DE69026371T2 - Heilmittel und verfahren zur inhibierung der vaskularisierung von tumoren - Google Patents
Heilmittel und verfahren zur inhibierung der vaskularisierung von tumorenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische Wirkstoffe und Verfahren zum Behandeln von Tumoren.
- Streptococcen der β-hämolytischen Gruppe (GBS) sind ubiquitäre Mikroorganismen. Von GBS ist nicht bekannt, daß es schädliche Infektionen des Menschen verursacht, außer bei Neugeborenen. GBS-Pneumonie, auch bekannt als "früheinsetzende Krankheit (early-onset disease)", ist mit hoher Morbidität und Mortalität bei Neugeborenen verbunden. Die GBS-Infektion kann am Tage der Geburt vorliegen und ist besonders häufig bei unreifen Säuglingen. Nachdem die Kinder das Alter von einigen Wochen erreicht haben und eine normale Lungenentwicklung erfolgt ist, unterliegen sie nicht länger der GBS-Pneumonie.
- In einer Reihe von Untersuchungen, die von Dr. Carl G. Hellerqvist und seinen Mitarbeitern an der Vanderbilt University School of Medicine, Nashville, Tennessee, durchgeführt wurden, wurde ein Polysaccharid-GBS-Toxin identifiziert. Dieses Toxin, das bei β-hämolytischen Streptococcen der Gruppe B erhöht vorliegt, ist vermutlich ein Hauptfaktor für die Komplikationen bei GBS-Pneumonie.
- Das GBS-Toxin ist aus GBS-Kulturmedien isoliert, gereinigt und teilweise charakterisiert worden. Siehe Hellerqvist, et al. (1981), Pediatr. Res., 15:892-898; Rojas, et al. (1981), Pediatr. Res., 15:899-904; Rojas, et al. (1983), Pediatr. Res. 17:1002-1008; und Hellerqvist, et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:51-55. Bei diesen Untersuchungen wurden Schafe als ein experimentelles Modell zum Testen der Effekte des GBS-Polysaccharidtoxins auf Lungen verwendet. Im Unterschied zum Menschen sind die Lungen von ausgewachsenen Schafen wie auch von jungen Schafen anfällig gegenüber dem GBS-Toxin. Wenn das Toxin in Schafe infundiert wird, erzeugt es eine pulmonale Hypertension und eine gesteigerte pulmonale Gefäßpermeabilität. Diese Änderungen sind ähnlich zu solchen, die auftreten bei Neugeborenen mit Sepsis durch Streptococcen der Gruppe B.
- GBS-Toxin ist ein komplexes Polysaccharid mit einem geschätzten Molekulargewicht von ungefähr 200000. Dieses Polysaccharid teilt immunologische strukturelle Merkmale mit dem Gruppen- Antigen, wie von Hellerqvist et al. (1981), oben zitiert, berichtet, und enthält Phosphodiesterstrukturen, von denen angenommen wird, daß sie direkt oder indirekt für die Toxinfunktion wesentlich sind [Hellerqvist, et al. (1987), oben zitiert].
