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Verfahren zur Herstellung leukocyten- und trombocytenarmer Blutkonserven
sowie dafür geeignete gebrauchsfertige Ausrüstung Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur I7erstellung von Blutkonserven, deren Leukocyten- und Trombocytengehalt gegenüber
dem von Vollblut erheblich erniedrigt ist.
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Es ist bekannt, daß Vollbluttransfusionen zur Bildung von Leukocyten-
und Trombocytenantikörpern führen können, wobei eine deutliche Abhängigkeit von
der Dosis und den Zeitintervallen zwischen den einzelnen Transfusionen besteht.
Besondere Bedeutung kommt dieser Erscheinung bei Organtransplantationen zu, da die
nach Vollblut transfusionen bereits existierenden Antikörper für die Rejektion des
Transplantates verantwortlich sein können.
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Aus diesem Grunde ist es angezeigt, dem für eine spätere
Organtransplantittíon
vorgesehenen Patienten lediglich leukocyten- und trombocytonarme Blutkonserven zu
verabfolgen und auf diese Weise e-le Präimmunisierung gegen Gewebeantigene weitgehend
auszuschließen.
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Daneben sind solc»P Präparationen von Bedeutung für Patienten mit
besonderen hämatologisch-serologischen Veränderungen, wie z.B. polytransfundierte
und anämische Menschen. Auch sind solche Präparationen besonders geeignet für wissenschaftliche
Untersuchungen, bei denen Leukocyten und "rombocyten stehende Faktoren sind, z.B.
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bei der Darstellung von Erythrocytenmembranenzymen.
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Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Gewinnung leukocyten- und
trombocytenarmer Blutkonserven bekannt.
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Einmal können die Leukocyten- und Trombocytenzahlen durch wiederholtes
Waschen von Vollblut mit physiologischer Rochsalzlösung erniedrigt werden. Dieses
Verfahren ist Jedoch bedenklich, weil durch das dabei erforderliche wiederholte
Waschen und Zentrifugieren eine Schädigung der Erythrocyten eintreten kann. Weiterhin
ist bekannt geworden, daß man die Leukocyten- und Trombocytenzahl nur in heparisisiertem
oder mit Ionenaustauscher behandeltem Blut durch Verwendung von Kunststoffiltern
reduzieren kann; genauere Analysen haben darüber hinaus gezeigt, daß
hierbei
im wesentlichen nur die Granulocy..en; nicht aber die Lymphocyten entfernt werden.
Schließlich ist es bekannt, daß man die Erythrocyten durch Zusatz grormole kularer
Substanzen wie Dextran sedimenti-ren und dadurch gleichzeitig den Leukocyten- und
Tromboc-tengehalt erheblich vermindern kann.
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Es ist bekannt, daß der kritische Wert Fih den Leukocyten gehalt bei
etwa 1000 Leukocyten Je/ul (0,47 bis 1,0 x 109 Leukocyten je Transfusionseinheit)
liegt, wenn eine Antigen- und -immunwirkung vermieden werden soll (Gert Jesen, K.
and Kissmeyer-Nielsen, F.: Immunology of leukocytes. In: Progress in Clinical Pathology;
Ed.
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Stefanini, M., II (Grune and Stratton, New York (1969); Brittingham,
T.E. und Chaplin jr., Blood 17, 159 (1961); Dausset, J. et al., Vox Sanguinis 2,
248 (1957). Die zuvor beschriebenen vorbekannten Verfahren ermöglichen die Erreichung
dieses Grenzwertes entweder überhaupt nicht oder führen in nicht genau reproduzierbarer
Weise zu Blutkonserven, deren Leukocytenzahl teils unter, teils huber 1000 //ul
liegt. Es ist deshalb erforderlich, den Leukocytengehalt jeder einzelnen Konserve
zu bestimmen und dabei alle diejenigen auszuscheiden, deren Gehalt zu hoch ist.
