DE2142422B2 - Derivate des Digoxigenins, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung zur radioimmunologischen Bestimmung von Digoxin - Google Patents

Description

H
— NH- C-COOR₂

CH,

H
-NH-C-COOR₂

OH

55

60

65 H
— NH- C-COOR₂

CH,

N-

N
H

wobei R₂ ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe ist.

2. 3-Succinyldigoxigenintyrosin, gegebenenfalls radiojodiert.

3. 3 - Succinyldigoxigenintyrosin - nieder - alkylester, gegebenenfalls radiojodiert.

4. 3-Succinyldigoxigenin-L-tyrosin, gegebenenfalls radiojodiert.

5. 3 - Succinyldigoxigenin - L - tyrosin - niederalkylester, gegebenenfalls radiojodiert.

6. Verwendung einer der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei X entweder ein radio-gekennzeichnetes Peptid oder ein radiogekennzeichnetes Aminosäureradikal ist, für die radioimmunologische Bestimmung von Digoxin.

Die Erfindung bezieht sich auf Derivate des Digoxigenins sowie auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der radiologisch gekennzeichneten Derivate des Digoxigenins bei der radioimmunologischen Bestimmung von Digoxin.

Die Ärzte haben lange nach besseren Methoden gesucht, um die genauen therapeutischen Dosen festzustellen und die Digitalis Toxizität zu diagnostizieren. Kürzlich haben Smith, Butler und Haber in einem mit »Determination of Therapeutic and Toxic Serum Digoxin Concentrations by Radioimmunoassay« betitelten Aufsatz in New England Journal or Medicine, Vol.281, S. 1212 bis 1216 (1969), ein Verfahren zur Bestimmung von Serum-Digoxin-Konzentrationcn unter Verwendung von schweren Wasserstoff enthaltendem Digoxin angegeben. Die Verwendung eines solchen Digoxins bei der Feststellung von

Serum-Digoxin in Nanogrammengen bringt die der flüssigen Szintillations-Auszählung anhaftenden Nachteile mit sich, die in Verbindung mit der relativ niedrigen spezifischen Aktivität von im Handel befindlichem, mit schwerem Wasserstoff versehenem Digoxin, den Einsatz verheknismäßig großer Probenvolumen und bzw. oder erhöhte Auszählzeiten mit sich bringen, um die erforderliche Empfindlichkeit und Genauigkeit zu erreichen. Mit Rücksicht auf die beschränkten Möglichkeiten, die mit schwerem Wasserstoff versehene Cardenolid-Glykoside für die radioimmunologische Bestimmung bieten, besteht das Bedürfnis nach anderen radiologisch gekennzeichneten Verbindungen, die wirkungsvoll bei der radioimmunologischen Prüfung von Digoxin im menschlichen Serum eingesetzt werden können.

Zu diesem Zweck schlägt die Erfindung neue Cardenolide der nachstehenden allgemeinen Strukturformel vor:

O

30

35

in der R' für -OH oder -OCOCH₃ steht, B ein Diacylradikal einer Dicarbonsäure, in welcher die Carboxylgruppen an den benachbarten Kohlenstoffatomen substituiert sind, bedeutet, wie 2. B. einen Succinyl-, Maleyl-, Fumaryl- oder o-Phthaloyl-, vorzugsweise jedoch einen Succinylrest, und X eine der nachfolgenden Bedeutungen haben kann:

45

a) -OH.

b) —OM, worin M ein Alkalimetall, vorzugsweise Natrium, ist,

c) —N—Protein

worin das Protein im allgemeinen ein menschliches Serum-Albumin, Insulin, Lysozym oder ein Rinder-Serum-Albumin, vorzugsweise jedoch ein menschliches Serum-Albumin oder Rinder-Serum-Albumin ist,

d) — N— Peptid
H

60

worin das Peptid vorzugsweise nicht mehr als 20 Einheiten, vorzugsweise nicht mehr als 6 Einheiten besitzt, und wenigstens eine der Peptid-Einheiten eine der nachfolgenden Aminosäuren enthält: Tyrosin, 4-Hydroxypheny!glycin. Tryptophan, 5-Hydroxytryplophan und Histidin, wobei gegebenenfalls eine oder mehrere der Peptid-Einheiten mit einer radiologischen Kennzeichnung versehen, vorzugsweise radiojodiert sind, oder

e) ein Aminosäureradikal, das vorzugsweise eine der nachfolgenden Strukturformeln besitzt:

H
-NH-C-COOR₂

-CH₂

OH

H
NH-C-COOR₂

OH

	'S..	-NH	I	)*	H C — I	COOR2
HO S		H t	CH2	Γ
	Il I \ / N H
	-NH		COOR2
	\ I
	K/
	\ / N H

H
-NH-C-COOR₂

CH₂

N—
.11

N
H

wobei R₂ ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe (bis zu 6 Kohlenstoffatomen) bedeutet, wobei die niedere Alkylgruppe vorzugsweise ein Methyl- oder Äthylradikal ist und worin das Aminosäurcradikal gegebenenfalls mit einer radiologischen Kennzeichnung versehen ist, vorzugsweise ein oder zwei radioaktive Jodalome aufweist, deren mögliche Positionen durch ein Sternchen angegeben sind. Die vorzugsweise verwendeten Aminosäureradikale leiten sich vom Tyrosin, Histidin und 4-Hydroxyphenylglycin ab, wobei L-Tyrosin der Vorzug gegeben wird.