- Die vorliegende Erfindung beruht auf dem neuen Konzept, daß GBS-Toxin als ein therapeutischer Wirkstoff zum Bekämpfen von Tumoren durch die Inhibierung der Vaskularisierung verwendet werden kann. Damit ein solider Tumor über eine Größe von ungefähr 1 cm³ wachsen kann, müssen sie vaskularisieren, wobei sie die Bildung von neuen Blutgefäßen zum Versorgen des Tumors, sobald er sich vergrößert, induzieren. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß sich das sich neubildende Gefäßsystem in einem Entwicklungsstadium befindet, das vergleichbar ist zu dem embryonalen Lungengefäßsystem von unreifen Kindern und Neugeborenen zum Zeitpunkt der Geburt. Die Zellen des Gefäßsystems von solchen Tumoren sind in einem empfänglichen Zustand für die Wechselwirkung mit GBS-Toxin. Insbesondere wird angenommen, daß die Lungenzellen des Gefäßsystems des Tumors zelluläre Rezeptoren für die kritischen strukturellen Stellen des GBS-Toxins aufweisen. Solche Rezeptoren erlauben dem Toxin mit dem Gefäßsystem des Tumorkörpers zu interagieren und dadurch die Tumorvaskularisierung zu hemmen durch Induzieren einer Wirtvermittelten Zerstörung der neu gebildeten Kapillaren. Diese Wechselwirkung ist spezifisch für das Gefäßsystem an der Stelle des Tumors. Ein reifes normales Gefäßsystem, wie ein Lungengefäßsystem, besitzt keine Rezeptoren mehr, die mit dem GBS- Toxin interagieren. Weiterhin ist das Toxin sicher bei der systemischen Verabreichung an einen Patienten durch intravenöse Infusion. GBS und das Toxin, das es erzeugt, werden bekanntermaßen von normalen erwachsenen Menschen toleriert, obwohl GBS- Infektionen bei Erwachsenen mit anderen Komplikationen, wie Diabetes mellitus, Leberfehlfunktion und bestimmten Formen der Malignität zusammenhängen kann [Archives Internal Medicine (1988), 145, 641-645].
- Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ursprünglich im Zusammenhang mit Lungentumoren demonstriert. Jedoch wird angenommen, daß es allgemein anwendbar ist auf solide Tumore, die neue Kapillaren entwickeln, um dem Tumor Blut zuzuführen. Insbesondere wird angenommen, daß das Verfahren besonders wirksam ist bei Carcinomen und Adenocarcinomen. Die Aufgabe des Verfahrens besteht in einer zumindest teilweisen Hemmung der Entwicklung des Gefäßsystems des soliden Tumors, Carcinoms, Adenocarcinoms oder Lungentumors. Die Hemmung der Entwicklung der neuen Kapillaren zum Zuführen von Blut zu dem sich entwickelnden Tumor neigt dazu, das Wachstum des Tumors zu stoppen und sollte hilfreich sein beim Kontrollieren oder Beseitigen der soliden Tumoren.
- Die vorliegende Erfindung verwendet ein Polysaccharidtoxin, hergestellt von β-hämolytischen Streptococcus-Bakterien der Gruppe B, als einen therapeutischen Wirkstoff zur Behandlung von sich entwickelnden soliden Tumoren in menschlichen Patienten. Dieses Toxin, hierin als GBS-Toxin bezeichnet, wird in gereinigter Form verwendet, die aus einem komplexen Polysaccharidpolymer mit Mannosylphosphodiestergruppen, wie von Hellerqvist et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:51-55 beschrieben, besteht. Zum Zwecke der Inhibierung der Vaskularisierung eines sich entwickelnden Tumors kann das GBS-Toxin parenteral in einer Menge verabreicht werden, die wirksam ist für die Hemmung. Zum Beispiel kann das Toxin intravenös in einer wäßrigen Lösung in einer Dosis von 1 bis 10 Mikrogramm (mcg) pro Kilogramm (kg) des Körpergewichts des Patienten infundiert werden. Insbesondere kann das Vehikel zur Verabreichung sterile normale Kochsalzlösung enthalten, und kann das Toxin in Mengen von 0,5 bis 2 Milligramm (mg) pro 30 Milliliter (ml) der Lösung enthalten. Das Behandlungsprotokoll kann variiert werden, je nach dem Erfordernis für die wirkungsvollsten Ergebnisse. Zum Beispiel kann die Verabreichung des Toxins je nach Bedarf wiederholt werden, nämlich auf einer wöchentlichen Grundlage.
