JPS5923388B2 - カテコ−ルアミン及びその代謝物の測定法ならびに測定装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、カテコールアミン及びその代謝物の新規な測
定法ならびにそのための測定用装置に関する。

カテコール性化合物は動植物界に広く分布する化合物で
あり、特に生体内で重要な働きをしているカテコールア
ミンはその典型的なものとしてあげられる。

従つてカテコールアミン（ドーパミン、ノルエピネフリ
ン、エピネフリン等）及びその代謝物（３−メトキシチ
ラミン、ノルメタネフリン、メタネフリン、ホモバニリ
ン酸、バニリルマンデル酸、３｜４−ジヒドロキシフェ
ニル酢酸、３｜４−ジヒドロキシマンデル酸、３−メト
キシー４−ヒドロキシフェニルグリコール、３｜４−ジ
ヒドロキシフェニルグリコール等）の体内での変動を知
ることは、医学、薬学、生化学、薬理学、神経化学、分
析などの分野においてきわめて重要である。カテコール
アミンならびにその代謝物の存在量は微量であるが、そ
のうちカテコールアミンの測定法としては、例えばガス
クロマトグラフイ一（ケミカル・アンド・フアーマシユ
ーテイカル・ビユレテイン、１６巻６９９〜７０１頁１
９６８年）、ガスクロマトグラフイーマススペクトロメ
トリ一（サイエス、１７６巻１７７〜１８０頁１９７２
年）、高速液体クロマトログラフイ一（ライフ・サイエ
ンス、１４巻３１１〜３２２頁１９７４年）、酵素アイ
ソトープ法（サーキユレーシヨン・リサーチ、２６巻５
３〜５７頁１９７０年）などが知られており、目的に応
じて使いこなせるようになつてきている。

しかし代謝物に関しては研究が少なく、高感度で正確に
測定しうる方法はまだ確立されていない。

最近の高速液体クロマトグラフイ一の進歩はこれら代謝
物の分離分析を可能としたが、２８０ｎｍの吸光度を利
用しているため（ジヤーナル・オブ・クロマトグラフイ
一、１１６巻２４０〜２４３頁１９７６年）、多数の成
分からなる生体試料中の代謝物を定量するには特異性の
点で問題がある。また感度も正常人尿中代謝物の定量に
は不充分であう、より高感度で特異性の高い測定法の開
発が強く望まれている。本発明者らはこれらの問題を解
決するため種々研究した結果、塩化第二鉄及びフエリシ
アン化カリウムを試薬として用いると、カテコールアミ
ン及びその代謝物とモノフエノール類（夾雑物質）では
試薬との反応において反応性に差異があわ、この反応性
の差異を利用してカテコールアミン及びその代謝物を高
感度で特異的に測定しうることを，見出した。

例えばネイチヤ一、１７０巻２４９〜２５０頁１９５２
年に記載されているように、塩化第二鉄とフエリシアン
化カリウムとの組み合わせは、フエノール類のペーパー
クロマトグラフイ一において発色剤として用いられてい
たものであるが、この発色は瞬間的に起こることが記載
されておう（２５０頁左欄下から１４行参照）、フエノ
ール類の種類により反応性に差異があることはこれまで
全く知られていなかつた。

これに対し本発明者らの研究によれば、ジヒドロキシフ
エニル化合物（カテコールアミン）及びメトキシヒドロ
キシフエニル化合物（カテコールアミンの代謝物）と試
薬との反応は、モノヒドロキフエニル化合物（いわゆる
モノフエノール類）との反応よりも一般に速く起こり、
各成分間の反応性に特異性があることが明らかになつた
。本発明はこの新知見に基づくもので、カテコールアミ
ン及びその代謝物に試薬としての塩化第二鉄及びフエリ
シアン化カリウムを作用させ、カテコールアミン及びそ
の代謝物と夾雑するモノフエノール化合物との試薬に対
する反応性の差異を利用して、カテコールアミン及びそ
の代謝物を吸光光度法によシ測定することを特徴とする
、カテコールアミン及びその代謝物の測定法である。

本発明方法は、動植物界その他のカテコールアミン、例
えばドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリンなど
、ならびにこれらの代謝物例えば３−メトキシチラミン
、ノルメタネフリン、メタネフリン、ホモバニリン酸、
バニリルマンデル酸、３，４−ジヒドロキシフエニル酢
酸、３，４−ジヒドロキシマンデル酸、３−メトキシ−
４−ヒドロキシフエニルグリコール、３，４−ジヒドロ
キシフエニルグリコールなどの測定に特に適している。
試薬としての塩化第二鉄及びフエリシアン化カリウムは
、好ましくは水溶液の形で用いられる。