Selbst das beste bislang bekannte Verfahren, nämlich die Sedimentation, führt zu
mehr als 20% zu unbrauchbaren Konserven, während durch Adsorption an Kunststoffiltern
nicht
einmal 50% der behandelten Vollblutkonserven auf erzen angestrebten Leukocytgehalt
von weniger als 1000 //ul gebracht werden können.
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Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein zuverlässiges
Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe in reproduzierbarer Weise leukocyten-
und trombocytenarme Blutkonserven mit einer Leukocytenzahl von weniger als 1000
//ul und einer Trombocytenzahl von weniger als 20.000 / µl einfach und schnell hergestellt
werden können.
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Demgemäß ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
leukocyten- und trombocytenarmer Blutkonserven, welches dadurch gekennzeichnet ist,
daß man Vollblut in einem sterilen Behälter mit einem Stabilisator sowie vorzugsweise
mit hochmolekularen Verbindungen, insbesondere mit Dextran mit einem Molekulargewicht
von etwa 50.000 bis 250.000, versetzt und nach Beendigung der Sedimentation das
erhaltene Sediment zu r weiteren Reduzierung des Leukocytengehaltes auf einen Wert
unter 1000 //ul und des Trombocytengehaltes auf einen Wert unter 20.000 //ul durch
ein steriles Adsorptionsfiltermaterial in einen zweiten sterilen Behälter fließen
läßt.
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Als Adsorptionsfiltermaterial hat sk h Watte aus feinen
Natur-
und/oder Synthesefasern oder Glasfasern besonders bewährt. Geeignet slad beispielsweise
Polyamidfasern, Polyesterfasern sos,Le Perfluoräthylenfasern, wobei die ersteren
besonders bevorzugt sind. Ferner lassen sich z.B. auch Pulver oder Granulate der
genannten Mate-Ialien r.it Erfolg verwenden.
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Das fUr die Sedimentation verwendete Dextran kann ein Molekulargewicht
von etwa 50.000 bis 250.000-aufweisen; vorzugsweise liegt das Molekulargewicht bei
etwa 60 bis 110,000, insbesondere bei etwa 70,000.
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Als Stabilisatoren kommen die bekannten Systeme für Blutkonserven
in Frage, insbesondere Stabilisatoren auf Heparinbasis sowie die sogenannten ACD-Stabilisatoren
aus Zitronensäure, Zitrat und Dextrose. Auch die Sedimentation von Blut, welches
nur mit Stabilisatoren vermischt ist, führt in Verbindung mit dem Adsorptions-Filterverfahren
zur Verminderung der Leukocyten- und Trombocytenzahlen. Besonders günstige Ergebnisse
werden jedoch durch die Kombination der letztgenannten Stabilisatoren mit hochmolekularen
Substanzen wie Dextran und anschließendem Filtrieren erhalten.
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Der Erfolg des erfindungsgemäßen Verfahrens war aufgrund der bisherigen
Kenntnisse auf-diesem Gebiet äußerst
überraschend und in keiner
Weise vorhersehbar. Insbesondere war bekannt, daß eine Behandlung von ACD-haltigem
Vollblut mit einem AdsorptionsfiltermateriaL zu überhaupt keiner merklichen Senkung
der Leukocyten-und Trombocytenzahl führt, jedoch durch das gleiche Verfahren mit
heparinhaltigem Voliblut glundsätzlich nur der Gehalt an Granulocyten, nicht aber
der an Lymphocyten vermindert werden kann (vg. T.J. Greenwalt et al, in Transfusion
2, 221-229 (1962, insbesondere Seite 222, rechte Spalte). Nach Sedimentation des
beispielsweise einen ACD-Stabilisator und Dextran enthaltenden Vollblutes gelingt
es dagegen überraschend, den bereits verminderten Leukocytengehalt zuverlässig und
reproduzierbar auf Werte weit unter 1000 /iul zu senken, und die Trombocytenzahl
auf einen Wert unter 20000 /µl zu bringen, wenn man das bereits vorbehandelte Blut
der an sich bekannten Filtration durch ein Adsorptionsfiltermate rial unterwirft.
