DE2148452C3

DE2148452C3 - Verwendung einer wasserunlöslichen Protoplastmembranfraktion aus haemolytischen Streptococcen mit tumorstatischer Wirkung bei der Bekämpfung maligner Geschwulste

Info

Publication number: DE2148452C3
Application number: DE2148452A
Authority: DE
Inventors: Shigeo Suzuki; Akihiro Higashimurayama Yamamoto
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1970-09-30
Filing date: 1971-09-28
Publication date: 1982-04-01
Also published as: GB1333996A; DE2148452A1; FR2108094B1; US3786141A; FR2108094A1; CA971895A; DE2148452B2; CH567421A5; JPS496096B1

Description

Lysis der Zellen der haemolytischen Streptococcen übersteht. Dies wurde durch elektronenmikroskopische Aufnahmen bei einer Vergrößerung von 60 000 festgestellt Die Fraktion enthält weder die Zellwand noch Cytoplasma, in welchem die Nebenwirkungen hervorrufenden Stoffe enthalten sind. Dieses Präparat erzeugt keine Entzündungen, kein Fieber und keine Schmerzen, wie dies bei den bekannten Präparaten der Fall ist Die tumorstatische Wirkung des Präparats ist wesentlich höher als die der bekannten Präparate mit den wasserlöslichen Wirkstoffen.

Da die Protoplastmembranfraktion in Form einer Suspension selbst beim Aufbewahren im Kühlschrank verhältnismäßig instabil ist, wird sie gefriergetrocknet. Zu diesem Zweck wird die Suspension z. B. mit einem 1 > der nachstehend genannten Trägerstoffe oder Verdünnungsmittel gefriergetrocknet Man erhält auf diese Weise üin Trockenpräparat, das durch Zusatz von Wasser leicht in eine applizierbare Form gebracht werden kann. Besonders stabile Trockenpräparate können durch Gefriertrocknung einer Suspension der Protoplastmembranfraktion erhalten werden, die als Stabilisator eine Aminosäure, ein Saccharid oder ein wasserlösliches Kohlenhydrat in einem Gewichtsverhältnis von 1 :1 bis 50 :1, bezogen auf das Trockenge- r> wicht der aktiven Fraktion, enthält Beispiele für geeignete Aminosäuren sind Alanin, Asparaginsäure, Citrullin, Cystein, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Hydroxyprolin, Isoleucin, Ornithin, Prolin, Serin, Threonin und Valin. Beispiele für geeignete Saccharide sind Sucrose, Maltose, Raffinose und Lactose. Beispiele für geeignete wasserlösliche Kohlenhydrate sind Dextran und lösliche Stärke.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Protoplastmembranfraktion bei der Bekämpfung maligner Geschwulste. Zu diesem Zweck wird die Protoplastmembranfraktion in einem pharmakologisch verträglichen Trägerstoff und bzw. oder Verdünnungsmittel suspendiert Beispiele für bevorzugte Trägerstoffe bzw. Verdünnungsmittel sind Bernheimer's Basalmedium oder physiologische Kochsalzlösung.

Die Beispiele und Versuchsbeispiele erläutern die Herstellung der Protoplastmembranfraktion.

Bernheimer's Basalmedium hat folgende Zusammensetzung:

675 mg Maltose, 6 ml einer 20prozentigen wäßrigen Lösung von Kaliumdihydrogenphosphat, auf pH 6,9 bis 7,0 mit Natriumhydroxid eingestellt, 12 ml einer 2prozentigen wäßrigen Lösung von Magnesiumsulfatheptahydrat und 66 ml destilliertes Wasser.