Nachstehend ist das Reaktionsschema zur Herstellung der erfindungsgemäßen Digoxigenin-Derivate angegeben, wobei solche Verbindungen als repräsentativ gewählt wurden, in denen die Gruppierung in der vorstehend angegebenen Strukturformel ein Succinyl ist:

(CH₃CO)₂O
Stufe I Digoxin Digoxinpentaazetat

' Stufe.¹!
H₂SO₄

wasserhaltiges
Methanol

O Digoxigenin-12-azetat

Digoxigenin-12-azetat Digoxigenin-!2-a/etat-

3-hi*nisuccinat

Hierbei sind die Stufen 1 und II aus dem Stand der Technik bekannt, so daß auch das Digoxigenin-12-azetat ebenfalls als bekannt zu gelten hat (siehe z. B. Elseviers Encyclopedia of Organic Chemistry, Vol. 14, Supplement 1969, S. 4562). Bei dem in der Stufe III erhaltenen Produkt handelt es sich jedoch um eine neue Verbindung, welche unter die oben angeuebene Strukturformel fallt, wobei X OH und R' OCOCH₃ bedeutet.

Das neue Zwischenprodukt Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat kann dann zur Herstellung anderer, neuer, unter die vorliegende Erfindung fallender Verbindungen eingesetzt werden, und zwar nach folgendem Reaktionsschema:

Stufe IV — Kupplung
Protein
Peptid

Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat + Aminosäure oder

Aminosäureester
• Protein

oder
I l-Azetyl-S-succinyldigoxigenin -

Peptid
oder

Aminosäure
oder

Aminosäureester

Stufe V Hydrolyse

Protein
oder

Peptid
.VSuccinyldigoxigenin

oder

— Aminosäure

— Aminosäureester
Stufe VI Radiojodierung

— radiojodierte Aminosäure
oder

3-Succinyldigoxigenin

— radiojodierter Aminosäureester oder

— radiojodiertes Peptid

Bei den Reaktionsprodukten der Stufen IV, V und VI handelt es sich um neue Verbindungen. Bei dem oben angegebenem Reaktionsablauf handelt es sich bei der Aminosäure oder dem Aminosäureester, der an das Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat gebunden wird um eine der folgenden Aminosäuren oder ihrer niederen Alkylester: Tyrosin, 4-Hydroxyphenylalanin Tryptophan, 5-Hydroxytryptophan oder Histi-

din. Die Radiojodierung wird vorzugsweise mit ''⁵I durchgeführt. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die Jodierung auch mit anderen Jodisotopen, wie beispielsweise '" !.durchgeführt werden kann.

Die erfindungsgemäßen 3-Succinyldigoxigeninderivate können durch Hydrolyse des Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinats erhalten werden, wie nachfolgend noch beschrieben wird.

In der oben angegebenen Reaktionsfolgc können in der Stufe III die Anhydride der Maleinsäure und o-Phthalsäure statt Bernsteinsäureanhydrid verwendet werden, so daß dann Verbindungen erhalten werden, in denen die Gruppierung B der oben angegebenen Strukturformel ein Maleyl- oder ein oPhthaloylrest ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen, von denen die Gruppierung B der oben angegebenen Strukturformel ein Fumarylrest ist, werden in an sich bekannter Weise durch Isomerisierung von Verbindungen erhalten, in denen die Gruppierung B ein Maleylrest ist.

Die Reaklionsstufen I und II bei dem oben angegebenen Reaktionsschema sind bekannt, und das hierbei anfallende Reaktionsprodukt Digoxigenin-12-azetat ist ebenfalls bekannt. Dementsprechend ist es für das Verständnis der Erfindung nicht erforderlich, für diese Reaktionsstufen eine ins einzelne gehende Beschreibung zu geben.

Bei den nachstehenden Temperaturangaben handelt es sich um Celsiusgrade, wenn nicht ausdrücKlich etwas anderes angegeben ist.

Stufe III

Die neue Verbindung Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat wird durch Umsetzung von Digoxigenin-12-azctat mit Bernsteinsäureanhydrid in Gegenwart eines geeigneten inerten Lösungsmittels bei einer Temperatur erhalten, die allgemein zwischen etwa 25 und etwa 150", vorzugsweise zwischen etwa 80 und etwa 140 liegt. Als repräsentative Beispiele derartiger inerter Lösungsmittel seien genannt: ein Kohlenwasserstoff wie beispielsweise Benzol, ein Äther wie beispielsweise Diüthyliilher. Tetrahydrofuran oder Dioxan. ein Keton wie beispielsweise Azeton oder Methylethylketon, ein Ester wie bcisniclswei.se Äthvl-

azetat oder Bulylazetal. ein halogcnicrter Kohlenwasserstoff wie beispielsweise Chloroform. Mcthylenchlorid. Tetrachlorkohlenstoff. Dichloroäthan und andere Lösungsmittel, wie beispielsweise Schwefelkohlenstoff. Tctramclhylharnstoff. Dimethylformamid. Dimethylsulfoxid. vorzugsweise in Kombination mit Pyridin. Kollidin. Chinolin und anderen schwachen Basen, um die Bildung von Anhydrocardenoliddcrivatcn zu vermeiden. Pyridin. Kollidin und Chinolin können aber auch für sich alleine verwendet werden.

Die Verhältnisse zwischen Bernsteinsäureanhydrid und Digoxigcnin-12-azetat werden so eingestellt, daß die besten F^:rgcbnissc erhalten werden. Im allgemeinen liegen die Verhältnisse zwischen etwa stöchiometnsehen Anteilen bis etwa /um lOfachen dieser Anteile und vorzugsweise von etwa dem 3fachen bis etwa dem 5fachen der stöchiometrischen Verhältnisse. Nachdem im Vakuum der größte Teil des Lösungsmittels abgedampft ist, wobei die Temperatur höchstens 60 beträgt, vorzugsweise zwischen 35 und 40 liegt, wird der Rückstand mit Wasser behandelt und der Überschuß an Bernsteinsäureanhydrid in Gegenwart eines Alkalibikarbonats oder einer vergleichbaren schwachen Base hydrolysiert. Nach Entfernung des nicht umgesetzten Ausgangsmaterials und der neutralen Verunreinigungen durch Filtration und oder Extraktion mit einem nicht mischbaren Lösungsmittel (/. B. Dichlormethan. Chloroform. Benzol. Äthylazetat) wird die wäßrige Phase angesäuert. so daß annähernd reines Digoxigenin-12-azetat-3-hunisuccinat erhalten wird, das für die Stufe IV eingesetzt werden kann.

