bestandteile, die norma- aldehydlösung mischt, beträgt die Stärke der Aldehydlerweise
in einer die Zellen umgebenden Lösung vor- lösung das Doppelte der Konzentration beim Fixierhanden
sind, und bewahrt die Morphologie der io Zeitpunkt des Aldehyds in der Lösung. Die folgenden
Zellen, so daß die katalytischen Enzyme innerhalb Formalinlösungen liefern gute Ergebnisse:
der Zellen bleiben und auch die klassischen Identifiziereigenschaften der Zellen praktisch nicht verloren Lösung I
gehen. Wenn Gesamtblut analysiert werden soll, kann
man entweder vor oder nach der Zugabe des Substrats 15 (20% Formalin)
und des pH-Puffers einen Hämolyseschritt vorsehen, (pH-Wert — 7,2) um die in dem Gesamtblut vorhandenen roten Blutzellen
zu zerbrechen und ihren Hämoglobingehalt in Na2HPO4 6,5 g
die Lösung zu entlassen. Nachdem die besondere NaH2PO4 4,0 g
Leukozytenart gefärbt ist, wird die Lösung mit den ao Formalin-Stamialösung 200 ml
Leukozyten durch die fotometrische Zähleinrichtung
geschickt, die selbsttätig die Anzahl der vorhandenen Diesen Mengen wird Wasser zugegeben, bis das
gefärbten Zellen zählt. Die Ausbildung eines starken endgültige Volumen 1000 ml beträgt. Dieses Reagenz
Farbstoffniederschlags in der ausgewählten Zellenart wird zum Bestimmen des Gehalts an Eosinophilen
ermöglicht es dem fotometrischen Zähler, diese Zellen 25 und Neutrophilen durch Peroxidasefärbung benutzt.
von anderen in der Lösung befindlichen Zellen zu
unterscheiden. Lösung II
Da sehr viele Zellenzyme sehr leicht beschädigt oder
bereits bei der geringsten Handhabung von den (20 % Formalin)
Zellen freigegeben werden, ist es notwendig, daß das 30 (pH-Wert = 7,2)
als Fixiermittel zugegebene Monoaldehyd die meta- jtq ^«
bolischen Vorgänge bzw. Stoffwechselvorgänge unter- l/15-molares KH2PO4"'.'.".".'.'.'.'.'.''. δ',Ο ml
bricht, also die Zellen tötet, und die in den Zellen l/15-molares K2HPO4 32,0 ml
befindlichen interessierenden Enzyme immobilisiert, Formalin-Stammlösung 20 0 ml
ohne daß dabei die katalytisch^ Wirksamkeit der 35 jj O 43 0 ml
Enzyme in einem hohen Maß nachteilig beeinträchtigt 2
wird. Dies sind dieselben Anforderungen wie bei der 100,0 ml
cytologischen Fixierung in der klassischen Enzym-
cytochemie. Hierzu wird beispielsweise auf die folgen- Die folgenden Stammlösungen werden benutzt, um
den Druckschriften verwiesen: A. W ach t el et al, 40 die obigen Formalin-Arbeitslösungen herzustellen:
3. Histochem, and Cytochem., Band 7, S. 291 (1959)
und B. J. D a ν i s et al, J. Histochem. and Cytochem., l/15-molares KH2PO4 (einfachbasisch): etwa
Band 7, S. 291 und 292 (1959). 9,07 g KH2PO4 aufgelöst in 11 destilliertem
Darüber hinaus genügt das bei dem erfindungs- Wasser.
gemäßen Verfahren verwendete Monoaldehyd der 45 l/15-molares K2HPO4 (zweifachbasisch): etwa
Forderung, daß die Fixierlösung irgendwelche der 11,61 g K2HPO4 aufgelöst in 11 destilliertem
zuvor löslichen Bestandteile in der extracellulären Wasser.
Lösung nicht ausfällt. Diese Eigenschaft des nach der Formalin-Stammlösung: Eine 37%ige handels-
Erfindung verwendeten Fixiermittels steht im Gegen- übliche Formaldehydlösung,
satz zu den Forderungen bei den klassischen histo- 50
logischen Fixierverfahren, bei denen eine maximale Wenn die Körperflüssigkeit, die die weißen Blut-
Menge an intra- und extracellulären Substanzen zellen enthält, Gesamtblut ist, müssen die roten Blutunlöslich gemacht werden soll. Die bekannten cyto- zellen hämolysiert werden, da die Gefahr besteht
logischen Fixiermittel, beispielsweise Aceton, kommen daß der gleichzeitige Durchtritt von zwei oder mehre
daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht in 55 ren roten Blutzellen durch eine fotometrische Zähl
Frage. einrichtung irrtümlicherweise als eine gefärbte weißi
Eine bevorzugte cytologische Fixierlösung ist eine Blutzeile oder abnormale Zelle verstanden werdei
0,2- bis 40°/0ige wäßrige Lösung aus einem Mono- könnte. Die Gefahr des gleichzeitigen Durchtritt
aldehyd, beispielsweise Formaldehyd, Butyralaldehyd, könnte man dadurch vermindern, daß die Lösun;
Propionalaldehyd oder Acetaldehyd. Di-Aldehyde 60 verdünnt wird. Dies führt jedoch zu einer geringere!