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Gegenstand der Erfindung ist ferner eine gebrauchsfertige Ausrüstungskombination
zur Durchführung des uvor beschriebenen Blutaufbereitungsverfahrens; diese Kombination
ist gekennzeichnet durch einen ersten, die erforderliche Menge an Stabilisatorlösung
und gegebenenfalls an Dextran enthaltenden sterilen Behälter, einen zweiten leeren
sterilen Behälter sowie ein mit dem Adsorptionsfiltermaterial
gefülltes
Verbindungsstück für die beiden Behälter, welches auch fest mit einem der Behälter,
insbesondere dem ersten verbunden sein kann. Gemäß einer bevorzugten Aus führungs
form sind die sterilen Behälter Kunststoffbeutel.
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Mit Hilfe dieser Ausrüstung ist es möglich, auf einfachste Weise leukocyten-
und trombocytenarme Blut konserven bei Bedarf herzustellen. Das Vollblut wird direkt
vom Donor in den vorbereiteten ersten Behälter geleitet, in welchem es mit oem Stabilisator
sowie mit dem Dextran versetzt wird. Nach dem Vermischen wird der Behälter umgekehr
aufgehängt und solange sich selbst überlassen, bis die Sedimentation abgeschlossen
ist; Je nach Temperatur sind hierfür im allgemeinen etwa 30 bis 120 Minuten erforderlich,
wobei die Sedimentationsgeschwindigkeit mit steigender Temperatur zunimmt. Anschließend
wird der erste Behälter mit dem sterilen Zwischenstück, welches gleichzeitig das
Adsorptionsfiltermaterial enthält, sowie dem zweiten sterilen Behälter verbunden,
worauf man das Sediment langsam aus dem ersten in den zweiten Behälter fließen läßt,
in welchem sich die fertige Blutkonserve sammelt, wozu mindestens etwa 30 Minuten
erforderlich sind.
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Von besonderer praktischer Bedeutung ist, daß das erfindungsgemäße
VOrfahren keine Konserven mit zu hohen Leukocyten
- und Tr@mbocytenzahlen
liefert, welche verworfen werden müßten. Besonders wichtig ist dies dann, wenn Blutkonserven
mit einer bestimmten Blutfaktorkombination benötigt werden und nur wenige Donoren
zur Verfügung stehen.
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Zur näheren Erläuterung der Erfindung wird nachfolgendes Beispiel
diene@
Beispiel 400 ml Blut wurden einem Donor entnommer ur. direkt
in eine pyrogenfreie Glasflasche geleitet, welche 50,0 ml ACD-Stabilisatorlösung
gemäß USP XVI B der nachfolgenden Zusammensetzung: Trinatriumcitrat x 2 H20 13,2
g Zitronensäure 4,4 g Dextrose «4,7 g Aqua bidest. ad 1000,0 g sowie ferner 70,0
ml einer 6% Dextran enthaltenden physiologischen Kochsalzlösung (Dextran m1s einem
durchschnittlichen Molekulargewicht von 70.000, bezogen von der Firma Knoll AG,
Ludwigshafen, BDR, unter der Bezeichnung 11Makrodex") enthielt. Das Blut wurde gründlich
mit der in der Flasche enthaltenen Lösung vermischt, worauf die Flasche umgedreht
und bei Zimmertemperatur 60 bis 120 Minuten hängengelassen wurde. Nachdem sich die
Erythrocyten abgesetzt hatten, wurde das Sediment während 30 bis 45 Minuten über
ein Adsorptionsfiltermaterial aus Nylonfasern (Filtermaterial der Firma Fenwal Laboratories,
MortonGrove, Illinois, USA) in eine zweite sterile pyrogenfreie Flasche abgelassen.