- Die Dosisgröße und der weitere Verlauf des GBS-Toxins können durch Aufzeichnen der Anzahl von zirkulierenden Granulozyten ermittelt werden. Da das Toxin mit den Rezeptoren des sich entwickelnden Tumorgefäßsystems interagiert, werden die zirkulierenden Granulozyten beeinflußt. Das Behandlungsprotokoll hängt von der Art des zu behandelnden soliden Tumors ab. Auf der Grundlage der vorliegenden Hinweise ist das Verfahren besonders gut anwendbar auf solide Tumoren im gesamten menschlichen Körper, insbesondere auf Tumoren, die als Carcinome oder Adenocarcinome klassifiziert sind. Der Grad der Wirksamkeit hängt von dem Ausmaß der Rezeptoren für das GBS-Toxin ab, die das sich entwickelnde Gefäßsystem des Tumors bereitstellt. Das Gefäßsystem von Lungentumoren besitzt nachgewiesenerweise solche Rezeptoren. Weiterhin zeigten Assays mit menschlichen Großzell- und Kleinzellcarcinomen GBS-Toxin-Bindungsstellen in dem Gefäßsystem dieser Tumormassen. Auch wurden humane Großzelladenocarcinome, die in Mausstudien verwendet wurden, die zu der vorliegenden Erfindung führten, immunologisch identifiziert durch monospezifische Antikörper gegen humane Brustadenocarcinome. Obwohl bisher noch nicht mit Sicherheit nachgewiesen, wird angenommen, daß die Gefäßsysteme von sich entwickelnden soliden Tumoren im allgemeinen zumindest einige GBS-Toxin- Bindungsstellen aufweisen, und das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann deshalb verwendet werden, um zumindest eine teilweise Hemmung der weiteren Gefäßsystementwicklung zu erzielen.
- Es wird erwartet, daß die Toxinrezeptorinteraktion bei sich entwickelnden Kapillaren in dem Tumor zu Granulozytopenie und anschließender Freisetzung des Enzyms Elastase aus den Granulozyten führt. Das verringerte Vorhandensein von Elastase kann mit einem Radioimmunoassay nachgewiesen werden, der als ein weiteres Mittel zum Verfolgen der Behandlung dienen kann. Weiterhin kann der oxidative Schaden, der durch die Granulozyten induziert wird, durch das Messen von konjugierten Dienen in dem Plasma registriert werden.
- GBS-Toxin zur Verwendung in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden durch Kultivieren von β- hämolytischen Streptococcus-Stämmen der Gruppe B, die in jüngster Zeit Neugeborene infiziert haben, oder diese infizieren können. Isolate solcher Stämme können deshalb aus dem Blut von infizierten Kindern und mit den Symptomen der GBS-Pneumonie erhalten werden. Stämme von GBS, die erhalten wurden durch successives in vitro-Kultivieren wären nicht geeignet als eine Quelle für das GBS-Toxin. Kohlenhydrat, das in das Kulturmedium freigesetzt wird, kann einen Mangel in den spezifischen strukturellen Merkmalen aufweisen, von denen angenommen wird, daß es Phosphodiesterreste sind, die mit den Rezeptoren der embryonalen Lungenzellen interagieren. Die Eignungsfähigkeit des Polysaccharidbestandteils kann durch Austesten in Schafen ermittelt werden, wie beschrieben von Hellergvist et al. (1981), Pediatr. Res. 15:892-898; und Rojas, et al. (1981), Pediatr. Res. 15:899-904. Die Wirkung des Toxins auf Schaflungen beruht in der Steigerung der pulmonalen Hypertension, die sich in einem gesteigerten pulmonalen Arteriendruck und auch einer gesteigerten Lungengefäßpermeabilität manifestiert.
- Die Rezeptorinteraktionseigenschaft des GBS-Toxins kann durch eine in vivo-Passage eines GBS-Stammes gesteigert werden. Zum Beispiel können Mäuse oder Kaninchen durch intraperitoneale Injektion inokuliert werden. Nachdem die Mäuse oder Kaninchen ernsthaft erkrankt sind, werden sie getötet, ihre Milz wird entnommen, und die aus der Milz gewonnene GBS-Kultur wird für die Infektion der nächsten Maus oder Kaninchens verwendet. Mehrere in vivo-Passagen sind wünschenswert, wie zum Beispiel fünf Passagen durch Mäuse. Dieses Verfahren ist ausführlich beschrieben von Hellerqvist et al. (1987), oben zitiert.