sind nicht geeignet, da sie Querverbindungen eingehen Zählgeschwindigkeit. Es wird daher bevorzugt, di
und extra-zelluläre Niederschläge bilden. Acetone, roten Blutzellen durch Zugabe eines Reagenzes zu de
Säuren und die meisten Alkohole sind aus ähnlichen Zellensuspension zu hämolysieren, so daß die rote
Gründen ebenfalls nicht geeignet. Die Konzentration Blutzelien lediglich aufbrechen und ihren Inhal
des Monoaldehyds muß hoch genug sein, um die Zellen 65 beispielsweise Hämoglobin, in die Lösung abgebei
zu töten, ohne jedoch die Wirksamkeit der Enzyme Das hämolysierende Reagenz darf die suspendierte
zu beeinträchtigen. Bei geringen Konzentrationen und Zellen nicht zur Klumpenbildung anregen und da
tiefen Temperaturen benötigt man zusätzliche Zeit, nachfolgende histochemische Reaktionen nicht störe
es darf also beispielsweise mit irgendeiner der Substan- können. Zur Verwendung als cytochemisches Substrat
zen, die in späteren Schritten zum Färben der Zellen in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist beispielsweise
benutzt werden, nicht reagieren. Ferner darf das eine Mischung aus einem anorganischen oder orgahämolysierende
Reagenz nicht bewirken, daß die nischen Peroxid und aus 4-Chlor-l-naphthol geeignet,
interessierenden Enzyme der weißen Blutzellen in die 5 und zwar um eine Peroxidase enthaltende Zelle zu
Lösung austreten und daß sich lösliche Substanzen in färben, beispielsweise ein Eosinophil oder Neutrophil.
dem extrazellulären Medium niederschlagen. Das Peroxid und 4-Chlor-l-naphthol dienen als
Der Hämolyseschritt wird entweder vor oder nach Enzymsubstrate, und das 4-Chlor-l-naphthol wird
der Färbereaktion ausgeführt. Falls er nach dem darüber hinaus als Kopplungsreagenz verwendet.
Färben vorgenommen wird, darf er weder den Färb- xo Ohne Zugabe eines getrennten Chromogene ausstoß,
noch die gefärbten oder ungefärbten weißen fällenden Kopplungsreagenzes erzeugt das 4-Chlor-Blutzelleri
ändern. 1-naphthol innerhalb der Peroxidase enthaltenden
Bei deni vorliegenden Verfahren wird die Entfernung Zelle einen blauschwarzen Farbstoffniederschlag. Eine
der roten Blutzellen durch Hämolyse gegenüber einer Mischung aus o-Tolidin und 4-Chlor-l-naphthol kann
mechanischen Entfernung bevorzugt, da die Verwen- 15 man ebenfalls verwenden, um einen verschiedenartigen
dung eines Hämolysereagenzes sicherstellt, daß sich purpurroten Farbstoff zu erzeugen, wenn das beim
der gesamte Vorgang einfach abspielt. Bei der Ver- Fixierschritt benutzte Formaldehyd inaktiviert
Wendung eines solchen Reagenzes ist es nämlich wird.
lediglich erforderlich, sowohl beim kontinuierlichen Um einen wahren selektiven Färbevorgang zu
Strömungsverfahren als auch beim diskontinuierlichen ao erhalten, wird der pH-Wert der Lösung gesteuert.
Einzelbearbeitungsverfahren dem ursprünglichen Blut- Wenn der pH-Wert der Lösung unter 3,0 liegt, werden
volumen ein zusätzliches Lösungsvolumen zuzugeben. schwere Farbstoffniederschläge nur in Eosinophilen
Der Hämolyseschritt kann dadurch ausgeführt gebildet. Wenn der pH-Wert in der Lösung innerhalb
werden, daß der Lösung, die die roten und weißen eines Bereichs von 3,0 bis 5,0 liegt, werden schwere
Blutzellen enthält, eine wäßrige Lösung aus einer ali- 25 Farbstoff niederschläge nur in Eosinophilen und mittelphatischen
Säure mit einem pKa-Wert von etwa mäßige Farbstoffniederschläge nur in Neutrophilen
3,0 bis 5,5 zugegeben wird. Essig-, Propion-, Butter- erzeugt. Wenn der pH-Wert auf einen Bereich zwischen
oder Milchsäure in einer Konzentration von etwa 5,0 und 7,0 gepuffert ist, entstehen schwere Farbstoff-1
bis 10 % reichen aus. Eine Essigsäurelösung mit einer niederschlage nur in Eosinophilen und Neutrophilen.
Konzentration von etwa 7 % wird bevorzugt. Die 30 Wenn lipasehaltige Zellen, d. h. Monozyten, gefärbt
Lösung kann man in einem Temperaturbreich von et- werden sollen, wird nach der Erfindung vorzugsweise
wa37cCfürl0Minutenundbisetwa55°CfürlMinute eine Kombination aus einem Naphtholester, beispislserhitzen,
um die Katalyseenzyme zu inaktivieren, die weise 1-Naphthylacetat oder 1-Naphthylbutyrat, und
pseudoperoxidase Wirksamkeit des Hämoglobins zu aus einem Diazoniumsalz, beispielsweise Hexazoniumvermindern
und die Hämolyse zu beschleunigen. Bei 35 pararosanilin, verwendet, bei dem es sich um ein
niedrigen Temperaturen benötigt man eine längere Chromogene ausfällendes Kupplungsreagenz handelt.
