DE2043189C3 - Schnelltest zum Nachweis einer pathologischen Katecholaminmenge im Harn - Google Patents

Description

Die [-.rfiii'.l.int! betriff! ei π Schneiltestvcrfahren zur annähernd· Feststellung des Gehalts an Adrenalin. Noradreiu: bzw. Dopamm im Harn ·' irch Puffern des .mix-s.aui.itcn Harns. Adsorption an Aluminiumoxid und Oxydation in Gegenwart von Kaliumferricyanid.

Fs ist bekannt, daß krankhafte Veränderungen im Organismus die Ausscheidung der Katecholamine Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin beeinflussen. So bewirken beispielsweise Tumore, die sich am sympathischei: Nervensystem ansiedeln, wie Neuroblastome und Phaeochromozytome eine erhöhte Ausscheidung von Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin im Harn.

Die quantitative Bestimmung der Katecholamine ist sehr zeitraubend und erfordert sowohl einen hohen personellen als auch apparativen Aufwand. Die Katecholamine werden heute allgemein nach dem Verfahren von Euler bestimmt. Danach wird eine Harnprobe von etwa 25 ml auf einen pn-Wert von etwa 8,5 eingestellt und auf eine Aluminiumoxydsäule aufgegeben. Die Katecholamine werden mit Essigsäure eluiert, das Eluat mit Ammoniak auf einen p_H-Wert von 5 bis 6 eingestellt, mit Kaliumferricyanid oxydiert, das Oxydationsprodukt mit Alkali und Ascorbinsäure in stabile Lutine umgewandelt und deren Fluoreszenz als Maß für die Konzentration der Katecholamine bestimmt.

Angesichts der Langwierigkeit und Umständlichkeit der quantitativen Bestimmung wäre es erwünscht, zunächst vorab in einem Schnelltest festzustellen, .ob der Katecholaminspiegel im Harn krankhaft erhöht ist oder nicht. Es brauchten dann nur diejenigen Proben einer genaueren Untersuchung, d. h. einer quantitativen Bestimmung, unterworfen zu werden, in denen dieser Schnelltest positiv verlaufen war. Hierdurch würde eine erhebliche Arbeitsersparnis erreicht, weil nicht wie bisher alle Harnproben der quantitativen Bestimmung unterworfen werden müßten, sondern durch den Schnelltest gleich diejenigen ausgeschieden würden, die keinen erhöhten Katecholaminspiegel anzeigen. Von besonderer Bedeutung ist eine solche Schnellbcstimmungsmethodc, weil in der modernen Medizin immer mehr Laborbefunde zur exakten Ermittlung der Krankheitsursache herangezogen werden. Eine brauchbare Schnellbestimmungsmethode würde es sehr erleichtern, die Werte für den Katecholaminspiegel im Harn generell in die Laboruntersuchungen mit einzubeziehen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer brauchbaren Schnellbestimmungsmethode, die eine Aussage darüber erlaubt, ob der Kalechülaminspiegel über dem normalen Spiegel eines gesunden Patienten liegt und damit krankhaft verändert ist oder nicht. Die erfindungsgemäße Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man eine geringe

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Hammenge mit einer nicht ox\die:cnden Saure. Aluminiumoxyd-Reagenzpapiers und führt zu einer

außer Phosphorsäure, aufkocht, mn einer alkalischen gleichmaßigeren I^;arbentwii_klung auf dem Reagenz-

l'ui'erlosung aus dem Dinatriumsalz \on Athvlen- papier.