- Unter Verwendung eines GBS-Stammes, der eine stark interagierende Form des GBS-Toxins erzeugt, kann der Stamm in einem größeren Maßstab in vitro kultiviert werden, um das GBS-Toxin in das Kulturmedium freizusetzen. Einzelheiten des Verfahrens zum Durchführen einer solchen Kultivierung sind ebenfalls von Hellerqvist et al. (1987), oben zitiert, beschrieben. Wie beispielsweise von Hellerqvist et al. (1981), oben zitiert, beschrieben, kann der GBS-Stamm in einem Todd Hewitt Medium mit Hilfe einer 18-stündigen Inkubation bei 35ºC kultiviert werden. Das anfängliche Kultivieren kann verwendet werden zum Erzeugen eines Inokulums für größere Ansätze, das durchgeführt werden kann in einem Todd Hewitt Medium, Inkubieren des inokulierten Kolbens in einem Kreiselschüttler für 24 bis 48 Stunden bei 25 bis 37ºC.
- Nach dem Kultivieren der GBS werden die Zellen von dem Überstand abgetrennt, der das GBS-Toxin enthält. Geeignete Aufbereitungsverfahren werden in Hellerqvist et al. (1981, 1987), oben zitiert, beschrieben. Kurz, nachdem die Kulturüberstände autoklaviert worden sind, wird Ethanol auf eine 70 % -Konzentration zugesetzt. Das erhaltene Präzipitat kann einer wäßrigen Phenolextraktion unterzogen werden, gefolgt von dem Verfahren, wie beschrieben von Galanos et al. (1969), Eur. J. Biochem., 9:245-249. Zum Beispiel, wie von Hellerqvist et al. (1981), oben zitiert, beschrieben, kann die Extraktion durchgeführt werden mit einem Extraktionslösungsmittel, das sich zusammensetzt aus gleichen Teilen Wasser und Phenol, das auf das Ethanolpräzipitat bei einer erhöhten Temperatur, wie bei einer langsamen Erwärmung für 30 Minuten auf bis zu 70ºC, angewendet wird. Die Wasserphase der Extraktion kann gegen Wasser dialysiert und durch Gelfiltration gereinigt werden, wie beschrieben von Hellerqvist et al. (1987), oben zitiert. Alternativ wird GBS-Toxin in einer Form mit hohem Molekulargewicht (Hellerqvist et al., 1981, oben zitiert) aus dem angehefteten Präzipitat durch Chromatographieverfahren gewonnen (Hellerqvist et al., 1981, oben zitiert), wobei das Phenol/Wasser-Extraktionsverfahren weggelassen wird. GBS-Toxin kann auch nach dem Proteaseverdau von bakteriellen Membranfraktionen erhalten werden (Hellerqvist et al, unveröffentlicht).
- Die Fähigkeit eines isolierten GBS-Toxins als ein Tumorwachstumsinhibitor kann ermittelt werden durch Peroxidase-Antiperoxidase (PAP)-Assays auf Tumorgewebsproben unter Verwendung von Anti-GBS-Toxin-IgG und durch Infusion in ein Schafmodell bei 2 µg, 10&supmin;¹¹ Mol pro kg (Hellerqvist et al., 1981, 1987, oben zitiert). Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff GBS-Toxin eine beliebige, gereinigte Fraktion oder einen Bestandteil des natürlichen GBS-Toxins oder von Medien oder Proteaseverdaus von lysierten GBS-Bakterien erhalten, und dessen Toxizität durch jedes der spezifizierten Assayverfahren bestätigt werden kann.