Reaktionszeit. Höhere Temperaturen inaktivieren die Der optimale pH-Wert für diese Farbreaktion beträgt
Peroxidaseenzyme und fördern ein Verklumpen nach etwa 5,5 bis 6,5, vorzugsweise etwa 6,0. Bei einem
der Zugabe des Hämolysereagenzes. solchen pH-Wert werden lediglich in Monozyten
Bei den Färbeschritten handelt es sich um enzyma- 40 schwere Farbstoffniederschläge gebildet,
tische Färbungen, bei denen die morphologisch unzer- Die normalerweise bei der klassischen Esteraseli-
störte Zelle für die Erzeugung der Farbe direkt pasehistochemie verwendeten Substrate sind geringverantwortlich ist. Das Substrat und das Kopplungs- fügig unlöslich. Damit innerhalb einer kurzen Zeit,
reagenz werden innerhalb der Zelle durch eines der in beispielsweise 5 Minuten, eine hinreichende Farbentder
Zelle vorkommenden Enzyme in einen unlöslichen 45 wicklung auftritt, soll die Konzentration des Substrats
Farbstoff umgewandelt. Eine derartige Färbung er- in der endgültigen Inkubationslösung etwa 0,5 mg/ml
fordert eine schnelle Kopplung mit dem gespaltenen übersteigen. Naphthol-AS-Ester und ihre Derivate
Substrat und bedingt auch ein unlösliches Erzeugnis sowie 1-Naphthylbutyrate haben jedoch eine Löslichinnerhalb
der Zelle. Bezüglich dieser Kriterien wird keit von weniger als 0,5 mg/ml. Dieses Problem wird
verwiesen auf: Lehrer, G. M., et al, J. Biophysic. 50 vorzugsweise durch Zugabe bis zu einem Viertel de<
and Bicichem. Cytol., Band 6, Nr. 3, S. 399 bis 404 endgültigen Volumens von 2,2'-Oxydiäthanol (Di-(1959);
Davis, B. J., et al, J. Histochem. and äthylenglycol) oder anderen wasserartigen Alkoholer
Cytochem., Band 7, S. 297 ff. (1959); und Davis, oder Estern, beispielsweise Äthylenglykol, Propylen
B. J., Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., Band 101, S. 90 ff. glycol, Dimethyläther von Diäthylenglycol und Di
(1959). 55 äthylcarbitol, überwunden. Wenn man in dieser Weisi
Der Färbeschritt erfordert eine sorgfältige Auswahl vorgeht, kann man 1-Naphthylbutyrat und 1-Naphthyl
der Reagenzien. Zwei klassische hystochemische acetat bis zu einer Konzentration von nahezu 1 mg/m
Substrate für Peroxidaseenzyme sind beispielsweise lösen. Auch andere Substrate können gelöst werden
Benzidin und Paraphenylendiamin. Hierzu wird ver- beispielsweise «-Naphthylchloracetat, Indoxylestei
wiesen auf Pear se in Histochemistry: Theoretical 60 beispielsweise Indoxylacetat, Indoxylpropionat um
and Applied sowie auf L. O r η s t e i η in J. Histo- Indoxylbutyrat, 8-Hydrochinolinester, beispielsweis
ehem. and Cytochem , Band 16, S. 504 (1968). Diese 8-Hydrochinolinacetat, 8-Hydrochinolinpropionat um
Reagenzien sind jedoch als cytochemische Substrate 8-Hydrochinolmbutyrat. Unter denselben Bedingunge:
für das erfindungsgemäße Verfahren nicht geeignet, kann man nur 0,1 mg/ml Naphthol-AS-Acetat löser
da sie äußerst schnell mit dem als Fixiermittel dienen- 65 so daß sich eine wesentlich geringere Farbentwicklun
den Monoaldehyd reagieren und Verbindungen her- ergibt. Die anderen Ester der Naphthol-AS-Derivat
vorrufen, die sich niederschlagen und die nicht als lösen sich in einem noch geringeren Maß.
Peroxidasesubstratc für die Farberzeugung dienen Die folgenden Beispiele sind typische Reagenzici
9 10
die zum Färben von Monozyten, Eosinophilen und Die obigen Substanzen werden für etwa 1 Minute
Neutrophilen bevorzugt verwendet werden: gemischt und dann gegeben in
Reagenzien für Eosinophi.e und Neutrophile O^o.ares KyHPO4 (StamrnJÖsung
Stammlösungen: 5 einzustellen) 17>°ml
0,003% und 0,006% Gewichtsteile von H2O2 Insgesamt ... 18,6 ml
in Wasser,
0,5 g von 4-Chlor-l-naphthol in 25 ml von Die Mengg ^ benutzten basischen Fuchsins hat
2,2'-Oxydiäthanol, 10 eine endgültige Konzentration von 0,001 bis 0,01%.