Es ist selbstverständlich, daß Maleinsäureanhydrid oder Phthalsäureanhydrid an Stelle von Bernsteinsäureanhydrid verwendet werden können, wobei entweder Digoxigenin-12-azetai-3-hemimalcat bzw. Digoxigenin-12-azetat-3-hcmiphthalat erhalten wird. Das Digoxigenin-12-azctat-3-hemifumarat kann in an sich bekannter Weise durch Isomerisierung von Digoxigenin-12-azetat-3-hcmimaleat hergestellt werden.

Stufe !V

Die Kupplung des Aminosäureester mit dem Digoxigenin-12-azctat-3-hemisuccinat in Stufe IV kann in der gleichen Weise erfolgen wie die Kupplung des Aminosäureesters an 3-o-Succinyldigiloxigenin, so wie es von 01 i ν e r et al. in der J. Clinical Investig.. Vol. 47. 1035 bis 1042 (1968). in Anwendung auf Isobutylchloroformat Tür die Bildung gemischter Anhydride beschrieben wurde. Es können auch Pivaloylchlorid oder N-Äthoxycarbonyl^-äthoxy-U-dihydrochinolin für denselben Zweck eingesetzt werden. Das gemischte Anhydrid kann unter wasserfreien Bedingungen in einem inerten Lösungsmitte! wie 7. B. Dichloromethan. Chloroform. Äthyfazetat. Dioxan. Tetrahydrofuran, Monoglym. Diglym usw. bei Tem peraturen zwischen -10 und 25°, vorzugsweise zwi schen -5 und 10' in Gegenwart eines Äquivalents einer organischen Base, wie z. B. Triethylamin. Trin-butylamin, Tri-n-octylamin. N-Methylmorpholin usw. hergestellt werden. Die Kupplung mit dem zweckentsprechenden Aminosäurealkylester kann in einem wäßrigen Lösungsmittel, beispielsweise in 50%igem Dioxan. ausgeführt werden, so wie es im Stand der Technik beschrieben ist. oder vorzugsweise in den vorerwähnten wasserfreien Lösungsmitteln in Gegenwart eines zusätzlichen Äquivalents an Base

Es kann auch N-Äthoxycarbonyl-2-äthoxy-1,2-dihydrochinolin für die Kupplung der beiden Reaktanten eingesetzt werden, die den vorerwähnten wasserfreien Lösungsmitteln zugegeben wurden; die Temperatur beträgt während einiger Stunden oder so lange, bis die Reaktion beendet ist, 5 bis 30°.

Es besteht auch die Möglichkeit, eine freie Aminosäure an Stelle eines Alkylaminosäureesters an Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat unter Anwendung der oben beschriebenen wasserfreien Bedingungen zu binden.

Bei der Isolierung des gewünschten neutralen Kupplungsproduktes wird so vorgegangen, daß die basischen und sauren Verunreinigungen, einschließlich des nichtumgesetzten Ausgangsmaterials, durch Zusammenbringen der Lösung der Reaktionsmischung in einem nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. Dichloromethan, Chloroform, Benzol, Äthylazetat usw., mit verdünnter wäßriger Mineralsäure und mit verdünnter wäßriger Alkalibikarbonatlösung bzw. Alkalikarbonat- oder Alkalihydroxidlösung entfernt werden. Die neutralen Verunreinigungen, vorzugsweise die N-Acyl-aminosäureester, werden anschließend unter Berücksichtigung der Molekulargröße vermittels Cielfiltration und bzw. oder in Ansehung der Polarität vermittels der Kieselsäure-Gel-Chromatographie und bzw. oder präparativer Dünnschichtchromatographie entfernt. Die Entfernung der neutralen Verunreinigungen ist wünschenswert, jedoch nicht vor der Hydrolyse in der Stufe V wesentlich.

Die Protein- und Peptid-Derivate der vorliegenden Erfindung können auch aus dem erfindungsgemäßen neuen Zwischenprodukt Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat nach den von 01 i ν e r et al. in J. Clinical Investig., Vol. 47, S. 1035 bis 1042, für die Kupplung von menschlichem Serum-Albumin und Rinderserum-Albumin an 3-o-SuccinyIdigitoxigenin (SDG) beschriebenen Verfahren erhalten werden. Bei der vorliegenden Erfindung wird Digoxi genin- 12-azetat-3-hemisuccinat an Stelle von SDG eingesetzt. Das Peptid (der Ausdruck »Peptid« schließt Polypeptide ein), das für die Herstellung der erfindungsgemäßen Peptidderivate eingesetzt wird, besitzt eine oder mehrere Gruppierungen, die jodiert werden können, wie z. B. 4-Hydroxyglycin, Tyrosin, 5-Hydroxytryptophan. Histidin. Als repräsentative Beispiele für derartige Peptide seien genannt:

L-Tyrosyl-i.-lysin.

L-Tyrosyl-i -glutaminsäure.

L-Tyrosyl-L-tyrosin,

1 -T ryptophyl-i-glutaminsäure.

ι-Tryptophylglycin.

i.-Tryptophyl-L-tyrosin.

i.-Tryptophyl-! -lysin.

L-Leucyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-arginyl-

L-phenylalanyl-L-alanin, L-Histidyl-i -alanin, L-Histidyl-L-glutaminsäure, L-Histidyl-L-tyrosin und Gramicidin.