試薬の両成分を水に溶解し、この水溶液をカテコール性
化合物及びその代謝物と反応させてもよいが、通常は各
成分の水溶液を別個に調製し、反応のしばらく前に各水
溶液を混合して用いることが好ましい。本反応は好まし
くは緩衝剤、例えばくえん酸緩衝液などの存在下に行わ
れ、ＰＨは６以下の酸性域が好ましい。反応温度は４〜
１００℃が好ましい。塩化第二鉄は本反応の選択性を増
大するために用いられる。他の化合物、例えば塩化第二
銅又は塩化ニツケルを用いると反応の特異性が失われる
か又は反応は進行しない。試薬水溶液の濃度は試料中の
各成分の濃度などによつても異なるが、高感度で定量的
な反応性の差異を得るためＦｅＣｌ３は０．０１〜０．
５モ〜１１Ｋ３〔Ｆｅ（ＣＮ）６は０．０１〜０．５モ
ル／ｔが好ましい。

また約１分ないし数分の反応時間で特異性が得られ、約
１．５〜５分の反応時間が好ましい。前記のように、カ
テロールアミン及びその代謝物とモノフエノール類とで
は試薬に対する反応性が特異的で、モノフエノール類の
反応は著しく遅いか又はほとんど反応しないので、試料
中にモノフエノール類が存在していてもこれを除去する
ことなしに、カテコールアミン及びその代謝物だけを高
感度で測定することができる。本発明方法によれば、試
薬を作用させたのち吸光光度法により各成分を測定する
。

反応による発色の色調が青色なので、６００〜７００ｎ
ｍ付近の吸光度を測定することにより各成分を特異的に
定量できる。各成分を例えばＦｅＣＩ３濃度０．０３Ｍ
．．Ｋ３〔Ｆｅ（ＣＮ）６〕濃度０．０３Ｍ１反応温度
４５℃及び反応時間１．５分の条件下に反応させ、６９
０ｎｍにおける吸光度を測定すると、そのピーク面積と
各成分の濃度、例えば３，４−ジヒドロキシマンデル酸
、３，４−ジヒドロキシフエニル酢酸、バニリルマンデ
ル酸、ホモバニリン酸及び３−メトキシ−４−ヒドロキ
シフエニルグリｐ−ルの量との関係は、約４００ｎｇま
での濃度で直線となり、検量線として利用できる。

さらに本発明方法は、高速液体クロマトグラフイ一の検
出系と組み合わせることができる。

この態様においては、試料を高速液体クロマトグラフイ
一により処理して各成分に分離したのち、試薬を作用さ
せ、次いで各成分を吸光光度法により定量する。充填剤
としては、試料の種類に応じて普通の充填剤例えばイオ
ン交換樹脂、順相型の樹脂、逆相型の樹脂などから適宜
選択することができるが、例えば逆相型のスフエリソル
ブＳ５ＯＤＳ（フエイス・セパレーシヨン社製）が好ま
しい。この実施態様は、植物成分及び生体試料好ましく
は尿中のカテコールアミン及びその代謝物の各成分を特
異的に高い感度で定量するために特に適している。本発
明はさらに、前記の本発明方法を実施するための測定装
置である。

本発明の測定装置は、カテコールアミン及びその代謝物
に試薬としての塩化第二鉄及びフエリシアン化カリウム
を作用させるための反応槽、ならびに反応槽に接続され
た吸光光度計から構成されている。吸光光度計としては
、通常のものが用いられる。好ましくは反応槽には、カ
テコールアミン及びその代謝物（試料）を供給する機構
、ならびに試薬を供給する機構が接続されている。

試料供給機構としては、例えば通常の試料インジエクタ
一を用いることができる。詳薬供給機構は、好ましくは
塩化第二鉄槽及びフエリシアン化カリウム槽から成う、
試薬の両成分を別個に直接に１個の反応槽に供給しても
よいが、これらの試薬槽と反応槽との間に混合槽を配置
接続し、試薬両成分を混合したのち反応槽に供給するよ
うに構成することが特に好ましい。混合槽の代わわにも
う１個の反応槽を設け、第１の反応槽に一方の試薬成分
を添加し、この反応溶液を第２の反応槽に送り、そこで
他方の試薬成分を添加することもできる。この場合第１
反応槽には塩化第二鉄溶液を、第２反応槽にはフエリシ
アン化カリウム溶液を添加することが好ましい。試薬は
ポンプ輸送することができる。