0,1-Normalessigsäure. Beim pärben der Monozyten werden bei einem
λ VWsirkiinpen- bevorzugten strömungstechnischen Ausführungsbei-
Arbeitslosungen. ^ ^ ^2 m]/mm formalinfixierte Probe, etwa
Färbelösung für Eosinophile (pH-Wert^ 2,5): 0,42 ml/min «-Naphthylbutyrat und etwa 0,42 ml/min
η 1 Nnrmalessiesäure 40 ml 15 Hexazoniumpararosanilin zugegeben. 3eim Farben
2 T OxvdüKol (100 V) 20 ml der Eosinophilen werden etwa 0,60 ml/min Eosinophü-
^mAo Pü£mlö.ung) .. 8 ml färbelösung und etwa 0,10 ml/min 0,06·/.«*H2O2
konzentrierte Essigsäure ... 3,4 ml zu etwa 0,42 ml/min der fonnalinfixierten, hamoly-
konzentnerte hssigsaure , ^^ ρ^ zugegeben Beim Färben der Eosino-
Färbelösung für Eosinophile und Neutrophile 20 peilen und Neutrophilen werden etwa 0,32 ml/min
(pH-Wert ^ 3,3): Eosinophil-Neutrophil-Färbelösung, etwa 0,10 ml/mm
0 1-Normalessigsäure 40 ml 0,03%iges Wasserstoffperoxid und etwa 0,23 ml/mm
22'-Oxydiäthanol (100 %) 20 ml der f ormalinfixierten, hämolysierten Probe zusammen-
4lchlor-l-naphthol (Stammlösung) .. 13 ml gebracht. «tw,,tnroben
25 Eine Reihe von Komponenten in Gesamtblutprooen
In Verbindung mit den oben erwähnten 4-Chlor- stört sowohl das Peroxidase- als auch das Monozyten-1-naphthol-Lösungen
werden Wasserstoffperoxidlö- färbeverfahren.
sungen verwendet Zahlreiche andere organische und Wenn die Peroxidasereaktion durchgeführt wird,
inoreanische Peroxide können benutzt werden. Als kann Serumkatalyse die granulocytische Peroxidase
Beispiele werden angeführt: Natriumperborattetrahy- 30 überwältigen und dabei das Substrat aufbrauchen,
drat, Natriumcarbonatperoxid, Natriumpyrophosphat- Katalase ist wärmeunbeständig bei etwa 5υ <l,
neroxid Äthylhydroperoxid, tertiäres Butylhydroper- während Peroxidase bis zu etwa 80 C stabil ist. Uemzuoxid
und Harnstoffperoxid. Alle diese Stoffe können mit folge wird die Katalase vorzugsweise durch Erhitzen
einer endgültigen Konzentration von 0,1 bis 0,0001 Ge- auf eine Temperatur von 37° C für 10 Minuten bzw.
Ssprozent verwendet werden. 35 auf 55°C für 1 Minute oder dazwischenliegende
Das 4-Chlor-l-naphthol wird mit einer endgültigen Temperatur- und Zeitwerte inaktiviert. Besonaeis
Konzentration von 0,001 bis 0,06 Gewichtsprozent bevorzugt wird eine Erwärmung auf 500C für 3 Mi-
. tzt nuten. Eine Verdünnung des Bluts verstärkt das
Reagenzien für Monozyten Verhältnis der intrazellulären Peroxidasewirksamkeit
40 in bezug auf die restliche Katalasasekonzentration. Stammlösungen: Wenn die Katalasekonzentration auf einen Punkt
1 a-Naphthylbutyrat — 1 Gewichtsprozent in vermindert ist, bei dem sie erfolgreich mit der Neutro-2
2'-Oxydiäthanol, philäeroxidase konkurriert, wird das aktivere Eosino-
2 1/15-molares KH2PO4 (zweifachbasisch) — etwa philperoxid immer noch stark gefärbt.
' 9 07 g/l 45 Beim Erhitzen der Blutlösung wird auch die Pseudo-
3 1/15-molares K2HPO4 (zweifachbasisch) — etwa peroxidasewirksamkeit des Hämoglobins zerstört.
11 61 ß/1 *^e störende Komponente während der Monozyten-
4 Basische', Fuchsin (beispielsweise Matheson, CoIe- färbung ist der C l'-Esteraseinhibitor, eine gut bekannte
man & Bell) 1 g in 25 ml von 2 n-HCl, Komponente des Serums, die die Cl'-Esterase inaktiv
5 2 2'-Oxydiäthanol, 5° hält. Die Wirkung des Cl'-Esteraseinhibitors kann
6 o'l-molares K2HPO4, man in mannigfacher Weise blockieren. Ein Wei
7' l'ß Natriumnitrit in 25 ml H2O. besteht darin, eine Mischung aus Heparin (ein Anti·
" ö koagulat) und Cl'-Esterase der Probe zuzugeben
Arbeitsreagenzien: um den Inhibitor zu binden. Dies wird jedoch nich1
Λ-Naphthylbutyrat: 55 bevorzugt, da Cl'-Esterase sehr teuer ist. Statt dessei
.„ ... ν τ η mi kann man e'ne Kombination von Heparin unc
<x-Naphthylbutyrat (Stammlosung).. 2,Um streptokinase zugeben. Eine wenig aufwendige Ar
2,2'-Oxydiathanol o,u m besteht ^.^ dfc prQbe ^ dner Kaliumsalzlösun!