Es versteht sich, daß die vorerwähnten Peptide an Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat nach den insbesondere von Oliver et al. in Anwendung auf menschliches Serum-Albumin und Rinderserum-Albumin beschriebenen Verfahren gebunden werden können. Statt dessen können die Peptide mit niederem Molekulargewicht an Digoxigcnm-l2-azetat-3-hemi-

509529/326

1533

succinat durch die oben für die Bindung einer Aminosäure oder eines Aminosäureesters an Digoxigeninl2-azetat-3-hemisuccinat beschriebenen Verfahren gebunden werden. Es ist klar, daß die vorstehende Beschreibung für die Verfahrensbedingungen für die Stufe IV auch auf Maleat- und Phthaleatderivale der vorliegenden Erfindung Anwendung finden können.

Stufe V

Die Reaktionsstufe V umfaßt die selektive Hydrolyse der 12-Azctatgruppe des Cardenolids oder der Alkylgruppe der Aminosäure-Gruppierung R₂ oder von beiden. Hierbei wird so vorgegangen, daß das Produkt der Stufe IV zusammengebracht wird mit einem Überschuß an Base zwischen etwa 5 und etwa 50 Äquivalenten, vorzugsweise von etwa IO und etwa 20 Äquivalenten, in Gegenwart von Wasser und oder einem inerten Lösungsmittel. Als Beispiele für die in dieser Stu^rc verwendeten Basen seien genannt: Triäthylamin. Natriumkarbonat. Kaliumkarbonat, Natriumbikaibonat. Kaliumbikarbonat, Ammoniak od. dgl. Alkalimetailkarbonate. Alkalimelallbikarbonalc und Ammoniak werden bevorzugt. Ein vorzugsweise in dieser Stufe verwendetes inertes Lösungsmittel ist ein mit Wasser vermischbares Lösungsmittel, wie z. B. Alkohole wie Methanol, Äthanol, Propanol, sek.-Butanol, tert.-Butanol. Amyl-Alkohol usw.. Ketone wie Azeton, Methyläthylketon usw., Äther wie Diäthyläther, Dioxan oder Tetrahydrofuran und andere Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid u. dgl. Sie können miteinander vermischt werden, so daß das Reaktionsmittel oder das Ausgangsmaterial aufgelöst werden. Die Hydrolyse in dieser Stufe erfordert im allgemeinen Wasser. In einigen Fällen kann jedoch die Reaktion über eine Hydrolyse- oder eine Austauschreaktion des Karbonatrests und Wasserstoffatoms des Lösungsmittels oder Reaktionsmittels laufen.

Die Hydrolyse wird bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 50. vorzugsweise von etwa 20 bis etwa 25 während einer Zeitdauer von 5 bis 20 Tagen bei Alkalimetallbikarbonattn oder von 3 bis 48 Stunden bei Alkalikarbonaten und Basen vergleichbarer Basizität durchgefühlt werden. Eine begrenzte Wirkung der Alkalibikarbonate auf 3-Succinyldigoxigenin-i-tyrosin-methylester macht die Isolierung der zwei teilweise hydrolysierten Produkte 3-Succinyl-12-azetyldigoxigenin-i -tyrosin (R' = OCOCH₃. X = Tyrosin, R₂ = H) und 3-Succinyldigoxigenin-i -tyrosin-methylester (R' - OH. X = Tyrosin. R, = CH₃) in annähernd gleichen Mengen möglich. Die erste Verbindung wird ebenfalls direkt aus Digoxigenin-12-a/etat-3-succinat Fivaloyl-Mischanhydrid und t-Tyrosin in wasserfreien" Pyridin in Gegenwart eines Äquivalents Base erhalten.

Dementsprechend fuhrt eine selektive Hydrolyse von Digoxigenm-^-azetat-S-hemisuceinat mit einem 20fachen Überschuß an wäßrigem Aikalikarbonal zu der Bildung von Digoxigenin-3-succinat (in der eingangs erwähnten Strukturformel bedeutet R' OH und X — OH), einem neuen Derivat des Digoxigenin. das wasserlösliche Alkahtnetallsalze bilden kann.

Auf ähnliche Weise bewirkt die Behandlung von Peptid- oder Proteinkonjugaten des Digoxigeninl2-azetat-3-hemisuccinats. das entsprechend der obenerwähnten Methode von Oliveretal, erhalten wurde, mit wäßrigen Alkalibikarbonaten oder Alkalikarbonaten bei einer Temperatur von 5 bis 25 wäh

rend einer Zeitdauer von einigen Tagen bis einigen Stunden eine selektive Entfernung der 12-Acetyl-; gruppe, wodurch die neuen Derivate der vorliegenden, Erfindung entstehen, bei denen in der eingangs erwähn-? 5 ten Strukturformel R' eine OH-Gruppe bedeutet und^ X für eine der Gruppierungen nach (c) und (d) steht:! Das Hydrolyseprodukt wird durch eine Folgcvon: Arbeitsstufen aufbereitet, nämlich: Neutralisation, Entfernung der neutralen Verunreinigungen, Ausfällung durch Ansäuern in den Fällen, in denen X eine Aminosäure oder eine kleine Peptid-Gruppierung bedeutet, präperativc Dünnschichlchromatographie oder Gelfiltration.

Bei Derivaten, welche Seitenkelten von höherem Molekulargewicht, wie solche, welche Polypeptide oder Proteine enthalten, ist eine Dialyse möglich; es kann jedoch gegebenenfalls auch eine Gelfiltration stattfinden. In allen Fällen wird eine vollständige Entfernung der jodierbaren Verunreinigungen vor der Jodierung durchgeführt.