- GBS-Toxin kann auf Lentil-Lectin fraktioniert werden. Die wirksamste GBS-Fraktion passiert zwei hintereinander angeordnete Lentil-Lectin-Säulen. Eine GBS-Toxinfraktion mit niedrigerer spezifischer Toxinaktivität in dem Schafmodell (siehe Dosis- Antwort in Figur 3, Hellerqvist et al., 1971) kann von den Lentil-Lectin-Säulen mit α-Methylmannosid eluiert werden. Dies zeigt an, daß ein gesteigerter Spiegel an Substitution mit Mannosylphosphatgruppen die toxische Eigenschaft steigert, aber die Lentil-Lectin-Affinität verringert. Die am stärksten wirksame Form des Toxins besitzt ein geschätztes Molekulargewicht von ungefähr 200000 und setzt sich offensichtlich aus Rhamnose, Mannose, Galactose, Glukose, N-Acetyl-glucosamin und N-Acetyl- Galactosamin in einem ungefähren molaren Verhältnis von 2:2:3:1:2:1 zusammen.
- Das Verfahren wird weiter durch die folgenden experimentellen Beispiele erläutert.
- Gereinigtes GBS-Toxin wurde gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt.
- Todd Hewitt-Medium (THB), 10 ml, wird mit einer gefrorenen Stockkultur inokuliert, die aus Isolaten von erkrankten Neugeborenen erhalten wurde und die für 9 bis 12 Stunden inkubiert wurde. Die so erhaltenen Kulturen werden als Inokulum in den unten beschriebenen Verfahren verwendet, die dazu dienen sollen, Kulturen mit erhöhtem Plasmidgehalt und GBS-Toxin produzierenden Eigenschaften zu erhalten.
- Einer Maus wird 1 ml der Kultur aseptisch in die Bauchhöhle injiziert. Hellerqvist et al, (1987). Wenn Sepsis auftritt, wird das Tier getötet und die Milz entfernt. Eine Schafblut- Agar-(SBA)-Platte wird mit der Milz "kontaminiert", und die Platte wird mit einer Schlinge abgestreift, um einzelne Kolonien zu erhalten. Die Milz wird in 10 ml Todd Hewitt-Medium eingebracht und diese Kultur wird für die zweite Mauspassage verwendet, vorausgesetzt, daß die SBA-Platte keine weiteren Kolonien als die β-hämolytischen Streptococcen aufweist. Bei der fünften Passage und jeder weiteren Passage werden 15 l- Ansätze an Todd Hewitt-Medium mit 10&sup9; Bakterien aus den Milzkulturen inokuliert und bei 37ºC auf einem Kreiselschüttler für 42 Stunden inokuliert.
- THB, ergänzt mit Serum aus Mensch oder anderen Spezies, wird inokuliert, und die erhaltene Kultur wird in einer seriellen Passage als Substitut für die Abfolge der Mauspassage verwendet. Bei der fünften oder weiteren Subkultur werden die Bakterien in großen Ansätzen in THB oder THB, ergänzt mit Serum und Glukose, kultiviert.
- Aliquots werden jedem Kolben nach dem Vervollständigen der Inkubation entnommen und verwendet zum Inokulieren von Platten mit:
- a) Sabaraud-Dextrose-Agar (SDA), im Duplikat,
- b) Eosin-Methylenblau (EMB),
- c) Tryptikase-Sojaagar (TSA), und
- d) SBA.
- Die Kolben werden autoklaviert und bei 4ºC für 38 Stunden gelagert, wobei dies eine ausreichende Zeit ist für sämtliche Platten, die Abwesenheit von:
- 1) Hefen und Pilzen auf den SDA-Platten, eine bei 37ºC und eine bei Raumtemperatur inkubiert, und
- 2) gram-negativer Kontamination auf der EMB-Platte
- anzuzeigen.
- Identische Sätze an Platten und Sterilitätsstandards werden verwendet, um sicherzustellen, daß kein mikrobielles Wachstum auf den Chromatographiesäulekügelchen oder den Dialysebeuteln während des Reinigungsverfahrens auftritt.
- THB-Medien werden verwendet, ergänzt mit Serum und Glukose 2 g/l. Um die Probleme zu umgehen, die sich aus dem Zusetzen oder nicht-Zusetzen von Hefeextrakt zu den Medien ohne einen entsprechenden Hinweis der Hersteller zu umgehen, können die Medien durch eine Filterkassette mit einem Cut 0ff von 10000 Mw (Millipore Corp.) filtriert werden. Falls unfiltrierte Medien verwendet werden, müssen mögliche Hefe-Mannane durch Lectin- Chromatographie entfernt werden.