Beispiel 1

Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21060, ein nahezu avirulenter Stamm) wird 24 Stunden bei 37° C in Fleischbrühe gezüchtet. 100 ml der Kultur werden in 2 1 eines 5prozentigen Hefeextraktmediums überimpft, das durch Auflösen von 100 g Hefeextrakt in 1,51 destilliertem Wasser, Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf pH 7,4 mit Natronlauge, 60minütiges Erhitzen auf 100⁰C, Abkühlen, Filtrieren und Auffüllen mit Wasser oo auf 2 1 und lOminütiges Dampfsterilisieren bei 1 atü hergestellt wurde. Die Züchtung in diesem Nährmedium wurde 20 Stunden bei 37° C durchgeführt Die erhaltene Gärmaische wurde mit Eis abgekühlt und zentrifugiert. Die Zellen wurden zweimal mit kalter physiolgischer Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in BBM suspendiert und die Absorption wurde auf einen Wert von 8,00 bei 660 nm eingestellt. Die Absorption zeigt, daß die Suspension 5 mg Zellen, ausgedrückt in Zellentrockengewicht, pro ml der Suspension enthielt Das Volumen der Suspension betrug 95 mL 20 ml der Zellensaspension wurden unter Kühlung zentrifugiert und die abgetrennten Zellen wurden in 20 ml einer 0,5 molaren Natriumcitratlösung suspendiert Diese Lösung wurde durch Vermischen von 5 Volumteilen einer 1 molaren Natriumcitratlösung mit 1 Volumteil einer 0,2 molaren Phosphatpufferlösung (pH 7,2), 1 Volumteil einer 2prozentigen Natriumthioglykolatlösung und 3 Volumteilen destilliertem Wasser hergestellt Die Suspension wurde mit 80 mg eines lytischen Enzyms versetzt, das aus dem Lysat von mit Bakteriophagen infizierten Streptococcen sp. der Gruppe C nach dem in Journal of Biochemistry, Bd. 57 (1965), S. 64 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 25° C stehengelassen, danach mit Eis abgekühlt und 30 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert Die Fällung wurde zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 20 ml BBM suspendiert, das das Kaliumsalz von Penicillin G in einer Konzentration von 27 000 I E/ml enthielt Das Präpirat enthielt unlösliche Wirkstoffe in einer Menge von 0,88, ausgedrückt als Absorption bei 660 nm.

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde Streptococcus hemolyticus Sv (ATCC Nr. 21059) verwendet. Das Präparat enthielt aktive Substanzen in einer Menge von 0,90, ausgedrückt durch die Absorption bei 660 nm.

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde Streptococcus hemolyticus C 203 S (ATCC Nr. 21 546) verwendet. Das Präparat hat einen Absorptionswert von 0,96 bei 660 nm.

Beispiel 4

Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde Streptococcus hemolyticus S-43 (ATCC Nr. 21 547) verwendet. Das Präparat hat eine Absorption von 0,92 bei 660 nm.

Beispiel 5

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde Streptococcus hemolyticus Blackmore (ATCC Nr. 21 548) verwendet. Das Präparat hat eine Absorption von 0,95 bei 660 nm.

Beispiel 6

Gemäß Beispiel 1 wurden gezüchtete Zellen von Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21060, nahezu avirulenter Stamm) hergestellt. Die Zellen wurden in BBM suspendiert und die Absorption wurde auf einen Wert von 9,20 bei 660 nm eingestellt. Dieser Wert entspricht einer Konzentration der trockenen Zellen von 6 mg/ml. 40 ml der Suspension wurden mit 8 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die das Kaliumsalz von Penicillin G in einer Konzentration von 1,6 χ 10⁵IEAnI enthielt, und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Suspension 30 Minuten auf 45°C erwärmt und hierauf sofort abgekühlt. Die erhaltene Suspension entspricht dem bekannten Präparat PCB-45. Dieses Präparat PCB-45 enthielt die Streptococcenzellen in einer Menge von 5 mg/ml, ausgedrückt als trockene Zellen (Absorptionswert 8,00 bei 660 nm).

Aus 20 ml der erhaltenen Suspension wurden die Zellen abzentrifugiert und in 20 ml einer 0,5 molaren Natriumcitratlösung suspendiert Die erhaltene Suspension wurde mit 80 mg eines lytischen Enzyms versetzt das nach der in Beispiel 1 zitierten Mefhode erhalten wurde. Die Suspension wird 30 Minuten bei 25" C stehengelassen, danach mit Eis abgekühlt und zentrifugiert Die erhaltene Fällung wurde gemäß Beispiel 1 weiter verarbeitet Es wurde ein Präparat mit einem Absorptionswert von 1,20 bei 660 nm erhalten. ! ο

Beispiel 7

20 ml des gemäß Beispiel 6 hergestellten Präparates PCB-45 wurden mit 80 mg eines lytischen Enzyms π versetzt das nach der in Beispiel 1 zitierten Methode erhalten wurde.