また試料ィンジエクタ一の前に緩衝液槽を配置し、緩衝
液をインジエクタ一にポンプ輸送し詳料を反応槽に送る
ことが好ましい。本発明の測定装置はさらに、試料供給
機構と反応槽との間に高速液体クロマトグラフイ一用装
置を配置接続することが好ましい。

高速液体クロマトグラフイ一用装置としては通常のもの
が用いられ、普通の充填剤を充填したカラムと、カラム
に液体好ましくは恒温水を循環させるための循環液槽か
ら成つていてよい。本発明の測定装置の好ましい態様の
一例を第１図に示す。

この図において反応槽１ど塩化第二鉄槽２及びフエリシ
アン化カリウム槽３とは混合槽４を介して接続されてお
り、各試薬溶液は送液ポンプ５及び６により輸送される
。試薬の混合は任意の手段で行うことができ、例えば磁
気撹拌器などが用いられる。試料は試料インジエクター
７から導入され、反応槽１に供給される。高速液体クロ
マトグラフイ一用装置を組み込む場合は、インジエクタ
ー７から導入された試料は高速液体クロマトグラフイ一
用カラム８を通つて反応槽１に供給される。９はカラム
８の循環恒温水槽である。

試料インジエクター７の前には好ましくは緩衝液槽１０
が配置されており、緩衝液は送液ポンプ１１により・試
料インジエクター７に供給される。反応槽１の後には普
連の分光光度計１２が接続され、吸光度の測定結果は記
録計１３によジ記録される。測定終了後の液は、廃液槽
１４に排出される。第１図に示す装置において、混合槽
４を取勺除き、反応槽１と分光光度計１２との間に他の
反応槽１′を配置し、そして反応機１にはポンプ５によ
う塩化第二鉄溶液が、反応槽１″にはポンプ６によ勺フ
エリシアン化カリウム溶液が供給されるように構成する
こともできる。本発明によれば好ましくは高速液体クロ
マトグラフイ一用装置を接続して、カテコールアミン及
びその代謝物の各成分を、簡単かつ経済的な手段で高感
度かつ特異的に測定することができ、医学、薬学、生化
学、薬理学、神経学等の分野における分析、定量、診断
その他のためにきわめて有用である。

実験例 すべての実験において、第１図に示すと同様な装置であ
つて、ただし高速液体クロマトグラフイ一用カラム８及
び循環恒温水槽９を取り付けない装置を用いて測定を行
つた。

試料としては下記のものをそれぞれ２×１０−３モルの
量で用いた。３，４−ジヒドロキシマンデル酸（ＤＯＭ
Ａ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、３，４−ジヒドロキ
シフエニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、バニリルマンデル酸（
ＶＭＡ）、３−メトキシ−４−ヒドロキシフエニルグリ
コール（ＭＨＰＧ）、ドーパ（ＤＯＰＡ）、 ドーパミ
ン（ＤＡ）、ノルエピネフリン（ＮＥ）及びエピネフリ
ン（Ｅ）。

夾雑物質であるモノヒドロキシフエニル化合物として、
４−ヒドロキシフエニル酢酸及び３−ヒドロキシフエニ
ル酢酸をそれぞれ２×１０−３モル（前記の試料と同量
）の量で用いた。所定濃度の塩化第二鉄水溶液及びフエ
リシアン化カリウム水溶液をそれぞれ塩化第二鉄槽２及
びフエリシアン化カリウム槽３から混合槽４にポンプで
送液したのち反応槽１に供給し、各試料は試料インジエ
クター７から反応槽１に供給した。

４５℃の温度で所定の時間反応させたのち、分光光度計
１２で吸光度を測定した。

（４）各試料の反応性の差異及び感度： ０．０２Ｍ−ＦｅＣｌ３及び０．０１１ＦＫ３〔Ｆｅ（
ＣＮ）６〕の試薬濃度、１．５分の反応時間の条件で反
応させ、各試料の吸光度を６００〜７２０ｎｍの波長で
測定した結果を第２図に示す。