Es versteht sich, daß die obenerwähnten Verfahrensbedingungen Tür die Stufe V in gleichem Maße auch auf die erfindungsgemäßen Maleyl- und Phthaloyldenvate Anwendung finden können 25

Stufe VI

Die radiojodierten Derivate können nach einem der nachfolgenden Verfahren hergestellt weiden:

1. Chloramin - T - Methode von Hunters-Green w ood, W. M. H u η t er.F.C.Greenwood. Nature 194. 495 (1962),

2. Jodchlorür-Methode, N. Ce ska, F.Grossm u 11 er. U. L u η d k ν i s t. Acta Endocrino-

logia 64. Ill bis 125(1970).

3. Isotopenaustauschmethode. R. E. Counsell, V. V. Ranade, P. Pocha. R. E. Willette, W. Diguilio, .1. Pharmaceut. Sciences 57, 1657(1968), und

4. Elektrolytische Jodierung, F. Pen nisi. LLR ο s a. J. Nuclear Biol. and Medicine 13. 64 (1964).

Wasserlösliche Substrate, wie z. B. solche, welche solubilisiercndeCarboxylgruppen oder Peptidgruppen

!Ti ~," ^CiruPP^lcrungX enthalten, sind in wäßrigen Medien jodierbar. Die Jodierung von lipophilen Substraten, wie beispielsweise Alkylester (R₂ = Alkyl) erfordert den Einsatz von inerten Lösungsmitteln oder wasserhaltigen Lösungsmitteln, die Wasser und

so mit Wasser vermischbare Lösungsmittel wie z. B. Methanol. Äthanol. Dioxan. Tetrahydrofuran. Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid usw. enthalten, men der Jodierung wird nichtumgesetztes Jodid in an sich bekannter Weise entfernt, beispielsweise ver-

mittels Absorption auf einem lonenaustauscherharz. uie mitabsorbierten jodierten Cardenolide könnet dann selektiv mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel eluiert werden. Polypeptide- oder Proteinkonjugate werden, wo es möglich ist, durch CtW i^ercini^ »«"»η sich eine Gelfiltration oder tiektrophorese anschließt. In manchen Fällen ist es möglich das Ausmaß der Dijodierune dadurch zu kontrollieren, daß das Verhältnis von Substrat zu Jod über emen Bereich von 1 :1 bis 100:1 variiert Z^T ,^A ^{= Tyrosin ist}- «Pbt ein Verhältnis I? TV¹ in ^{blS 20%} «Wertes Antigen, vergliche mit 5 bis 7% bei einem Verhältnis von 25:1. Die einfach und doppelt gekennzeichneten Derivate mit

niederem Molekulargewicht können in einfacher Weise vermittels präparaliver Dünnschichtchromatographie oder Kieselsäure-Gel-Chromatographie voneinander getrennt werden, wobei beide Komponenten mit einer Reinheit von mehr als 95% erhallen werden.

Es versteht sich, daß die oben beschriebenen Verfahrensbedingungen der Stufe VI in gleicher Weise auf Maleyl-und Phthaloylderivate der vorliegenden Erfindung anwendbar sind. Mit den folgenden Beispielen soll die Erfindung weiter veranschaulicht werden, ohne daß dadurch jedoch die Erfindung in irgendeiner Weise eingeschränkt wird; falls nichts anderes ausdrücklich gesagt ist, handelt es sich bei allen Teilen um Gewichtsleile und allen Temperaluren um Celsiusgrade.

Beispiel I

Λ. Line Mischung von 1,37 g Dioxigenin-12-azetat, 1,27 g Bernsteinsäureanhydrid und 15 ml Pyridin wird während 7 Stunden unter dem Rückflußkühlcr behandelt. Die Reaktionsmischung wird mit wäßrigen Lösungen von Natriumkarbonat abgeschreckt und zwecks Entfernung des Pyridins kon/cnlriert. Bei der Ansäuerung fällt 1.55 g rohes Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat an.

Bei der Reinigung durch präparative Dünnschichtchromatographie und wiederhokes Ausfällen aus Wasser wird reines Digoxigenin-^-azetat-S-hemisuecinal erhalten; Schmelzpunkt: 135 bis 140", [-«Ti³ + 42 (c = 0,265, Methanol), log.· 4,21 bei 217 ηΐμ (Methanol).

Das obige Verfahren wird auch zur Herstellung von Digoxigenin - 12 - azetat - 3 -hemimaleat und Digoxigenin-Q-azelat^-hemiphthalat angewandt, wobei das Bernsteinsäureanhydrid durch Maleinsäureanhydrid und o-Phthalsäureanhydrid ersetzt wird.

B. Eine Lösung von 230 mg Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat in 25 ml Wasser, das 1,20 g Kaliumkarbonat enthält, wird über 46 Stunden bei 25 gehalten. Die Mischung wird mit verdünnter Salzsäure angesäuert, wobei das Rohprodukt ausfällt.

Bei der Reinigung durch Dünnschichtchromatographie und Kristallisation aus wasserhaltigem Azeton fällt 74 mg Digoxigenin-3-hemisuccinat an. Schmel/-punkt:211 bis213\[u]% ·+ 20 "(c = 0,356.Methanol). log .· 4.20 bei 218 mjx (Methanol).

Nach diesem Verfahren wird auch Digoxigenin-3-hemimaleat und Digoxigcnin-3-hemiphthalat hergestellt, wobei als Ausgangsmatcriai Digoxigenin-12-a/etat-3-hemimaleat bzw. Digoxigenin- 12-azetat-3-hemiphthalat verwendet wird.