- Die verwendeten Verfahren sind unsere ursprünglichen Verfahren (Hellerqvist et al., 1981, Pediatr. Res. 15:892-898). Autoklavierte Kulturüberstände oder Proteaseverdaus von Membranen, die als frei von jeglicher mikrobieller Kontamination ermittelt wurden, werden präzipitiert durch Einstellen auf 70 % Ethanol, und sie werden zweimal einer Phenol-Wasser-Extraktion unterzogen, Gallanose et al. (1969). Die Wasserphase wird für die Dialyse gegen Wasser gesammelt und anschließend einer DE52- Chromatographie unterzogen. Das GBS-Toxin in Wasser bindet an DE52 und wird mit ungefähr 0,25 M NaCl eluiert, wenn ein Gradient von 0 bis 0,4 M NaCl angewendet wird, Hellerqvist et al. (1987). Die Fraktionen werden hinsichtlich der optischen Drehung und mit einem kalorimetrischen schwefelsauren Phenolassay untersucht. Als nächstes ergibt eine Gelfiltration auf Sephacel S-300 GBS-Toxin, das langsam von der Säule eluiert. Nach Dialyse und Lyophilisation wird das GBS-Toxin subfraktioniert auf einer Lentil-Lectin-Affinitätssäule, die mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) entwickelt wird. GBS- Toxin (2 bis 5 mg) von der Sephacel -Säule wird in PBS (0,5 ml) gelöst und auf eine Lentil-Lectin-Säule (1 x 5 cm) gegeben. Das Material, das nicht auf der Säule bleibt (GBS-Toxin LL) und in zwei Säulen Volumen eluiert, wird dialysiert und lyophilisiert und erneut auf die regenerierte Lenil-Lectin-Säule gegeben. Der Durchflußpeak wird als GBS-Toxin LL1 gesammelt, und eine teilweise zurückgehaltene Fraktion, die mit 1,5 Säulenvolumen eluiert, entspricht GBS-Toxin LL2. Dieses Verfahren ist notwendig, falls nicht-filtrierte THB-Medien verwendet werden, da Hefe-Mannane die Präparation kontaminieren könnten.
- Es wird empfohlen, das vorgefilterte THB zu verwenden. Der Grund für diese Empfehlung ist, daß GBS-Toxin selbst strukturelle Merkmale besitzt mit ausreichender Aff inität für Lentil- Lectin, die erforderlich sind für die Elution mit α-Methyl- Mannosid. Diese GBS-Toxinfraktionen jedoch zeigen eine geringere spezifische Aktivität wenn sie in das Schafmodell infundiert werden im Vergleich zu GBS-Toxin LL1 oder LL2.
- GBS-Toxin LL1 und LL2 sind die wirksamsten isolierten Modulatoren der pathophysiologischen Antwort und besitzen eine Aktivität bei 1/60 der ursprünglichen Dosis oder einer Dosis von 10&supmin;¹¹ Mol/kg in dem Schafmodell, besitzen praktisch identische 1HNMR-Spektren, die Signale enthalten, die charakteristisch sind für ein Polysaccharid, das auch Phosphodiesterreste enthält, Hellerqvist et al. (1987). Wenn das Polysaccharid, das dieses am stärksten wirksame GBS-Toxin darstellt, einer Zuckeranalyse unterzogen wird, ergibt sich die in Tabelle 1 gezeigte Zusammensetzung. Tabelle 1: Zuckerzusammensetzungen des GBS-Toxins LL1 und LL2 Zucker Mol-% Rhamnose Mannose Galactose Glukose N-Acetyl-Glukosamin N-Acetyl-Galactosamin
- Die Wirkung des GBS-Toxins, hergestellt wie in Beispiel I beschrieben, wurde untersucht hinsichtlich der Wachstumsrate von humanem Großzelladenocarcinom, das in Nacktmäusen propagiert wurde. Die gereinigte Fraktion des GBS-Toxins LL1, das hergestellt worden war wie in Beispiel I beschrieben, wurde verwendet.