iiia,iiintetrues<igsäure. einem Alkalih\ droxyd und Anschließend wird die Probe langsam durch ein Bromthymolblau bestehenden Pu!ieilos_ung alkali- 5 Filter aus mit A'ummiumoxvd imprägniertem Papier Men. gegebenenfalls filtriert, dann langsam durch gegeben. Die Filti/'.ionsgeschw indigkeit ist dabei e-.n Hlier aus mit Aluminiumoxid imprägniertem wesentlich. F.\in zu rasches Durchlaufen muß -.er-IVinier tiltriert. das durch Imprägnieren üblichen mieden werden. Als geeignet haben sich Filtrations-( hrr.maiographiepapiers n-.it einer pho'-phorsauun Geschwindigkeiten von etwa 10 His 12 Tropfen, w aßt igen Losung eines Mumimimisalze- oder mit -r, Minute erwiesen. B i den eingesetzten Harnmengen einer Aluminatlosuiig. I ällung \ι·η Aluminium Ment die !-"titration.dauer zwischen iwa 4 und incinmd mit einer Hase, vorzugsweise i'asformiiMTi 25 Minuten und beträft im Normalfall beim DurchAmmoniak, bzw. mittels hnchprnzeniiger Ammo- saunen des Harn* mit der Wasserstrahlnumpe etwa •u'imchloridlösung und Trocknen de, Papiers er· \2 bis 13 Minuten. Das Filtrieren der Probe erfolgt nalten worden isl. danach mil ciivjr geringen Wasser- 15 in üblicher Weise durch geeignete Filiriervorrichtunmenge nacKnilt. auf das Aluminiumoxydpapier gen. wie Büchner-Trichter oder andere mit Bohruneine wäßrige Reagenzlösung aus Kaliumferricyanid, gen versehene Filterplatien, auf die ein Vorrats-Ammoniumacetat und Kupfersulfat aufbringt und zylinder aufgesetzt ist. Zur Bestimmung der Filtraeine definierte Zeit einwirken läßt, überschüssiges tionsgeschwindigkcit enthält die F-iltriervorrichuing Reagenz absaugt und die entstandene Färbung mit 20 an ihrem unteren Ende einen Tropfenzähler. Für die der in gleicher Weise bestimmten Färbung einer Zwecke der Erfindung als besonders geeignet hat Harnprobe bekannten Kate :holamingehalts ver- sich eine Filtrierapparatur aus Plexiglas erwiesen, gleicht. Das Oberteil besteht aus einem 200 mm langen Rohr Wie bei der quantitativen fluorphotometrischen von 11.5 mm lichter Weite und einem Außendurch-Bestimmung wird der Nachweis in einem Teil des 25 messer von 20 mm. Auf etwa 1 cm Länge ist die gut durchmischten 24-Stunden-Harns durchgeführt Bohrung auf lfi mm erweitert. Das Unterteil der Für den Versachszweck ist eine Menge von etwa Apparatur besteht aus einem 40 mm langen aus-1 ¹Vo des 24-Stunden-Harns, .as etwa 1 bis 20 ml gebohrten Plexiglasrohr, das unten durch einen entspricht, am besten geeignet. Die Menge des Stutzen mit Schlaucholive, oben durch eine Siebwährend 24 Stunden ausgeschi Jenen Harns beträgt 30 platte von 11,5 mm Durchmesser verschlossen ist. etwa 100 bis 500 ml beim Säugling und etwa 300 bis Um die Siebplatte herum ist das Rohr auf etwa 2000 ml und darüber beim Erwachsenen. In das 10 mm Länge auf einen Außendurchmesser von Sammelgefäß werden 20 bis 30ml lOprozentiger Kimm abgedreht. Das Filter aus aluminiumoxyd-Schwefelsäure oder eine andere nicht oxydierende imprägniertem Papier wird auf die Siebplatte aufanorganischc Säure, wie Salzsäure, gegeben, um eine 35 gelegt und dann das Oberteil der Apparatur auf-Autoxydation der Brenzkatechinamine in alkali- gesteckt, wodurch das Filter fest in die Paßflächen schern Milieu während des Sammelns zu verhindern. von Ober- und Unterteil eingeklemmt wird. Die Phosphorsäure ist ungeeignet, da sie den Test stören Probe läuft häufig auch »line Betätigung der Wasserwürde. Der auf einen pn-Wert von zweckmäßig nicht strahlpumpe durch, in der Regel wird jedoch von unter 2 angesäuerte Harn wird nach einer Lagerung 40 vornherein mit Wasserstrahlvakuum gearbeitet, von mindestens 1 und höchstens 5 Tagen mit ver- Das als Filter verwendete aluminiumoxyddünnter Säure aufgekocht. Für 1 ° 0 des 24-Stunden- imprägnierte Reagenzpapier wird hergestellt durch Harns genügt Aufkochen der Harnprobe mit 3 ml Imprägnieren üblichen Chromatographiepapiers mit 2pro7.entiper Schwefelsäure über dem Bunsen- einer phosphorsauren wäßrigen Lösung eines Alubrenner in einem großen Reagenzglas. 45 miniumsalzes einer anorganischen oder organischen