Die weitere Verarbeitung erfolgt gemäß Beispiel 1. Es wurde ein Präparat mit einem Absorptionswert von 0,98 bei 660 nm erhalten. 2u

Beispiel 8

20 ml des gemäß Beispiel 6 hergestellten Präparates PCB-45 wurden zentrifugiert. Die abgetrennten Zellen wurden in 20 ml einer 0,5 molaren Natriumcitratlösung suspendiert. Die Suspension wurde mit 160 mg eines teilweise gereinigten lytischen Enzyms versetzt, das aus einer Gärmaische von Streptomyces albus nach der in der Zeitschrift Biochemistry, Bd. 5 (1964), S. 2764 beschriebenen Methode erhalten wurde. Die begleitende Peptidase wurde abgetrennt. Die mit dem lytischen Enzym versetzte Suspension wurde 40 Minuten bei 37''C stehengelassen, danach mit Eis abgekühlt und zenrifugiert. Die Fällung wurde gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Es wurde ein Präparat mit einem Absorptionswert von 1,05 bei 660 nm erhalten.

Beispiel 9

Das gemäß Beispiel 1 erhaltene Präparat wurde mit einem gleichen Volumen einer lprozentigen wäßrigen DL-Methioninlösung versetzt. Jeweils 2 ml des Gemisches wurde in Reagenzgläser abgefüllt Die Reagenzgläser wurden 2 Stunden auf -30⁰C eingefroren und hierauf 20 Stunden bei einer Temperatur unterhalb 2O⁰C und einem Druck von 0,01 Torr gefriergetrocknet. Danach wurde das Vakuum mit getrockneter Luft aufgehoben, und die Reagenzgläser wurden dicht verschlossen. Es wurde ein Trockenpräparat erhalten.

Beispiel 10

Die gemäß Beispiel 6 erhaltene Fällung wurde in 20 ml BBM suspendiert, das kein Penicillin enthielt. Die erhaltene Suspension wurde mit einem gleichen Volumen einer lprozentigen wäßrigen DL-Methioninlösung versetzt und gemäß Beispiel 9 gefriergetrocknet. Es wurde ein Trockenpräparat erhalten.

Beispiel 11

Beispiel 10 wurde wiederholt, an Stelle von DL-Methionin wurde L-Arginin verwendet. Es wurde ein Trockenpräparat erhalten.

Beispiel i2

Beispiel 10 wurde wiederholt an Stelle von DL-Methionin wurde Sucrose verwendet Es wurde ein Trockenpräparat erhalten.

Zum Vergleich der tumorstatischen Wirkung, der entiündungserregenden und schmerzerregenden Eigenschaften der Protoplastmembranfraktion mit bekannten Präparaten wurden einige bekannte Präparate auf die in den folgenden Vergleichsbeispielen beschriebene Weise hergestellt

Vergleichsbeispiel 1

Zellen von Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21060) wurden in BBM suspendiert, das das Kaliumsalz von Penicillin G in einer Konzentration von 27 000 ΙΕ/ml enthielt Die Suspension wurde 20 Minuten bei 37° C inkubiert und anschließend 30 Minuten auf 45⁰C erwärmt Das als PCB-45 bezeichnete Präparat hat einen Absorptionswert von 8,00 bei 660 nm; vgl. Beispiel 6.

Vergleichsbeispiel 2

Vergleichsbeispiel 1 wurde wiederholt an Stelle von Penicillin G wurde Cephalosphorin C (Cephaloridin) verwendet. Das mit CEB-45 bezeichnete Präparat hatte einen Absorptionswert von 8,00 bei 660 nm.

Vergleichsbeispiel 3

Vergleichsbeispiel 1 wurde wiederholt an Stelle von Penicillin G wurde Cycloserin verwendet Das mit CYB-45 bezeichnete Präparat hat einen Absorptionswert von 8,00 bei 660 nm.