- Ein humanes Großzellungenadenocarcinom (BRX Lu 4), mit einem relativen DNA-Index von 1,4, wurde in Gewebekultur etabliert, die in RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, kultiviert wurde. Die Zellen in Kultur waren koloniebildend in Weichagar und behielten einen relativen DNA-Index von 1,4 bei. Immunzytochemische Charakterisierung war positiv für Zytokeratin und zeigte eine Kreuzreaktion mit 2 von 2 monoklonalen Antikörpern, die gegen das Großzellbrustadenocarcinom von Brustursprung gerichtet waren.
- Tumorinokula wurden von Zellen hergestellt, die auf Gewebekulturplatten bis zu 90 % Konfluenz kultiviert wurden. 10&sup7; in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendierte Zellen wurden aus verschiedenen Spritzen subcutan über den Venenweg in jede der 22 Nacktmäuse injiziert. Nach 10 Tagen erreichte die durchschnittliche Tumorgröße 100 + 12 Kubikmillimeter (cmm), und die Tiere wurden in drei Gruppen aus 7, 7 und 8 Einzeltieren mit randomisierter Tumorgröße aufgeteilt. Eine vierte Gruppe aus 7 nicht-tumortragenden Tieren diente als Kontrollgruppe.
- Inokulum wurde hergestellt durch Auflösen des Polysaccharidtoxins (Fraktion L1) in PBS in Konzentrationen, um Inokula von 2 µg/kg und 20 µg/kg, entsprechend 0,25 und 2,5 Picomol pro Injektion, zu ergeben. Dextran 70 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) bei 20 µg/kg oder 7 Picomol pro Injektion wurde als Kontrolle verwendet.
- Vier Gruppen an Mäusen, tumortragende Gruppen 1 bis 3 und nicht-tumortragende Gruppe 4, wurden intravenös über die Schwanzvenen mit 100 µl PBS, enthaltend: 2,5 Picomol GBS-Toxin, Gruppe 1 und Gruppe 4; 0,25 Picomol GBS-Toxin, Gruppe 2, und 7 Picomol an Dextran, Gruppe 3, injiziert. Die Injektionen erfolgten am Montag, Mittwoch und Freitag, und die Tumorvolumen wurden aus den Höhe-, Breite- und Längemessungen an jedem Tag der Injektion berechnet.
- Die Gruppe 4 zeigte, daß das GBS-Toxin bei 20 µg/kg keinen Einfluß auf die Gewichtszunahme hatte, und die Tiere zeigten keine Anzeichen von Toxizität. Dosen von 4 mg/kg wurden zuvor von Hellerqvist et al. (1981) in Blei-sensibilisierten Tieren ohne offensichtlichen Effekt verwendet. Vorläufige histologische Untersuchung zeigte keinen offensichtlichen Gewebsschaden, in Lunge, Leber, Niere, Milz oder Gehirn. Das Tumorwachstum in den verschiedenen Gruppen erfolgte mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Eine vorläufige Untersuchung der Tumoren zum Zeitpunkt des Tötens der Tiere zeigte, daß Nekrosen und Hämorrhagie mehr als die Hälfte der Tumormasse in sechs der sieben Tiere in Gruppe 1, die 20 µg/kg von GBS-Toxin erhielten, betraf. Ein solcher Schaden war nicht sichtbar in der Gruppe, die Dextran bei der äquimolaren Konzentration erhielt. Die Gruppe, die 2 µg/kg erhielt, zeigte ein intermediäres, histologisches Bild.