Nach dem Abkühlen wird die Harnprobe tropfen- Säure, Fällen von Aluminiumhydroxyd und Trockweise mit einer alkalischen Pufferlösung vei setzt, bis ncn des Papier. Zui Imprägnierung sind Salze wie die Farbe \on Rot über Gelb nach Grün umschlägt. AUSO₁).,, AlCl₃ und andere wasserlösliche Salze ge-Die Pufferlösung enthält Thymolblau als Indikator, eignet. Bevorzugt wird Aluminiumsulfat verwendet, eine Base, vorzugsweise verdünnte Natronlauge, zum 50 Die Fällung von Aluminiumhydroxyd bzw. Alu-Alkalisieren der Probe sowie das Dinatriumsalz von miniumoxydhydroxyd erfolgt vorzugsweise durch Äthylendiamintetraessigsäure. Nach Farbumschlag Einbringen des imprägnierten Papiers in eine Amnach Grün werden noch etwa 1 bis 3 Tropfen moniakatmosphäre. Es ist jedoch auch möglich, die Pufferlösung bis zum Umschlag nach Blau zugesetzt. Fällung durch Eintauchen in verdünnte Ammoniak-Einegeeignete Pufferlösung hat folgende Zusammen- 55 lösung vorzunehmen, jedoch sind Haltbarkeit und setzung: Aktivität des Papiers nicht ganz so gut wie bei der

Einwirkung von gasförmigem Ammoniak. Das

50 mg Thymolblau Papier kann auch mit einer Lösung von Natrium-

8 g Dinatriumsalz der Äthylendiamintetraessig- aluminat imprägniert und das Aluminiumoxyd durch

säure 60 Eintauchen in eine hochprozentige Ammonium-

100 ml lOprozentrige Natronlauge. chloridlösung gefällt werden.

Die Einwirkung von gasförmigem Ammoniak An Stelle von Natronlauge sind auch andere Alkali- erfolgt am besten auf das noch feuchte Papier. Die

hydroxyde wie KOH geeignet. Einwirkungsdauer beträgt vorteilhaft etwa 60 bis

Zweckmäßig wird die alkalisierte Probe dann 65 70 Stunden, jedoch beeinträchtigen geringere oder

filtriert, vorteilhaft durch ein dichtes Filter. Der höhere Einwirkungsdauer die Aktivität nicht

Filtrationsschritt ist nicht unbedingt erforderlich, wesentlich. Die Trocknung des Papiers wird zu-

verringert jedoch die Gefahr der Verstopfung des nächst zweckmäßig bei Raumtemperatur vorgcnom-

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nieii und dann im T.xsikkator über chemischem sdiwindiükeit von etwa It) bis 12 Tropfen/Minute

Trocknungsmittel fortgesetzt. Sie ist nach 2- bi · unter Anwendung von WasserstrahKakuum filtriert.