Das filtrierte Sediment wurde mit einem gleichen Volumen physiologischer Kochsalzlösung
versetzt, um das ursprüngliche Volumen wieder herzustellen. Nach gründlicher Vermischung
des Flascheninhaltes wurden jeweils Proben von 2'ml für die
Bestimmung
der Leukocytenzahl sowie des Gehaltes an Blutplättchen entnommen.
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Zum Vergleich wurden weitere Vollblutkonserven wie zuvor beschrieben
behandelt, wobei jedoch die zusätzliche Filtration entfiel .
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Die erhaltenen Ergebnisse sind in den beiliegenden Figuren 1 und 2
sowie in der nachfolgenden Tabelle I zusammengefaßt. Wie die Werte in der Tabelle
zeigen, wird mit Hilfe der Dextran-Sedimentation bereits eine Minderung der Leukocyten
und der Blutplättchen um 85 % erreicht; wie jedoch aus Fig. 1 hervorgeht, ist bei
dieser Arbeitsweise nicht sicher, daß eine ausreichende Verminderung der Leukocytenzahl
in Jedem Einzelfall erreicht wird, denn etwa 20 % der Proben liegen oberhalb des
Grenzwertes von 1000 Leukocyten / /ul. Wenn man dagegen erfindungsgemäß zusätzlich
filtriert, so wird eine Verminderung der Leukocytenzahl um 96 % beobachtet, wobei
48 von 50 Versuchen Leukocytenzahlen zwischen 50 und 400 /,ul ergaben und nur 2
Versuche zu einem Gehalt von 650 / /ul also immer noch zu einem weit unter der Grenze
liegenden Wert, führten.
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Überraschend ist darüber hinaus, daß die erfindungsgemäß im Anschluß
an die Dextran-Sedimentation durchgeführte Filtration über Polyamidfasern nicht
nur die Granulocytenzahl, sondern auch die Lymphocytenzahl erniedrigt, was im Gegensatz
zu den Filtrationsversuchen mit heparinhaltigem Vollblut steht 'vewgl. die Ergebnisse
in Tabelle I sowie T.J. Greenwalt, a.a.O.). Zwar wurde kein nachteiliger Einflul'
oer Dextran-Sedlmentation und der Filtration auf die roten Blutkörperchen beobachtet,
doch ist eine Aufbewahrung der erfindungemäß hergestellten Blutkonserven länger
als 24 Stunden im allgemeinen nicht empfehlenswert.
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Im Hinblick auf die Leichtigkeit der Herstellung ergeben sich hierdurch
in der Praxis keinerlei Schwierigkeiten.
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In den anliegenden Figuren ist jeweils die Zahl der Einzelversuche
gegen die Leukocytenzahl / /ul Sediment aufgetragen. Fig. 1 gibt die Verteilung
für 50 Blutkonserven nach der Dextran-Sedimentation wieder, während Fig. 2 die Ergebnisse
für 50 erfindungsgemäß hergestellte Blutkonserven wiedergibt, welche zunächst mit
Dextran sedimentiert und anschlieP0nd über Polyamidfasern filtriert wurden.
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Tabelle I Hämatologische Untersuchung von 50 Proben
| Leukocyten/µl Abnahme de@ Lympho- Granulo- Blutplättchen/µl
Abnahme der |
| Mittelwert Leukocyten- cyten cyten Mittelwert Blutplätt- |
| (Streuung) zahl in % (Streuung) chenzahl |
| in % |
| Ausgangswerte 6380#1550 ./. 41#7% 59#7% 217.140#31.690 ./. |
| (4.000-14.000) (32-51%) (48-69%) (127.000-293.000) |
| Werte nach der 950#380 85,1 % 55#10% 45#10% 27.640#11.740 87,2% |
| Dextran- (475 - 2.450) (43-78%) (22-@7%) (4250-98.000) |
| Sedimentation |
| Werte nach der 260#110 95,9 % 70#8% 30#8% 6.840#3150 96,9% |
| zusätzlichen (50 - 650) (54-86%) (14-40%) (2250 - 16.000) |
| Filtration |