- Die erhaltenen Daten zeigten, daß das GBS-Toxin in gleich wirksamer Weise die Wachstumsrate der Tumoren über die ersten Tage der Behandlung verringerte, und daß über die folgenden 8 Tage die Wachstumsrate in Gruppe 1 bei der geringeren Rate blieb, während die Rate in Gruppe 2 erhöht war hinsichtlich der Rate, die in Gruppe 3, die Dextran erhielt, beobachtet wurde. Bei der Beendigung des Experiments waren die durchschnittlichen Tumorgrößen + Standardabweichungen der Mittelwerte wie folgt:
- Gruppe 1, die 2,5 Picomol GBS-Toxin/Inj. erhielt, 422 + 68 p < 0,005
- Gruppe 2, die 0,25 Picomol GBS-Toxin/Inj. erhielt, 550 + 71 p < 0,05
- Gruppe 3, die 7,0 Picomol Dextran/Inj. erhielt, 731 + 132
- Es wurden keine signifikanten Änderungen in der Gewichtszunahme beobachtet zwischen den tumortragenden und den nicht-tumortragenden Mäusen, die 2,5 Picomol GBS-Toxin/Inj. erhielten, oder zwischen den anderen Gruppen.
- Diese Daten zeigen, daß GBS-Toxin alleine die Wachstumsrate der humanen Tumorzellen in einer dosisabhängigen Weise verringert, um ungefähr 45 % gegenüber Dextran bei einer Dosis von 20 Microgramm oder 2,5 Picomol pro kg und um 25 % bei einer Dosis von 2 Microgramm oder 0,25 Picomol pro Injektion. GBS- Toxin induziert bei 1 µg/kg schwere Atemnot in dem Schafmodell, und es wird angenommen, daß dies auf der gesamten Entzündungs- und immunologischen Antwort beruht, an der Makrophagen, B- und T-Lymphozyten und Granulozyten beteiligt sind. Dem gewählten Mausmodell fehlen T-Zellen und somit auch die T-Zell-abhängige B-Zell-Antwort und zeigt somit den Wert des GBS-Toxins als einen Wirkstoff, der als Tumorwachstumssuppressor aktiv ist, vermutlich über seine Wirkung auf das Kapillar-Endothel. Es wird erwartet, daß in dem tumortragenden Normalindividuum diese Wirkung zu einer Gefäßzerstörung und anschließender Tumornekrose führen würde. Die histochemischen Untersuchungen, die mit GBS-Toxin und Anti-GBS-Toxin-IgG und Kontroll-IgG mit Schaflunge und humanem Tumorgewebe durchgeführt wurden, stützen diese Annahme.
- Der Umstand, daß GBS-Toxin eine spezifische Bindung an die Kapillaren von verschiedenem, humanem Tumorgewebe zeigt, und die Wachstumsrate in der exponentiellen Phase eines humanen Tumors in einem immundefizienten Tiermodell verringert durch Induktion einer Pathophysiologie, die ähnlich ist zu der, die in Schaflunge und humaner, neonataler Lunge, hervorgerufen durch GBS-Toxin bzw. durch die früh einsetzende Krankheit, beobachtet wird, legt nahe, daß GBS-Toxin die Vaskularisierung von humanen Tumoren, und dadurch deren Wachstum hemmen wird.
Claims (7)
1. Polysaccharidtoxin, hergestellt von β-hämolytischen
Streptococcus-Bakterien der Gruppe B, bekannt als GBS-
Toxin, wobei das GBS-Toxin in einer gereinigten,
toxinaktiven Form vorliegt zum Inhibieren der
Neovaskularisierung.
2. Polysaccharidtoxin nach Anspruch 1 zum Inhibieren der
Vaskularisierung eines sich entwickelnden, soliden Tumors.
3. Polysaccharidtoxin nach Anspruch 2 zum Inhibieren der
Vaskularisierung eines Carcinoms.
4. Polysaccharidtoxin nach Anspruch 2 zum Inhibieren der
Vaskularisierung eines Adenocarcinoms.
5. Polysaccharidtoxin nach Anspruch 2 zum Inhibieren der
Vaskularisierung eines Lungentumors.
6. Polysaccharidtoxin nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das
parenteral verabreicht wird durch intravenöses Infundieren
einer wäßrigen Lösung des Toxins.
7. Polysaccharidtoxin nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das
parenteral in einer Dosismenge verabreicht wird, die 1 bis
10 µg des Toxins pro kg Körpergewicht entspricht.
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