Vergleichsbeispiel 4

Zellen von Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21 060) wurden mit Aluminiumpulver in einem Mörser vermählen und mit einer Phosphatpufferlösung vom •κι pH-Wert 7,2 extrahiert Der Extrakt wurde langsam mit kaltem Aceton versetzt. Die hierbei auftretende Fällung wurde abgetrennt, getrocknet und in destilliertem Wasser gelöst

⁴' Vergleichsbeispiel 5

Der Überstand des im Verfahren gemäß Beispiel 1 erhaltenen Lysats von Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21 060) wurde abgetrennt.

Vergleichsbeispiel 6

Zellen von Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21 060) wurden in destilliertem Wasser suspendiert und mit Glaspulver in einem Zellenhomogenisator der Firma Braun vermählen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und der Überstand abgetrennt und in einem Cellophanschlauch gegen Ammoniumsulfatlösung dialysiert Eine Fraktion, die zwischen 50- und 80prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat ausfiel, wurde abzentrifugiert. Diese Fraktion wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert Es wurde ein tumorstatisches Präparat erhalten.

Versuch A

65 In diesem Versuch wurde die entzündungserregende Wirkung der Protoplastmembranfraktion und bekannter Präparate untersucht.

Versuchsmethodik

Die in den Beispielen und Vergleichsbeispielen beschriebenen Präparate wurden subcutan in den Rücken von männlichen Mäusen des ddY-Stammes mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 28,5 g in der in Tabelle I angegebenen Menge injiziert. Nach 3 Stunden wurde in die gleiche Stelle eine 0,5prozentige Evans Blau-Lösung injiziert. Nach 30 Minuten wurden die Mäuse getötet und die Häute abgezogen und auf das Auslaufen des Pigmentes untersucht. Das Auslaufen des Pigments zeigt eine Entzündungswirkung mit ihr vorausgehender Vasodilatation an. Für jeden Versuch wurde eine Gruppe von 5 Mäusen verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I	Verabfolgte	Zahl der Mäuse
	Dosis, y	mit positiver
		Reaktion

Präparat von
Beispiel Nr.	30	0
1	30	0
2	30	0
3	30	0
4	30	0
5	30	0
6	30	0
8
Präparat von Ver
gleichsbeispiel Nr.	100	5
1	100	5
2	100	5
3	70	5
4	50	5
5	20	5
6

Anmerkungen:

Die angegebenen Dosen beziehen sich auf das Trockensubstinzgewicht. Im Falle der Präparate von Beispiel 1 bis 6 und 8 sowie der Präparate der Vergleichsbeispiele 4 bis 6 bedeutet die Dosis die Wirkstoffmenge aus 100 γ Trockengewicht Streptococcenzellen. Im Falle der Präparate der Vergleichsbeispiele 1 bis 3 bedeutet die Dosis die Menge an Streptococcenzellen.

die Temperaturerhöhung der Präparate der Vergleichsbeispiele 1 bis 6 mehr als 1 ° C betrug.

Versuch B

In diesem Versuch werden die Fieber erzeugenden Eigenschaften der Protoplastmembranfraktion und der bekannten Präparate untersucht

Versuchsmethodik

Die gleichen Präparate wie in Versuch A wurden intravenös in das Ohr von Kaninchen (japanischer weißer Stamm) injiziert und die Körpertemperatur wurde rektal in stündlichen Abständen bis 12 Stunden nach der Injektion gemessen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt Die Temperaturerhöhung bei den Präparaten der Beispiele 1 bis 6 und 8 beträgt höchstens 0J⁰C, während

Tabelle 11	Verab folgte Dosis, γ	Körpertemperatur	(rektal	)	1	4	8	12
				Stunden nach Verabfolgung des Präparats
		0	38,9	38,9	39,3	39,1
	150		.38,7	39,2	39,2	39,!
Präparat von Beispiel Nr.	300	38,8	39,6	39,5	39,4	39,3
1	750	383	39,5	39,5	39,4	39,3
	1500	39,3	38,9	38,8	38,9	38,8
	150	39,0	39,0	38,9	39,2	39,0
	150	38,8	39,1	39,1	39,2	39,2
2	150	39,0	39,1	39,4	39,4	39,3
3	150	38,9	39,2	393	39,1	39,1
4	150	39,1	38,9	39,0	39,0	39,2
5	150	393
6		38,9	383	40,7	40,1	38,9
8	500		383	41,0	39,9	39,6
Präparat von Vergleichs beispiel Nr.	500	38,8	38,9	40,9	40,2	39,2
1	500	39,0	38,6	403	38.9	38,7
2	350	39,0	39,2	41.1	40,1	39,8
3	250	38,6	39,1	40,7	39.8	39.3
4	100	39,2
5		39,1
6