3taeiger l.anerung im Fxsikkator über Phosphor- Das zur Filtration \erwendele Aiuminiumo.w J.papier

pento.xsd. Atzkali und Calciumoxid beendet, lias j_s[ aul f-'ljcnde Weist· hergestellt worden:

fertig getrocknete Papier ist in einem gut \erschlos- j 50 g AUSO.).₍ ΙΜΙ.,Ο wurden unter Zusatz \(n

senen Gefäß über Blaugel praktisch unbegrenzt 2.25 ml S5piozenuger Orthophosphorsäure ^m wenig

haltbar. Frisch hergestelltes Papier wird zweckmäßig W isscr gelöst. Nach Auflösung des Salzes wird mit

n.indestens 2 bis > Wochen gelagert, da seine F'iltra- \\,.^u auf KiOn aufgefüllt und gegebenenfalls

tionseigenschaften zunächst schlecht sind und auch tiUrierl. Mit dieser Losung werden Streifen aus

die Farbentwicklur.g unregelmäßig ist. iu Chromatographiepapier Schleichcr-Schüll Nr. 2043 a

Nachdem die Harnprobe .urch das Aluminium- oder b MuI. imprägniert, indem das Papier viermal owdpapier gelaufen ist. w , d zur Entfernung \on durch eine Hache mit der Impragnierlösung gelullte Resten scharf abgesaugt und anschließend wird mit Schale gezogen wird. Anschließend läßt man einige einer kleinen Wassermenge von beispielsweise 0.5 Sekunden über eine Ecke des Papiers abtropfen, bis 3 ml gewaschen. Nach dem langsamen Durch- i^ Danach wird das Papier m> auiüehängt. daß überlaufen des Waschwassers wird der Rest scharf ab- schlissige Lösung über eine Ecke abtropfen kann, gesaugt. Nach 2- bis 3minüiigem '.iitropfen wird das Papier

Nach Abstellen der Wasserstrahlpumpe wird auf in noch feuchtem Zustand m ine frisch mit kon/en-

das Aluminiumoxydpapier eine geringe Menge einer tricrtem Ammoniak beschickte Zelle eingebracht,

wäßrigen Reagenzlösung aufgetropft, die etwa äqui- 20 wobei das Papier nicht eintauchen darf. In dieser

molare Mengen Kupfersulfat und Kaliumferricyanid Amnioniakatmosphärc wird etwa 60 bis 70 Stunden

sowie Ammoniumacetat enthält. Eine geeignete belassen; danach wird das Papier zunächst 2 Stunden

Lösung kann beispielsweise folgendermaßen her- bei Raumtemperatur und schließlich 2 bis 3 Tage

gestellt werden: über Phosphorpentoxyd, Atzkaii und Calciumoxyd

103,2 mg Kupfersulfat werden in 36 ml 50pro7.cn- 25 im Exsikkator getrocknet und anschließend noch tiger wäßriger Ammoniumacetatlösung gelöst. Diese 3 Wochen gelagert. Nachdem der Harn durchLösung wird mit Wasser auf 50 ml aufgefüllt. gelaufen ist. wird mit 10 Tropfen Wasser nach-

Gctrennt werden 136.8 mg Kaliumferricyanid in gespült und an der Wasserstrahlpumpe scharf ab-

50 ml Wasser gelöst, und beide Lösungen vereinigt. gesaugt. Danach wird die Wasserstrahlpumpe ab-

Die Reagenzlösung ist lichtempfindlich und wird 30 gestellt und das Aluminiumoxydpapierfilter werden

daher zweckmäßig in einer schwarz lackierten 5 Tropfen einer Reagenzlösung aufgebracht, die

SchlifTflasche aufbewahrt. Die Menge der Reagenz- durch Vereinigung der beiden folgenden Lösungen

lösung wird so gewählt, daß das Filter gerade bc- erhalten wurde:
deckt ist. Nach 1 bis 4, vorzugsweise 2 bis 3 Minuten