1/15-molares KH2PO4 o.unu zu verdünnen Normalerweise benötigt man eim
(einfachbasisch) 6o 5ofache Verdünnung. Dadurch wird jedoch die Zähl
Insgesamt ... 16,0ml geschwindigkeit erheblich herabgesetzt. Ein bevor
zugtes Verfahren besteht darin, 2,2'-Oxydiäthanol de
Die obige Lösung sollte täglich neu aufbereitet fixierten Blutprobe in Konzentrationen von 10 bi
wer(jen 30 % zuzusetzen. Dadurch wird der Inhibitor in einer
65 höheren Maße geschädigt als die Monozytenlipas*
Hexazoniumpararosanilin-Kuppler: In den F i g. 1 und 2 ist eine Vorrichtung dargestellt
Basises Fuchsin (Stammlösung) .... 0,8 ml mit der man die verschiedenen Reagenzien der Prob
Natriumnitrit (Stammlösung) 0,8 ml zugeben kann. Die in der F i g. 1 dargestellte Anorc
:*·■■
11 12
nung dient zum Bestimmen und Zählen der Eosino- Schlange 31 geleitet und von dort einem Zähler 3i
philen und Neutrophilen, während die in der F i g. 2 zugeführt, der die Gesamtanzahl der Eosinophiler
dargestellte Anordnung zum Bestimmen des Monozyt- und Neutrophilen zählt. An den Zähler 32 ist eir
gehalts in einer Probe verwendet wird. Diese Anord- Schreiber 33 angeschlossen.
nungen sind einer von Skeggs, L. T., Am. J. 5 Mit der beschriebenen Anordnung kann man die ir
Clinical Path., Band 28, S. 311 (1957), beschriebenen einer Probe vorhandenen Eosinophilen und Neutro
Vorrichtung ähnlich, die früher zur klinisch-chemischen philen zählen.
Analyse verwendet wurde. Mit der in der F i g. 2 gezeigten Anordnung kanr
Bei der Darstellung nach der F i g. 1 wird eine man die Anzahl der Monocyten in einer Probe zählen
Probe von einem Probennehmer 1 durch eine Leitung 2 io Die Probe wird von einem Probennehmer 34 zugeführ
geführt und mit einer Formalinlösung gemischt, die in und in einem ummantelten Eisbad 35 mit e:inem luft
einem Kühler 46 gekühlt wird. Es werden Luftblasen zu- unterteilten Formalinstrom vereinigt, der zuvor ir
gegeben, um den Flüssigkeitsstrom in Schübe zu unter- einer Schlange 36 gekühlt wird. Diesem Gemisch
teilen, um eine Durchmischung der aufeinanderfolgen- wird a-Naphthylbutyrat, Oxydiäthanol und Hexa
den Proben zu verhindern. Das Proben-Formalin- 15 zoniumpararosanilin sowie Essigsäure tugeführt
Gemisch wird durch eine Mischschlange 3, eine geheizte Zum Herstellen dieses Gesamtgemisches wird clei
Mischschlange 4 und eine weitere Mischschlange 5 Strom durch Mischschlangen 37 bis 43 geleitet. Di(
geleitet, die in einem Kühler 6 mit Eiswasser gekühlt die gefärbten weißen Blutzellen enthaltende Lösung
wird. Über eine Leitung 7 wird der fixierten Probe für wird einem fotometrischen Monozytenzellenzählcr <U
die Hämolyse Essigsäure zugeführt. Dieses Gemisch 20 zugeführt, an den ein Schreiber 45 angeschlossen ist
wird durch eine Mischschlange 8 und eine geheizte Für die Durchführung des erfindungsgem.ißen Ver
Mischschlange 9 geleitet und von dort einem Strom- fahrens geeignete Zahl-Einrichtungen sind beispiels
teiler 10 zugeführt, in dem Probenüberschüsse und weise in den folgenden Literaturstellen beschrieben
Blasen über eine Leitung 11 abgegeben werden und der K a m e η s k y, L. A., et al, Annals N. Y. Acad
Probenstrom aufgeteilt wird. Die aufgeteilten Ströme 25 Sei., Band 157, Abhandlung 0, S. 310 ff. (1.969) unc
werden von Leitungen 12 bzw. 13 geführt. Dem Strom K a m e η s k y, L. A., et al, Proc. I. E. E. E., Band 57
in der Leitung 13 wird ein Gemisch aus einem Eosino- S. 2007 (1969).
philfärbemittel und Wasserstoffperoxid über Leitungen Der Zähler beleuchtet die Lösung mit den suspen
15 bzw. 16 zugegeben. Weiterhin wird der Strom durch dierten Zellen mit einem Lichtstrahl. Gefärbte Zeller
über eine Leitung 14 zugeführte Luft erneut in Schüde 30 entfernen eine gewisse Lichtmenge aus dem Strahl
unterteilt. Das Gemisch wird durch Mischschlangen Diese entfernte Menge unterscheidet sich meßbar vor
17 und 18 geleitet. Weiterhin strömt das Gemisch durch derjenigen Lichtmenge, die von nicht gefärb :en Zeller
Mischschlangen 20, 21 und 22 und gelangt in einen oder von weniger stark gefärbten Zellen entfernt wird
Eosinphilzellenzähler 23, an den ein Schreiber 24 Infolge dieser Differenz kann man zwischen zwei odei
angeschlossen ist. 35 mehreren Arten von Zellen unterscheiden und diese
Der Strom in der Leitung 12 wird mit einem Zellen genau zählen.