Anmerkungen:

Die angegebenen Dosen beziehen sich auf das TrockensubstanzgewichL Im Falle von Beispiel 1 bedeuten die Dosen

^v> die Menge an aktiven Substanzen, die aus 500, 1000, 2500 und 5000y (Trockengewicht) Streptococcenzellen erhalten wurden. Im Falle der Beispiele 2—6 und 8 sowie der Vergleichsbeispiele 4—6 bedeuten die Dosen die Menge an aktiven Substanzen, die aus 50Oy (Trockengewicht) der Streptococcenzellen erhalten wurden. Im Falle der Vergleichsbeispiele 1—3

4-5 bedeuten die Dosen die Mengen an Streptococcenzellen.

Versuch C

In diesem Versuch wurden die schmerzerregenden Eigenschaften der Protoplastmembranfraktion und der bekannten Präparate untersucht Es wurden die gleichen Präparate verwendet wie in Versuch A, die intraperitoneal 5 Wochen alten männlichen Mäusen vom ddY-Stamm mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20,6 g injiziert wurden. Die Dosen betrugen bei den Präparaten der Beispiele 1 bis 6 und 8 jeweils 750 y, bei den Präparaten der Vergleichsbeispiele 1 bis 3 je 2500 ν und bei den Präparaten der Vergleichsbeispie-Ie4,5bzw.6 175Oy, 125Oybzw.50Oy.

Das Verhalten der Mäuse wurde während einer Stunde nach der Injektion der Präparate beobachtet Die mit der Protoplastmembranfraktion gespritzten Mäuse zeigten kein anormales Verhalten, während die mit den bekannten Präparaten gespritzten Mäuse Krümmungssyndrome zeigten, d.h. Verdrehung des Körpers, Einziehen der Bauchdedce und Strecken der Hinterbeine.

Versuch D

10

In diesem Versuch wird die tumorsiatische Wirkung der Protoplastmembranfraktion und der bekannten Präparate untersucht.

5 Wochen alten männlichen Mäusen vom ddY-Stamm wurden Ehrlich ascites Carcinomzellen intraperitoneal in einer Menge von 10·" Zellen pro Maus injiziert. Pro Gruppe wurden 10 Mäuse verwendet. Die Präparate der Beispiele 1 bis 3, 5 und 10 und der Vergleichsbeispiele 1 bis 6 wurden den Mäusen 24 Stunden nach der Beimpfung mit den Carcinomzellen intraperitoneal in einer Menge von 0.1 ml pro Maus täglich während 4 Tagen injiziert.

Als Blindprobe wurde BBM injiziert, das das Kaliumsalz von Penicillin G in einer Konzentration von 27OOOIE/ml enthielt. Nach 40 Tagen wurde die tumorstatische Wirkung an Hand der Zahl der überlebenden Tiere in jeder Gruppe bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 111 zusammengestellt.

Tabelle III	Verabfolgte Dosis, ν	Zahl der über lebenden Mäuse

Präparate von Beispiel Nr.	75	7
1	75	6
2	75	6
3	75	5
5	75	7
10
Präparat von Ver gleichsbeispiel Nr.	250	10
1	250	10
2	250	10
3	175	1
4	125	1
5	50	3
6	_	0
Blindversuch

Anmerkungen:

Die angegebenen Dosen beziehen sich auf das Trockensubstanzgewicht. Im Falle des Präparats von Beispiel 1 bis 3, 5 und 10 sowie der Präparate der Vergleichsbeispiele 4 bis 6 bedeuten die Dosen die Wirkstoffmengen aus 250 γ (Trockengewicht) Streptococcenzellen. Im Falle der Präparate der Vergleichsbeispiele I bis 3 bedeuten die Dosen die Mengen an Streptococcenzellen.