Einwirkungsdauer der Reagenzlösung auf das Alu- 35 Lösung): 103,2mg Kupfersulfat werden in 36ml miniumoxydpapier wird scharf abgesaugt und mit SOprozentigem wäßrigem Ammoniumwenig Wasser, beispielsweise 10 Tropfen, nach- acetat gelöst und die Lösung wird mit gespült. Danach wird das Reagenzpapier entnommen Wasser auf 50 ml aufgefüllt,
und im noch feuchten Zustand mit der Vergleichs- Lösung 2: 136,8 mg Kaliumfe.'ricyanid werden in farbe verglichen. Auf das Nachspülen kann vcr- 40 50 ml Wasser gelöst,
ziehtet werden, jedoch muß dann sofort mit der

Vergleichsfärbung verglichen werden, da eine Nach- Die Reagenzlösung läßt man 3 Minuten auf das

dunklung erfolgt. Aluminiumoxydpapierfilter einwirken, saugt dann

Die Herstellung einer geeigneten Standardfärbung, scharf ab und spült mit 10 Tropfen Wasser nach. die nach Fixierung dann photographisch reprodu- 45 Das noch feuchte Reagenzpapier zeigt eine Braunziert werden kann, wie das bei Reagenzpapieren der färbung, die einen Katecholamingehalt im Harn von Fall ist, erfolgt mit Harnproben bekannten Katechol- etwa 1000 /<g/24 Stunden, also einen höheren als den amingehalts, wobei die Färbung, die von einem Normalwert zeigt.

gerade noch zulässigen Katecholaminspiege! hervor- Die Reagenzlösung wird entweder vor jedem Vcr-

gcrufcn wird, als Grenzfärbung herangezogen wird. 50 such frisch aus den beiden getrennten Lösungen

. hergestellt oder die Lösungen werden nach dem Ver-

^BeisP^iel einigen im Dunkeln etwa 1 Woche im Kühlschrank

10 ml eines mit lOprozentiger Schwefelsäure aufbewahrt. Während dieser Zeit wird das in Ferrischwach angesäuerten und 1 Tag gelagerten 24- cyanidl'Jsungen enthaltene Ferrocyanid als Kupfcr-Stunden-Harns werden mit 3 ml 2prozentiger 55 ferrocyanid ausgefällt. Nach Abzentrifugicrcn Schwefelsäure versetzt und in einem großen (10 Minuten bei 4000 U/Min.) ist die überstehende Reagenzglas kurz aufgekocht. Nach dem Abkühlen Lösung längere Zeit haltbar. Eine Berührung mit wird die Harnprobe tropfenweise mit einer Puffer- organischen oxydablen Substanzen (z. B. Gummilösung aus 50 mg Thymolblau, 8 g Dinatriumsalz kappe an Tropfflaschen) muß ebenso vermieden der Äthylendiamintetraessigsäure und 100 ml 10- 60 werden wie die Einwirkung von Licht,
prozenticer Natronlauge versetzt, bis die Farbe von _TT ,, , _ , ..... .

Rot über Gelb nach Grün umschlägt. Dann werden Herstellung der S t a η d a r d f a r b u η g
weitere 1 bis 3 Tropfen bis zum Umschlag nach Blau In einer Harnprobe eines Patienten mit einwandzugegeben. Dl; gepufferte Probe wird durch ein frei festgestelltem Phacochromozytom (bzw. Neuro-Blaubandfiltcr von Schleicher-Schüll Nr. 589 filtriert 65 blastom) werden nach dem bekannten Verfahren von und anschließend in der auf Seiten 4 und 5 be- Euler Adrenalin, Noradrcnalin und Dopamin quanschriebcncn Filtricrapparatur durch ein Filter aus titativ bestimmt. Proben dieses Harns mit einem aluminiumoxydimprägnicrtem Papier mit einer Gc- Gehalt von 3, 4, 5 bzw. 6 /ig Gesamtkatecholamin

werden in der beschriebenen Weise dem Schnelltest unterworfen und die dabei erhaltenen vier Farbschattierungen fotografisch fixiert. Anschließend werden dem Schnelltest mindestens etwa 200 Harnproben von gesunden medikamentös nicht vorbehandelten Versuchspersonen unterworfen, bei denen die 24-Stunden-Ausscheidung an Adrenalin. Noradrenalin und Dopamin höchstens 500 ng betragt (quantitative Untersuchung) und die erhaltenen Farben mit den vier Vergleichsfarben verglichen. Als Standardfarbe wird diejenige herangezogen, die sich in mindestens 95 " » der Fälle als dunkler oder gleich intensiv erweist wie die zum Vergleich untersuchten Kontrollen.