Färbemittel für Eosinophile und Neutrophile und mit In einem derartigen Zähler kann man die Zellcr
Wasserstoffperoxid zusammengeführt. Diese Sub- mit hohen Zählgeschwindigkeiten bestimmen, beistanzen
werden über Leitungen 26 bzw. 27 zugegeben. spielsweise 1000 bis 30 000 Zellen pro Minute und
Die über eine Leitung 25 zugeführte Luft dient wieder- 40 pro Kanal. Die Blutproben von verschiedenen Patienum
zur Unterteilung des Stroms in Schübe. Dieses ten werden aufeinanderfolgend zugeführt und sind
Gemisch wird durch eine Mischschlange 28 und eine durch kurze Waschfiüssigkeitsschübe getrennt, die
auf 37°C erhitzte Schlange 29 geschickt. Der die eine Verseuchung der nachfolgenden Blutproben
gefärbten Zellen enthaltende Strom wird durch eine durch die vorangegangenen Proben verhindern.
Hierzu 2 Bialt Zeichnungen
Claims (3)
1. Verfahren zum Nachweisen einer weißen Blutzellenart, bei dem die zu untersuchenden
weißen Blutzellen mit einem cytologischen Fixiermittel zusammengebracht werden, das die weißen
Blutzellen tötet und die in den Zellen enthaltenen katalytischen Enzyme immobilisiert, ohne dabei
die katalytischen Eigenschaften der Enzyme ernsthaft zu zerstören, danach ein zur enzymatischen
Färbung einer weißen Blutzellenart dienendes cytochemisches Substrat zugegeben wird und die
gefärbten weißen Blutzellen ausgezählt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die zu
untersuchenden weißen Blutzellen in einer Lösung in Suspension gehalten werden und als Fixiermittel
ein Monoaldehyd verwendet wird, daß der Lösung unter Vermeidung des Ausfällens von in
<Ser extracellulären Lösung befindlichen Kornponenten
das Monoaldehyd, das eine weiße Bluttellenart enzymatisch färbende cytochemische Sub-
»trat und ein pH-Puffer zugegeben werden, der den pH-Wert der Lösung derart einstellt, daß die
durch das Substrat bewirkte selektive Färbung der einen weißen Blutzellenart unterstützt wird, und
daß die Auszählung der suspendierten gefärbten weißen Blutzellen fotometrisch vorgenommen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Monoaldehyd ein Formaldehyd, Butyraldehyd, Propionaldehyd oder Acetaldehyd
ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Monoaldehyd eine 0,2- bis
40°/Oige wäßrige Formaldehydlösung ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mit dem cytochemischen
Substrat ein getrenntes, Chromogene ausfällendes Kupplungsreagenz zugegeben wird,
das derart ausgewählt ist, daß in der extracellulären Lösung vorhandene lösliche Komponenten nicht
ausgefällt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kupplungsreagenz Hexazoniumpararosanilin
enthält.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das cytochemische
Substrat ein Gemisch aus Peroxid und 4-Chlor-1-naphthol
ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß durch Zugabe einer schwachen Säure
der pH-Wert auf einen Wert von weniger als 3,0 eingestellt wird, wobei nur in den Eosinophilen
ein starker Farbniederschlag erfolgt.
8. Verfahren nacli Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß durch den pH-Puffer ein pH-Wert zwischen etwa 3,0 und 5,0 eingestellt wird, wobei
nur in den Eosinophilen ein starker Farbniederschlag und nur in den Neutrophilen ein schwacher
Farbniederschlag erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß durch den pH-Puffer in der Lösung
ein pH-Wert von etwa 5,0 bis 7,0 eingestellt wird, wobei nur in den Eosinophilen und in den Neutrophilen
ein starker Farbniederschlag erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das cytochemische Substrat ein
Naphtholester, lndoxylester oder 8-Hydrochinolester ist und es sich bei den gezählten Zellen um
Monocyien handelt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein 1-Naphthylacetat
ist.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadarch gekennzeichnet,
daß das Substrat ein 1-Naphthylbutyrat ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert
innerhalb eines Bereiches von 5,5 bis 6,5 gehalten wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch
aus Heparin und Streptokinase oder ein Gemisch aus Heparin und komplementärer C'1-Esterase
zugegeben wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß 2,2'-Oxydiäthanol
(Diäthylenglycol) zugegeben wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der die weißen
Blutzellen enthaltenden Lösung, falls in ihr auch rote Blutzellen vorhanden sind, nach der Zugabe
des Fixiermittels ein Hämolysicrmittel zugesetzt wird, das die roten Blutzellen veranlaßt, ihren
Inhalt in die Lösung freizugeben, und daß das Hämolysiermittel derart gewählt ist, daß es die
in den weißen Blutzellen erzeugte Färbung nicht auflöst und in der extracellulären Lösung vorhandene
lösliche Komponenten nicht ausfällt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämolysiermittel eine
l°/oige bis 50%ige Lösung einer aliphatischen
Säure mit einem pKa-Wert von 3,0 bis 5,5 ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämolysiermittel eine 7°/oige
Essigsäurelösung ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämolysiermittel
vor Zugabe des cytochemischen Substrats, des pH-Puffers und gegebenenfalls des Kupplungsreagenz zugesetzt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämolysiermittel
nach Zugabe des cytochemischen Substrats, des pH-Puffers und gegebenenfalls des Kupplungsreagenz zugesetzt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung
zum Zwecke der Inaktivierung der Katalyse behandelt wird, ohne dabei in der extracellulären
Lösung vorhandene Komponenten auszufällen.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung auf eine Temperatur
von etwa 370C für 10 Minuten und bis etwa 55° C für 1 Minute gebracht wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zum Zählen von
Peroxydase enthaltenden Zellen das cytochemische Substrat ein Gemisch aus o-Tolidin oder Peroxid
und 4-Chlor-l-naphthol ist.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert in der Lösung
unter 7,0 gehalten wird.
25. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß zum Zählen von Lipase enthaltenden
Zellen das cytochemische Substrat ein
Gemisch aus einem Naphtholester und einem Darüber hinaus ist die manuelle Leukozytendifferen-
Diazoniumsalz ist. zierung unter dem Mikroskop äußerst zeitraubend.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch ge- Um bei der Differenzierung und Zählung von
kennzeichnet, daß der pH-Wert zwischen 5,5 und Teilchen subjektive Fehlennöglicbkeiten zu vermeiden,
6,5 gehalten wird. 5 ist ^ aus der us_ps 2g 07 416 bekannt) die in einer
Lösung suspendierten roten und weißen Blutzellen mit Hilfe einer selbsttätig arbeitenden Vorrichtung
voneinander zu unterscheiden uad zu zählen. Dazu
werden die roten und die weißen Blutzellen verschieden
ίο eingefärbt. Diese Einfärbung geschieht nach bekannten
Verfahren und stellt auf Grund der unterschiedlichen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Natur der roten und weißen Blutzellen kein so schwie-Nachweisen
einer weißen Blutzellenart, bei dem die riges Problem dar wie die Differenzierung der weißen
zu untersuchenden weißen Blutzellen mit einem cyto- Blutzellen selbst. Die aus der genannten US-PS
logischen Fixiermittel zusammengebracht werden, das 15 bekannten allgemeinen Maßnahmen lassen sich daher
die weißen Blutzellen tötet und die in den Zellen ent- nicht ohne weiteres auf das bekannte klassische Verhaltenen
katalytischen Enzyme immobilisiert, ohne fahren zur Leukozytendifferen;:ierung anwenden. So
dabei die katalytischen Eigenschaften der Enzyme geht es beispielsweise aus der zaerstgenannten Lileraernsthaft
zu zerstören, danach ein zur enzymatischen tursteile B. Romeis, Mikroskopische Technik,
Färbung einer weißen Blutzellenart dienendes cyto- 20 1968, hervor, daß die Vorbehandlung der Blutauschemisches
Substrat zugegeben wird und die gefärbten striche zur Einfärbung einer weißen Blutzellenart stets
weißen Blutzellen ausgezählt werden. von einem oder mehreren Spülvorgängen in destillier-Ein
solches Verfahren ist seiner grundsätzlichen tem oder Leitungswasser unterbrochen wird. Bei tuner
Art nach aus der Druckschrift B. R ο m e i s, Mikro- nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip arbeitenskopische
Technik, 16. Auflage, 1968, S. 343, 345 und 25 den selbsttätigen Vorrichtung wie nach der US-PS
346 bekannt. Hierbei wird zur Differenzierung der 28 07 416 ist es aber äußerst schwierig, ein einmal
weißen Blutzellen bzw. Leukozyten ein getrockneter zugegebenes Mittel wieder von den weißen Blutzellen
und gefärbter Blutausstrich unter einem Mikroskop zu trennen. Zum Stand der Technik wird ferner auf
ausgewertet, um die prozentualen Anteile vim fünf die DT-AS 12 00 577 sowie die CH-PS 4 68 635 ver-Leukozytenarten
und gegebenenfalls auch die pro- 30 wiesen, aus denen es zum Zählen von suspendierten
zentualen Anteile von abnormalen Zellen zu bestim- weißen Blutzellen bekannt ist, die ebenfalls in der
men. Bei den fünf Leukozytenarten handelt es sich Suspension befindlichen roten Blutzellen zu hämolyum
die Neutrophilen, Lymphozyten, Monozyten, sieren, um eine Störung der Leukozytenzählung durch
Eosinophilen und Basophilen. Bezüglich dieser klassi- die roten Blutzellen zu vermeiden,
sehen Art der Leukozytendifferenzierung wird er- 35 Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gänzend zu dem genannten Stand der Technik auf Verfahren zum selektiven Nachweisen von weißen »Laboratory Medicine — Hematology«, 3. Ausgabe, Blutzellenarten zu schaffen, das eine automatische J. B. M i a 1 e (The C. V. Mosby Company, St. Louis, differentielle Leukozytenzählung ermöglicht.