Versuch E

Zur Bestimmung der akuten Toxizität (LD₅₀) und der effektiven Dosis (ED₅₀) werden 5 Wochen alten männlichen Mäusen vom ddY-Stamm Ehrlich ascites Carcinomzellen intraperitoneal in einer Menge von 10⁶ Zeilen pro Maus injizier.. Pro Grappc warden IO Mäuse verwendet Das Präparat von Beispiel 1 sowie das bekannte Streptococcen-Präparat PCB-45 wird den Mäusen 24 Stunden nach der Beimpfung mit den Carrinornzeilen intraperitoneal in bestimmter Menge täglich während 4 Tagen gegeben. Nach 40 Tagen wird an Hand der Zahl der überlebenden Tiere die EDs₀ und LDso berechnet In Tabelle IV sind die Ergebnisse zusammengefaßt

Tabelle IV	Präparat PCB-45	von Bei spiel 1
	0,246 25 101,6	Ul 400< 330,6 <
ED₅₀ (KE/Tier) LD₅₀ (ΚΕ/Tier) LDso/EDso

Anmerkung:

IKE (klinische Einheit) entspricht 0,1 mg Trockensubstanzgewicht Streptococcenzellen.

Claims

Patentanspruch:

Verwendung einer wasserunlöslichen Protoplastmembranfraktion aus haemolytischen Streptococcen mit tumorstatischer Wirkung bei der Bekämpfung maligner Geschwulste.

Die lebenden Zellen haemolytischer Streptococcen besitzen bekanntlich eine beachtliche tumorstatische Wirkung; VgL US-PS 34 77 914 und GB-PS 11 53 113. Nach der JP-AS 66 90/1968 erhält man ein brauchbares Präparat zur Behandlung maligner Tumoren, wenn man haemolytische Streptococcenzellen in penicillinhaltigem Bemheimer's Basalmedium (BBM) in verhältnismäßig hoher Konzentration etwa 20 Minuten bei einer Temperatur von etwa 37°C inkubiert und anschließend die Zellensuspension etwa 30 Minuten auf etwa 45° C erwärmt. Durch diese Behandlung wird die Toxizität beträchtlich vermindert, die Aktivität des Präparates jedoch beträchtlich erhöht Dieses Präparat wird abgekürzt mit PCB-45 bezeichnet Nach der GB-PS 11 53 113 erhält man ähnliche Präparate nach gleichen Verfahren, bei denen an Stelle eines Penicillins Cephalosporin C oder Cycloserin verwendet wird. Das mit Cephalosporin C erhaltene Präparat wird als CEB-45 und das mit Cycloserin hergestellte Präparat als CYB-45 bezeichnet.

Die nach den bekannten Verfahren erhaltenen Präparate besitzen zwar eine beachtliche Wirkung gegenüber malignen Geschwulsten, sie haben jedoch den Nachteil, daß sie Entzündungen und Fieber sowie am Behandlungsort Schmerzen erzeugen. Diese Nebenwirkungen rühren von verschiedenen Bestandteilen in den Zellen, insbesondere im Cytoplasma und der Zellmembran, her.

Es sind ferner verschiedene Verfahren zur Herstellung von Präparaten aus haemolytischen Streptococcen bekannt, die als Wirkstoff eine wasserlösliche Fraktion enthalten. Es ist bekannt daß derartige Präparate durch Extraktion der Zellen mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung eines anorganischen Salzes und Ausfällung des Wirkstoffes mit einem organischen Lösungsmittel hergestellt werden können; vgl. JA-AS 1 647/1963. Nach dem Verfahren der GB-PS 11 63 865 kann man die Zellen der haemolytischen Streptococcen auch mit einem lytischen Enzym, wie Lysozym, Cellulase oder Protease, behandeln und die wasserlösliche Fraktion als Wirkstoff abtrennen.

Sämtlichen vorgenannten bekannten Präparaten ist gemeinsam, daß sie aus wasserlöslichen Fraktionen der Zellen der Streptococcen stammen. Ihre tumorstatische Aktivität ist ungenügend im Vergleich zu der von PCB-45, einem Präparat aus Streptococcenzellen. Diese Präparate enthalten noch zahlreiche andere Bestandteile neben den tumorstatisch wirkenden Substanzen, die Entzündung, Fieber oder Schmerzen erzeugen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Arzneimittel aus haemolytischen Streptococcen mit tumorstatischer Wirkung zur Verfugung zu stellen, die sich zur Bekämpfung maligner Geschwulste eignen und keine Entzündung, Fieber und Schmerzen erzeuen. Zur Lösung dieser Aufgabe wird vorgeschlagen, eine wasserunlösliche Protoplastmembranfraktion aus haemolytischen Streptococcen mit tumorstatischer Wirkung zi? verwenden. Die Erfindung betrifft somit dem im Patentanspruch gekennzeichneten Gegenstand.