Claims (8)

Patentansprüche:

1. Schnelltestverfahren /ur annähernden test stellung de¹- Gehalts an Adrenalin. Noradrenalin C und Dopamin im Harn duri.li Puffern des aiv gesäuerten Harns. Adsorption an Aluminiumoxid und Oxidation in Geeenwart '.ni Kaiiuniferrieyanid. dadurch g e k e η η / e i c h n e t . daH :nan eine gelinge Harnmenge mit einer rieht ic ox\ jieienden Säure, außer Phosphorsäure, aufgekocht, mit einer alkalischen Pufferlösung aus dem Dinatriumsal/ von AtIn lendinmintetrnesMgsäure. einem Aikalihydroxyd und Bromthymolblau bestehenden Pufferlosung, alkalisicrt, «e-{!cbenenfalls filtriert, dann langsam durch ein Filter aus mit Aluminiumoxyd imprägniertem Papier filtriert, das durch Imprägnieren üblichen Chromatographiepapiers mit einer phosphorsauren wäßrigen Lösung eines Alun1iniumsal7.es oder mit einer Aluminatlösung, Fällung von Aluminiumhydroxid mit einer Base, vorzugsweise gasförmigem Amoniak. bzw. mittels hochprozentiger Ammoniumchloridlösung und Trocknen des Papiers erhalten worden ist, danach mit einer geringen Wassermenge nachspült, auf das Aluminiumoxydpapier eine wäßrige Reagenzlösung aus Kaliumferricyanid, Ammoniumacetat und Kupfersulfa" aufbringt und eine definierte Zeit einwirken laßt, überschüssiges Reagenz absaugt und die entstandene Färbung mit der in gleicher Weise bestimmten Färbung einer Harnprobe bekannten Katecholamingehalts vergleicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Bestimmung etwa 1 "n des 24-Stunden-Harns, vorzugsweise 1 bis 20 ml, einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Harn mit verdünnter Schwefelsäure oder Salzsäure aufkocht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Harn mit einer Pufferlösung alkalisiert, die als Base Natronlauge enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Harn durch einen Filter aus Aluminiumoxydpapier saugt, das durch Imprägnieren des Papiers mit einer Lösung von Aluminiumsulfat in Gegenwart von Phosphorsäure, etwa 60- bis 70stündige Einwirkung Ammoniakdampf auf das noch feuchte Papier und Trocknen erhalten worden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Filtration dos Harns durch das Filter aus Aluminiumoxydpapier mit einer Filtrationsgeschwindigkeit von etwa 8 bis 14, vorzugsweise etwa 10 bis 12 Tropfen/Minute, gegebenenfalls unter Anwendung von Wasser- _ Strahlvakuum, vornimmt.

7. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, d ί.ΐ man die Reagenzlösung aus Kaliumfcrricv.nud. Ammoniumacetat und Kupfersulfat in uner Menge auf das Filter aus AIuminiumo\ydpapier aufbringt, daß dieses gerade bedeckt ist, und eine Zeü von etwa 1 bis 3 Minuten einwirken läßt.

8. Aluminiumoxydimprägniertes Papier zur Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 7, gekennzeichnet durch einen aus phosphorsaurer Lösuniz eines Aluniiniumsal/es mit einer nase, vorzugsweise durch etwa M)- bis T'Ktiindiges fiinwir!--.-n von gasförmigem Ammoniak und Trocknen erk.dtencn Niederschlag von Aliiminiumoxyd