第２図において曲線１はＤＯＭん曲線ぱＨＰｌ曲線はＤ
ＯＰＡＣｌ曲線はＶＭん曲線ｖは４−ヒドロキシフエニ
ル酢酸、曲線はＭＨＰＧｌそして曲線は３−ヒドロキシ
フエニル酢酸の吸光度である。この結果から明らかなよ
うに、シヒドロキシフエニル化合物及びメトキシヒドロ
キシフエニル化合物はモノヒドロキシフエニル化合知に
比して一般に高い感度を示し、例えば６９０ｎｍにおけ
る吸光度測定では、前者の化合物群が後者よりも数倍高
感度であることが認められる。

［有］）反応時間： ０．０２Ｍ−ＦｅＣｌ３及び０．０１Ｍ−Ｋ３〔Ｆｅ（
ＣＮ）６］の試薬濃度で、種々の反応時間で反応させた
のち、それぞれ６９０ｎｍの波長で吸光度を測定した結
果を第３図に示す。

なお図中の記号は第２図の場合と同じ意味を有する。こ
の試薬濃度においては、ジヒドロキシフエニル化合物及
びメトキシヒドロキシフエニル化合物と群とモノヒドロ
キシフエニル化合物群との選択性を増すためには約１．
５分の反応時間が好ましいことが認められる。

（０ＦｅＣ１３の濃度及びＫ３〔Ｆｅ（ＣＮ）６〕の濃
度：Ｋ３〔Ｆｅ（ＣＮ）６〕の濃度を０．０１Ｍの一定
にして、種々のＦｅＣｌ３の濃度で１．５分間反応させ
たのち、それぞれ６９０ｎｍの波長で吸光度を測定した
結果を第４図に示す。

同様にしてＦｅＣｌ３の濃度を０．０３Ｍの一定にして
、Ｋ３〔Ｆｅ（ＣＮ）６〕の濃度を変化させた場合の測
定結果を第５図に示す。第４図及び第５図の記号は第２
図の場合と同じ意味を有する。これらの結果から、各試
薬の至適濃度はＦｅＣｌ３が０．０２〜０．０３Ｍ１Ｋ
３〔Ｆｅ（ＣＮ）６〕０．０２〜０．０４Ｍであつた。

また０．０３Ｍ−ＦｅＣｌ３及び０．０３Ｍ−Ｋ３〔Ｆ
ｅ（ＣＮ）６〕の濃度における反応では、ジヒドロキシ
フエニル化合物はモノヒドロキシ化合物に対し約３０倍
、またメトキシヒドロキシ化合物は約２０倍の感度で測
定することができた（第５図）。９実験Ａと同じ条件下
でカテコールアミンの測定を行つた。

その結果を第６図に示す。この図中の曲線はドーパ、曲
線はエピネフリン、曲線Ｘはノルエピネフリン、曲線は
ドーパミンの吸光度である。

この結果から明らかなように、カテコールアミンもそれ
ぞれ高感度で測定できる。

実施例 １ 第１図と同様の高速液体クロマトグラフイ一用装置を接
続した装置を用いてカテコールアミン及びその代謝物の
測定を行つた。

公知方法と本発明の方法を比較するため、装置を次のよ
うに変形した。カラム８を反応槽１に接続する代わｂに
、公知方法によりカラム８を通過しただけの試料の吸光
度を２８０ｎｍの波長で測定するための他の吸光光度計
に接続し、２８０ｎｍでの吸光度測定後の試料を反応槽
１に供給して試薬と反応させ、次いで吸光光度計１２で
６９０ｎｍの波長における吸光度を測定するようにした
。試料としては、３，４−ジヒドロキシマンデル酸（Ｄ
ＯＭＡ）、バニリルマンデル酸（ＶＭＡ）、３メトキシ
−４−ヒドロキシフエニルグリコール（ＭＨＰＧ）、
３，４−ジヒドロキシフエニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及び
ホモバニリン酸（ＨＶＡ）の各４００ｎｇからの混合物
を用いた。

測定条件は下記のとおりである。

カラム８の大きさ：内径４．６ＴＷＬ１長さ２５ｃｍ充
填剤：スフエリソルブＳ５ＯＤＳカラム温度：４５℃ 移動層：１０％メタノール／くえん酸塩緩衝液（ＰＨ３
．４）試薬濃度：０．０３Ｍ−ＦｅＣｌ３ Ｏ．Ｏ３Ｍ−Ｋ３〔Ｆｅ（ＣＮ）６〕 流速：０．６ｍｔ／分 検出：２８０ｎ瓜１．０ＡＵＦＳ（公知方法）６９０ｎ
ｒｎ，１．２８ＡＵＦＳ（本発明）測定結果を第７図に
示す。