Beispiel 2

A. Eine Mischung von 216 mg Digoxigenin- 12-azctat-3-hemisuccinat. 4 ml Dichloromethan. 0.04 ml Tri- äthylamin und 0,052 ml Pivalylchlorid wird bei 20° während 15 Minuten gerührt und vor der Zuaabe einer abgekühlten (—10°) Lösung von 88 mg 1 -Tyrosinmethylesterhydrochlorid, 0,72 ml Tri-n-butylamin und 2 ml Pyridin auf -10° abgekühlt. Die Mischung wird während 10 Minuten bei -10 bis -5^C und während einer weiteren Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird mit Wasser verdünnt, mit 6 N-Salzsäure angesäuert und mit Dichloromethan extrahiert. Das Extrakt wird mehrmals mit einer l%igen wäßrigen Lösung von Natriumbikarbonat und WasseT gewaschen, getrocknet und zu einem gummi- bzw. harzartigen Rückstand eingedampft, der vermittels Dünnschichlchromatographie gereinigt wurde. Der reine ^-Acetyl-S-succinyldigoxigenini,-tyrosinmethylesler wird als eine farblose harzartige Masse erhallen; [>]? + 42° (c = 0,293, Methanol); los; .■■ 4,42 bei 222 ηΐμ, 3,34 bei 276 πΐμ (Methanol) und 4.32 bei 221 πΐμ, 3,43 bei 294 πΐμ (0,1 N-NaOH).

Das obige Verfahren wird wiederholt mil der Maßgabe, daß die Methyl- und Äthylester des Histidins und 4-Hydroxyphenylglycins und der Äthylestcr von L-Tyrosin eingesetzt werden, wobei die entsprechenden Aminosäureeslcrderivate anfallen.

B. Eine Mischung von 25 mg rohem 12-Azetoxy-

3 - succinyldigoxigenin - L - tyrosinmethylester, 2,5 ml Methanol und 2,5 ml Wasser, das 100 mg Kaliumkarbonat enthält, wird während 3 Stunden auf 25° gehalten. Die Mischung wird mit verdünnter Salzsäure angesäuert, das Methanol wird abgedampft. Dann wird mit Äthylazetat extrahiert. Das Extrakt wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird vermittels Dünnschichtchromatographie gereinigt, wobei 4 mg 3-Succinyldigoxigenin-L-lyrosin anfallen. Schmelzpunkt: 165 bis 175 . [> <] + 45" (cc = 0,245, Methanol), log /■ 4,40 bei 222 mn, 329 bei 276 πΐμ (Methanol); 4,34 bei 220 ΐημ, 3,39 bei 294 πΐμ (0,1 N-NaOH).

Das obige Verfahren wird auch angewandt für die Hydrolyse der anderen Aminosäureesterderivate, die gemäß dem Verfahren nach Beispiel 2A hergestellt wurden, damit die entsprechenden Aminosäurederivate erhalten werden.

Beispiel 3

A. Digoxigenin-12-azetal-3-hemisuccinat wurde mit Rinderserum-Albumin gekuppelt nach der Methode von 01 i ν e r et al., J. Clinical Investig. 47, 1035 bis 1042 (1968). Das erhaltene azetylierte Konjugat enthält 34 Moleküle Digoxigenin pro Molekül Rinderserum-Albumin, wie sich aus der Bestimmung nach der Schwefelsäuremcthode von Butler und Chen (V. P. B u 11 e r, Jr., und J. P. C h e n, Proc Nat. Acad. Sei. 47. 71 bis 78 [ 1967]) ergab.

B. Digoxigenin-n-azetat-S-succinal-Rinderserum-Albumin (81 mg), 165 mg Kaliumkarbonat und 3 ml Wasser werden während 3 Stunden auf 23 gehalten. Die Mischung wird mit 0.075 ml Essigsäure neutralisiert und während 4 Tagen bei 5° dialysiert. Das Dialysat wird zentrifugiert und tiie überstehende Schicht lyophilisiert. wobei 65 mg Digoxigenin-3-succinyl-Rinderserumverbindung mit 28 Molekülen Digoxigenin pro Molekül Rinderserum-Albumin erhalten wurden.

Beispiel 4

A. Entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 2 B, jedoch unter Austausch des Kaliumkarbonats gegen Kaliumbikarbonat und einem Reaktionsablauf von

4 Tagen, werden sowohl 12-Azetyl-3-succinyldigoxigenin-L-tyrosin und 3-Succinyl-digoxigenin-L-tyrosinmethylester erhalten. Das obige Verfahren wird auch für die Hydrolyse der anderen Aminosäureesterderivate angewandt, welche entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 2 A zar Herstellung der entsprechenden Derivate erhalten wurden.

B. Bei Zugabe von einer Mischung von Pivalinsäure und Digoxigenin-12-a7£tat-3-hemisuccinat (hergestellt nach Beispiel 2 A aus 79 mg Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinat) za einer Suspension von 27 mg L-Tyrosin, 0,038 ml Tri-n-butylamin und 5 ml Pyridin,

Umrühren während 16 Stunden bei 25° und Isolierung wie im Beispiel 2 B beschrieben, wird 12-Azetyl-3-succinyldigoxigenin-L-tyrosin erhalten, das mit der nach Beispiel 4A beschriebenen Substanz identisch ist. Das Verfahren nach Beispiel 4 B wird mit 4-HydroxyphenyIglycin und Histidin an Stelle von L-Tyrosin wiederholt, wobei die entsprechenden Aminosäurederivate erhalten werden.