Die Gewinnung einer wasserunlöslichen Protoplastmembranfraktion aus haemolytischen Sireptococcen ist von Y. Sokawa und F. Egami in The Journal of Biochemistry, Bd. 57 (1965), S. 64 ff. beschrieben.

Zur Herstellung der wasserunlöslichen Protoplastmembranfraktion können alle haemolytischen Streptococcen verwendet werden, deren Zellen eine tumorsta-ο tische Wirkung besitzen. Bevorzugt verwendete haemolytische Streptococcen sind Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Nr. 21060), Streptococcus hemolytcus SV (ATCC Nr. 21059), Streptococcus hemolyticus C 203 S (ATCC Nr. 21546), Streptococcus hemolyticus S-43

is (ATCC Nr. 21547) und Streptococcus hemolyticus Blackmore (ATCC Nr. 21548).

Die haemolytischen Streptococcen werden nach üblichen Verfahren und in üblichen Nährmedien, wie Fleischbrühe oder einem Hefeextrakt enthaltenden Nährmedium, gezüchtet Nach beendeter Züchtung werden die lebenden Zellen abgetrennt und mit phisiologischer Kochsalzlösung oder einer anderen geeigneten Pufferlösung gewaschen.

Die Herstellung lytischer Enzyme ist bekannt.

Beispielsweise kann ein lytisches Enzym aus dem Lysat von mit Bakteriophagen infizierten Streptococcen der Gruppe C nach dem von Y. Sokawa und F. Egami in The Journal of Biochemistry, Bd. 57 (1965), S. 64 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Ferner kann ein

jo lytisches Enzym aus der Gärmaische eines Mikroorganismus nach dem in der Zeitschrift Biochemistry, Bd. 5 (1966), S. 2764—2776, beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das verwendete zell-lytische Enzym stammt vorzugsweise aus Bakterien und Actinomyceten oder wird aus dem Lysat von mit Bakteriophagen infizierten Streptococcen hergestellt.

Sofern die zell-lytischen Enzyme eine Protease enthalten, die eine ungünstige Wirkung auf die tumorstatische Aktivität ausübt wird das Enzym vorzugsweise vor der Verwendung von der Protease befreit.

Die Behandlung der Zellen der haemolytischen Streptococcen mit dem zell-lytischen Enzym wird in einer wäßrigen Lösung durchgeführt, in welcher die Zellen suspendiert sind. Als wäßrige Lösung wird vorzugsweise eine hypertonische Lösung von Natriumcitrat Natriumsuccinat oder Sucrose verwendet. Es können jedoch auch Salzlösungen sowie Pufferlösungen verwendet werden. Der pH-Wert des Suspendiermediums hängt von der Art des verwendeten Enzyms ab. Vorzugsweise liegt der PH-Wert im Bereich von 6 bis 8, um die tumorstatisch wirksame Substanz während der Behandlung zu stabilisieren. Die Behandlungstemperatur und -zeit hängt ebenfalls von der Art des verwendeten Enzyms ab. Im allgemeinen liegt die Behandlungstemperatur bei 10 bis 40⁰C und die Behandlungszeit beträgt 10 bis 120 Minuten. Die bevorzugte Behandlungstemperatur 10 bis 30° C und die bevorzugte Behandlungszeit 10 bis 60 Minuten, um die Aktivität der tumorstatisch wirksamen Substanz nichtzu vermindern.

Nach beendeter Lysis der Zellen wird die aktive Substanz als wasserunlösliche Fraktion aus dem Lysat, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt und danach mit physiologischer Kochsalzlösung, einer Pufferlösung oder destilliertem Wasser gewaschen.

Das nach dem geschilderten Verfahren erhaltene Präparat ist die Protoplastmembranfraktion, welche die