図中の上の曲線は公知方法による２８０ｎｍでの吸光度
、下の曲線は本発明による６９０ｎｍでの吸光度を示し
、曲線のピーク土の各成分の略語は前記の意味を有する
。この結果から明らかなように、本発明によれば各成分
を高感度で定量できる。実施例 ２ 実施例１と同じ変形装置を用いて尿中のカテコールアミ
ン代謝物を測定した。

測定条件は、検出条件を下記のように変えた以外は実施
例１と同じである。検出：２８０ｎｍ．．０．１ＡＵＦ
Ｓ（公知方法）６９０ｎｍ．．０．６４ＡＵＦＳ（本発
明）試料としての尿は次のように処理したものを用いた
。

尿５ｍｔを分液沢斗に採シ、６Ｎ−ＨＣｌＯ．５ｒｒＬ
ｔ及びＮａＣｌｌ，５ｔを加えて攪拌したのち酢酸エチ
ル２０ｍｔを加えと振盪する。酢酸エチル層を分取し、
４０℃で減圧下に蒸発乾固し、残査に０．２Ｎ一酢酸２
ｍｔを加えて溶解し、これを試料とする。測定結果を第
８図に示す。

図中の上及び下の曲線ならびに各成分の略語は第７図の
場合と同じ意味を有する。この結果から明らかなように
、公知方法によればきわめて複雑な測定曲線が得られ、
各成分を特異的に定量することは困難である。

これに対し本発明によれば測定すべき成分の単純明瞭な
ピークが得られ、特異的かつきわめて容易に定量するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法を実施するための好ましい装置の一
例を示すフロー図、第２〜６図は本発明による試薬に対
するカテコールアミン及びその代謝物の特異性及び感度
を示すためのグラフ、第７及び８図はそれぞれ標準試料
及び尿の測定結果を示すグラフである。 第１図において１は反応槽、２は塩化第二鉄槽）３はフ
エリシアン化カリウム槽、４は混合槽、７は試料インジ
エクタ一、８は高速液体クロマトグラフイ一用カラム、
１２は分光光度計を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ カテコールアミン及びその代謝物に試薬としての塩
   化第二鉄及びフェリシアン化カリウムを作用させ、カテ
   コールアミン及びその代謝物と夾雑するモノフェノール
   化合物との試薬に対する反応性の差異を利用して、カテ
   コールアミン及びその代謝物を吸光光度法により測定す
   ることを特徴とする、カテコールアミン及びその代謝物
   の測定法。 ２ カテコールアミン及びその代謝物を含有する試料を
   高速液体クロマトグラフィーにより処理し、次いで試薬
   としての塩化第二鉄及びフェリシアン化カリウムを作用
   させたのち、吸光光度法により測定することを特徴とす
   る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ カテコールアミン及びその代謝物に試薬としての塩
   化第二鉄及びフェリシアン化カリウムを作用させるため
   の反応槽、ならびに反応槽に接続された吸光光度計から
   構成されていることを特徴とする、カテコールアミン及
   びその代謝物に前記の試薬を作用させ、カテコールアミ
   ン及びその代謝物と夾雑するモノフェノール化合物との
   試薬に対する反応性の差異を利用して、カテコールアミ
   ン及びその代謝物を吸光光度法により測定する方法を実
   施するための装置。 ４ カテコールアミン及びその代謝物を反応槽に供給す
   る機構、ならびに試薬としての塩化第二鉄及びフェリシ
   アン化カリウムを反応槽に供給する機構が反応槽に接続
   されていることを特徴とする、特許請求の範囲第３項に
   記載の装置。 ５ 試薬供給機構が塩化第二鉄槽及びフェリシアン化カ
   リウム槽から成り、これらの槽と反応槽との間に試薬混
   合槽が配置接続されていることを特徴とする、特許請求
   の範囲第４項に記載の装置。 ６ カテコールアミン及びその代謝物を含有する試料の
   供給機構と反応槽との間に高速液体クロマトグラフィー
   用装置が配置接続されていることを特徴とする、特許請
   求の範囲第４項又は第５項に記載の装置。