B e i s ρ i e 1 5

A. Die Jodierung von IO g 3-Succinyldigoxigenin-L-tyrosin, das nach dem Verfahren des Beispiels 2 B erhalten wurde mit 9 mc ¹²⁵I, wird bei pH 7,4 nach der Methode von Hunter und Greenwood mit einem Verhältnis von Substrat zu Jod von 2,5: 1 durchgeführt. Nicht umgesetztes Jodid wird beim Durchlauf durch einen qiiarternäres Amin in der Chloridform enthaltenden Ionenaustauscher entfernt. Das mitabsorbierte Produkt wird eluiert und enthält 4,06 mc '²⁵I in zwei jodierten Produkten, nämlich 3-Suecinyldigoxigenin-(3-jodo-L-tyrosin ¹²M) und 3-Succinyldigoxigenin-(3.5'-dijodo-L-tyrosin ¹²⁵I). die im Verhältnis von 6: 1 gebildet werden. Die Trennung der beiden Komponenten in einer radiochemischen Reinheit von mehr als 95% erfolgt vermittels Dünnschichtchromatographie.

B. Die Jodierung von 60 g 3-Succinyldigitoxigenin-L-tyrosin mit 6 mc ¹²⁵I mit einem Verhältnis von Substrat zu Jod von 20 : 1 ergibt eine Gesamtausbeute von 4,13 mc¹²⁵1 an dem mono- und dijodierten Produkt im Verhältnis von 13 : 1.

C. Die 3-Succinyl-digoxigeninaminosäLreester. die nach Beispiel 4A erhalten wurden, werden nach dem von 01 i ν e r et al. Verfahren radiojodiert.

Das Verfahren nach Beispiel 5 A wird mit den anderen Aminosäurederivaten (3-Succinyldigoxigeninhistidin und 3-Succinyldigoxigenin-4-hydroxyphenylglycin) wiederholt, um die radiojodierten Derivate herzustellen.

Beispiel 6

A. Eine Mischung von 216 mg Digoxigenin-12-azetat-3-hemisuccinal, 4 ml Dichloromethan, 0,04 ml Triäthylamin und 0,052 ml Pivalylchlorid wird bei 20 während 15 Minuten umgerührt und vor der Zugabe einer abgekühlten (- 10°) Lösung von 88 mg Peptid-L-tyrosyl-L-lysin, 0,072 ml Tri-n-butylamin und 2 ml Dimethylformamid auf - 10 abgekühlt. Die Mischung wird während 10 Minuten bei — 10 bis —5 und während einer weiteren Stunde bei Raumtemperatur umgerührt. Die Mischung wird mit Wasser verdünnt, angesäuert mit 6 N-Salzsäure und mit Äthylazetat extrahiert. Das Extrakt wird mehrmals mit einer l%igcn wäßrigen Lösung von Natriumbikarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet und bis zu einem harzartigen Rückstand eingedampft, der vermittels Dünnschichtchromatographie gereinigt wird, wobei 12 - Acetyl - 3 - succinyldigoxigenin - L - ty rosol -1 - lysin erhalten wird.

B. Eine Mischung von 25 mg des Produkts nach Beispiel 6A. U5 ml Methanol und 2^ ml Wasser, das 100 mg Kaliumbikarbonat enthält, wird während 3 bis 5 Tagen aaf 25° gehalten. Die Mischung wird mit verdünnter Salzsäure angesäuert, zwecks Entfernung des Methanols eingedampft und mit Äthylazetai extrahiert. Das Extrakt wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und zur Trocknung eingedampft. Der Rückstand wird durch Dünnschicht-

chromalographie gereinigt. Dabei wird 3-Succinyldigoxigcnin-i.-tyrosol-i-lysin erhalten.

C. Das Produkt nach Beispiel 6B wird nach dem von O 1 i ν c r el al. in dem oben angegebenen Aufsatz beschriebenen Verfahren radiojodicrl, wobei radiojodiertes 3 - Succinyldigoxigenin - L - tyrosyl - L - lysin erhalten wird.

D. Das Produkt nach Beispiel 6A wird ebenfalls radiojodiert nach dem von OI i ν e r et al. beschriebenen Verfahren. Dabei wird radiojodierles 12-Acetoxy-3-Succinyldigoxigenin-L-tyrosyl-L-lysin erhalten. Die Verfahren nach den Beispielen 6A bis 6C werden mit folgenden Peptiden wiederholt:

L-Tyrosyl-L-glutaminsäure,

L-Tyrosyl-L-tyrosin,

L-Tryptophyl-L-glutaminsäure,

L-Tryptophylglycin,

L-Tryptophyl-L-trysin,

L-Tryptophyl-L-lysin,

L-Leucyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-arginyl-

i-phenylalanyl-i.-alanin,
L-Histidyl-t.-alanin,
i.-Histidyl-L-glutaminsäure,
i.-Histidyl-t -tyrosin und
Gramicidin.

Es versteht sich, daß die Verfahren der Beispiele 2, 4, 5 und 6 auch auf die Hemimaleat- und Hemiphthalatderivate anwendbar sind, die nach dem Verfahren des Beispiels 1A erhalten werden. Die Fumarylderivate der Erfindung werden in an sich bekannter Weise aus den Maleylderivaten durch Isomerisierung der Maleinsäure in Fumarsäure erhalten.

Die radiojodierten Derivate der vorliegenden Erfindung, d. h. die radiojodierten Verbindungen der eingangs wiedergegebenen Strukturformel, in der R' Tür -OH oder OCOCH₃ und X Tür eines der Radikale (d) oder (e) steht, können als gekennzeichnetes

Antigen in der radioimmunologischen Bestimmung von Digoxin eingesetzt werden. Bei einer radioimmunologischen Bestimmung, die hier Anwendung finden kann, kann es sich um eine solche handeln, die eine geringfügige Modifikation der von S m i t h et al.

in New England Journal of Medicin, Vol. 281, S. 1212 bis 1216 (March 27, 1969), für mit schwerem Wasserstoff gekennzeichnetes Digoxin wie folgt beschrieben ist:

Zu 1 ml Serum in Kunststoffteströhrchcn, 12 auf 75 mm (Falcon Plastics, Los Angeles. California), werden unter intensivem Mischen 3 ng eines radiojodierten Derivats entsprechend der vorliegenden Erfindung zugesetzt. Daraufhin werden Antidigitoxin-Antikörper in einer Menge zugegeben, die ausreichend ist, um 37 bis 50% des radiojodierten Derivats in Abwesenheit einer nicht gekennzeichneten Arznei zu binden. Die Mischung wird dann bei 25° während einer Stunde inkubiert. Ein Vergleich zwischen der radiojodierten Verbindung und dem nicht gekennzeichneten Digitoxin fur die Antikörper vermittelt die Menge des Komplexes, welche beim Gleichgewicht vorliegt. Dk Abtrennung der freien

bf, radiojodierten Verbindung wird durch Anwendung von mit Dextran überzogener Holzkohle entsprechend der von Herbert et al. in J. Clinical Endocr. Vol. 25, 1375 bis 1384 <1965|.

beschriebenen Tec!snik erreicht, wobei sich eine selektive Bindung der freien gekennzeichneten und nicht gekennzeichneten Verbindung an der überzogenen Holzkohle ergibt, deren Trennung durch Zentrifugieren herbeigeführt wird. Die überstehende Phase wird dekantiert und in einem Gammazähler ausgezählt.

Die Immunogene der vorliegenden Erfindung, d. h. die Verbindungen mit der eingangs erwähnten Strukturformel, in der R' für -OH und X für ein Proteinkonjugat steht, wie es unter (c) definiert ist, können für die Erzeugung von Antidigoxin-Antikörper nach den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren fur die Herstellung von Antidigitoxigenin-Antikörpern aus den Proteinkonjugaten von 3-Succinyldigitoxigenin, wie sie in dem vorerwähnten Aufsatz von OI i ν e r et al beschrieben sind, verwendet werden.

Das Digoxigenin-3-succinat in der Form seines Alkalimetallsalzes, insbesondere des Natriumsalzes, kann für dieselben pharmakologischen Zwecke in denselben Mengen wie Digoxigenin eingesetzt werden, mit der Ausnahme, daß das Natriumsalz des Digoxigenin-3-succinats wasserlöslich ist, wodurch die Verbindung als injizierbare Wasserlösung einsetzbar ist. Die korrespondierenden Fumarat-, Maleat- und o-Phthalatderivate können in ähnlicher Weise Anwendung finden.

Die radiojodierten Derivate der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere für die radioimmunologische Prüfung von Digoxin in menschlichem Serum. Obgleich die radiojodierten Derivate des Digitoxigenin bekannt sind, beispielsweise der radiojodierte 3 - Succiny I -digitoxi genin - L - tyrosin - methylester (vgl. The Journal ot Clinical Investication, Vol. 47, S. 1035 bis 1042 [1968]), können diese Derivate nicht für die

Messung des Scrum-Digoxin-Spiegels wetzen der ungünstigen immunologischen Quer-Aktivität verwendet werden.

Die radiojodierten Cardenolidderivate der voriiegenden Erfindung stellen eine Verbesserung gegenüber dem mit schwerem Wasserstoff behandelten Digoxin dar, das bislang für die radiologische Prüfung von Digoxin verwendet wurde. Die Gründe hierfür bestehen in folgendem:

1. An Stelle der kostspieligen und komplexen FIüssig-Scintillationszähler, die für die Verbindung mit schwerem Wasserstoff benötigt wird, kann ein verhältnismäßig billiger Zähler eingesetzt werden.

2. Es werden keine Scintillationsflüssigkeiten und spezielle Phiolen benötigt.

3. Es entfallen interne und externe Standardisierungen wie bei dem Digoxin mit schwerem Wasserstoff.

4. Die Zählgenauigkeit ist höher, insbesondere in wäßrigen Medien.

Die radiojodierten Derivate der vorliegenden Erfindung, in denen die Aminosäure-Gruppierung in der Säureform vorliegt, anstatt in Esierform (R₂ = H), besitzen eine wesentlich höhere Polarität, Löslichkeit und Hydrophilität, wodurch diese Derivate bei physiologischen pH-Werten wasserlöslich sind und in wäßrigen Medien jodiert werden können. Sie besitzen

eine Seitenkette, die in etwa hinsichtlich der Polarität vergleichbar ist mit der Tridigitoxose-Gruppierung der natürlichen Cardenolide. Sie zeigen auch ein höheres Bindungsvermögen an Antikörpern und eine geringere Neigung hinsichtlich der Adsorption auf lipophilen Oberflächen, wie z, B. Kunststoff-Teströhrchen.

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   **i*L Derivate des Digoxigenins, gekennzeichnet durch die nachfolgende Strukturformel:

   IO

   OH

   in der R' fiir —OH oder -OCOCH₃ steht, B ein Succinyl-, Maleyl-, Fumaryl- oder o-Phthaloylrest bedeutet und X eine der nachfolgenden Bedeutungen haben kann:

   a) -OH.

   b) —OM, worin M ήη Alkalimetall ist,

   c) —N — Protein

   d) —N— Peptid

   35

   worin das Peptid nicht mehr als 20 Einheiten und wenigstens eine der Peptid-Einheiten eine der nachfolgenden Aminosäuren enthält: Tyrosin, 4-Hydroxyphenylglycin, Tryptophan, 5-Hydroxytryptophan und Histidin, wobei gegebenenfalls eine oder mehrere der Peptid-Einheiten mit einer radiologischen Kennzeichnung versehen, vorzugsweise radiojodiert sind, oder

   e) ein gegebenenfalls mit einer radiologischen Kennzeichnung versehenes Aminosäureradikal, das eine der nachfolgenden Strukturformeln besitzt:

   ⁵° HO

   H
   NH-C—COOR,

   i
   CH,