Mo. 1967), S. 822 bis 830, 1126, 1127 und 1130 Zur Lösung dieser Aufgabe ist das eingangs beverwiesen. 40 schriebene Verfahren nach der Erfindung dadurch Diese klassische Art der Leukozytendifferenzierung gekennzeichnet, daß die zu untersuchenden wsißen beruht auf den verschiedenen Färbeeigenschaften der Blutzellen in einer Lösung in Suspension gehalten Nucleinsäuren und Proteine von den einzelnen Teilen werden und als Fixiermittelein Monoaldehyd verwendet der verschiedenartigen Leukozytenarten und auf der wiH. daß der Lösung unter Vermeidung des Ausfallens Fähigkeit des menschlichen Auges und Gehirns, in 45 von in der extracellulären Lösung befindlichen Komdem mikroskopisch vergrößerten Bild der gefärbten ponenten das Monoaldehyd, das eine weiße Blutzellen-Zellen die einzelnen unterschiedlich gefärbten Struk- art enzymatisch färbende cyiochemische Substrat und türen zu erkennen, die für jede einzelne Leukozytenart ein pH-Puffer zugegeben werden, der den pH-Wert der charakteristisch sind. Jede der verschiedenen Leuko- Lösung derart einstellt, daß die durch das Substrat zytenarten enthält unterschiedliche Anteile von ver- 50 bewirkte selektive Färbung der einen weißen Blutschiedenartigen katalytischen Enzymarten, die die zellenart unterstützt wird, und daß die Auszählung Zellen befähigen, ihre speziellen Funktionen auszufüh- der suspendierten gefärbten weißen Blutzellen fotoren. Die Umstände, unter denen enzymhaltige Zellen metrisch vorgenommen wird.
sehen Art der Leukozytendifferenzierung wird er- 35 Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gänzend zu dem genannten Stand der Technik auf Verfahren zum selektiven Nachweisen von weißen »Laboratory Medicine — Hematology«, 3. Ausgabe, Blutzellenarten zu schaffen, das eine automatische J. B. M i a 1 e (The C. V. Mosby Company, St. Louis, differentielle Leukozytenzählung ermöglicht.
Mo. 1967), S. 822 bis 830, 1126, 1127 und 1130 Zur Lösung dieser Aufgabe ist das eingangs beverwiesen. 40 schriebene Verfahren nach der Erfindung dadurch Diese klassische Art der Leukozytendifferenzierung gekennzeichnet, daß die zu untersuchenden wsißen beruht auf den verschiedenen Färbeeigenschaften der Blutzellen in einer Lösung in Suspension gehalten Nucleinsäuren und Proteine von den einzelnen Teilen werden und als Fixiermittelein Monoaldehyd verwendet der verschiedenartigen Leukozytenarten und auf der wiH. daß der Lösung unter Vermeidung des Ausfallens Fähigkeit des menschlichen Auges und Gehirns, in 45 von in der extracellulären Lösung befindlichen Komdem mikroskopisch vergrößerten Bild der gefärbten ponenten das Monoaldehyd, das eine weiße Blutzellen-Zellen die einzelnen unterschiedlich gefärbten Struk- art enzymatisch färbende cyiochemische Substrat und türen zu erkennen, die für jede einzelne Leukozytenart ein pH-Puffer zugegeben werden, der den pH-Wert der charakteristisch sind. Jede der verschiedenen Leuko- Lösung derart einstellt, daß die durch das Substrat zytenarten enthält unterschiedliche Anteile von ver- 50 bewirkte selektive Färbung der einen weißen Blutschiedenartigen katalytischen Enzymarten, die die zellenart unterstützt wird, und daß die Auszählung Zellen befähigen, ihre speziellen Funktionen auszufüh- der suspendierten gefärbten weißen Blutzellen fotoren. Die Umstände, unter denen enzymhaltige Zellen metrisch vorgenommen wird.
gefärbt werden können, sind Gegenstand der enzym- Nach dem erfindungsgeciäßen Verfahren ist es
histochemischen oder enzymcytochemischen Metho- 55 möglich, die Fixierung und Färbung der weißen
dologie. Hierzu wird verwiesen auf: Histochemistry: Blutzellen in der gleichen Lösung durchzuführen, ohne
Theoretical and Applied, A. G. E. P e a r s e, (Little daß es dabei zu irgendwelchen Niederschlägen oder
& Brown, Boston, 1968); Enzyme Cytology, D. B. Ausfällungen kommt. Da darüber hinaus durch die
R ο ο d y η (Academic Press, London, New York, Einstellung des pH-Werts ein so großer farblicher
1967); und Laboratory Medicine — Hematology, John ?a Unterschied zwischen einzelnen Leukozytenarten ein-
B. Mi ale, S. 184, 185 und 212 bis 217. gestellt werden kann, daß die Leukozytenarten von
Diese bekannte Art der klassischen Leukozyten- einer fotometrischen Einrichtung allein auf Grund
differenzierung ist jedoch eines der subjektivsten der Farbe voneinander unterschieden werden können,
Verfahren im klinischen Labor. Die Begrenzung auf das erfüllt das erfindungsgemäße Verfahren alle zur
Zählen von nur 100 bis 200 Zellen pro Probe und das 65 selbsttätigen Leukozytendiflerenzierung erforderlichen
Ermüden nach stundenlanger Arbeit über dem Bedingungen. Außer den 2U untersuchenden weißen
Mikroskop begünstigen bei dieser lebenswichtigen Blutzellen bleibt nämlich die Suspension frei von
hämatologischen Befundung die Fehlermöglichkeiten. anderen Partikeln, die sonst von einer fotometrischen
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